CN112843227B - 一种w/o/w佐剂组合物、制备的疫苗组合物及其制备方法 - Google Patents
一种w/o/w佐剂组合物、制备的疫苗组合物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种w/o/w佐剂组合物，其包括HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物、脂肪醇聚氧乙烯醚和油。本发明佐剂组合物用于制备的疫苗组合物在不同温度下，稳定不发生分层和破乳现象，疫苗制备条件简单温和。制备的疫苗快速达到免疫效果，且疫苗在使用时无不良反应。
Description
本申请为专利申请201710847843.9的分案申请，原案发明名称为“一种w/o/w佐剂组合物、制备的疫苗组合物及其制备方法”，申请日为2017年09月19日。
技术领域
本发明涉及水包油包水佐剂组合物，使用其制备的疫苗组合物和疫苗组合物的制备方法，属于兽药领域。
背景技术
细菌、病毒及寄生虫感染广泛分布于人和动物。由这些病原引起的疾病通常对抗微生物化学药物疗法具有抗性，使得没有有效的治疗方法。因此，愈来愈多的人使用疫苗学方法以控制传染病。完整的传染性病原体可在经化学灭活或合适的遗传工程处理后变得适用于疫苗配制物。或者，可将病原体的蛋白质亚基在重组表达系统中表达并纯化，以用于疫苗配制中。疫苗可通过在组合物中包含合适的佐剂而变得更有效。
佐剂一般是指增加对抗原的体液和/或细胞性免疫应答的任何物质。佐剂被用于实现两个目的：其减缓抗原从注射部位释出，且其刺激免疫系统。传统疫苗通常由灭活或被杀死或经修饰的活致病微生物的粗制备物组成。与这些致病微生物的培养物其中的杂质可作为增强免疫应答的佐剂。然而，以利用致病微生物或纯化的蛋白的同质制备物作为抗原而制成的疫苗所激发出的免疫力通常不够。因此，有必要加入某些外源物质(诸如佐剂)。再者，制造合成及亚单位疫苗很昂贵，加入佐剂可容许使用较小剂量的抗原来刺激类似的免疫应答，从而降低疫苗的制造成本。当将药剂与佐剂组合时可显著增加某些可注射药剂的效力。
US5424067专利公开了一种水包油包水佐剂，其使用商品化的佐剂，例如SEPPIC,公司的商品名为Montanide ISA 206，其缺点是免疫效果见效慢，难以在较短时间内达到理想的免疫效果。另外使用较多的表面活性剂，其带来的免疫副反应问题也不容忽视。
现有技术的化妆品也采用水包油包水剂型，但其制备乳化通常需要较高的乳化温度，通常乳化温度超过了37度，如采用该技术制备疫苗，在此条件下抗原很容易失活。
专利申请CN106511995A公开了一种双相佐剂，专利申请CN106267184A公开了一种水包油包水型乳化剂，专利申请CN103223164A公开了一种水包油包水型佐剂疫苗，上述现有技术共同存在的问题是，制备的乳剂粒径偏大，粘度较大，稳定性差。
因此，现有技术需要一种疫苗制备条件简单温和，对其中的抗原影响小，且制备的疫苗中的微粒粒径小，在不同温度下稳定不发生分层和破乳现象，且免疫效果上能快速达到理想效果且基本无不良反应的佐剂。
发明内容
为解决现有技术中的问题，本发明提供了一种佐剂组合物，其中，所述w/o/w佐剂组合物包括HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物、脂肪醇聚氧乙烯醚和油；所述佐剂组合物制备的疫苗，产生的微粒粒径小，稳定性高，在不同温度下均稳定不发生分层和破乳现象。
本发明的所述佐剂组合物制备的疫苗能快速产生抗体，保证免疫动物能及时达到保护的状态。
本发明还提供了一种疫苗的制备方法，使用所述佐剂组合物和抗原分别加热至25℃-37℃，混合即可制备疫苗。所述方法在温和的条件下制备疫苗，对其中蛋白成分的活性无影响，保证了疫苗的免疫效力。
本发明的佐剂组合物制备的疫苗，不产生不良反应，快速产生抗体，保证了免疫效果。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明提供一种w/o/w佐剂组合物，其中，所述w/o/w佐剂组合物包括HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物、脂肪醇聚氧乙烯醚和油。
本发明的佐剂组合物在不同温度下，尤其在室温稳定不发生分层和破乳现象，疫苗制备条件简单温和，疫苗粒径小。而本领域公知，双相佐剂是油亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，但一来表面活性剂种类众多，不是现有技术任意组合都能达到合适的粒径范围和稳定。
如本文所述“室温”是指18至25℃的温度。
如本文所述，“佐剂”是指可增加对抗原的体液或细胞免疫应答的任何物质。佐剂通常被用于达成两种目的：减缓抗原从注射部位释出及刺激免疫系统。
如本文所述“HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物”：是指蔗糖与脂肪酸经过酯化反应所得的混合物，蔗糖有8个-OH基团，可以与脂肪酸反应形成不同HLB值的蔗糖脂肪酸酯组合物，本发明所述的脂肪酸酯优选碳原子为8-28的脂肪酸，可以举例，辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、花生四烯酸。HLB值为5以下的蔗糖脂肪酸酯组合物可以举例商品化的，例如日本三菱Ryoto蔗糖酯，可以选择的型号，L195，蔗糖酯的月桂酸组合物，其HLB值为1，L595，蔗糖酯的月桂酸组合物，其HLB值5；蔗糖酯s170，蔗糖酯的硬脂酸组合物其HLB值为1，中国对应的蔗糖酯型号为SE-1，蔗糖酯s370，蔗糖酯的硬脂酸组合物其HLB值为3s，中国对应的蔗糖酯型号为SE-3，蔗糖酯s570，蔗糖酯的硬脂酸组合物其HLB值为5，中国对应的蔗糖酯型号为SE-5。
如本文所述“脂肪醇聚氧乙烯醚”，又称为聚氧乙烯脂肪醇醚。是非离子表面活性剂中。这种类型的表面活性剂是由聚乙二醇(PEG)与脂肪醇缩合而成的醚，用以下通式表示：RO(CH2CH2O)nH，其中n是聚合度，因聚乙二醇的聚合度和脂肪醇的种类不同而有不同的品种R一般为饱和的或不饱和的C12～18的烃基，可以是直链烃基，也可以是带支链的烃基。n是环氧乙烷的加成数，也就是表面活性剂分子中氧乙烯基的数目，当碳链R为C12时，生成的脂肪醇聚氧乙烯醚则俗称AEO，例如AEO3、AEO5、AEO9、AEO12。
如本文所述“油”包括矿物油和植物油或者合成的可代谢油，矿物油包括但不限于，兽用注射用白油、植物油包括但不限于花生油、大豆油、中链脂肪酸甘油酯，合成的可代谢油包括但不限于角鲨烷或者角鲨烯。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯的重量百分比为0.25％W/V-8.0％W/V，脂肪醇聚氧乙烯醚为1.0％W/V-12.0％W/V，余量为油。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯为碳原子为8-28的脂肪酸酯。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯选自蔗糖辛酸酯、蔗糖癸酸酯、蔗糖月桂酸酯、蔗糖肉豆蔻酸酯、蔗糖硬脂酸酯、蔗糖油酸酯、或蔗糖花生四烯酸酯。
作为本发明的进一步优选实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯为日本三菱Ryoto蔗糖酯L195、L595、蔗糖酯s170、蔗糖酯SE-1，蔗糖酯s370、蔗糖酯SE-3，蔗糖酯s570、或蔗糖酯SE-5。
作为本发明的进一步优选实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，HLB为1的蔗糖酯的月桂酸组合物、HLB为5的蔗糖酯的月桂酸组合物、HLB为1的蔗糖酯的硬脂酸组合物、HLB为的蔗糖酯的硬脂酸组合物、或HLB为5的蔗糖酯的硬脂酸组合物。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，肪醇聚氧乙烯醚以RO(CH2CH2O)nH通式表示，R为饱和的或不饱和的C12～18的烃基。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，肪醇聚氧乙烯醚以RO(CH2CH2O)nH通式表示，R为C12。
作为本发明的进一步优选实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，脂肪醇聚氧乙烯醚为AEO3、AEO5、AEO9、或AEO12。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，HLB值为5以下糖酯脂肪酸酯的重量百分比为0.5％W/V-8.0％W/V。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，HLB值为5以下糖酯脂肪酸酯的重量百分比为0.75％W/V-8％W/V。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，HLB值为5以下糖酯脂肪酸酯的重量百分比选自1.0％，1.5％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，或8％。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，脂肪醇聚氧乙烯醚的重量百分比为2％W/V-8％W/V。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，脂肪醇聚氧乙烯醚的重量百分比为3％W/V-7％W/V。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，脂肪醇聚氧乙烯醚的重量百分比选自2％，3％，4％，5％，6％，7％，或8％。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，所述的w/o/w佐剂组合物还包括另一种或多种非离子表面活性剂和/或免疫增强剂。
如本文所述“本发明所述的免疫增强剂”包括但不限于生育酚、DDA、左旋咪唑、皂树皮皂苷、聚肌胞、分支杆菌培养物的一种或者几种组合。
如本文所述，“其它非离子表面活性剂”，是指排除HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物和脂肪醇聚氧乙烯醚二缩甘露醇单油酸酯的其它表面活性剂，包括但不限于司本-80、司本-85，聚乙二醇单油酸酯、聚乙二醇双油酸酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油、二缩甘露醇单油酸酯的一种或者几种组合。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，所述另一种或多种非离子表面活性剂选自司本-80、司本-85、聚乙二醇单油酸酯、聚乙二醇双油酸酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油、二缩甘露醇单油酸酯。
所述免疫增强剂选自生育酚、DDA、左旋咪唑、皂树皮皂苷、聚肌胞、分支杆菌培养物的一种或者几种组合。
作为本发明的一种实施方式，上述组合物的w/o/w佐剂组合物还包含水。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，所述的w/o/w佐剂组合物还包括重量百分比为0.5％W/W-3％W/W的水。
本发明的w/o/w佐剂组合物中还可包含1.0％W/W，1,5％W/W，2.0％W/W的水。
在本发明的w/o/w佐剂组合物中添加上述含量的水后，佐剂组合物的冷稳定性大大提高。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，所述油包括矿物油、植物油或者合成的可代谢油。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的w/o/w佐剂组合物中，矿物油为兽用注射用白油；植物油为花生油、大豆油、或中链脂肪酸甘油酯，合成的可代谢油为角鲨烷或者角鲨烯。
本发明还提供一种制备疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：将抗原与上述的w/o/w佐剂组合物分别加热至25℃-37℃，然后在搅拌状态下，将所述抗原加到所述w/o/w佐剂组合物中。
本发明的疫苗组合物制备方法，条件温和，操作简单，能保证其中抗原成分的最大活性。
如本文所述，“抗原”或“免疫原”是指任何刺激免疫应答的物质。此名词包括被杀死的、灭活的、减毒的或经修饰的活细菌、病毒或寄生虫。术语抗原亦包括个别的或其任何组合的多核苷酸、多肽、重组蛋白质、合成的肽、蛋白质提取物、细胞(包括肿瘤细胞)、组织、多糖、或脂质、或其片段。术语抗原亦包括抗体，诸如抗受试者遗传型抗体或其片段，以及可模拟抗原或抗原决定簇(表位)的合成肽模拟位(mimotopes)。
如本文所述，“疫苗”是指包含如本文定义的抗原的组合物。将疫苗施用给受试者可产生大致上针对一种或多种特定疾病的免疫应答。治疗有效的疫苗量可根据所使用的具体抗原、或受试者的状况而有不同，且可由本领域技术人员决定。
可将两种或多种抗原组合在一起以制造可保护针对由病原体引起的多种疾病来保护受试者的多价组合物。目前，疫苗的商品制造者以及终端使用者偏好多价疫苗产品。虽然常规佐剂通常受限于可与其一起有效使用的不同抗原(单价或多价)，但是本文所述的佐剂可有效用于广泛的抗原(单价以及多价)中。因此，本文所述的抗原可合并在包含本文所述的佐剂的单一组合物中。
一些可作为抗原与佐剂组合物一起使用的细菌的例子包括，但不限于大肠杆菌、流感嗜血杆菌、睡眠嗜血菌、猪螺杆菌、细胞内劳森菌、嗜肺军团菌、莫氏杆菌属、牛分枝杆菌、猪肺炎支原体、丝状支原体亚种、LC丝状菌、产气荚膜梭菌、犬牙周臭味菌、溶血巴氏杆菌、多杀巴氏杆菌、发光光杆菌、喉管卟啉单胞菌、牙龈卟啉单胞菌、唾液卟啉单胞菌、痤疮丙酸杆菌、普通变形杆菌、威斯康辛绿脓杆菌、绿脓杆菌、荧光假单胞菌C9、荧光假单胞菌SIKW1、莓实假单胞菌、浅黄假单胞菌、食油假单胞菌、假单孢菌B11-1、富养产碱菌、不动嗜冷单胞菌、普氏立克次体、立克次氏立克次体、鼠伤寒沙门氏菌、邦哥利沙门氏菌、肠沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、黏质沙雷氏菌、钝顶螺旋藻、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、猪葡萄球菌、白色链霉菌、肉桂链霉菌、猪链球菌、除角质链霉菌、疥疮链霉菌、嗜酸热硫化叶菌、集胞藻属、霍乱弧菌、伯氏舒螺旋菌、齿密螺旋菌、小密螺旋菌、噬齿密螺旋菌、屈曲密螺旋菌、文氏密螺旋菌、钯密螺旋体及钩端螺旋体种，诸如已知的病原体犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈佐钩端螺旋体、博氏哈佐牛钩端螺旋体、博氏哈佐普拉伊特诺钩端螺旋体、问号钩端螺旋体、黄疸出血钩端螺旋体、波莫纳钩端螺旋体和布拉迪斯拉发钩端螺旋体，及其组合。
灭活的病毒及可用于佐剂组合物中。一些可作为抗原使用的病毒例子包括，但不限于：鸟疱疹病毒、牛疱疹病毒、犬疱疹病毒、马疱疹病毒、猫病毒性鼻气管炎病毒、马立克氏病病毒、羊疱疹病毒、猪疱疹病毒、伪狂犬病病毒、鸟副黏病毒、牛呼吸道合胞体病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒、犬细小病毒、牛副流感病毒3、羊副流感病毒3、牛疫病毒、边界病病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、I型BVDV、II型BVDV、古典猪瘟病毒(Classicalswine fever virus)、鸟白血病病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、牛结核病病毒、猪感染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒(FeLV)、新城疫病毒(Newcastle Diseasevirus)、羊进行性肺炎病毒、羊肺腺癌病毒、犬冠状病毒(CCV)、泛嗜性CCV(pantropicCCV)、犬呼吸道冠状病毒、牛冠状病毒、猫杯状病毒、猫肠冠状病毒、猫感染性腹膜炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪凝血性脑骨髓炎病毒、猪细小病毒、I型猪环病毒(PCV)、II型PCV、猪生殖及呼吸综合征(PRRS)病毒、传染性胃肠炎病毒、火鸡冠状病毒、牛流行热病毒、狂犬病轮状病毒、水泡性口炎病毒、慢病毒、鸟流感病毒、鼻病毒、马流感病毒、猪流感病毒、犬流感病毒、猫流感病毒、人流感病毒、东方马脑炎病毒(EEE)、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗河病毒、西方马脑炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头状瘤病毒、水痘带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、鼻病毒和麻疹病毒，及其组合。
肽抗原的例子包括支气管败血性薄德特氏菌p68、GnRH、IgE肽、Fel d1和癌症抗原，及其组合。其它抗原例子包括核苷酸、碳水化合物、脂质、糖脂、肽、脂肪酸和磷壁酸和肽聚糖，及其组合。
一些可作为抗原与佐剂组合物一起使用的寄生虫例子包括，但不限于无形体属、肝片吸虫、球虫、艾美球虫属、犬新孢子虫、刚地弓形虫、贾第虫、恶丝虫、钩口线虫、锥虫属、利什曼原虫属、毛滴虫属、小球隐孢子虫、巴贝西虫、血吸虫、绦虫、类圆线虫、蛔虫、毛线虫、肉孢子虫、哈蒙德虫和等孢子球虫，及其组合试者。本领域中预期佐剂的组合将显示出较个别组分更强的反应原性。然而，当与其中使用任何一种或二种组分的组合物相比较时，本文所述的组合物显示出降低的反应原性，同时仍保持佐剂的效果。还令人惊讶地发现，当与其它佐剂组合物相比较时，本文所述的佐剂组合物显示出安全性改善。
本文所述的佐剂组合物可用于在受试者内产生所需的免疫应答。其在多种物种中均有效。任何需要施用佐剂组合物的动物均为合适的受试者。其包括哺乳动物及非哺乳动物，包括灵长类、家畜、伴侣动物、实验室试验动物、圈养野生动物、鸟类(包括卵)、爬行动物及鱼。因此，该术语包括，但不限于：猴子、人、猪；牛、绵羊、山羊、马、小鼠、大鼠、荷兰猪、仓鼠、兔子、猫、犬、鸡、火鸡、鸭、其它禽类、青蛙和蜥蜴。
如本文所述“受试者”是指任何需要施用佐剂组合物的动物。其包括哺乳动物和非哺乳动物，包括灵长类、家畜、伴侣动物、实验室试验动物、圈养的野生动物、鸟(包括卵)、爬行动物和鱼。因此，该术语包括，但不限于猴子、人、猪；牛、绵羊、山羊、马、小鼠、大鼠、荷兰猪、仓鼠、兔子、猫、犬、鸡、火鸡、鸭、其它禽类、青蛙和蜥蜴。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的制备疫苗组合物的方法中，所述w/o/w佐剂组合物占所述疫苗组合物的比例为40％w/w-60％w/w。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的制备疫苗组合物的方法中，所述抗原为灭活抗原或亚单位抗原。
本发明的疫苗组合物的制备方法，可以有效制备灭活疫苗、病毒颗粒样抗原疫苗，以及亚单位疫苗。在此粒径范围内，不因上述抗原的具体成分而影响疫苗的状态和稳定，且均能保证其中的抗原成分快速产生免疫效力。
产生的疫苗能快速达到免疫效果，有别于现有技术，本发明提供的佐剂与疫苗合用后能快速产生抗体，且疫苗在使用时无不良反应的佐剂。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的制备疫苗组合物的方法中，所述抗原为猪细小病毒VP2蛋白抗原、口蹄疫病毒颗粒样抗原、或猪伪狂犬gB和gD抗原。
本发明还涉及所述制备方法制备的疫苗组合物。
本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括上述的w/o/w佐剂组合物和抗原。
本发明的上述疫苗组合物可以采用本领域常规制备方法制备，制备的疫苗状态稳定，能快速产生免疫效力。
作为本发明的另外一个方面，本发明提供一种疫苗组合物，其特征在于，其包含上述佐剂组合物、抗原。
上述“疫苗组合物”的含有佐剂的比例疫苗组合物总量的比例为为40％w/w-60％w/w。
如本文所述，“约”或“大约”是指所指示的变量值及所有在所指示数值的实验误差内(如：平均值的95％置信区间内)或所指示数值的10％内(无论那一个数值较大)的变量值，除非“约”被用于表示以周计的间隔，其中“约3周”为17至25天，而约2至约4周为10至40天。
如本文所述，“抗体”是指可因为对抗原的免疫应答而与特异抗原结合的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有“恒定”及“可变”区的“轻”及“重”多肽链所组成的血清蛋白质，且根据该恒定区的组成而区分为数类(如：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。
如本文所述“TCID50”是指“组织培养感染剂量”且定义为感染50％指定批次的经接种的细胞培养物时所需要的病毒稀释量。可使用多种方法来计算TCID50，包括本说明书全文中所使用的斯皮尔曼-卡伯法(Spearman-Karber method)。斯皮尔曼-卡伯法的描述见B.W.Mahy&H.O.Kangro，Virology Methods Manual，p.25-46(1996)。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但本发明不局限于下述例举。
下列实施例中所使用的金银花等饮片为购自河南千方药业有限公司的饮片，它们经检验符合《中华人民共和国兽药典》2015年版项下的规定，其它试验材料为本领域技术人员的常规试验选择。
实施例1、佐剂组合物的制备
蔗糖酯L195(日本三菱Ryoto)4.0g、AEO-5 4.0g、矿物油92g
制备方法：将蔗糖酯L195、AEO-5和矿物油混合均匀，加热至30℃。
实施例2、疫苗组合物
圆环病毒抗原溶液50g(灭活前病毒含量为107.2TCID50)、实施例1制备的佐剂组合物50g，先分别加热至31℃，然后在水浴锅中，开启搅拌，转速为350转，将圆环病毒抗原溶液加入到佐剂组合物中，搅拌乳化时间为10分钟，搅拌完毕。放至20℃。然后进行粒径测定和稳定性试验。粒径测定采用马尔文3000激光粒度仪，搅拌使用IKAR W20搅拌。
实施例3佐剂组合物的制备
按照表1配比，使用实施例1方法制备佐剂组合物。
表1佐剂组合物的制备
按照表2列出的制备方法制备对比佐剂1～3。
表2对比佐剂的制备
| 对比佐剂1 | CN106511995A实施例1制备 |
| 对比佐剂2 | CN 106267184A实施例2制备 |
| 对比佐剂3 | CN103223164A实施2制备 |
实施例4疫苗组合物的制备和理化评价
1、疫苗组合物的制备
取实施例3制备的佐剂组合物，按照实施例2方法制备疫苗组合物
2、疫苗组合物的理化评价
2.1、黏度检测：用运动黏度仪检测疫苗的黏度。
2.2、乳液类型检测：滴一到两滴乳液在水的表面，进行观察：
如果乳液立即分散，则为连续水相乳液(O/W)。如果经抹刀搅拌后乳液才分散，并有白色的小滴浮在表面，则为多相乳液(W/O/W)。如果经抹刀搅拌，乳液扩散并浮在表面，水相依然清澈，则为连续油相乳液(W/O)。
2.3、稳定性观察：
a：佐剂组合物放置在4℃观察，每5天观察一次，观察15天，看有无沉淀
b：每组疫苗各取15ml置25ml玻璃瓶中，每组分2瓶，分别放置4℃、25℃、每天观察是否有分层或破乳，没有分层和破乳记录为无变化4℃详细记录观察情况观察6个月，25℃观察15天。
2.4、粒径。用马尔文3000激光粒度仪测定20℃时疫苗组合物的粒径。
上述检测结果见表3。
表3疫苗组合物和佐剂组合物的理化评价
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表3中试验结果表明：对比例1、对比例2、对比例3制备的佐剂制备的疫苗组合物虽然剂型合格，但粒径较大且不稳定，而本发明技术方案制备的样品粒径和稳定性均合格，另外还意外发现，本发明加入水后佐剂本身的冷稳定性有较大提高。
实施例5本发明的佐剂组合物在猪伪狂犬疫苗中的应用
1.疫苗的配制
按照表4的组分和含量，在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中加入用杆状病毒表达的猪伪狂犬gB和gD抗原的混合物(gB和gD等摩尔比)，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲定容至体积，按照抗原与佐剂组合物重量比1:1进行配比，乳化是将抗原相和佐剂相分别加热至31℃，搅拌转速为300转，将抗原相加入到佐剂相中，搅拌10分钟。
表4组合物的配制表
| 组别 | 猪伪狂犬抗原 | 佐剂 |
| A(疫苗A) | 100微克/头份 | 实施例1制备的佐剂组合物 |
| B(疫苗B) | 100微克/头份 | 实施例3试验例1制备的佐剂组合物 |
| C(疫苗C) | 100微克/头份 | 实施例3试验例2制备的佐剂组合物 |
| D(疫苗D) | 100微克/头份 | 实施例3试验例7制备的佐剂组合物 |
| 对比疫苗 | 100微克/头份 | 206佐剂(法国SEPPIC公司产品) |
2、中和抗体检测：将21日龄PRV抗体阴性仔猪30头随机分成6组，5头/组，注射上述伪狂犬疫苗2ml/头以及实施例7制备，疫苗免疫后，每周参照GB/T18641-2002方法血清中和试验的方法测定灭活疫苗组的中和抗体效价，测定的中和抗体效价见表5。
表5猪伪狂犬灭活疫苗免疫仔猪后不同时间的抗体情况
抗体检测结果表明：本发明的佐剂配制的疫苗，能更快的产生抗体，一周即比对照疫苗产生更高的抗体，几乎相当于对比疫苗的2倍，而且抗体达到的最高值也更高，说明本发明提供的佐剂组合物由更好的免疫效果。而且加入免疫增强剂的组效果更好。
3、疫苗不良反应观察
按照表4配制的疫苗，进行田间试验，观察疫苗的不良反应，每组注射500头仔猪，结果显示：对比疫苗组，接种24小时有8头出现了位出现红、肿、热、痛等炎症反应。个别伴有体温升高、恶心、呕吐等全身反应，而其他组中仅疫苗B组出现1头猪有炎症反应，没有全身反应。说明本发明的佐剂组合物不产生不良反应。
实施例6本发明的佐剂组合物在猪细小病毒疫苗中的应用
1.疫苗的配制
按照表6的组分和含量，在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中加入用杆状病毒表达的猪细小病毒VP2抗原的混合物，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲定容至体积，按照抗原与佐剂组合物重量比1:1进行配比，乳化是将抗原相和佐剂相分别加热至31℃，搅拌转速为300转，将抗原相加入到佐相中，搅拌10分钟。
表6组合物的配制表
效价实验用体重300-350g豚鼠25只，分别编号后，全部采血，分离血清，检测豚鼠血清抗体效价均不高于1：4时，进行疫苗的免疫评价。每组疫苗免疫10只豚鼠，腿部肌肉注射0.5ml/只(两侧大腿各注射0.25ml)豚鼠在免后35天采血，分离血清，将血清分成3份，保存于-20℃。一份用于HI抗体检测，两份留存备用，检测结果见表7。
表7猪细小病毒不同时间的抗体情况
表7中抗体检测结果表明：本发明的佐剂配制的疫苗，能更快的产生抗体，一周即比对照疫苗产生更高的抗体，几乎相当于对比疫苗的2倍，说明本发明提供的佐剂组合物有更好的免疫效果。
实施例7口蹄疫抗原的检测
抗口蹄疫的疫苗组合物的免疫原性比较试验
1.疫苗的配制
按照表8的组分和含量，在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中加入用杆状病毒表达的口蹄疫病毒颗粒样抗原(O型)的混合物，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲定容至体积，按照抗原与佐剂组合物重量比1:1进行配比，乳化是将抗原相和佐剂相分别加热至31℃，搅拌转速为300转，将抗原相加入到佐剂相中，搅拌10分钟。
表8组合物的配制表
| 组别 | 口蹄疫抗原 | 佐剂 |
| 甲(疫苗甲) | 50微克/头份 | 实施例1制备的佐剂组合物 |
| 乙(疫苗乙) | 50微克/头份 | 实施例3试验例7制备的佐剂组合物 |
| 对比疫苗 | 50微克/头份 | 206佐剂(法国SEPPIC公司产品) |
1.免疫程序
利用口蹄疫O型抗体ELISA检测试剂盒、抗体均为阴性的6月龄的健康黄牛20头，随机分为4组，每组5头注射表8的口蹄疫疫苗，另外5组作为阴性组。疫苗免疫前每头牛采血，免疫后每周采血，连续采血至免疫后21日。
2.抗体水平检测
对采集的血清分别使用口蹄疫O型抗体ELISA检测试剂盒和口蹄疫A型抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有牛只的抗体均为阴性，免疫后7天不同疫苗免疫的牛只抗体水平均开始上升，免疫后21天均能达到1：128以上。PBS对照组牛只抗体为阴性，无变化。详细抗体检测情况见表9，表明本发明疫苗组合物能产生更高的抗体水平。
表9不同疫苗免疫牛只后O型口蹄疫ELISA抗体水平
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表9中口蹄疫抗体检测结果表明：本发明的佐剂配制的疫苗，能更快的产生抗体，一周即比对照疫苗产生更高的抗体，几乎相当于对比疫苗的2倍，说明本发明提供的佐剂组合物有更好的免疫效果。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (8)
1.一种w/o/w佐剂组合物，其中，所述w/o/w佐剂组合物包括重量百分比为1% W/V -8.0%W/V的HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯、3%W/V -7%W/V的脂肪醇聚氧乙烯醚，余量为矿物油；
所述蔗糖脂肪酸酯为日本三菱Ryoto蔗糖酯L195或蔗糖酯s170，所述脂肪醇聚氧乙烯醚为AEO5。
2.根据权利要求1所述的w/o/w佐剂组合物，其中，所述的w/o/w佐剂组合物还包括另一种或多种非离子表面活性剂和/或免疫增强剂。
3.根据权利要求2所述的w/o/w佐剂组合物，其中，所述另一种或多种非离子表面活性剂选自司本-80、司本-85、聚乙二醇单油酸酯、聚乙二醇双油酸酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油、二缩甘露醇单油酸酯；所述免疫增强剂选自生育酚、DDA、左旋咪唑、皂树皮皂苷、聚肌胞、分支杆菌培养物的一种或者几种组合。
4.根据权利要求1所述的w/o/w佐剂组合物，其中，矿物油为兽用注射用白油。
5.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物通过如下方法制备：将抗原与权利要求1~4任一项所述的w/o/w佐剂组合物分别加热至25℃-37℃，然后在搅拌状态下，将所述抗原加到所述w/o/w佐剂组合物中。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述w/o/w佐剂组合物占所述疫苗组合物的比例为40%w/w-60% w/w。
7.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述抗原为灭活抗原或亚单位抗原。
8.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述抗原为猪细小病毒VP2蛋白抗原、口蹄疫病毒颗粒样抗原、猪伪狂犬gB和gD抗原。
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