CN1555271A

CN1555271A - 白细胞介素-12作为兽医疫苗佐剂

Info

Publication number: CN1555271A
Application number: CNA028181964A
Authority: CN
Inventors: H-J; H·-J·楚
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2001-09-17
Filing date: 2002-09-13
Publication date: 2004-12-15
Also published as: WO2003024354A3; HUP0500238A3; JP2005520786A; NZ531526A; US20080003201A1; MXPA04002490A; EP1427349A2; CA2457563A1; EP1427349A4; PL374123A1; KR20040044942A; YU24004A; WO2003024354A2; HUP0500238A2; US20030129161A1; HRP20040282A2; BR0212556A

Abstract

本发明公开了提高兽医疫苗免疫原性的组合物，它包括药理学有效量的免疫调节剂和免疫佐剂。另外，本发明公开了一种疫苗组合物，它包括免疫有效量的抗原、免疫调节剂、免疫佐剂和药物上可接受的载体。该组合物可任选地含有常规的次级佐剂或防腐剂。本发明进一步公开了通过给鸟或哺乳动物物种施用药理学有效量的权利要求1的所述免疫原性提高组合物或免疫有效量的所述疫苗组合物，提高或促进弱的、免疫抑制或临界安全抗原的免疫原性的独特方法。

Description

白细胞介素-12作为兽医疫苗佐剂

相关领域的说明

在本说明书中引用的所有专利和出版物在此全文引入作为参考。

已确立了许多致虚弱或致死疾病的病因学。例如，牛呼吸道合胞病毒(此后称为“BRSV”)被认为是在牛的呼吸道疾病综合征中的重要因素。该疾病在牛中的特征在于快速的呼吸、咳嗽、食欲的丧失、眼睛和鼻子的排出物以及体温升高。在急性爆发时，在症状出现后48小时内可发生死亡。认为在小牛中，BRSV是在地方性动物肺炎中最普通的病毒病原体，且在新近断奶的小牛当中，还与肺气肿有关。

大型动物的另一疾病，腺疫，是由马链球菌(Streptococcus equi.)的细菌感染引起的。还被称为瘟热或谷仓热的腺疫是马的上呼吸道的高度传染性疾病，其特征在于存在局部和播散性脓肿。

已知各种致病剂引起小动物的疾病。例如，发现狗的疾病与犬埃里希体(Ehrlichia canis)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPI)、II型犬腺病毒(CAV-2)、犬腺病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)、出血性黄疸钩端螺旋体(LI)、犬钩端螺旋体(LC)、流感伤寒钩端螺旋体(LG)、波摩那钩端螺旋体(LP)等的存在有关。类似地，猫的疾病尤其由可传播的病毒如猫免疫缺陷病毒和猫白血病病毒，细菌如猫鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)等引起。

在动物内对有效预防产生高度传染性、致虚弱和致死疾病的这些类型的致病剂具有真正的需要。然而，兽医疫苗的缺点常常是由于某些致病剂的弱抗原活性或由于从一个动物物种到另一个动物物种的生物变化导致的不良免疫应答。在动物内获得合适的体液免疫应答的任何尝试中，降低的生理功效也是有问题的。难以实现生产充足含量的血清抗体(它反映通过同时的细胞-介导的免疫对疾病的真实防御)。此外，必须通过预先排除致使敏感抗原灭活的重要测试来解决含各添加剂或添加剂的组合的抗原物质的物理和化学相容性。来自窄的安全限的令人讨厌的副作用或潜在的毒性对开发有用的兽医免疫程序提供又一侵袭。建立保护免疫不是一件简单的事情。因此，研究集中在寻找一种可靠、无毒的佐剂，它与抗原相容，且能改进动物疫苗的免疫原性和效力，而没有牵涉增加的毒性。

已检验过许多免疫佐剂，和许多具有有希望的能力来提高对具有弱免疫原性缺点的各种抗原的细胞-介导和体液免疫应答(参见在R.Rabinovich，“Vaccine Technologies：View to theFuture”，Science 265：1401-1404(1994年9月2日)和F.Audibert，“Adjuvants：current status，clinical perspectives and futureprospects”，Immunology Today 14(6)：281-284(1993))。在白喉、破伤风和肝炎B疫苗中发现的明矾(硫酸铝钾)刺激体液免疫应答，但不刺激细胞-介导的免疫。结果，该盐不是对所有的免疫原有效。铝盐同样具有的缺点是使自身或疫苗不适合于冻干或冷冻。由于铝盐的局限，研究已转向许多可供替代的免疫佐剂，如皂甙、非离子嵌段共聚物表面活性剂、单磷酰脂质A、胞壁酰二肽(角鲨烯油)或三肽和细胞因子。然而，合适的免疫佐剂体系的选择不是容易的事情，并且要求大量的实验以发现在特定的动物物种内，体系是否提高对不同免疫原的细胞-介导和体液免疫应答。在发现免疫佐剂体系是否将在动物内所需地起作用时，维持免疫原的稳定性和效力是能影响选择方法的其它重要因子。

白细胞介素-1(IL-1)是被发现可用作佐剂的第一个细胞因子，它通过增加白细胞介素-2(IL-2)的产量，由细胞-介导的免疫放大对牛血清白蛋白的次级抗体应答。以前的研究已表明，重组牛IL-1β可用作对病毒感染的牛免疫应答的免疫调节剂(参见Reddy等，“Adjuvanicity of recombinant bovine interleukin-1β：influence on immunity，infection and latency in bovineherpes virus-1 infection”，Lymphokine Res.9：295-300(1990))。在这些研究中，小牛的r-BOIL-1β处理增加抗牛胞疹病毒-1(BHV-1)、牛病毒腹泻(BVD)和副流感-3(PI-3)病毒的抗体产量，提高对病毒感染的MDBK细胞的细胞毒性应答，在侵袭之后降低BHV-1的病毒脱落，且在地塞米松注射之后具有BHV-1的降低复发。这些报道暗示当以水溶液形式皮下给药时，重组牛白细胞介素-1β可增强抗原的活性。

已进行临床试验评估细胞因子如干扰素α(IFN-α)和干扰素γ(IFN-γ)在无应答的受实验者内改进乙型肝炎疫苗的免疫原性的能力。

在免疫学中的随后研究检测到其它细胞因子如白细胞介素-12的重要性和活性(参见，例如，Y.-W.Tang等，“Interleukin-12Treatment during Immunization Elicits a T Helper Cell Type1-like Immune Response in Mice Challenged with RespiratorySyncytial Virus and Improves Vaccine Immunogenicity”，J.Infectious Diseases 172：734-738(1995)；S.Morris等，“Effectsof IL-12 on in Vivo Cytokine Gene Expression and Ig IsotypeSelection”，J.Immunology，pp.1047-1056(1994)；J.Orange等，“Effects of IL-12 on the Response and Susceptibility toExperimental Viral Infections”，J.Immunology，pp.1253-1264(1994)；G.Trinchieri，“Interleukin-12 and its role in thegeneration of T_H1 cells”，Immunology Today，14(7)：335-338(1993)；R.Gazzinelli等，“Interleukin-12 is required forthe T-lymphocyte-independent induction of interferon γ by anintracellular parasite and induces resistance in T-cell-deficient hosts”)，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 90：6115-6119(1993年7月)；R.Locksley，“Commentary：Interleukin-12 in hostdefense against microbialpathogens，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5879-5880(July 1993)；B.Graham et al.，″Priming Immunization Determines T Helper Cytokine mRNA Expression Patterns inLungs of Mice Challenged with Respiratory Syncytial Virus，″J.Immunology 151：2032-2040(August 15，1993)；J.Sypek et al.，″Resolution of Cutaneous Leishmaniasis：Interleukin 12 Initiates a Protective T Helper Type 1 Immune Response，″J.Exp.Med.177：1797-1802(June 1993)；F.Heinzel et al.，″Recombinant Interleukin 12 Cures MiceInfected with Leishmania major，″J.Exp.Med.. 177：1505-1509(May 1993)；C.Tripp etal.，″Interleukin 12 and tumor necrosis factor α are costimulators of interferon γproduction by natural killer cells in severe combined immunodeficiency mice withlisteriosis，and interleukin 10 is a physiologic antagonist，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：3725-3729(April 1993)；R.Manetti et al.，″Natural Killer Cell Stimulatory Factor(Interleukin 12 [IL-12])Induces T Helper Type 1(Th1)-specific Immune Responses andInhibits the Development of I1-4-producing Th Cells，″J.Exp.Med. 177：1199-1204(April1993)；C.-S.Hsieh et al.，″Development of T_H1 CD4⁺ T Cells Through IL-12 Produced byListeria-Induced Macrophages，″Science 260：547-548(April 23，1993)；P.Scott，″IL-12：Initiation Cytokine for Cell-Mediated Immunity，″Science 260：496-497(April 23，1993)；M.Gately et al.，″Regulation of Human Cytolytic Lymphocyte Responses by Interleukin12，″Cellular Immunology 143：127-142(1992)；A.D′Andrea et al.，″Production ofNatural Killer Cell Stimulatory Factor(Interleukin 12)by Peripheral Blood MononuclearCells，″J.Exp.Med.. 176：1387-1398(November 1992)；B.Naume et al.，″A comparativestudy of IL-12(Cytotoxic Lymphocyte Maturation Factor)-，IL-2-，and IL-7-inducedeffects on Immunomagnetically purified CD56 NK cells，″J.Immunology 148：2429-2436(April 15，1992)；S.Chan et al.，″Induction of Interferon γ Production by Natural KillerCell Stimulatory Factor：Characterization of the Responder Cells and Synergy with OtherInducers，″J.Exp.Med. 173：869-879(April 1991)；and M.Kobayashi et al.，″Identification and Purification of Natural Killer Cell Stimulatory Factor(NKSF)，aCytokine with Multiple Biologic Effects on Human Lymphocytes，″J.Exp.Med. 170：827-845(September 1989)).

已证明在BALB/c小鼠中，白细胞介素-12(其后称为“IL-12”)在诱导抗利什曼病的细胞-介导的免疫中的佐剂活性(L.Afonso等，“TheAdjuvant Effect of Interleukin-12 in a Vaccine AgainstLeishmania major”，Science 263：235-237(1994年1月14日))。抗硕大利什曼原虫的保护作用基于IL-12诱导形成利什曼病-特异的CD4⁺T_H1(T辅助细胞)细胞的能力。美国专利No.5571515(Scott等)和有关分案申请、美国专利Nos.5723127和5976539公开了通过提高对含原生动物寄生虫的抗原的细胞-介导的免疫应答，使用IL-12作为抗利什曼病的佐剂。基于在利什曼病模型中使用IL-12作为佐剂和使用癌症疫苗的说明，美国专利No.5723127涉及选择的抗原和IL-12的抗原组合物，和增加该组合物诱导宿主的细胞-介导的免疫应答对抗选择抗原的能力的方法。美国专利No.5976539提出一种抗原和IL-12的组合物及其使用方法，所述抗原选自癌细胞和用选择的抗原转染的癌细胞。在这一系列中进一步有关的继续申请美国专利No.6168923B1(Scott等)要求保护包括抗原和IL-12的组合物，所述抗原由致病微生物组成，IL-12诱导接种的宿主的抗微生物的细胞-介导的免疫应答，和施用IL-12以增加免疫原组合物诱导接种的宿主的细胞-介导的免疫应答的能力的方法。

美国专利No.5665347(Metzger等)揭示除了T_H1(T辅助细胞)细胞的活化之外，IL-12还抑制B1细胞活性的功能活性，但不抑制B2细胞，和具有IL-12受体的B1细胞。专利权人暗示IL-12可在B1细胞紊乱，如慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤和传染性单核细胞增多症的治疗中发现用途。

美国专利No.5817637(Weiner等)涉及药物免疫试剂盒，它在两个独立的接种物内使用遗传材料作为免疫剂。第三种接种物含有可与其它应答增强剂如转染、复制或炎性试剂，例如植物凝血素、生长因子、细胞因子(如α-干扰素、γ-干扰素、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等)和淋巴因子组合的布比卡因。

美国专利No.5985264(Metzger等)涉及在新生宿主内提高对病原体的免疫应答的方法，该方法包括施用IL-12和抗原，以诱导如成年人一样对保护性应答的记忆。新生宿主是哺乳动物，例如人、鼠、猫、犬、牛或猪，并且包括胎儿以及新生儿到出生后约2岁。抗原被描述为细菌(例如肺炎球菌，脑膜炎奈瑟氏菌，流感嗜血菌)、病毒(例如肝炎、麻疹、脊髓灰质炎病毒、人类免疫缺陷、流感、副流感、呼吸道合胞病毒)、寄生虫(例如利什曼原虫、血吸虫)和真菌(例如念珠菌属、曲霉属)。

美国专利No.5744132(Warne等)公开了在IL-12蛋白质、聚山梨醇酯、冷冻保护剂、膨胀剂和缓冲剂的冷冻、液体或冻干配方中，提供IL-12的浓缩制剂的组合物和方法。美国专利No.5853714(Deetz等)提供使用疏水作用的色谱树脂，制造不含污染物如宿主细胞蛋白质和病毒的IL-12，从而纯化IL-12的方法。

除了上述现有技术之外，在该活跃的领域中还存在数篇专利和出版物公开了将含某些抗原的IL-12例如在副粘液病毒疫苗中用作佐剂(美国专利No.6071893，Graham等)，用于提高口服耐受性和治疗自身免疫疾病(WO98/16248)、用于治疗炎症(美国专利No.5674483，Tu等)，在百日咳博德特氏菌疫苗中用作佐剂(WO97/45139)和在含抗原如流感A、HIV、破伤风类毒素等的疫苗中用作共同佐剂(WO98/31384)等。进一步的研究提供了各种动物的细胞因子和生产它们的方法，举几个例子，例如猫IL-12(C.Leutenegger等，“Immunization of Catsagainst Feline Immunodeficiency Virus(FIV)Infection by UsingMinimalistic Immunogenic Defined Gene Expression VectorVaccines Expressing FIV gp140 Alone or with FelineInterleukin-12(IL-12)，IL-16，or a CpG Motif”，J.Virology74(22)：10447-10457(2000年11月)和WO01/04155A2)、鸟IL-15(WO97/14433)、羊IL-5或IL-12(WO97/00321)。

其它研究(包括本发明以上所述的一些出版物)集中在特定的疫苗配方及其制造方法。例如，美国专利No.5242686(Chu等)涉及在抗衣原体感染中有用的猫的疫苗组合物的制备方法。灭活的哺乳动物衣原体细胞或抗原可与免疫学上合适的佐剂和生理上可接收的盐组合。该专利列举了佐剂，例如表面活性剂、聚阴离子、聚阳离子、肽、特夫素、油乳液、免疫调节剂如白细胞介素-1、白细胞介素-2和干扰素、丙烯酸共聚物如乙烯/马来酸酐共聚物、苯乙烯与丙烯酸和甲基丙烯酸或其组合的混合物的共聚物。

美国专利No.5733555(Chu)和它的继续申请美国专利No.5958423涉及疫苗组合物，用于免疫动物，使其抗因牛呼吸道合胞病毒(“BRSV”)引起的感染，所述BRSV含有单独的修饰的活BRSV或与牛鼻气管炎病毒IV、牛病毒性腹泻病毒和副流感3病毒、佐剂和药物上可接受的载体组合。在单次施用之后，组合物通过细胞-介导的免疫、分泌性免疫球蛋白A免疫及其组合来诱导保护性免疫。佐剂可进一步包括表面活性剂，如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。这些专利列举了其它佐剂，如角鲨烷、角鲨烯、嵌段共聚物、皂甙、洗涤剂、Quil A、矿物油、植物油、白细胞介素如白细胞介素-1、白细胞介素-2和白细胞介素-12、肿瘤坏死因子、干扰素、诸如皂甙和氢氧化铝或Quil A和氢氧化铝的组合、脂质体、isom佐剂、合成糖肽如胞壁酰二肽、葡聚糖、羧基聚亚甲基、EMA、丙烯酸共聚物乳液如NeocrylA640或其混合物。

然而，在现有技术中还没有公开或例举当具体地与免疫佐剂共施用时，IL-12或其它免疫调节剂可有效和显著地提高弱的免疫抑制或潜在有毒抗原的免疫原性。

因此，本发明重要的目的是提供高度独特的疫苗，它在哺乳动物和鸟类中拥有显著改进的免疫原性，它由弱或免疫抑制抗原或具有窄的安全范围的抗原，同时结合含本发明的免疫调节剂和免疫佐剂的新型组合组成。

另一目的是提供使用含免疫调节剂和免疫佐剂的组合或含有该组合的疫苗的新方法，以便通过在包括T记忆细胞的细胞-介导的免疫上诱导更强的刺激，来显著改进疫苗的免疫原性，和提供更长的免疫持续时间，从而随着时间要求更小或更低频率的抗原剂量和减少副作用或潜在的毒性。

进一步的目的是在鸟或哺乳动物物种中提供增强、促进或延长抗原的免疫活性的新方法。

随着说明的继续进行，本发明进一步的目的和目标将变得显而易见。

通过提供含免疫调节剂和免疫佐剂的组合，和免疫调节剂与免疫佐剂和病毒、细菌、寄生虫或真菌抗原在其中一起共配制的疫苗，可实现前述目标。与经典的疫苗和本身含细胞因子的其它组合相比，本发明的产品生产高度改进的对抗原的免疫应答。以下将进一步描述本发明的背景和它与现有技术的不同。

发明概述

本发明涉及改进的疫苗配方，它包括免疫有效量的抗原、免疫调节剂和一种或多种免疫佐剂，其中显著提高了疫苗的免疫原性或生理效力。本发明包括含免疫调节剂和免疫佐剂的新型联合组合物，它显著改进接种的宿主对抗原的免疫应答。同样，本发明涉及增强、促进或延长弱的、免疫抑制或边缘安全抗原的免疫原性的新方法，它包括给鸟或哺乳动物物种施用药理学有效量的前述联合组合物或免疫有效量的前述疫苗组合物。

附图简述

无

发明详述

根据本发明，新型疫苗组合物包括免疫有效量的抗原、免疫调节剂、一种或多种免疫佐剂和药物上可接受的载体。令人惊奇地，将免疫调节剂和免疫佐剂掺入到疫苗内显著增强抗原物质的免疫原性和生理效力。免疫调节剂和免疫佐剂的独特组合对于增加许多抗原的生物活性具有有益的应用。

抗原包括药物或兽医领域的普通技术人员公知的各种各样的感染剂。感染剂在本质上例如可以是病毒、细菌或真菌。其它感染剂包括，但不限于寄生虫、肿瘤抗原和其它病理疾病的抗原。在该疫苗组合物中所使用的特定抗原或抗原的组合将取决于待接种的物种和所需的结果。

以各种用量将抗原与免疫调节剂和免疫佐剂一起掺混，抗原的用量范围通常为约0.0001-约1.0重量％。典型的病毒抗原的实例包括，但不限于牛呼吸道合胞病毒、1型单纯疱疹病毒(HSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVD)、副流感-3病毒(PI)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPI)、II型犬腺病毒(CAV-2)、犬腺病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(尤其，但不限于狂犬病疫苗)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猫白血病病毒(FeLV)、猫冠状病毒(猫感染性腹膜炎(FIP)的致病剂)、猪生殖和呼吸综合症(PRRS)病毒、鸡疱疹病毒(Marek病的致病剂)等。典型的细菌抗原包括，但不限于衣原体属、埃里希体属、巴斯德菌属、嗜血菌属、沙门菌属、葡萄球菌属、链球菌属、疏螺旋体属、支原体属(例如猪肺炎支原体的猪病)等。典型的寄生虫抗原包括，但不限于钩端螺旋体属、球虫亚纲、血孢子虫属、阿米巴属、锥虫属、利什曼原虫属、鞭毛虫属、组织滴虫属等。典型的真菌抗原包括，但不限于球孢子菌属、组织胞浆菌属、穿生菌属、曲霉属、隐球菌属等。

免疫调节剂以各种用量存在于本发明改进的疫苗中，范围通常是约0.00001-约0.01重量％。合适的免疫调节剂的实例包括，但不限于细胞因子，如IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等，干扰素如α-干扰素或γ-干扰素、肿瘤坏死因子、转化生长因子、集落刺激因子等，及其组合。所需地，免疫调节剂包括细胞因子。在优选的实施方案中，免疫调节剂是白细胞介素-12，最优选同源动物的白细胞介素-12，如，在犬疫苗中使用犬IL-12；在猫疫苗中使用猫IL-12；在马疫苗中使用马IL-12等等。人类IL-12或鼠IL-12，如重组人类IL-12(商购于Genetics Institute，Inc.，Cambridge，MA)或重组鼠IL-12(商购于许多供应商，例如Research Diagnostics，Inc.，Flanders，NJ和Cambridge Bioscience，Cambridge，英国；同样参见D.Schoenhaut等，“Cloning and Expression of Murine IL-12”，J.Immunology 248(1)：3433-3440(1992年6月1日))可合适地用于各种动物物种，但在一些动物疫苗中，免疫增强效果可能不如同源动物IL-12的大。

一种或多种免疫佐剂以各种用量存在于本发明改进的疫苗中，范围通常是约0.05-约50重量％。合适的免疫佐剂的实例包括，但不限于植物或动物来源的可代谢油如角鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四烷六烯)，或优选角鲨烷(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四烷)；嵌段共聚物，例如聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，如Pluronic(商购于BASFCorporation，Mount Olive，NJ)；皂甙如Quil A(Quilaja saponaria的纯化形式的商品名，获自Iscotec AB，Sweden and SuperfosBiosector a/s，Vedbaek，Denmark)；乙烯/马来酸酐共聚物如EMA-31(具有约等量乙烯和马来酸酐、估计平均分子量为约75000-100000的线性乙烯/马来酸酐共聚物，商购于MonsantoCo.，Louis，MO)；丙烯酸共聚物；丙烯酸共聚物乳液如Neocryl(与苯乙烯混合的丙烯酸和甲基丙烯酸的未聚结的丙烯酸共聚物，商购于Polyvinyl Chemicals，Inc.，Wilmington，MA)；矿物油乳液如MVP(轻质矿物油的水包油乳液，商购于Modern VeterinaryProducts，Omaha，NE)或其混合物。

本发明优选的聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物包括各种用量的聚氧丙烯和聚氧乙烯。所需地，该嵌段共聚物包括用量为所有分子的约10-20％的聚氧乙烯和平均分子量为约3250-4000的聚氧丙烯。

本发明的乙烯/马来酸酐共聚物典型地是具有下述性能的水溶性、白色、自由-流动的粉末：真实密度为约1.54g/ml，软化点为约170℃，熔点为约235℃，分解温度为约274℃，容积密度为约201bs/ft³和pH为约2.3(1％溶液)。

本发明优选的丙烯酸共聚物乳液是NeocrylA640，它包括含水丙烯酸共聚物，它的pH为7.5、粘度为100eps(Brookfield，25℃)、每加仑的重量为8.6磅，以含40重量％固体、38体积％固体和48的酸值供应。具体地，NeocrylA640是与苯乙烯混合的丙烯酸和甲基丙烯酸的未聚结含水丙烯酸共聚物的胶乳乳液。其它有用的产品包括，但不限于NeocrylA520和A625等。

免疫调节剂和免疫佐剂的优选组合包括同源动物IL-12、角鲨烷和聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物的混合物；同源动物IL-12和皂甙的混合物；以及在有或无矿物油乳液情况下同源动物IL-12/EMA-31和NeocrylA640的混合物。重组人类或鼠IL-12可被同源动物IL-12取代，但可诱导部分免疫加强效果。在那些情况下，可通过常规试验测定效力或潜力，然后可在有需要的患者或动物内合适地滴定活性成分的剂量。

药物上可接受的载体同样以各种用量存在于本发明的疫苗组合物中。无毒、惰性载体的用量当然取决于其它成分所选择的用量、所需的活性抗原物质的浓度、小瓶、注射器或其它常规的载体尺寸的选择等。可在任何方便的时间将载体加入到疫苗内。在冻干疫苗的情况下，载体可例如在给药之前立即加入。或者，可用载体一起制造最终产品。合适的载体的实例包括，但不限于无菌水、盐水、缓冲液、磷酸盐-缓冲的盐水、缓冲的氯化钠、植物油、最小基本培养基(MEM)、含HEPES缓冲液的MEM等。

任选地，组合物可含有各种用量的常规次级佐剂，这取决于佐剂和所需的结果。取决于其它成分和所需的效果，常规用量范围是约0.02-约20重量％，或提供约1微克-约50微克/剂量。合适的次级佐剂的实例包括，但不限于稳定剂、乳化剂、氢氧化铝、磷酸铝、pH调节剂如氢氧化钠、盐酸等、表面活性剂如Tween80(polysorbate 80，商购于Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；脂质体、iscom佐剂、合成糖肽如胞壁酰二肽；膨胀剂如葡聚糖或葡聚糖例如与磷酸铝的组合；羧基聚亚甲基；细菌的细胞壁如分枝菌细胞壁提取物；它们的衍生物如小棒状杆菌、痤疮丙酸杆菌，例如牛Calmede Guern(BCG)；牛痘或动物痘病毒蛋白质；亚病毒颗粒佐剂如环状病毒；霍乱毒素；N，N-双十八烷基-N`，N`-双(2-羟乙基)丙二胺(阿夫立定)；单磷酰脂质A；二甲基双十八烷基溴化铵(DDA，商购于Kodak，Rochester，NY)；合成物及其混合物。所需地，将氢氧化铝与其它次级佐剂或免疫佐剂如QuilA混合。合适的稳定剂的实例包括，但不限于蔗糖、明胶、胨、消化蛋白质的提取物如NZ-Amine或NZ-Amine AS。乳化剂的实例包括，但不限于矿物油、植物油、花生油和可用于注射剂或鼻内疫苗的其它标准的、可代谢的无毒油。

为了本发明的目的，这些佐剂在此处被称为“次级”，仅仅是与在疫苗中作为主要成分的以上所述的免疫佐剂相对照，因为它与免疫调节剂组合的效果将显著增加哺乳动物或鸟对抗原物质的体液免疫应答。次级佐剂主要包括在疫苗配方中作为加工助剂，但一些佐剂确实在一定程度上拥有免疫提高性能且具有双重目的。

视需要，可将常规的防腐剂以范围为约0.0001约0.1重量％的用量添加到疫苗中。取决于在配方中所使用的防腐剂，低于或高于这一范围的用量可以是有用的。典型的防腐剂包括，例如山梨酸钾、偏亚硫酸氢钠、苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞等。

灭活、修饰或其它类的疫苗的选择和本发明改进的疫苗配方的制备方法是本领域的普通技术人员公知或容易确定的。作为灭活疫苗的制备的例举，例如，将免疫调节剂，优选同源动物IL-12与一种或多种抗原、一种或多种免疫佐剂和任选地一种或多种次级佐剂混合。抗原可以是灭活的FIV，FeLV，犬埃里希体，CCV，螺旋体属物种等。作为进一步的例举，在存在或不存在免疫佐剂或次级佐剂的情况下，将免疫调节剂，优选同源动物IL-12与抗原混合，制备修饰的疫苗。在此情况下的抗原可以是BRSV，马链球菌，CPV，CAV-2，CDV，CPI等。然而，应当理解可通过配方领域公知的各种标准技术来制造本发明的疫苗，且不受此处所述的例举限制。

可制备含免疫调节剂和免疫佐剂的组合并以独立的产品施用。在施用弱的免疫抑制或临界安全抗原之前、同时、序贯或就在此之后短时间，可将药理学有效量的这一免疫原性提高组合物例如肠胃外、口服或其它方式施给哺乳动物或鸟，以便增强、促进或延长抗原的免疫原性。典型地，将在接种过程开始之前的24小时内，和优选在接种过程开始之前4小时内或同时，施用免疫原性提高组合物。若接种要求大于1个剂量的抗原物质，则可以以序贯的方式施用免疫原性提高组合物和施用疫苗。尽管不那么有效，但可在疫苗增加对抗抗原的免疫性之后，施给免疫原性提高组合物，但几乎不超过24小时。

当与疫苗分开施给时，组合物可进一步包括药物上可接受的载体和任选地此处所述的次级佐剂。可以以各种用量，典型地以单位剂量容器内的用量存在免疫调节剂和免疫佐剂二者。尽管组合的剂量取决于抗原、物种、接种或待接种的宿主的体重等，但药理学有效量的免疫调节剂的剂量范围为约0.1微克-约100微克/剂，和优选约5微克-约50微克/剂。免疫佐剂的范围典型地为约1微克-约25微克/剂。尽管在组合中特定免疫佐剂的存在和用量将影响改进免疫应答所需要的免疫调节剂的用量，但认为操作者可通过满足特定情况的常规测试容易地调节免疫调节剂的有效剂量用量。

当施用同源动物的IL-12时，可显著地降低在疫苗内免疫调节剂的用量，这是它的功效导致的。对于小动物如狗、猫等来说，在本发明的联合组合物中，典型地使用范围为约0.02微克-约2微克/剂同源动物IL-12，优选使用约0.1微克-约1微克/剂动物IL-12，更优选约0.5微克/剂。对于大的动物如马、牛、猪等来说，典型地使用范围为约0.1微克-约5微克/剂动物IL-12，优选使用约0.5微克-约2.5微克/剂。应当理解，这些给定范围以上和以下的用量可在更小的鸟和非常大的动物中发现它们各自的用途。为了保持生物活性，还推荐就在使用之前，将动物的IL-12加入到疫苗或单位剂型中。

作为非限制性实例，合适的犬疫苗可包括浓度/剂量1×10⁵TCID₅₀的犬埃里希体的Ebony株；浓度/剂为5×E7的布氏疏螺旋体IPS；浓度/剂为5×E8的布氏疏螺旋体B-31；5％v/v的emulsigen SA；1％v/v的EMA-31；3％v/v的NeocrylA640；1∶20000浓度的硫柳汞(5％)；适量1×MEM稀释剂和每剂浓度为约0.5微克每剂量的犬IL-12或浓度为约10微克每剂的人类IL-12。

本发明进一步包括供增强、促进或延长弱的、免疫抑制或临界安全抗原的免疫原性的新方法，该方法包括向鸟或哺乳动物物种施用药理学有效量的免疫原性提高组合物或此处所述的接种或免疫有效量的疫苗配方。增强弱的、免疫抑制或临界安全抗原的免疫原性包括改进抗原的潜能。促进免疫原性是指加速这一动作的开始。延长免疫原性是指延长活性的耐久性。

作为一般规则，可方便地肠胃外(皮下、肌内、静脉内、真皮内或腹膜内)、颊内、鼻内、经皮或口服施用本发明的疫苗。本发明包括的施用路线取决于抗原物质和共-配方剂。例如，若疫苗含有皂甙，当无毒口服或鼻内施用时，必须注意不要将皂甙元糖苷注射到血流内，因为它们具有强的溶血作用。同样，许多抗原若口服的话将不是有效的。优选地，皮下、肌内施用疫苗，或在马链球菌和其它情况下，鼻内施用。

疫苗的剂量将取决于所选择的抗原、施用途径、物种、体重和其它标准因素。认为本领域的普通技术人员会容易且能轻易滴定对抗各抗原的免疫原应答用的合适剂量，以实现免疫有效的用量和施用方法。

有利地，通过在疫苗配方中使用与免疫佐剂联合的抗原和免疫调节剂如细胞因子，优选同源动物的IL-12，改进的疫苗是高度抗原性的、诱导T记忆细胞的刺激比过去可实现的更强。在用本发明的配方接种之后，对抗原物质的血清抗体滴度比在不存在免疫调节剂的相同配方诱导的滴度要高得多。例如，以前的研究表明，在用角鲨烷和聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物为佐剂的BRSV接种之后，在14天时，对BRSV的血清抗体滴度为约1∶125。令人惊奇地，在用与角鲨烷、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物和重组人类IL-12混合的BRSV接种之后，在14天时，对BRSV的血清抗体滴度明显地较高，为约1∶395，在28天之后，仍然显著较高，为约1∶366。显著提高的免疫原性、加速的作用开始和延长的免疫持续时间佐证了增高的血清抗体滴度(即体液免疫应答)和T记忆细胞的更强刺激。这一选择发明的疫苗在效力上的显著改进与现有技术的状态具有根本的区别。

此处所使用的“CFU”代表集落形成单位。BRSV的“感染单位”例如定义为TCID₅₀。“TCID₅₀”或50％组织培养感染剂量定义为感染50％的组织培养物时的剂量。例如，当含抗原的溶液被1∶100稀释时，1个感染单位等于感染50％的组织培养物时的数量。在BRSV情况下，TCID₅₀是要求感染或杀灭50％的组织培养细胞的病毒数量。术语“细胞-介导的免疫”包括T-辅助细胞、T-杀伤细胞和T-延迟过敏细胞的刺激，以及巨噬细胞、单核细胞和其它淋巴因子和干扰素生产的刺激。可通过常规的体内和体外分析测定细胞-介导的免疫的存在。可通过常规的ELISA或IFA分析测定局部免疫如分泌性IgA，这表明血清中和抗体的滴度为1-2或更大。根据本发明诱导的细胞-介导的或局部免疫，对抗原是特异的或直接与抗原有关。术语“哺乳动物”是指人、牛、奶牛、绵羊、鹿、马、猪、山羊、狗、猫等。术语“鸟”是指家禽如鸡或火鸡和其它类型的家养或野生鸟。尽管优选在动物中的兽用，但认为此处所述的免疫原性提高和疫苗组合物可在医疗领域中发现有益用途。

根据下述非限制性实施例，可获得本发明进一步的理解。然而，列出实施例，仅为了阐述本发明的一些方面，和不应当解释为对它的限制。应当理解，实施例不意味着全部限定本发明的范围和条件。应当进一步理解，当已给出典型的反应条件(例如温度、反应时间等)时，也可使用高于和低于所规定范围的条件，但通常不那么方便。下述实验研究使用获自Genetics Institute，Inc.，Cambridge，MA(Wyeth，Madison，NJ的全资子公司)的重组人类IL-12。除非另有说明，在室温(约23℃-约28℃)和大气压下，进行实施例的实验，此处所指的所有份数和百分数以重量为单位，所有温度用℃来表达。

实施例1

佐剂对马疫苗的免疫原性的影响

进行研究，以确定一些佐剂对马链球菌灭活疫苗的免疫原性的影响。为了制备佐剂，使用重组人类IL-12(4.45mg/ml)、皂甙、修饰的活疫苗用稳定剂(SGGK-3，25％v/v)和细菌生长培养基(修饰的ToddHewitt培养液，MTHB)的储存液。制造三种佐剂共混物接近10μg IL-12/剂、50μg IL-12/剂和10μg IL-12+5mg皂甙/剂。

为了制备含约10μg IL-12/剂的佐剂共混物，通过将约0.056mlIL-12加入到约49.719ml的足量水中至总计50ml，来制造再水化稀释剂。然后，通过将约0.056ml IL-12加入到与约37.444ml MTHB混合的约12.5ml SGGK-3(25％v/v)中，制造调节稀释剂。

为了制备含约50μg IL-12/剂的佐剂共混物，通过将约0.281mlIL-12加入到约49.719ml的足量水中至总计50ml，来制造再水化稀释剂。然后，通过将约0.281ml IL-12加入到与约37.219ml MTHB混合的约12.5ml SGGK-3(25％v/v)中，制造调节稀释剂。

为了制备含约10μg IL-12+5mg皂甙/剂的佐剂共混物，通过将约0.056ml IL-12加入到约0.625ml皂甙中，并将该混合物加入到约49.319ml的足量水中至总计50ml，来制造再水化稀释剂。然后，通过将约0.056ml IL-12加入到约0.625ml皂甙中，并将该混合物加入到与约37.819ml MTHB混合的约12.5ml SGGK-3(25％v/v)中，制造调节稀释剂。

为了制备各种疫苗，用约2.5ml再水化稀释剂再水化一小瓶PinnacleI.N.(一种鼻内马腺疫疫苗，商购于Fort Dodge AnimalHealth，Inc.，Wyeth，Madison，NJ的兽医分公司)。对于各组制备10剂疫苗(约20ml疫苗)。在再水化疫苗之后，将约0.467ml再水化疫苗加入到约19.533ml的调节稀释剂中，获得约1×10⁷CFU/剂的数量。

在接种之间的三周内对接受试验疫苗的所有马接种2次。采用与长度约5.5英寸的导管相连的注射器，鼻内施用疫苗。将第一次接种疫苗施用到左鼻孔内，将第二次接种疫苗施用到右鼻孔内。用商购的马链球菌疫苗(含有Havlogen的Stepguard，一种由羧基聚亚甲基制造的佐剂，由Bayer Animal Health，Inc.，(Bayer公司的一个农业分公司)制造)接种对照组内的所有马，并相隔3周接受两次接种疫苗。根据制造商的说明肌内施用商业疫苗。

5匹马没有被接种，相反，在接触侵袭之前，在各鼻孔内用1ml(约5×10⁸CFU/ml)马链球菌CF-32株接种5天。使用带有长度约5.5英寸的导管的注射器接种马。从侵袭之前2天到之后的5天，每天观察这5匹马的临床症状和直肠温度。在侵袭之后，每天收集鼻拭子，监控马链球菌的脱落。第二次接种后21天，将所有接种过的马与5匹直接侵袭的马掺混在一起，从-2天到侵袭之后的0天(DPC)每天观察动物，以确立基线，侵袭之后1-28天观察各种临床症状。在侵袭之后的30、33和36天另外观察动物。

下表1示出了与在研究中使用的其余佐剂相比，佐剂IL-12(约50μg IL-12/剂)和IL-12与皂甙的组合是相对更好的免疫刺激剂，这通过平均临床得分、局部淋巴节脓肿的出现、马链球菌的脱落和播散性脓肿来证明。与接受不含IL-12或IL-12与皂甙的组合的商业疫苗的组相比，在这两组内的马在播散性脓肿的出现方面显示出降低约35％-约40％，在平均临床得分方面降低约23％-约40％。

表1

马链球菌研究的结果

佐剂	每组的总马数	具有局部脓肿的马数	具有播散性脓肿的马数	具有播散性脓肿的马数量的下降％¹	平均临床得分	与Bayer组相比平均临床得分的下降％
佐剂	每组的总马数	具有局部脓肿的马数	具有播散性脓肿的马数	具有播散性脓肿的马数量的下降％¹	平均临床得分	与Bayer组相比平均临床得分的下降％	SP油	5	5	2	20％	65.6	13％
IL-12(10μg)	5	5	1	40％	59.6	14％	SP油	5	5	2	20％	65.6	13％
IL-12(10μg)	5	5	1	40％	59.6	14％	IL-12(50μg)	5	4	1	40％	52.8	23％
IL-12(10μg+皂甙)	4	3	1	35％	47.5	40％	IL-12(50μg)	5	4	1	40％	52.8	23％
IL-12(10μg+皂甙)	4	3	1	35％	47.5	40％	Carbopol	5	5	2	20％	61.8	21％
DDA+DEAE Dex³	4	4	2	10％	65.2	17％	Carbopol	5	5	2	20％	61.8	21％
DDA+DEAE Dex³	4	4	2	10％	65.2	17％	Bayer疫苗	5	5	3	N/A²	78.6	N/A

¹对于各组来说，与Bayer组相比，播散性脓肿和平均临床得分的下降百分数。

²“N/A”意味未获得。

³“DDA”是二甲基双十八烷基溴化铵，“DEAE Dex”是二乙基氨基乙基-葡聚糖。

实施例2

佐剂对牛疫苗的免疫原性的影响

进行研究，以确定一些佐剂对BRSV(牛呼吸道合胞病毒)的修饰的活疫苗的免疫原性的影响。为了制备佐剂，使用SP油佐剂(5％v/v)和重组人类IL-12(约1260μg/ml)的储存液。

通过混合20ml PluronicL121(聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，商购于BASF公司，Mount Olive，NJ)、40ml角鲨烷、3.2mlpolysorbate 80和936.8ml缓冲盐溶液，并均化该混合物，一直到形成稳定的团块或乳液，从而制备SP油。在均化之前，高压灭菌各成分或混合物。通过过滤进一步使乳液灭菌。分别添加甲醛和硫柳汞到0.2％的最终浓度和1∶10000的稀释。

通过将约0.278ml IL-12加入到约69.722ml 5％v/vSP油中，以制造约70ml约5％v/v的SP油+约10μg/剂的IL-12佐剂，从而制造佐剂共混物(它包括约5％v/v的SP油+约10μg IL-12/剂)。

为了制备疫苗，在MDBK细胞(Madin-Darby牛肾细胞；MDBK细胞细胞系来源于正常成年公牛的肾脏)中生长BRSV，并在接种之后6天收集。在每剂约10^5.7TCID₅₀的BRSV滴度下，将疫苗饼与MEM共混，然后冻干。然后，使用以上所述的含佐剂稀释剂的IL-12再水化冻干的疫苗饼，制造最终的疫苗制剂。

采用BRSV疫苗皮下接种约6月龄的9头牛，而留下7头牛作为对照组。通过检测对BRSV的特异抗体来测量血清抗体应答。通过接种后28天，用有毒力的BRSV侵袭接种者和对照组，来证明的疫苗的效力。

用SP油+IL-12作为佐剂的修饰的活BRSV疫苗对BRSV诱导非常高滴度的抗体应答(在接种后28天时，为约1∶366)。在有毒力的BRSV侵袭之后，接种组内与对照组相比疾病的严重性降低(降低约53％)。这表明在该研究内使用的SP油+IL-12佐剂与BRSV修饰的病毒疫苗相容且可显著提高BRSV修饰的病毒疫苗的效力。

下表2示出了用修饰的活BRSV和含IL-12的佐剂接种的牛对BRSV的抗体应答。

表2

对BRSV的抗体应答

组	动物数量	0DPV	14DPV	28DPV/0DPC	7DPC	14DPC
组	动物数量	0DPV	14DPV	28DPV/0DPC	7DPC	14DPC	接种者	9	＜5	625	366	150	2420
对照组	7	＜5	＜5	＜5	＜5	125	接种者	9	＜5	625	366	150	2420

下表3示出了在有毒力的BRSV侵袭之后，用修饰的活BRSV和含IL-12的佐剂接种的牛的疾病的减少。

表3

疾病的减少

组	动物数量	平均总得分	疾病的减少
组	动物数量	平均总得分	疾病的减少	接种者	9	2.7	53％¹
对照组	7	5.7	N/A²	接种者	9	2.7	53％¹

¹疾病的减少是指与对照组相比，在侵袭之后没有显示疾病的牛的百分数。

²“N/A”意味着得不到。

实施例3

佐剂对狗疫苗效力的影响

进行研究，以确定一些佐剂对犬埃里希体单价疫苗，灭活菌苗的免疫原性的影响。为了制备佐剂，使用重组人类IL-12(4.45mg/ml)、EMA-31(1％v/v，具有约等量乙烯和马来酸酐、具有约75000-100000的估计平均分子量的线性乙烯/马来酸酐共聚物，商购于MonsantoCo.，St.Louis，MO)和NeocrylA640(3％v/v，与苯乙烯混合的丙烯酸和甲基丙烯酸的未凝结的含水丙烯酸共聚物的胶乳乳液，pH为7.5，粘度为100eps(Brookfield，25℃)，每加仑的重量为8.6磅，以含40重量％固体、38体积％固体和48的酸值供应，商购于PolyvinylChemicals，Inc.，Wilmington，MA)的储存液。在没有镁和钙、包括缓冲盐水的稀释缓冲液中，制备IL-12的工作溶液。将55μl的IL-12储存液加入到9,955μl的稀释缓冲液中。稀释的IL-12的工作溶液的最终浓度为20μg/ml。

为了制备疫苗，将约1×10⁴或1×10⁵TCID₅₀的犬埃里希体的灭活Ebony株与1％v/v的EMA-31和3％v/v的Neocryl共混。在约1∶20000含量的防腐剂存在下，将2％的硫柳汞加入到疫苗中。在注射之前，将用量为500μl/剂量的稀释的IL-12工作溶液与疫苗混合。如下表4所示，对第4组来说，将疫苗与100μg/剂的牛CalmedeGuern(BCG)菌苗共混。

将35条狗随机分为6组，包括四组接种组和两组对照组。在两种抗原含量下，用犬埃里希体疫苗的单价Ebony株接种受接种组。如下表4所示，第2组用约1×10⁴TCID₅₀的抗原含量接种，其余组用约1×10⁵TCID₅₀的抗原含量接种。第2、3和5组用与每剂10μg的IL-12共混的疫苗接种。第4组用含BCG作为佐剂的疫苗接种。分别在20周龄和23周龄时施给两种剂量的各疫苗。为了证明交叉-保护的可能性，第5和6组用犬埃里希体的Broadford株异源侵袭，其它用犬埃里希体的Ebony株异源侵袭。

如下表4所示，当接种组用犬埃里希体的Ebony株异源侵袭时，第3组5条狗中的2条(40％)和第4组6条狗中的2条(33％)没有血小板减少症。1％的对照组(第1组)和用较低剂量疫苗接种的狗(第2组)直到研究最后还具有严重的血小板减少症。就致死性来说，对照组6条狗中的5条(83％)在观察过程中死之或者被安乐死。用IL-12作为佐剂的较低剂量的疫苗(第2组)接种的狗和用BCG作为佐剂的疫苗(第4组)接种的狗具有33％的死亡率。基于发病率和死亡率数据，IL-12作为佐剂的犬埃里希体疫苗具有显著提高的抗同源犬埃里希体侵袭的保护免疫。

与对照组相比，与EMA-31和Neocryl联合添加IL-12大大地增加犬埃里希体单价疫苗的效力并显著降低致死性。如第2组和3组所示，IL-12组合诱导的保护是抗原剂量-依赖型的。此外，与BCG相比，IL-12组合诱导的佐剂应答在降低接种的狗免于犬埃里希体的致死侵袭方面起重要作用。

下表4示出了用重组人类IL-12作为佐剂的单价犬埃里希体疫苗的预-免疫原性研究结果。

表4

预-免疫原性研究

组的编号	动物数量	治疗	侵袭材料	血小板减少症	死亡率(％)	直肠温度
组的编号	动物数量	治疗	侵袭材料	血小板减少症	死亡率(％)	直肠温度	1	6	对照	Ebony	6/6¹	5/6，83％	6/6²
2	6	10e4 EB/IL12	Ebony	6/6	2/6，33％	6/6	1	6	对照	Ebony	6/6¹	5/6，83％	6/6²
2	6	10e4 EB/IL12	Ebony	6/6	2/6，33％	6/6	3	5	10e5 EB/IL12	Ebony	3/5	0/5，0％	3/5
4	6	10e5 EB/BCG	Ebony	4/6	2/6，33％	6/6	3	5	10e5 EB/IL12	Ebony	3/5	0/5，0％	3/5
4	6	10e5 EB/BCG	Ebony	4/6	2/6，33％	6/6	5	6	10e5 EB/IL12	Broadfoot	2/6	0/6，0％	2/6
6	6	对照	Broadfoot	2/6	0/6，0％	2/6	5	6	10e5 EB/IL12	Broadfoot	2/6	0/6，0％	2/6

¹该比例表示血小板减少的狗/测试的总狗数量。

²该比例表示具有升高的直肠温度的狗/该组内的总狗数量。

实施例4

对狗疫苗的体液免疫应答的评价

进行研究，以确定一些佐剂对修饰的活的和灭活病毒以及犬Duramune10疫苗的灭活菌苗(由冻干的活的、减毒的犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPI)、II型犬腺病毒(CAV-2)、犬腺病毒(CDV)和含犬冠状病毒(CCV)的稀释剂、出血性黄疸钩端螺旋体(LI)、犬钩端螺旋体(LC)、流感伤寒钩端螺旋体(LG)、波摩那钩端螺旋体(LP)、灭活的病毒和菌苗部分组成，商购于Fort Dodge AnimalHealth，Inc.，Yyeth，Madison，NJ的一个兽医分公司)的免疫原性的影响。为了制备佐剂，使用重组人类IL-12(4.45mg/ml)、Duramune10免疫原性疫苗、EMA-31、NeocrylA640和硫柳汞(2％v/v)的储存液。

为了制备试验疫苗，通过分别混合Neocryl和EMA-31到约3％和约1％的最终浓度，来制备起始的佐剂。以约1∶20000的浓度添加硫柳汞作为防腐剂。

为了制备IL-12作为佐剂的稀释液，将Duramune10疫苗的稀释部分与上述起始佐剂以约1∶10的比例首先共混，即1份Duramune10疫苗稀释液和9份含Neocry1和EMA-31的起始佐剂。然后以约10μg或40μg/剂的最终浓度添加重组人类IL-12。

在使用之前，在9份IL-12作为佐剂的稀释剂中再水化1份Duramune10疫苗的冻干部分。因此，在该研究中使用的Duramune10疫苗部分比常规的免疫原性疫苗低约10倍。换句话说，与为商业规模设计的常规疫苗相比，在该研究中使用的疫苗含有不足量的抗原(subpotent)。

总计15条狗随机分为3组，每组5条，并在10周龄和13周龄时皮下接种2次。第一组用含约10μg IL-12的疫苗接种，第二组用含约40μg IL-12的疫苗接种，第三组用不含IL-12但包括1∶10稀释的Duramune10安慰剂接种。

在第一次接种后0天(0DPV1)和在第二次接种后0天(0DPV2)、7、14、21和28DPV2时，抽取狗的血清。通过微凝集试验(MAT)测量对钩端螺旋体的抗体滴度。

下表5-8详述了结果。在LP部分和LG部分观察到主要组和安慰剂组之间的显著区别。对于表5所列的LP部分来说，在0DPV2(用约10μg IL-12接种的组)和21DPV2(相同组)时观察到显著的区别。对于表6所列的LG部分来说，在0DPV2(用约40μg IL-12接种的组)与7、14和21DPV2(10μg和40μg组)时观察到显著的区别。在其它两部分(表7和8)中没有观察到显著的区别。因此，表明，除了EMA-31和Neocryl的混合物之外，IL-12也提高对两种钩端螺旋体，LP和LG的体液免疫应答。

表5

波摩那钩端螺旋体的MAT分析结果

组	0DPV1	0DPV2	7DPV2	14DPV2	21DPV2
组	0DPV1	0DPV2	7DPV2	14DPV2	21DPV2	Duramune10+IL-12(10μg)	≤4	147¹	512	388	256¹
Duramune10+IL-12(40μg)	≤4	128	638	388	194	Duramune10+IL-12(10μg)	≤4	147¹	512	388	256¹
Duramune10+IL-12(40μg)	≤4	128	638	388	194	安慰剂	≤4	74	194	128	49
环境对照组	≤4	≤4	≤4	≤4	≤4	安慰剂	≤4	74	194	128	49

¹与安慰组相比数值是显著的。

表6

流感伤寒钩端螺旋体的MAT分析结果

组	0DPV1	0DPV2	7DPV2	14DPV2	21DPV2
组	0DPV1	0DPV2	7DPV2	14DPV2	21DPV2	Duramune10+IL-12(10μg)	≤4	11	2551²	2353²	1176²
Duramune10+IL-12(40μg)	≤4	37²	2931²	2274²	1084²	Duramune10+IL-12(10μg)	≤4	11	2551²	2353²	1176²
Duramune10+IL-12(40μg)	≤4	37²	2931²	2274²	1084²	安慰剂¹	≤4	6	215	337	215
环境对照组	≤4	≤4	≤4	6	8	安慰剂¹	≤4	6	215	337	215

¹在0DPV1时，1条狗的滴度为1024且没有纳入分析。

²与安慰组相比数值是显著的。

表7

出血性黄疸钩端螺旋体的MAT分析结果

组	0DPV1	0DPV2	7DPV2	14DPV2	21DPV2	28DPV2
组	0DPV1	0DPV2	7DPV2	14DPV2	21DPV2	28DPV2	Duramune10+IL-12(10μg)	≤4	8	49	60	32	24
Duramune10+IL-12(40μg)	≤4	14	105	86	42	32	Duramune10+IL-12(10μg)	≤4	8	49	60	32	24
Duramune10+IL-12(40μg)	≤4	14	105	86	42	32	安慰剂	≤4	5	74	62	28	21
环境对照组	≤4	≤4	≤4	≤4	≤4	≤4	安慰剂	≤4	5	74	62	28	21

表8

犬钩端螺旋体的MAT分析结果

组	0DPV1	0DPV2	7DPV2	14DPV2	21DPV2
组	0DPV1	0DPV2	7DPV2	14DPV2	21DPV2	Duramune10+IL-12(10μg)	≤4	6	256	194	64
Duramune10+IL-12(40μg)	≤4	16	338	278	223	Duramune10+IL-12(10μg)	≤4	6	256	194	64
Duramune10+IL-12(40μg)	≤4	16	338	278	223	安慰剂¹	≤4	5	159	139	49
环境对照组	≤4	≤4	≤4	≤4	≤4	安慰剂¹	≤4	5	159	139	49

¹在0DPV1时，1条狗的滴度为1024且没有纳入分析。

²与安慰组相比数值是显著的。

实施例5佐剂对猫疫苗的免疫原性的影响

为了确定重组人类IL-12是否可提高FIV-FeLV疫苗的免疫原性，在将EMA-31、NeocrylA640和MVP(轻质矿物油的水包油乳液，商购于Modern Veterinary Products，Omaha，NE)加入到疫苗中之后，将IL-12与灭活的猫免疫缺陷病毒(FIV)和猫白血病病毒(FeLV)以5μg/剂共混。施用疫苗的侵袭途径是腹膜内。用FIV-FeLV疫苗两次接种一组8周龄的20只猫，用补加IL-12的相同疫苗两次接种另一组20只年龄-匹配的猫。在接种完成之后3周，用有毒力的FeLV侵袭所有接种组以及9只年龄-匹配的对照。每周监控被侵袭的猫的病毒血症，共15周。为了监控被侵袭的猫的FeLV病毒血症，使用IDEXX FeLV抗原试验试剂盒，每周测试血清样品中FeLV p27抗原的存在。在侵袭暴露之后3-12周的过程中，在三个连续的取样点上检测到FeLV p27时，认为猫持续地感染FeLV。发现所有9只对照猫持续地感染了FeLV。发现接受FIV-FeLV疫苗的20只接种者中5只持续地感染了FeLV，同时发现接受补加IL-12的FIV-FeLV疫苗的20只接种者中只有1只持续地感染了FeLV。该结果表明，可使用与EMA-31、NeocrylA640和MVP组合的IL-12，以提高FeLV疫苗的免疫原性。

在前述内容中，为了阐述，而不是限制目的，已提供本发明特定实施方案的详细说明。应当理解，对基于本发明公开内容的本领域技术人员来说，显而易见的所有其它修改、分支和等价内容打算包括在权利要求所述的本发明范围内。

Claims

1.一种提高兽医疫苗免疫原性的组合物，其特征在于包括药理学有效量的免疫调节剂和免疫佐剂。

2.权利要求1的免疫原性提高组合物，其特征在于免疫调节剂选自细胞因子、干扰素、肿瘤坏死因子、转化生长因子、集落刺激因子及其组合。

3.权利要求2的免疫原性提高组合物，其特征在于免疫调节剂是细胞因子。

4.权利要求3的免疫原性提高组合物，其特征在于免疫调节剂是白细胞介素-12。

5.权利要求4的免疫原性提高组合物，其特征在于免疫调节剂是同源动物、重组的人或重组的鼠白细胞介素-12。

6.权利要求5的免疫原性提高组合物，其特征在于免疫佐剂选自皂甙、以代谢油、嵌段共聚物、乙烯/马来酸酐共聚物、丙烯酸共聚物、丙烯酸共聚物乳液、矿物油乳液及其混合物。

7.权利要求6的免疫原性提高组合物，其特征在于免疫佐剂是皂甙。

8.权利要求6的免疫原性提高组合物，其特征在于可代谢油是角鲨烷或角鲨烯。

9.权利要求8的免疫原性提高组合物，其特征在于可代谢油是角鲨烷。

10.权利要求6的免疫原性提高组合物，其特征在于嵌段共聚物是聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。

11.权利要求6的免疫原性提高组合物，其特征在于乙烯/马来酸酐共聚物是具有约等量乙烯和马来酸酐并且估计平均分子量为约75000-100000的线性乙烯/马来酸酐共聚物。

12.权利要求6的免疫原性提高组合物，其特征在于丙烯酸共聚物是苯乙烯与丙烯酸和甲基丙烯酸的未聚结的含水丙烯酸共聚物的混合物。

13.权利要求12的免疫原性提高组合物，其特征在于混合物是乳化混合物。

14.权利要求6的免疫原性提高组合物，其特征在于矿物油乳液是轻质矿物油的水包油乳液。

15.权利要求6的免疫原性提高组合物，其特征在于免疫佐剂是聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物与角鲨烷的混合物。

16.权利要求6的免疫原性提高组合物，其特征在于免疫佐剂是具有约等量乙烯和马来酸酐并且估计平均分子量为约75000-100000的线性乙烯/马来酸酐共聚物和丙烯酸共聚物乳液的混合物，其中所述丙烯酸共聚物乳液包括苯乙烯与丙烯酸和甲基丙烯酸的未聚结的含水丙烯酸共聚物的乳化混合物。

17.权利要求6的免疫原性提高组合物，其特征在于免疫佐剂是具有约等量乙烯和马来酸酐并且估计平均分子量为约75000-100000的线性乙烯/马来酸酐共聚物、丙烯酸共聚物乳液和矿物油乳液的混合物，其中所述丙烯酸共聚物乳液包括苯乙烯与丙烯酸和甲基丙烯酸的未聚结的含水丙烯酸共聚物的乳化混合物。

18.一种改进的兽医疫苗组合物，其特征在于包括免疫有效量的抗原、免疫调节剂、免疫佐剂和药物上可接受的载体。

19.权利要求18的疫苗组合物，其特征在于免疫调节剂选自细胞因子、干扰素、肿瘤坏死因子、转化生长因子、集落刺激因子及其组合。

20.权利要求19的疫苗组合物，其特征在于免疫调节剂是细胞因子。

21.权利要求20的疫苗组合物，其特征在于免疫调节剂是白细胞介素-12。

22.权利要求21的疫苗组合物，其特征在于免疫调节剂是同源动物、重组的人或重组的鼠白细胞介素-12。

23.权利要求22的疫苗组合物，其特征在于免疫佐剂选自皂甙、可代谢油、嵌段共聚物、乙烯/马来酸酐共聚物、丙烯酸共聚物、丙烯酸共聚物乳液、矿物油乳液及其混合物。

24.权利要求23的疫苗组合物，其特征在于免疫佐剂是皂甙。

25.权利要求23的疫苗组合物，其特征在于可代谢油是角鲨烷或角鲨烯。

26.权利要求25的疫苗组合物，其特征在于可代谢油是角鲨烷。

27.权利要求23的疫苗组合物，其特征在于嵌段共聚物是聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。

28.权利要求23的疫苗组合物，其特征在于乙烯/马来酸酐共聚物是具有约等量乙烯和马来酸酐并且估计平均分子量为约75000-100000的线性乙烯/马来酸酐共聚物。

29.权利要求23的疫苗组合物，其特征在于丙烯酸共聚物是苯乙烯与丙烯酸和甲基丙烯酸的未聚结的含水丙烯酸共聚物的混合物。

30.权利要求29的疫苗组合物，其特征在于混合物是乳化混合物。

31.权利要求23的疫苗组合物，其特征在于矿物油乳液是轻质矿物油的水包油乳液。

32.权利要求27的疫苗组合物，其特征在于免疫佐剂是聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物与可代谢油的混合物。

33.权利要求32的疫苗组合物，其特征在于可代谢油是角鲨烷。

34.权利要求23的疫苗组合物，其特征在于免疫佐剂是乙烯/马来酸酐共聚物和丙烯酸共聚物乳液的混合物。

35.权利要求34的疫苗组合物，其特征在于免疫佐剂进一步包括矿物油乳液。

36.权利要求23的疫苗组合物，其特征在于抗原选自牛呼吸道合胞病毒、1型单纯疱疹病毒、牛病毒性腹泻病毒、副流感-3病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、II型犬腺病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒、猫冠状病毒、猪生殖和呼吸道综合征(PRRS)病毒、鸡疱疹病毒、衣原体属、埃里希体属、巴斯德菌属、嗜血菌属、沙门菌属、葡萄球菌属、链球菌属、疏螺旋体属、支原体属、螺旋体属、球虫亚纲、血孢子虫属、阿米巴目、锥虫属、利什曼原虫属、鞭毛虫属、组织滴虫属、球孢子菌属、组织胞浆菌属、穿生菌属、曲霉属、隐球菌属及其组合。

37.权利要求36的疫苗组合物，其特征在于抗原是马链球菌并且免疫佐剂是皂甙。

38.权利要求36的疫苗组合物，其特征在于抗原是牛呼吸道合胞病毒并且免疫佐剂是嵌段共聚物与可代谢油的混合物。

39.权利要求36的疫苗组合物，其特征在于抗原是犬埃里希体并且免疫佐剂是乙烯/马来酸酐共聚物与丙烯酸共聚物乳液的混合物。

40.权利要求36的疫苗组合物，其特征在于抗原是犬细小病毒、犬副流感病毒、II型犬腺病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、出血性黄疸钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体，免疫佐剂是乙烯/马来酸酐共聚物与丙烯酸共聚物乳液的混合物。

41.权利要求36的疫苗组合物，其特征在于抗原是猫免疫缺陷病毒和猫白血病病毒的组合，并且免疫佐剂是乙烯/马来酸酐共聚物、丙烯酸共聚物乳液和矿物油乳液的混合物。

42.权利要求18的疫苗组合物，其特征在于进一步包括防腐剂。

43.权利要求18的疫苗组合物，其特征在于进一步包括次级佐剂。

44.权利要求43的疫苗组合物，其特征在于次级佐剂选自稳定剂、乳化剂、氢氧化铝、磷酸铝、pH调节剂、表面活性剂、脂质体、iscom佐剂、合成糖肽、膨胀剂、羧基聚亚甲基、细菌细胞壁、细菌细胞壁的衍生物、动物痘病毒蛋白质、亚病毒颗粒佐剂、霍乱毒素、N，N-双十八烷基-N｀，N｀-双(2-羟乙基)丙二胺、单磷酰脂质A、二甲基双十八烷基溴化铵及其混合物。

45.一种增强、促进或延长弱的、免疫抑制或临界安全抗原的免疫原性的方法，其特征在于在弱的、免疫抑制或临界安全抗原的施用之前、同时、序贯或之后，给鸟或哺乳动物物种施用药理学有效量的权利要求1的免疫原性提高组合物。

46.一种增强、促进或延长弱的、免疫抑制或临界安全抗原的免疫原性的方法，其特征在于给鸟或哺乳动物物种施用免疫有效量的权利要求18的疫苗组合物。

47.权利要求45或46的方法，其特征在于皮下、肌内、真皮内、腹膜内、鼻内、颊内、经皮或口服施用免疫原性提高或疫苗组合物。

48.权利要求45或46的方法，其特征在于施用免疫原性提高或疫苗组合物，所述组合物含有选自细胞因子、干扰素、肿瘤坏死因子、转化生长因子、集落刺激因子及其组合的免疫调节剂。

49.权利要求48的方法，其特征在于施用免疫原性提高或疫苗组合物，所述组合物含有包括同源动物、重组的人或重组的鼠白细胞介素-12的细胞因子。

50.权利要求49的方法，其特征在于施用免疫原性提高或疫苗组合物，所述组合物含有选自皂甙、可代谢油、嵌段共聚物、乙烯/马来酸酐共聚物、丙烯酸共聚物、丙烯酸共聚物乳液、矿物油乳液及其混合物的免疫佐剂。

51.权利要求50的方法，其特征在于施用免疫原性提高或疫苗组合物，所述组合物含有选自牛呼吸道合胞病毒、1型单纯疱疹病毒、牛病毒性腹泻病毒、副流感-3病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、II型犬腺病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒、猫冠状病毒、猪生殖和呼吸道综合征(PRRS)病毒、鸡疱疹病毒、衣原体属、埃里希体属、巴斯德菌属、嗜血菌属、沙门菌属、葡萄球菌属、链球菌属、疏螺旋体属、支原体属、螺旋体属、球虫亚纲、血孢子虫属、阿米巴目、锥虫属、利什曼原虫属、鞭毛虫属、组织滴虫属、球孢子菌属、组织胞浆菌属、穿生菌属、曲霉属、隐球菌属及其组合的抗原。