CN103028114A - 一种核酸疫苗、核酸疫苗免疫佐剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因核酸疫苗pcDNA-ORF5的免疫佐剂，包含真核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4。细胞因子IL-2和IL-4构建的真核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4合用作为猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸疫苗的免疫佐剂具有明显明显增强其免疫效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸疫苗免疫佐剂，即真核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4对PRRSV核酸疫苗pcDNA-ORF5的免疫作用具有显著增强作用，可以作为该核酸疫苗的免疫佐剂。
背景技术
目前对于PRRS的防控，免疫预防仍是主要措施。虽然不同毒株的弱毒疫苗和灭活疫苗相继上市，但灭活疫苗免疫效果的不稳定性，弱毒疫苗在存在着毒力返强及散毒的风险，因此开发安全有效的新型疫苗成了研究的重点。目前研究表明，核酸疫苗免疫后可使外源基因在动物体内表达，刺激机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫，尤其是能诱导产生细胞毒T 细胞，对病毒、胞内寄生的细菌和寄生虫引起的传染病具有预防和治疗作用，且对不同血清型的毒株具有交叉保护性，因此核酸疫苗被誉为第三次疫苗革命。根据大量的关于PRRSV基因的研究，结果显示，PRRSV的ORF5基因是研制基因工程疫苗的首选材料，用含编码ORF5的质粒对猪进行免疫，可使猪产生抗ORF5的特异性中和抗体，且免于强毒攻击造成的全身性病毒血症和肺部病变。虽然核酸疫苗在试验研究中显示出了较好效果，但是其免疫效果还不太理想，而使用免疫佐剂是提高核酸疫苗免疫效果的一种重要手段，目前常用的免疫佐剂主要有细胞因子佐剂、协同刺激分子佐剂和CpG DNA 序列佐剂，其中细胞因子是研究比较广泛的核酸疫苗佐剂，现已证实IL-1、IL-2、IL-4、和IL-18的白细胞介素具有良好的佐剂作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种核酸疫苗免疫佐剂，即真核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4，这种核酸疫苗免疫佐剂对PRRSV核酸疫苗pcDNA-ORF5的免疫作用具有显著增强作用，可以作为该核酸疫苗的免疫佐剂。
本发明的技术方案：
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因核酸疫苗pcDNA-ORF5的免疫佐剂，包含真核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4。
所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因核酸疫苗pcDNA-ORF5的免疫佐剂的制备方法：
（1）根据GenBank登录的猪IL-2基因mRNA序列和IL-4基因mRNA序列分别设计1 对克隆IL-2和IL-4全基因引物，并在引物的5′端分别设计BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶位点，扩增长度分别为542bp和427bp；
（2）采集健康长白猪前腔静脉血外周血，进行淋巴细胞的分离与培养，提取总RNA，进行RT-PCR扩增IL-2和IL-4基因并对目的基因进行回收纯化，目的基因与PMD19-T载体进行连接得到重组质粒，重组质粒转化、菌落PCR，重组质粒的抽提、酶切鉴定、DNA序列测定和分析，得到阳性质粒pMD19-T-IL-2 和pMD19-T-IL-4；
（3）获取真核表达载体pcDNA3.1(+)，然后对pMD19-T-IL-2 、pMD19-T-IL-4和真核表达载体pcDNA3.1(+)进行双酶切、连接、转化、酶切鉴定和测序，最后构建经测序正确的真核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4。
所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因核酸疫苗pcDNA-ORF5的制备方法，
（1）根据GenBank上发表的PRRSV Guizhou-1 ORF5基因序列，设计一对扩增ORF5基因的特异性引物，并分别在引物的5′端设计BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶位点；扩增长度603bp；
（2）将猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株病毒悬液接种于Marc-145细胞单层细胞，待出现细胞病变时收获细胞，然后提取总RNA，进行RT-PCR扩增ORF基因，并对目的基因进行回收纯化，构建克隆载体pMD19-T-ORF5、酶切鉴定和测序；
（3）获取真核表达载体pcDNA3.1(+)，然后对pMD19-T-ORF5和真核表达载体pcDNA3.1(+)进行双酶切、连接、转化、酶切鉴定和测序，最后构建经测序正确的真核表达质粒pcDNA-ORF5。
所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因核酸疫苗pcDNA-ORF5的免疫佐剂的制备方法中的引物序列如下：IL-2上游引物（F）：5′- CGGGATCCC TCACAGTAACCTCAACTCCT -3′、IL-2下游引物（R）：5′-CGGAATTCGCCTGATACATTTAACATG AGAG-3′；IL-4上游引物（F）：5′- CGGGATCCTTCATGGGTCTCACCTC -3′、IL-4下游引物（R）：5′- CGGAATTCTCAGCTTCAACAC TTTGA -3′。
所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因核酸疫苗pcDNA-ORF5的制备方法中的引物序列如下：ORF5上游引物（F）：5′- CGGGATCCATGTTGGGGAAGTGCT-3′、ORF5下游引物（R）:5′- CGGAATTCCTAGAGACGACCCCATT-3′。
本发明的有益效果：IL-4是由抗原或有丝分裂原诱导Th2 细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生，是Th2 细胞受刺激后产生的主要细胞因子。IL-4具有重要的免疫功能，如能增强B细胞对T细胞的抗原提呈作用，增加B细胞与T细胞的相互作用，调节B细胞的生长分化及其对抗原刺激的应答，包括增殖和分泌抗体，参与抗体类别转换，诱导抗体从IgM向IgE、IgI或IgGl转换，以及IgG向IgE转换。IL-4可以促进50%的休止T 细胞进行分裂，使Th0细胞向Th2 细胞分化，是Th2 细胞分泌的自我调节生长因子，它还能增强巨噬细胞的抗原递呈能力及对肿瘤细胞的细胞毒作用。
猪IL-2分子佐剂促进细胞免疫应答的效果比猪IL-4分子佐剂好，这可能是由于Thl型白细胞介素(IL-2)主要参与细胞介导免疫应答，Th2型白细胞介素(IL-4)通常参与B细胞活化并调节抗体的产生，主要调节机体体液免疫应答，IL-4能抑制T细胞表达IL-2受体。试验结果显示用纯化蛋白加免疫佐剂可以提高仔猪的抗体阳性率，质粒免疫和纯化蛋白免疫与猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（NVDC-JXA1株）免疫的的仔猪抗体的阳性率相同，证明了GP5蛋白具有良好的免疫效果，核酸疫苗和亚单位疫苗具有很大的研究潜力。也说明细胞因子IL-2和IL-4构建的真核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4合用作为猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸疫苗的免疫佐剂具有明显明显增强其免疫效果。
具体实施例
为了验证本发明的效果进行了如下实验：
1 材料与方法
1.1 病毒、细胞、细菌和实验动物
PRRSV病毒贵州分离株（PRRSV Guizhou-1株）由贵州大学动物生物技术中心实验室分离鉴定保存；Marc-145细胞，由中国兽药监察所宁宜宝研究员赠送，本实验室传代保存；Top10感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞，购自TaKaRa公司；6～8周龄Balb/c小白鼠，购自贵阳医学院；长白猪（经ELISA检测PRRS抗体阴性），购自贵州大学种猪场。
1.2主要试剂
克隆载体pMD19-T vector、T4 DNA Ligase、限制性内切酶BamH I和EcoRⅠ、RNase Inhibitor、dNTPs、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker、5×RT Buffer、Taq DNA聚合酶等，购自宝生物（大连）工程有限公司；TRIzol LS?? Reagent、SuperscriptTM Ⅲ Reverse Transcriptase，购自Invitrogen公司；Gel Extraction Kit(50×)试剂盒和E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒，购自OMEGA公司；pcDNA3.1(+)真核表达载体，本实验室保存；猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（NVDC-JXA1株），购自中牧生物药业有限公司；猪高免血清由贵州省疫病研究室制备；LSI猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒；购自北京祥龙环宇生物技术有限公司；Rat Anti-Mouse CD3-SPRD， Rat Anti-Mouse CD4/L3T4-FITC，Rat Anti-Mouse CD8a/Ly-2-PE，Mouse Anti-Porcine CD3-SPRD，Mouse Anti-Porcine CD8a-PE，Mouse Anti-Porcine CD4a-FITC，购于SBA；引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。
1.3引物设计
根据GenBank登录的猪IL-2基因mRNA序列(登录号X58428) 、IL-4基因mRNA序列(登录号NM-214123.1)和PRRSV Guizhou-1 ORF5基因序列（登录号EU259060），应用DNAStar软件，设计了3对引物，用于扩增IL-2、IL-4和PRRSV ORF5目的基因，并在上下游引物的5′端分别设计BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶位点，引物的序列（见表1）。
1.4病毒核酸的抽提
取本实验室保存的PRRSV病料的肝、脾、肺、淋巴结、扁桃体、脑等组织样品共约100 mg，加入500 PBS缓冲液，待检样品研磨后－20℃反复冻融3次12000 r/min离心取上清用于病毒核酸的提取。用Trizol法提取总RNA，操作步骤按Invitrogen公司的TRIzol LS Reagent试剂盒操作说明进行。将提取RNA于-70℃保存备用。
1.5扩增
采用两步法进行RT-PCR扩增，首先进行RT反应，然后再进行PCR反应，其步骤及反应体系如下：
RT反应体系：
将以上试剂充分混匀，PCR仪中进行反转录，反应条件为：42 ℃ 1 h。
PCR反应体系：
反应条件为：94 ℃变性90 sec，94 ℃ 30 sec，58 ℃ 30 sec，72 ℃ 90sec，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min，反应结束。制备1%的1×TAE琼脂糖凝胶，取5
PCR产物与1 
6×loading buffer混合，100 V、30～50 min电泳观察结果，并在凝胶成像系统中成像、分析鉴定。
1.6目的基因ORF5的回收纯化
将RT-PCR扩增的目的DNA 产物余下的45
电泳后，参照OMEGA公司Gel Extract Kit小量胶回收试剂盒操作说明书进行目的基因的胶回收。
1.7目的基因ORF5与pMD19-T载体的连接
根据pMD19－T 载体试剂盒说明，按以下列反应体系将 PCR 扩增产物与载体进行连接：
将以上试剂加入PCR管中，混匀，16 ℃，12～16 h，于PCR仪中进行。
重组质粒的转化
具体步骤如下：
（1）从-80 ℃超低温冰箱中取出Top10感受态细胞，冰上溶解10 min。
（2）取连接产物10与100的感受态细胞轻轻混匀（用枪头轻轻搅拌几下）后，冰浴30 min。
（3）取出后在42 ℃水浴90 sec。
（4）取出后迅速放入冰浴中，静置5 min。
（5）向管内加入800
的37 ℃预热SOC培养液。
（6）37 ℃振荡培养1 h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。
（7）6000 rpm，室温离心12 min，弃去800μL上清，管底残留的100
液体，用剩余液体悬浮细菌沉淀。
（8）在琼脂平板上均匀涂布8μL IPTG(20 mg/mL)和40μL X-gal(20 mg/mL)，将菌液滴于2×YT含Amp（50μg/mL）的固体培养基上，然后用推子将菌液涂布均匀后，置37 ℃温箱培养正面放置5～10 min，待完全吸收后倒置培养皿培养12～16 h后，观察蓝白菌落的出现。
菌落PCR
从上述的平板中（蓝白挑选的）用牙签挑取10个白色菌落接种于含Amp的2×YT琼脂平皿，牙签的另一部分菌落就放入加有12
含有TE（即洗脱缓冲液EB溶液，室温保存）和proteinasek（母液为500μLTE+2.5proteinase k（50 mg/mL））的Eppendorf管中（实为250 mL TE+1.25 mL proteinase k）。琼脂培养菌落培养6 h，然后放于4 ℃冰箱保存。菌液的溶液在PCR反应仪中55 ℃，15 min后，再80 ℃，15 min，0 ℃冰浴1 min。10 000 rpm离心1 min，取1 mLDNA加入下列9μL的体系中进行PCR反应。然后将10μLPCR产物全部电泳检测。
反应体系为：
反应条件为：94 ℃变性90 sec，94 ℃ 30 sec，58 ℃ 30 sec，72 ℃ 90 sec，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min，反应结束，并在凝胶成像系统中成像、分析鉴定，并判定阳性菌落。
重组质粒的抽提
挑取菌落PCR鉴定为阳性的菌落于2×YT液体培养基中振荡培养过夜，用E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit试剂盒提取重组菌的质粒DNA。
重组质粒的酶切鉴定
采用限制性内切酶BamHI与EcoRI对重组质粒进行双酶切鉴定，酶切体系如下：
将上述反应体系试剂混匀后，置于37 ℃水浴中酶切3 h，酶切产物电泳后观察结果。
重组质粒的DNA序列测定和分析
将上述酶切鉴定正确的菌液送Invitrogen公司进行测序鉴定，并将阳性质粒命名为pMD19-T-ORF5。
基因真核表达载体的构建
2.1 真核表达载体的获取
挑取含pcDNA3.1(+)质粒的菌液接种于含Amp（50μg/mL）的2×YT琼脂培养基中37 ℃培养过夜（预培养）。用灭菌牙签从琼脂培养皿中挑取单个菌落于含Amp（50μg /mL）的5 mL 2×YT液体培养基中培养过夜，用E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit试剂盒提取重组菌的质粒DNA，于-20 ℃保存备用。
2.2目的DNA与真核表达载体的双酶切
采用限制性内切酶BamHⅠ/EcoRI对测序正确的pMD19-T-ORF5阳性重组质粒和真表达载体pcDNA3.1(+)进行双酶切，双酶切体系如下：
酶切产物经1%的新鲜配制的琼脂糖凝胶进行电泳后，回收目的DNA片段，具体步骤见1.6。
2.3目的DNA与载体的连接
分别对酶切后的目的DNA片段与pcDNA3.1(+)进行回收，将纯化的ORF5目的DNA片段与pcDNA3.1(+) (+)线型片段，加入T4 DNA Ligase进行连接反应，其连接反应体系如下：
将上述反应体系试剂混匀后，于16 ℃连接过夜，将其连接质粒命名为pcDNA -ORF5。
2.4转化
连接产物转化Top10感受态细胞，具体步聚参照1.8。
2.5重组质粒的酶切鉴定
挑取菌落PCR鉴定为阳性的菌落于Amp（50μg/mL）的2×YT液体培养基中振荡培养，用E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit试剂盒提取重组菌的质粒DNA，用BamH 
/ EcoR I对重组质粒进行双酶切鉴定，酶切体系如下：
将上述试剂充分混匀后，于37 ℃水浴中酶切3 h，酶切产物电泳后观察结果。
2.6序列测定
将酶切鉴定为阳性的重组质粒菌液送Invitrogen公司进行序列测定。
3长白猪IL-2和IL-4基因克隆及真核表达载体的构建
3.1
用含3.8%的柠檬酸钠抗凝管无菌采取健康长白猪前腔静脉血10 mL，然后加入等量D-hank′s液稀释；取稀释的外周血缓慢加入到等量的淋巴细胞分离液中， 2 000 rpm室温离心20 min；吸取雾状层，加入D-hank′s液洗涤，2 000 rpm离心洗涤3次，弃上清液；沉淀细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液悬浮，加入ConA，使其终浓度为10μg/mL，5% CO2、37 ℃培养24 h。
总RNA的提取
收取培养24h的淋巴细胞，用Trizol法提取总RNA，操作步骤按Invitrogen公司的TRIzol LS
Reagent试剂盒操作说明进行。提取的RNA直接用于对IL-2和IL-4基因的RT-PCR扩增。
扩增
首先进行RT反应，同时做2管下列反应体系，一管用于合成IL-2的cDNA，另一管用于合成IL-4的cDNA，分别加IL-2（R）和IL-4（R）后将反应试剂轻轻混匀，进行RT反应。然后再进行PCR反应。
RT反应体系为：
反应条件为：42 ℃ 1 h。
PCR反应体系为：
同时做2管上述PCR反应体系，分别加IL-2( F)和IL-2( R)，IL-4 (F)和IL-4 (R)将以上试剂充分混匀，IL-2的反应条件为：94 ℃变性90 sec，再94 ℃ 30 sec，53 ℃ 30 sec，72 ℃ 90 sec，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min，反应结束。IL-4的反应条件为：94 ℃变性90 sec，再94 ℃ 30 sec，59 ℃ 30 sec，72 ℃ 90 sec，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min，反应结束。制备1%的TAE琼脂糖凝胶，取5μL PCR产物与1μL 6×loading buffer混合，100 V、30～50 min电泳观察结果，并在凝胶成像系统中成像、分析。
目的基因的回收纯化
目的基因经RT-PCR扩增，电泳鉴定正确后，参照Gel Extract Kit小量胶回收试剂盒操作说明书进行IL-2和IL-4目的基因的胶回收。
目的基因与pMD19-T载体的连接
根据pMD19-T 载体试剂盒说明，以下列反应体系将 IL-2和IL-4的PCR 扩增产物与载体进行连接，反应体系为：
将以上试剂充加入PCR管中，混匀，16 ℃，12～16 h，于PCR仪中进行。
重组质粒的转化
将2个重组质粒转化入感受态细胞Top10，具体步骤同1.8。
菌落PCR
在蓝白斑筛选后进行菌落PCR，进一步筛选白色阳性菌株，菌落PCR的方法步骤同1.9。
反应体系为：
IL-2反应条件为：94 ℃变性90 sec，再94 ℃ 30 sec，53 ℃ 30 sec，72 ℃ 90 sec，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min，反应结束。
IL-4反应条件为：94 ℃变性90 sec，再94 ℃ 30 sec，59 ℃ 30 sec，72 ℃ 90 sec，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min，反应结束。电泳检测结果。
重组质粒的抽提
挑取菌落PCR鉴定为阳性的菌落于含Amp（50μg /mL）的2×YT液体培养基中振荡培养，用E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit试剂盒提取重组菌的质粒DNA。
重组质粒的酶切鉴定
采用限制性内切酶BamHI与EcoRI对2个重组质粒进行双酶切鉴定，酶切体系如下：
将上述试剂充分混匀后，于37 ℃水浴中酶切3 h，酶切产物电泳后观察结果。
重组质粒的DNA序列测定和分析
将上述酶切鉴定正确的菌液送Invitrogen公司进行测序鉴定，并将阳性质粒命名为pMD19-T-IL-2和pMD19-T-IL-4。
和pcDNA-IL-4真核表达载体的构建
4.1 真核表达载体的获取
挑取甘油保存含pcDNA3.1(+)的质粒菌液接种到含Amp（50μg /mL）的2×YT琼脂培养基中37 ℃培养过夜（预培养）。用灭菌牙签从琼脂培养皿中挑取单个菌落于5 mL 2×YT（含Amp）液体培养基中过夜培养，用E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit试剂盒提取重组菌的质粒DNA，于-20 ℃保存备用。
4.2目的基因与真核表达载体的双酶切
采用限制性内切酶BamHⅠ/EcoRI对测序正确的pMD19-T-IL-2和pMD19-T-IL-4阳性重组质粒和真表达载体pcDNA3.1(+)分别进行双酶切，双酶切体系如下：
酶切产物经1%的新鲜配制的琼脂糖凝胶和1×TAE进行电泳后，回收目的片段，具体步骤同1.6。
4.3目的基因与载体的连接
将酶切后的目的片段与pcDNA3.1(+)回收后，加入T4 DNA Ligase进行连接反应，反应体系如下：
将上述试剂充分混匀后，于16 ℃连接过夜。
4.4转化
连接产物转化Top10感受态细胞，具体步聚参照1.8。
4.5重组质粒的酶切鉴定
挑取菌落PCR鉴定为阳性的菌落于含Amp（50μg /mL）的2×YT液体培养基中振荡培养，用E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit试剂盒提取重组菌的质粒DNA后，再用BamH I / EcoR I对重组质粒进行双酶切鉴定，酶切体系如下：
将上述试剂充分混匀后，于37 ℃水浴中酶切3 h，酶切产物电泳后观察结果。
4.6序列测定
将酶切鉴定为阳性的重组菌液送Invitrogen公司进行序列测定。
4.7构建的上述三种真核表达质粒在Marc-145细胞中的表达
采用脂质体转染法分别将pcDNA3.1(+)、pcDNA-ORF5、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4转染至Marc-145细胞，分别在转染后24 h、48 h和72 h用间接免疫荧光染色检测真核表达质粒pcDNA-ORF5的表达情况，同时48h抽提pcDNA3.1(+)、pcDNA-ORF5、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4 转染细胞的总RNA，做RT-PCR检测真核表达质粒的表达情况。脂质体转染按照
2000 reagent说明书进行。
4.8 SDS-PAGE和免疫印迹
转染48h后，弃去培养液，用PBS洗涤2次，加入细胞裂解液，煮沸10min，进行 SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色染色，同时用半干式转印仪进行 Western blot免疫印迹。用PBS洗印记膜3次（每次15分钟），并用脱脂乳进行封闭。取出洗涤后的转印膜，使用PBS溶液洗涤3次，每次15min。将洗涤好的转印膜装入新转印袋中，加入按一定比例稀释(1:1000)的一抗PRRSV阳性猪高免血清，然后37℃孵育1h后，取出转印膜，使用PBS溶液洗涤3次，每次15 min，再装入新转印袋中，加入按一定比例稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG，室温震荡孵育2～3 h；将膜取出洗涤3次后，将膜置于显色盒中，使用北京中杉金桥生物技术有限公司的DAB显色试剂盒对转印膜显色。
5 pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4作为pcDNA-ORF核酸疫苗佐剂效果的研究
参考《分子克隆实验指南》大量制备质粒DNA的方法，进行 pcDNA-ORF5、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4重组质粒的大量制备，并应用聚乙二醇沉淀法进行纯化，所得质粒100倍稀释后测OD260，计算质粒DNA的浓度。 然后进行动物实验，如下：
5.1 小鼠的分组及免疫程序 选取60只6～8周龄Balb/c小白鼠，随机分成6组，每组10只，按照表2的免疫方法和免疫程序进行免疫。第一次免疫后14 d进行第二次免疫，第二次免疫后7 d采血。
5.2免疫小白鼠血清IgG抗体检测 小鼠末次免疫后7 d，每组随机挑选5只小鼠采血分离血清，应用LSI猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒检测血清中是否有特异性IgG抗体。
5.3免疫小白鼠血常规和T淋巴细胞亚群的检测 小鼠末次免疫后7d，每组随机挑选5只小鼠采集抗凝血，进行T 淋巴细胞亚群检测。裂解血液中的红细胞，以荧光素标记的抗小鼠CD3+、CD4+、CD8+单克隆抗体，利用流式细胞技术进行T淋巴细胞亚群的检测，所得数据用SPSS13.0软件和Microsoft Excel 2000进行统计学处理。
5.4仔猪的分组及免疫程序 选取21头抗体检测为阴性的1月龄仔猪，随机分成7组，每组3头，按照表3的免疫方法和免疫程序进行免疫。第一次免疫后14d进行第二次免疫，第二次免疫后7 d采血。
5.5免疫仔猪血清IgG抗体检测 仔猪末次免疫后7 d，采血分离血清，应用LSI猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒检测血清中是否有特异性IgG抗体。
5.6免疫仔猪血常规和T淋巴细胞亚群的检测 仔猪末次免疫后7 d，采集抗凝血，进行血常规检测和T 淋巴细胞亚群检测。裂解血液中的红细胞，以荧光素标记的抗猪CD3+、CD4+、CD8+单克隆抗体，利用流式细胞技术进行T淋巴细胞亚群的检测。
6结果
6.1 PCR产物的鉴定
PRRSV ORF5、IL-2和IL-4的PCR扩增片段经胶回收，送大连宝生物工程有限公司测序，结果表明，扩增片段分别为PRRSV ORF5、IL-2和IL-4的特异性条带。
6.2 pcDNA-ORF5真核表达载体的构建
将酶切后的ORF5目的基因与同样酶双切后带有反向互补的粘性末端的真核表达载体pcDNA3.1(+)，在T4连接酶的作用下进行连接，构建成重组表达质粒pcDNA3.1(+)-ORF5，经转化Top 10。挑取菌落PCR鉴定为阳性的菌株1、2、3接种于5 mL含有2×YT液体培养基（含Amp 50 μg/mL）中，37 ℃180 rpm振荡培养过夜，使用E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit试剂盒提取重组菌的质粒DNA，选择菌株1、2、3进行BamHⅠ/ EcoRⅠ双酶切鉴定，电泳检测得到一大一小两个条带，其大小分别约为603bp和5400bp，表明酶切结果与预期相符，初步证明所克隆的目的基因成功插入pcDNA3.1(+)载体。
将符合酶切鉴定要求的重组质粒pcDNA-ORF5 送Invitrogen公司进行测序，测序结果序列与pMD19-T-ORF5的测序结果相同，表明PRRS病毒（PRRSV Guizhou-1株）ORF5基因的真核表达载体pcDNA-ORF5构建成功。
6.3 pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4基因真核表达载体的构建结果
将酶切后的目的基因与同样酶双切后带有反向互补的粘性末端的真核表达载体pcDNA3.1(+)，在T4连接酶的作用下进行连接，构建成重组表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4，经转化Top 10。将重组质粒pcDNA-IL-2转化菌进行菌落PCR鉴定，菌株除6、8均得到了与目的基因大小一致的片段，选择3、5、7、9号菌株扩增抽提质粒双酶切鉴定，初步证明所克隆的目的基因成功插入pcDNA3.1(+)载体。将重组质粒pcDNA3.1(+)-IL-4转化菌进行菌落PCR鉴定，菌株除10均得到了与目的基因大小一致的片段，选择1、2、6、7号菌株扩增抽提质粒双酶切鉴定，初步证明所克隆的目的基因成功插入pcDNA3.1(+)载体。
将符合酶切鉴定要求的重组质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4 送Invitrogen公司进行测序鉴定，测序结果序列与pMD19-T-IL-2和pMD19-T-IL-4的测序结果相同，表明猪IL-2和IL-4基因的核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-2和pcDNA3.1(+)-IL-4构建成功。
6.4真核表达质粒在Marc-145细胞中的表达
采用脂质体转染法分别将pcDNA3.1(+)、pcDNA-ORF5、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4转染至Marc-145细胞，分别在转染后24 h、48 h和72 h用间接免疫荧光染色检测真核表达质粒pcDNA-ORF5的表达情况，结果在24 h即可检测到特异荧光，随着表达时间的延长表达产物的量增多。
在pcDNA3.1(+)、pcDNA-ORF5、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4转染至Marc-145细胞后48 h，收集细胞抽提总RNA，进行RT-PCR，电泳检测RT-PCR产物，电泳结果显示扩增出目的条带，且pcDNA3.1(+)转染细胞的RT-PCR结果均为阴性，证实了真核表达质粒在Marc-145细胞中得到表达。
6.5 SDS-PAGE和免疫印迹
将表达的重组蛋白转移至NC膜上，与PRRS阳性猪高免血清反应后，以HRP标记的羊抗猪为二抗进行Western-Blotting鉴定。
在约42.9 KD处出现一条明显的特异性反应条带，表明表达的重组蛋白在纯化复性后可以被PRRS阳性血清所识别，具有良好的免疫学活性。
6.6免疫小白鼠血清IgG抗体检测结果
小鼠末次免疫后7 d，应用LSI猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒检测免疫后小鼠的血清中是否有特异性IgG抗体。结果见表4。
从表4中的检测结果可以看出，第一组小鼠注射质粒pcDNA3.1(+)后未产生相应抗体，而第二组注射真核表达质粒pcDNA-ORF5小鼠中，5只小鼠有80%的血清抗体呈阳性，第三组注射真核表达质粒pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-2，小鼠血清抗体阳性率为100%，第四组注射真核表达质粒pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-4，小鼠血清抗体阳性率为100%，第五组注射真核表达质粒pcDNA-ORF5、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4，小鼠血清抗体阳性率为100%，第六组注射生理盐水未产生相应抗体。
免疫小白鼠血常规和T淋巴细胞亚群的检测结果
小鼠末次免疫后7 d，每组随机挑选5只小鼠采集抗凝血，送贵阳医学院附属医院测血常规，进行T 淋巴细胞亚群检测。裂解血液中的红细胞，以荧光素标记的抗小鼠CD3+、CD4+、CD8+单克隆抗体，利用流式细胞技术进行T淋巴细胞亚群的检测，根据血常规检测的结果计算出CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD3+CD4+CD8+的含量结果见表5。
注：大写上标表示与相应组比较差异极显著(P<0.0l)；小写上标表示与相应组比较差异显著(P<0.05)。
从表5的检测结果显示，pcDNA-ORF5，pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-2，pcDNA-ORF5、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4 3个免疫组与生理盐水组比较可以极显著增加CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD3+CD4+CD8+细胞的含量（P<0.0l）。用pcDNA3.1(+)免疫小鼠也可以显著增加CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD3+CD4+CD8+细胞的含量（P<0.05）。其中pcDNA-IL-4对CD3+CD4+和CD3+CD8+ 细胞的含量无明显的影响，其含量略低于pcDNA-ORF5免疫组，但是与pcDNA3.1(+)免疫组相比有显著增加作用（P<0.05），但是与pcDNA-ORF5免疫组相比对于CD3+CD4+CD8+细胞的含量有极显著的增加作用（P<0.0l）。pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-2免疫组与pcDNA-ORF5、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4免疫组相比对CD3+CD4+和CD3+CD8+ 细胞的含量有极显著增加的作用（P<0.0l），对CD3+CD4+CD8+细胞的含量有显著的增加作用（P<0.05）。
免疫仔猪血清IgG抗体检测结果
仔猪末次免疫后7 d，应用LSI猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒检测核酸免疫后仔猪的血清中是否有特异性IgG抗体。结果见表6。
从表6中的检测结果可以看出，第一组仔猪注射质粒pcDNA3.1(+)后未产生相应抗体，而第二组注射真核表达质粒pcDNA-ORF5，第三组注射真核表达质粒pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-2，第四组注射真核表达质粒pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-4，第五组注射真核表达质粒pcDNA-ORF5、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4，仔猪血清抗体阳性率均为100%，第六组注射生理盐水未产生相应抗体，第七组注射猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（NVDC-JXA1株），仔猪血清阳性率均为100%。
免疫仔猪血常规和T淋巴细胞亚群的检测结果
仔猪末次免疫后7 d，采集抗凝血，送贵阳医学院附属医院检测血常规和T 淋巴细胞亚群。裂解血液中的红细胞，以荧光素标记的抗猪CD3+、CD4+、CD8+单克隆抗体，利用流式细胞技术进行T淋巴细胞亚群的检测，根据血常规检测的结果计算出CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD3+CD4+CD8+的含量结果见表7。
注：大写上标表示与相应组比较差异极显著(P<0.0l)；小写上标表示与相应组比较差异显著(P<0.05)。
从表7的检测结果显示，pcDNA-ORF5，pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-4，pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-2，pcDNA-ORF5、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4 4个免疫组与生理盐水组比较可以极显著增加CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD3+CD4+CD8+细胞的含量（P<0.0l）。用pcDNA3.1(+)免疫仔猪也可以极显著增加CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD3+CD4+CD8+细胞的含量（P<0.01）。其中pcDNA-IL-4对CD3+CD4+、CD3+CD8+ 和CD3+CD4+CD8+细胞的含量有显著的影响，其含量显著高于pcDNA-ORF5免疫组（P<0.05）。pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-2免疫组与pcDNA-ORF5、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4免疫组相比对CD3+CD8+和CD3+CD4+CD8+ 细胞的含量有极显著增加的作用（P<0.0l），对CD3+CD4+细胞的含量的影响极显著低于pcDNA-ORF5、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4免疫组（P<0.01）。pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-2免疫组与pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-4免疫组相比对CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3+CD4+CD8+ 细胞的含量有极显著增加的作用（P<0.0l）。
7 结论
本试验构建了真核表达载体pcDNA-ORF5，并将pcDNA-ORF5、pcDNA-IL-2 和pcDNA-IL-4基因在Marc-145细胞中进行了表达。动物免疫试验结果表明核酸疫苗pcDNA-ORF5可以诱导小鼠和仔猪产生相应的抗体，真核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4可以增强核酸疫苗pcDNA-ORF5的细胞免疫，但pcDNA-IL-2尤为显著。pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-2、pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-4，pcDNA-ORF5配合pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4可以诱导仔猪产生相应抗体且阳性率与灭活疫苗相同。
试验结果表明，pcDNA-ORF5，pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-4，pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-2，pcDNA-ORF5、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4免疫小鼠和仔猪可以极显著增加CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3+CD4+CD8+ 细胞的含量。用pcDNA3.1(+)免疫小鼠也可以显著增加CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD3+CD4+CD8+细胞的含量，说明基因疫苗诱发了机体的细胞免疫，并没有像PRRSV全病毒那样引起机体的免疫抑制。
本实验对真核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4对PRRSV核酸疫苗pcDNA-ORF5的免疫作用进行了研究，结果表明pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4真核表达质粒对PRRSV核酸疫苗pcDNA-ORF5的免疫作用具有显著增强作用，因此真核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4可以作为该核酸疫苗的免疫佐剂。
Claims (5)
1.猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因核酸疫苗pcDNA-ORF5的免疫佐剂，其特征在于：包含核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4。
2.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因核酸疫苗pcDNA-ORF5的免疫佐剂的制备方法，其特征在于：
（1）根据GenBank登录的猪IL-2基因mRNA序列和IL-4基因mRNA序列分别设计1 对克隆IL-2和IL-4全基因引物，并在引物的5′端分别设计BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶位点，扩增长度分别为542bp和427bp；
（2）采集健康长白猪前腔静脉血外周血，进行淋巴细胞的分离与培养，提取总RNA，进行RT-PCR扩增IL-2和IL-4基因并对目的基因进行回收纯化，目的基因与PMD19-T载体进行连接得到重组质粒，重组质粒转化、菌落PCR，重组质粒的抽提、酶切鉴定、DNA序列测定和分析，得到阳性质粒pMD19-T-IL-2 和pMD19-T-IL-4；
（3）获取真核表达载体pcDNA3.1(+)，然后对pMD19-T-IL-2、pMD19-T-IL-4和真核表达载体pcDNA3.1(+)进行双酶切、连接、转化、酶切鉴定和测序，最后构建经测序正确的真核表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4。
3.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因核酸疫苗pcDNA-ORF5的制备方法，其特征在于：
（1）根据GenBank上发表的PRRSV Guizhou-1 ORF5基因序列，设计一对扩增ORF5基因的特异性引物，并分别在引物的5′端设计BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶位点；扩增长度603bp；
（2）将猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株病毒悬液接种于Marc-145细胞单层细胞，待出现细胞病变时收获细胞，然后提取总RNA，进行RT-PCR扩增ORF基因，并对目的基因进行回收纯化，构建克隆载体pMD19-T-ORF5、酶切鉴定和测序；
（3）获取真核表达载体pcDNA3.1(+)，然后对pMD19-T-ORF5和真核表达载体pcDNA3.1(+)进行双酶切、连接、转化、酶切鉴定和测序，最后构建经测序正确的真核表达质粒pcDNA-ORF5。
4.根据权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因核酸疫苗pcDNA-ORF5的免疫佐剂的制备方法，其特征在于：引物序列如下：IL-2上游引物（F）：5′- CGGGATCCC TCACAGTAACCTCAACTCCT -3′、IL-2下游引物（R）：5′-CGGAATTCGCCTGATACATTTAACATG AGAG-3′；IL-4上游引物（F）：5′- CGGGATCCTTCATGGGTCTCACCTC -3′、IL-4下游引物（R）：5′- CGGAATTCTCAGCTTCAACAC TTTGA -3′。
5.根据权利要求3所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因核酸疫苗pcDNA-ORF5的制备方法，其特征在于：引物序列如下：ORF5上游引物（F）：5′- CGGGATCCATGTTGGGGAAGTGCT-3′、ORF5下游引物（R）:5′- CGGAATTCCTAGAGACGACCCCATT-3′。
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