CN112941091A - 一种猪血凝性脑脊髓炎dna疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗及其制备方法，是由RBD‑Fd基因与真核表达载体结合，通过转化大肠杆菌感受态制备的，其免疫原性更强、所需免疫剂量更低、毒副反应也更低。同时，本疫苗是以pFUSE‑mIgG3‑Fc1为载体骨架分子，对抗原基因与IgG‑Fc片段进行融合，可提高疫苗的抗原半衰期、热稳定性、pH耐受性。其诱导的中和抗体效价可达1:2048，是SARS‑CoV‑2 DNA疫苗INO‑4800的20倍，是一种猪PEDV‑TGEV二联DNA疫苗的12倍。

Description

一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗及其制备方法。
背景技术
猪血凝性脑脊髓炎（Porcine Hemagglutinating Encephalomyelitis，PHE），是由猪血凝性脑脊髓炎病毒（Porcine Hemagglutinating Encephalomyelitis Virus，PHEV）引起的猪急性、高度接触性传染病，致死率为30%~100%。该病于50年代末期首先发现于加拿大，目前已呈世界性分布，严重危害全球养猪业的健康发展。
猪血凝性脑脊髓炎根据临床症状的不同，主要划分为三种亚型：呕吐衰竭型、神经型和流感型。呕吐衰竭型多见于哺乳仔猪，发病仔猪与多种冠状病毒（如猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪丁型冠状病毒等）感染仔猪相似，表现为消化系统障碍；神经型亦多见于哺乳仔猪，发病仔猪的临床症状与仔猪伪狂犬病易发生混淆，均表现显著的神经症状，且死亡率为100%；流感型多见于成年猪只，其发病特征类似于猪流感，表现为流感样呼吸系统障碍。PHEV一般分布于病猪及带毒猪的上呼吸道及脑组织中，通常经口、鼻等呼吸道分泌物传播。由于尚缺乏针对该病的的治疗药物，疫苗的使用依然是阻止猪血凝性脑脊髓炎感染和疫情传播的有效手段。
PHEV为单股正链RNA病毒，与重症急性呼吸道综合症冠状病毒（SARS-CoV）、新型冠状病毒（SARS-CoV-2）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、牛冠状病毒（BCoV）及鼠肝炎病毒（MHV）等同属于冠状病毒科、β冠状病毒属成员。PHEV基因组编码五种结构蛋白，分别为棘突糖蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）和血凝素蛋白（HE）。S蛋白是由S1和S2亚基形成的三聚体（即S三聚体），其中S1亚基内部包含受体结合域（receptor bindingdomain，RBD），通过空间构象重塑介导病毒与宿主细胞受体识别、吸附和侵入过程，是疫苗设计的良好靶标。
当前，主要有5条技术路线进行冠状病毒疫苗的研发，即灭活病毒疫苗、核酸疫苗（包括DNA疫苗和mRNA疫苗）、腺病毒载体疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗。DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，被称为继灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗之后的“第三代疫苗”是将编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒DNA导入宿主体内，诱导机体产生特异性的体液和细胞免疫反应。由于DNA疫苗的制备工艺相对简单、生产成本低、无感染性、开发与生产周期短等优势，已成为多种人类和动物疫病防控的一个强有力的技术平台。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗及其制备方法。
一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗基因 RBD-Fd，它包括：P-S-RBD、柔性Linker、foldon（Fd）标签、Flag标签；
所述的一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗基因RBD-Fd，其特征在于：所述的基因RBD-Fd，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示；
一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗，它是在真核表达载体中插入了如序列表SEQ IDNO.5所示的基因；
所述的真核表达载体为pFUSE-mIgG-Fc1；
一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗的制备方法，它包括：
1） P-S-RBD基因的获得
提PHEV细胞培养物的总RNA，逆转录为cDNA，以之为模板；设计引物：
P-S-RBD上游引物：5’-GAATTCATGTGATTTACCCAATTGCGATATC-3’；
P-S-RBD下游引物：5’-GAAGGATCTGGTTGACACCAGCAAG-3’，
进行PCR反应，获得产物；
2）Fd标签基因的获得
人工合成Fd基因序列，在其5’端插入柔性Linker基因序列，在其3’端插入Flag基因序列和Bgl Ⅱ酶切位点；
3）RBD-Fd基因的获得
以P-S-RBD基因和Linker-Fd-Flag标签基因互为模板，加入上、下游引物，在高保真扩增酶的作用下，获得优化的RBD-Fd基因序列，所述的上、下游引物为：
上游引物：5’-GAATTCATGTGATTTACCCAATTGCGATATC-3’；
下游引物：5’-AGATCTCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCT-3’；
4）构建重组质粒pFUSE-RBD-Fd-Fc1
RBD-Fd基因插入pFUSE-mlgG3-Fc1载体中，构建重组质粒pFUSE-RBD-Fd-Fc1；
5）扩增。
本发明的有益效果在于：
本新型猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗，将传统RBD序列C-末端连接Fd标签，可以确保DNA疫苗基因在真核细胞中表达为融合蛋白的三聚体结构，能最大程度的模拟天然病毒蛋白结构，其免疫原性更强、所需免疫剂量更低、毒副反应也更低。同时，本DNA疫苗是以pFUSE-mIgG3-Fc1为载体骨架分子，对抗原基因与IgG-Fc片段进行融合，可提高疫苗的抗原半衰期、热稳定性、pH耐受性。实施例验证，相较于其他冠状病毒（如SARS-CoV-2、PEDV、TGEV等）DNA疫苗，本新型DNA疫苗诱导的抗原特异性免疫反应显著增强，其诱导的中和抗体效价可达1:2048，是SARS-CoV-2 DNA疫苗INO-4800的20倍，是一种猪PEDV-TGEV二联DNA疫苗的12 倍。本发明对于猪血凝性脑脊髓炎的防控具有重大价值。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1提供的PCR产物电泳的结果图，600 bp条带为P-S-RBD基因（597bp加起始密码子ATG）；135 bp条带为Linker-Fd-Flag标签基因；735 bp条带为RBD-Fd基因；
图2为实施例2提供的DNA疫苗质粒双酶切鉴定结果图，4132 bp条带为pFUSE-mIgG3-Fc1载体基因；735 bp条带为RBD-Fd基因；
图3为实施例2提供的DNA疫苗Western blot鉴定结果图，55kD-70kD之间蛋白条带为P-S-RBD蛋白；
图4为实施例3提供的酶联免疫吸附法检血清中特异性IgG抗体结果图；
图5为实施例3提供的微量中和试验检测血清中和抗体结果图；
图6为实施例3提供的流式细胞检测细胞因子结果图，1-5分别代表2ug RBD组、4ugRBD组、Ctrl组、PBS组和FA组。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细描述。下述实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照分子生物学、分子病毒学、分子免疫学、细胞生物学等领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 重组质粒pFUSE-RBD-Fd-Fc1的构建
（1）P-S-RBD基因的获得
①模板制备
抽提PHEV细胞培养物的总RNA，逆转录为cDNA，以之为模板，用于PCR扩增。
②引物设计
应用引物设计软件，参考Genbank登录的PHEV S蛋白基因相关序列，插入在5’端插入EcoR Ⅰ酶切位点和起始密码子，设计特异性扩增引物如下：
P-S-RBD上游引物：5’-GAATTCATGTGATTTACCCAATTGCGATATC-3’；
P-S-RBD下游引物：5’-GAAGGATCTGGTTGACACCAGCAAG-3’。
③PCR反应
使用TaKaRa公司得Premix Taq DNA聚合酶扩增P-S-RBD基因，按试剂使用说明加入Premix Taq 25 μL、P-S-RBD上游引物1 μL、P-S-RBD下游引物1 μL、模板500 ng，补加灭菌蒸馏水至50 μL。
PCR反应参数设定：98℃预变性2 min；98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，34个循环；72℃延伸5 min。取PCR产物进行凝胶电泳，观察扩增结果如图1。
（2）Fd标签基因的获得
根据序列表的序列2，人工合成Fd基因序列，并在其5’端插入如序列表的序列3柔性Linker基因序列，在其3’端插入如序列表的序列4 Flag基因序列和Bgl Ⅱ酶切位点。优化的Linker-Fd-Flag标签产物进行凝胶电泳，观察扩增结果如图1。
（3）RBD-Fd基因的获得
①模板
凝胶法回收纯化的P-S-RBD基因扩增产物、优化的Linker-Fd-Flag标签产物。
②引物
上游引物：5’-GAATTCATGTGATTTACCCAATTGCGATATC-3’；
下游引物：5’-AGATCTCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCT-3’。
③套叠PCR反应
以P-S-RBD基因和Linker-Fd-Flag标签基因互为模板，加入上、下游引物，在高保真扩增酶的作用下，获得优化的RBD-Fd基因序列，如序列表SEQ ID NO.5。
PCR反应参数设定：98℃预变性2 min；98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，34个循环；72℃延伸5 min。取PCR产物进行凝胶电泳，观察扩增结果如图1。
④PCR产物连接
利用无缝克隆技术将优化RBD-Fd基因插入pFUSE-mlgG3-Fc1载体中，构建重组质粒pFUSE-RBD-Fd-Fc1。按照无缝克隆试剂盒说明进行操作。
实施例2 猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗重组体的鉴定
将重组质粒pFUSE-RBD-Fd-Fc1转化大肠杆菌感受态细胞，取200 uL涂于LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取单个菌落接种于50 mL含相应抗生素的LB培养液中，大量提取质粒，制备候选疫苗。
（1）DNA疫苗重组体的双酶切鉴定
利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ消化重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳分析。酶切结果均与预计相同者为阳性重组质粒，如图2所示。挑选酶切结果与预计相同者进一步基因测序鉴定。
（2）DNA疫苗重组体的真核表达鉴定
于六孔细胞培养板中接种传代的293T细胞，5~7×105个/孔，待细胞长至60～80%单层时，利用LipofectatimeTM 3000转染试剂进行转染。转染剂量为2.5 μg重组质粒/孔，将细胞置于细胞培养箱中继续培养72小时，提取细胞总蛋白。经SDS-PAGE电泳分离后，进行转膜。一抗分别为鼠源PHEV多克隆抗体（1:1000）、兔源Fc单克隆抗体（1:1000）。经一抗、二抗标记后的PVDF膜，在显影仪上检测目的条带，如图3所示。
实施例3 猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗的免疫原性评价
试验动物为3周龄雄性BALB/c小鼠。一免和二免使用的疫苗佐剂分别为弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂。
（1）分组免疫
低剂量疫苗组（2 μg RBD）：将疫苗用PBS缓冲液稀释至20 μg/mL，取0.1 mL与0.1mL疫苗佐剂混合（即为液相混合物），然后进行后肢肌肉注射接种。试验第1天进行第一次免疫，试验第14天进行第二次免疫。
高剂量疫苗组（4 μg RBD）：将疫苗稀释至40 μg/mL，其他同低剂量疫苗组。
空载对照组（Ctrl）：用pFUSE-mlgG3-Fc1空载体代替疫苗，其他同低剂量疫苗组。
PBS对照组（PBS）：用PBS缓冲液代替液相混合物，其他同低剂量疫苗组。
佐剂对照组（FA）：直接用佐剂进行接种，其他同低剂量疫苗组。
分别于试验第0、13、27天采集受试小鼠血清，收集外周血淋巴细胞（PBMCs），分离脾脏淋巴细胞。
（2）酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中特异性IgG抗体
①将重组PHEV-RBD蛋白按照0.1 μg/孔包被酶标板，4℃过夜，弃上清；
②采用5%脱脂乳溶液37℃封闭2小时，PBS缓冲液洗涤5次；
③将供试血清用PBS缓冲液梯度稀释，分别加入酶标板，37℃孵育1小时，PBS缓冲液洗涤5次。使用PHEV感染小鼠血清和PBS缓冲液作为阳性对照和阴性对照。
④加入HRP标记的兔抗鼠二抗，37℃孵育1小时，PBS缓冲液洗涤5次。
⑤加入TMB显色剂反应5分钟，加入终止液终止反应，测定OD450nm值。
阳性结果的最高稀释倍数定为抗体滴度值。结果如图4，DNA疫苗免疫一次即可测到RBD特异IgG抗体，加强免疫后抗体水平进一步提升，结合抗体效价高达1：16382。
（3）微量中和试验（NA）检测血清中和抗体
①将供试小鼠血清用PBS缓冲液梯度稀释，与100 TCID50的病毒液等体积混合，加入96孔细胞培养板中，每个稀释度作8个重复，并设置病毒阳性对照、血清阴性对照；
②将96孔板置于细胞培养箱中孵育1小时，加入消化分散的小鼠神经瘤母细胞（N2a）悬液，100 μL/孔，置于细胞培养箱中培养24小时；
③逐日观察细胞病变效应（CPE），以此为指标，在对照系统成立的前提下进行结果判定。以能保护半数接种细胞不出现CPE的血清稀释度作为终点，按Reed-Muench法计算血清的50%中和效价。
结果如图5所示，免疫一次即可测到针对PHEV-RBD特异中和抗体，加强免疫后抗体水平进一步提升，中和抗体效价高达1：2048。
（4）流式细胞术（FACS）检测细胞因子水平
①采集受试小鼠PBMCs，PBS缓冲液润洗3次；
②使用FITC-CD4、APC-CD8、PE-IFN-γ、PerCP-IL-4单克隆抗体对外周血单核细胞进行染色，利用流式细胞仪检测T细胞CD4+、CD8+亚群以及IFN-γ、IL-4分泌水平。
③结果如图6所示，DNA疫苗免疫可诱导机体产生显著增强的CD8+和CD4+ T淋巴细胞免疫应答和显著增多的INF-γ细胞因子分泌，CD3+、CD4+、IFN-γ+、IL-4+ T细胞含量分别为0.52%、0.428%、1.112%、0.318%。
本发明提供了猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗具有良好的免疫原性，接种疫苗的小鼠体内产生了针对PHEV-RBD的体液免疫和细胞免疫应答。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗及其制备方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 597
<212> DNA
<213> （Artificial Sequence）
<400> 1
tgatttaccc aattgcgata tcgaagcttg gcttaattct aagaccgttt cttcgcctct 60
taattgggaa cgtaaaattt tttctaattg taattttaac atgggcaggc tgatgtcttt 120
tattcaggct gactcttttg gttgtaacaa tattgatgct tctcacttat atggtatgtg 180
ttttggtagc attactattg ataagtttgc tatacccaat agtagaaagg ttgatctgca 240
agtgggtaaa tctggttatt tacaatcttt taattataag attgacactg ctgttagcag 300
ttgtcaactc tattatagtt tgcctgcagc aaacgtatct gtcactcatt ataatccttc 360
atcttggaat agaaggtatg ggtttaataa tcagagtttt ggttccagag gccttcatga 420
tgctgtttat tcacagcaat gttttaatac acctaacaca tattgtcctt gtagaacaag 480
tcaatgcata ggtggtgcag gcacaggaac ttgtcctgta ggcaccactg tgcgcaagtg 540
ttttgctgca gttacaaaag ctactaagtg tacttgctgg tgtcaaccag atccttc 597
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> （Artificial Sequence）
<400> 2
ggaggaggag gaagcggagg aggaggaagc 30
<210> 3
<211> 81
<212> DNA
<213> （Artificial Sequence）
<400> 3
ggttatattc ctgaagctcc aagagatggg caagcttacg ttcgtaaaga cggcgaatgg 60
gtattgcttt ctaccttttt a 81
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> （Artificial Sequence）
<400> 4
gattacaagg acgatgacga taag 24
<210> 5
<211> 735
<212> DNA
<213> （Artificial Sequence）
<400> 5
atgtgattta cccaattgcg atatcgaagc ttggcttaat tctaagaccg tttcttcgcc 60
tcttaattgg gaacgtaaaa ttttttctaa ttgtaatttt aacatgggca ggctgatgtc 120
ttttattcag gctgactctt ttggttgtaa caatattgat gcttctcact tatatggtat 180
gtgttttggt agcattacta ttgataagtt tgctataccc aatagtagaa aggttgatct 240
gcaagtgggt aaatctggtt atttacaatc ttttaattat aagattgaca ctgctgttag 300
cagttgtcaa ctctattata gtttgcctgc agcaaacgta tctgtcactc attataatcc 360
ttcatcttgg aatagaaggt atgggtttaa taatcagagt tttggttcca gaggccttca 420
tgatgctgtt tattcacagc aatgttttaa tacacctaac acatattgtc cttgtagaac 480
aagtcaatgc ataggtggtg caggcacagg aacttgtcct gtaggcacca ctgtgcgcaa 540
gtgttttgct gcagttacaa aagctactaa gtgtacttgc tggtgtcaac cagatccttc 600
ggaggaggag gaagcggagg aggaggaagc ggttatattc ctgaagctcc aagagatggg 660
caagcttacg ttcgtaaaga cggcgaatgg gtattgcttt ctaccttttt agattacaag 720
gacgatgacg ataag 735

Claims (5)

1.一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗基因 RBD-Fd，它包括：P-S-RBD、柔性Linker、Fd标签、Flag标签。
2.根据权利要求1所述的一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗基因RBD-Fd，其特征在于：所述的基因 RBD-Fd，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示。
3.一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗，它是在真核表达载体中插入了如序列表SEQ IDNO.5所示的基因。
4.根据权利要求3所述的一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗，其特征在于：所述的真核表达载体为pFUSE-mIgG-Fc1。
5.一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗的制备方法，它包括：
1） P-S-RBD基因的获得
提PHEV细胞培养物的总RNA，逆转录为cDNA，以之为模板；设计引物：
P-S-RBD上游引物：5’-GAATTCATGTGATTTACCCAATTGCGATATC-3’；
P-S-RBD下游引物：5’-GAAGGATCTGGTTGACACCAGCAAG-3’，
进行PCR反应，获得产物；
2）Fd标签基因的获得
人工合成Fd基因序列，在其5’端插入柔性Linker基因序列，在其3’端插入Flag基因序列和Bgl Ⅱ酶切位点；
3）RBD-Fd基因的获得
以P-S-RBD基因和Linker-Fd-Flag标签基因互为模板，加入上、下游引物，在高保真扩增酶的作用下，获得优化的RBD-Fd基因序列，所述的上、下游引物为：
上游引物：5’-GAATTCATGTGATTTACCCAATTGCGATATC-3’；
下游引物：5’-AGATCTCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCT-3’；
4）构建重组质粒pFUSE-RBD-Fd-Fc1
RBD-Fd基因插入pFUSE-mlgG3-Fc1载体中，构建重组质粒pFUSE-RBD-Fd-Fc1；
5）扩增。
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