CN111944064A

CN111944064A - 一种covid-19亚单位疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN111944064A
Application number: CN202010847271.6A
Authority: CN
Inventors: 杨利敏; 刘文军
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2040-08-21
Also published as: CN111944064B

Abstract

本发明公开了一种COVID‑19亚单位疫苗及其制备方法，即一种新型冠状病毒肺炎重组蛋白亚单位疫苗及其制备方法。本发明保护的蛋白质，为由序列1或序列3所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质。本发明还保护一种COVID‑19亚单位疫苗，其活性成分为所述蛋白质的三聚体和/或二聚体和/或单体。对于亚单位疫苗，其重组蛋白分子量越大，构象越复杂，则免疫原性越强。本发明中亚单位疫苗为融合蛋白的三聚体结构，能最大程度的模拟天然病毒蛋白结构，相对于单体或双体，其免疫原性更强，所需免疫剂量更低，从而毒副反应也更低。本发明对于人新型冠状病毒肺炎的防控具有重大价值。

Description

一种COVID-19亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种COVID-19亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种可引起人新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的新发呼吸道病原体，与重症急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)同属于β-冠状病毒，具有较高的传染性和一定的致死率。

一种安全有效的疫苗对于控制疫情和防止再次暴发具有重要意义。多个不同的疫苗平台被用于COVID-19疫苗的研发，包括灭活病毒疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗和减毒活疫苗。由于冠状病毒的特殊性，其疫苗研发存在一定难度，选择一个适合COVID-19的疫苗研发策略将直接决定该疫苗研发的成败。

SARS-CoV-2为单股正链RNA病毒，是第7个已发现可感染人的冠状病毒。位于病毒囊膜表面的刺突蛋白(spike glycoprotein,S蛋白)是冠状病毒重要的结构蛋白，呈现为同源三聚体结构,参与细胞受体结合和膜融合过程。

发明内容

本发明的目的是提供一种COVID-19亚单位疫苗及其制备方法，即一种新型冠状病毒肺炎重组蛋白亚单位疫苗及其制备方法。

本发明首先保护一种蛋白质，为如下(a1)、(a2)、(a3)、(a4)、(a5)或(a6)：

(a1)蛋白质，自N端至C端依次包括如下功能元件：人白介素10信号肽、S-S-RBD、foldon蛋白；

(a2)蛋白质，自N端至C端依次包括如下功能元件：人白介素10信号肽、S-S-RBD、foldon蛋白、标签蛋白；

(a3)蛋白质，自N端至C端依次包括如下功能元件：人白介素10信号肽、S-S-RBD、foldon蛋白、His₆标签；

(a4)蛋白质，自N端至C端依次包括如下功能元件：S-S-RBD、foldon蛋白；

(a5)蛋白质，自N端至C端依次包括如下功能元件：S-S-RBD、foldon蛋白、标签蛋白；

(a6)蛋白质，自N端至C端依次包括如下功能元件：S-S-RBD、foldon蛋白、His₆标签；

S-S-RBD为SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合区。

S-S-RBD如序列表的序列1中第19-224位氨基酸残基所示。

人白介素10信号肽如序列表的序列1中第1-18位氨基酸残基所示。

foldon蛋白是T4噬菌体纤维蛋白的结构域。foldon蛋白具有促使融合蛋白形成三聚体的功能。foldon蛋白如序列表的序列1中第225-251位氨基酸残基所示。

具体的，所述蛋白质为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b2)由序列表中序列3所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b3)将(b1)或(b2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(b1)或(b2)衍生的蛋白质。

编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。

具体的，所述基因为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；

(c2)在严格条件下与(c1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(c3)与(c1)具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

序列表的序列2所示的DNA分子已经进行了针对哺乳动物细胞的密码子优化，可以在哺乳动物细胞中高效表达。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

本发明还保护一种COVID-19亚单位疫苗，其活性成分为特异蛋白的三聚体和/或特异蛋白的二聚体和/或特异蛋白的单体；所述特异蛋白为以上任一所述蛋白质。

本发明还保护一种制备COVID-19亚单位疫苗的方法，包括如下步骤：

(1)将以上任一所述基因插入表达载体，得到重组表达载体；

(2)将所述重组表达载体导入哺乳动物细胞并进行培养，收集上清液；

(3)从所述上清液中纯化所述蛋白质。

“从所述上清液中纯化所述蛋白质”具体可为“从所述上清液中纯化具有His₆标签的蛋白质”

所述表达载体为哺乳动物细胞表达载体。

所述表达载体具体可为pCDNA3.1载体。

所述重组表达载体具体可为：将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pCDNA3.1载体的NotI和XbaI酶切位点之间，得到重组质粒pCDNA/nCoV-RBDFd。

所述哺乳动物细胞具体可为HEK293细胞。

所述方法，具体包括如下步骤：

①采用脂质体转染法将重组质粒pCDNA/nCoV-RBDFd转染对数期生长的HEK293细胞，孵育4-6小时，然后采用DMEM细胞培养液培养72小时，然后收集细胞培养上清；

②取步骤①得到的细胞培养上清，离心，收集上清液；

③取步骤②得到的上清液，采用0.22μm滤膜过滤，收集滤液；

④取步骤③得到的滤液，采用截留分子量为10kDa的超滤膜包进行浓缩，收集浓缩液；

⑤取步骤④得到的浓缩液，采用镍离子金属螯合层析纯化，收集含有目标蛋白的过柱后溶液；目标蛋白为具有His₆标签的蛋白；

⑥取步骤⑤得到的过柱后溶液，上样于脱盐柱，采用生理盐水进行洗脱，得到以生理盐水为溶剂的目标蛋白溶液，即为COVID-19亚单位疫苗。

所述方法制备得到的COVID-19亚单位疫苗也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种用于预防和/或治疗人新型冠状病毒肺炎的疫苗，为(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)一种用于人新型冠状病毒肺炎的疫苗，包括以上任一所述蛋白质；

(d2)一种用于人新型冠状病毒肺炎的疫苗，包括所述COVID-19亚单位疫苗；

(d3)一种用于人新型冠状病毒肺炎的疫苗，包括所述COVID-19亚单位疫苗。

所述疫苗还包括疫苗佐剂。

本发明还保护以上任一所述蛋白质或以上任一所述COVID-19亚单位疫苗在制备用于预防和/或治疗人新型冠状病毒肺炎的疫苗中的应用。

本发明还保护组分甲和组分乙在制备用于预防和/或治疗人新型冠状病毒肺炎的疫苗中的应用；

所述组分甲为以上任一所述蛋白质或以上任一所述COVID-19亚单位疫苗；

所述组分乙为疫苗佐剂。

以上任一所述疫苗佐剂具体可为AddaVax^TM。

前期研究证明，SARS-CoV疫苗若选用全长刺突蛋白作为疫苗靶抗原，会引起抗体依赖感染增强(ADE)，从而影响疫苗保护效果。由于SARS-CoV-2与SARS-CoV同源性较高，因此SARS-CoV-2同样存在潜在ADE风险。

对于亚单位疫苗，其重组蛋白分子量越大，构象越复杂，则免疫原性越强。本发明中的亚单位疫苗为融合蛋白的三聚体结构，能最大程度的模拟天然病毒蛋白结构，相对于单体或双体，其免疫原性更强，所需免疫剂量更低，从而毒副反应也更低。

本发明对于人新型冠状病毒肺炎的防控具有重大价值。

附图说明

图1为实施例1中蛋白电泳的结果图。

图2为实施例1中Western blot检测的结果图。

图3为实施例2的步骤二的结果图。

图4为实施例2的步骤三的结果图。

图5为实施例2的步骤四的结果图。

图6为实施例2的步骤五的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pCDNA3.1载体：赛默飞公司，货号为V79020。HEK293细胞：赛默飞公司，货号为A14635。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、SARS-CoV-2亚单位疫苗的设计和制备

一、构建重组质粒

将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pCDNA3.1载体的NotI和XbaI酶切位点之间，得到重组质粒pCDNA/nCoV-RBDFd。重组质粒已进行测序验证。

序列表的序列2所示的DNA分子编码序列表的序列1所示的融合蛋白。融合蛋白单体的预期分子量为30kD左右(由于糖基化修饰分子量会略有出入)。

本发明提供的融合蛋白如序列表的序列1所示。序列表的序列1中，自N端至C端依次包括如下功能元件：人白介素10信号肽(序列1中第1-18位)、S-S-RBD(序列1中第19-224位)、foldon(Fd)蛋白(序列1中第225-251位)、His₆标签(序列1中第255-260位)。人白介素10信号肽，用于协助目标蛋白分泌到胞外。SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合区(receptorbinding domain，RBD)用S-S-RBD表示。S-S-RBD用于诱导SARS-CoV-2的特异性中和抗体生成。Fd蛋白是T4噬菌体纤维蛋白的结构域,使得纤维蛋白通过氢键、疏水作用和盐桥的方式形成三聚体。His₆标签用于蛋白纯化。

在细胞中，先表达得到序列表的序列1所示的融合蛋白，人白介素10信号肽在分泌过程中被切掉，仅保留成熟的目标蛋白。成熟的目标蛋白如序列表的序列3所示，成熟的目标蛋白又称为具有His₆标签的RBD蛋白或His₆-RBD蛋白。

二、His₆-RBD蛋白的制备和纯化

1、采用脂质体转染法将重组质粒pCDNA/nCoV-RBDFd转染对数期生长的HEK293细胞，孵育4-6小时，然后采用DMEM细胞培养液培养72h，然后收集细胞培养上清。

2、取步骤1得到的细胞培养上清，离心，收集上清液。

3、取步骤2得到的上清液，采用0.22μm滤膜过滤，收集滤液。

4、取步骤3得到的滤液，采用截留分子量为10kDa的超滤膜包(millipore)进行浓缩，收集浓缩液。

5、取步骤4得到的浓缩液，采用镍离子金属螯合层析纯化，收集含有目标蛋白的过柱后溶液。目标蛋白为His₆-RBD蛋白。

6、取步骤5得到的过柱后溶液，上样于脱盐柱，采用生理盐水进行洗脱，得到以生理盐水为溶剂的目标蛋白溶液，命名为His₆-RBD溶液。

三、鉴定

1、蛋白电泳

取步骤二得到的His₆-RBD溶液，进行SDS-PAGE电泳检测(同时进行还原电泳和非还原电泳，以鉴定蛋白的还原和非还原两种形式)。

结果见图1。还原状态下只能看到在30kD左右处出现一条蛋白条带，与预测蛋白分子量大小相符；非还原状态下能够看到3个蛋白条带，分别是单体、二聚体和三聚体三种构象形式。结果表明：His₆-RBD蛋白可以在Fd蛋白的协助下形成三聚体结构。

2、Western blot检测

取步骤二得到的His₆-RBD溶液，进行SDS-PAGE电泳(同时进行还原电泳和非还原电泳，以鉴定蛋白的还原和非还原两种形式)后进行Western blot检测。采用的一抗为SARS-CoV-2S1蛋白兔多抗(义翘神州，40592-T62)，采用的二抗为HRP标记鼠抗兔抗体。

结果见图2。

实施例2、SARS-CoV-2亚单位疫苗的免疫评价

实施例1制备的His₆-RBD溶液，即为亚单位疫苗。

中国猕猴(Macaca Mulatta)：北京中科灵瑞生物技术股份有限公司。

为了确认实施例1制备的亚单位疫苗的免疫效力，对中国猕猴进行肌肉途径接种，测定猴子体内的体液免疫和细胞免疫应答，以评价其在非人灵长动物上的免疫效力。

试验组：3只中国猕猴(个体编号：#163957，#140271，#140829)；试验对照组：1只中国猕猴(用Control表示)；阴性对照组：1只中国猕猴(用Sham表示)。

疫苗佐剂：AddaVax^TM(InvivoGen，货号为vac-adx-10)。AddaVax^TM是一种基于鲨烯的水包油纳米乳剂，其构成与佐剂

相似。

一、分组免疫

试验组：试验第1天进行第1次接种，试验第21天进行第2次接种；每次每只试验动物的接种方式如下：将亚单位疫苗用生理盐水稀释至0.5mg/mL(以总蛋白浓度计)，然后取0.1mL与0.1mL疫苗佐剂混合(即为液相混合物)，然后进行大腿肌肉注射接种。

试验对照组：用重组SARS-CoV-2RBD蛋白(金斯瑞，货号为Z03483)代替亚单位疫苗，其他同试验组。

阴性对照组：用生理盐水代替液相混合物，其他同试验组。

分别于试验第0天(即试验第1天的前1天)、试验第21天(第2次接种前)和试验第28天于大腿静脉采血。试验第28天，收集全血中的外周血淋巴细胞。

二、通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中的针对SARS-CoV-2S蛋白的特异IgG抗体

1、将重组SARS-CoV-2RBD蛋白(金斯瑞，货号为Z03483)按照0.1μg/孔包被酶标板，4℃包被15小时，弃上清。

2、采用3％牛血清白蛋白溶液37℃封闭1小时，然后采用PBS缓冲液洗涤5次。

3、将供试血清用PBS缓冲液梯度稀释后分别加入酶标板的不同孔中，37℃孵育30分钟，然后采用PBS缓冲液洗涤5次。供试血清即步骤一中采血得到的血液的血清。用PBS缓冲液代替供试血清，作为阴性对照孔。

4、加入HRP标记的鼠抗人抗体，37℃孵育15分钟，然后采用PBS缓冲液洗涤5次。

5、加入TMB显色剂(英创生物，TMB-S-004)反应5分钟，然后加入2M硫酸溶液终止反应，测定A450nm。

以试验孔参比阴性对照孔的A_450nm值＞2.1判为阳性，阳性结果的最高稀释倍数定为抗体滴度值。结果见图3(图3的纵坐标为抗体滴度值log以10为底的对数)。结果显示，免疫1次即可测到RBD特异IgG抗体，加强免疫后抗体水平进一步提升，试验组动物的抗体水平高于试验对照组动物。

三、通过中和实验检测血清中的中和抗体水平。

供试血清即步骤一中采血得到的血液的血清。

采用商品化试剂盒“SARS-CoV-2Surrogate Virus Neutralization Test Kit”(金斯瑞，货号为L00847)对不同免疫时间点的血清中和抗体进行测试。

将供试血清用PBS缓冲液梯度稀释。将不同稀释梯度的血清分别与试剂盒中的HRP标记的RBD蛋白孵育，然后加入预包被了人ACE2蛋白的酶标板，若血清中存在中和抗体，则会阻断RBD与ACE2的结合，从而达到检测血清中中和抗体的目的。

结果见图4(图4的纵坐标为供试血清的稀释倍数log以10为底的对数)。结果显示，免疫1次即可测到针对SARS-CoV-2特异中和抗体(滴度为200)，加强免疫后抗体水平进一步提升(滴度为3200-6400)。免疫1次后，试验对照组动物的中和抗体滴度为50，加强免疫后滴度达到400，抗体水平明显低于试验组动物。

四、进行酶联免疫斑点法(ELISPOT)

取步骤一中试验第28天采血得到的血液，收集外周血淋巴细胞。

采用商品化试剂盒“Human IFN-γSingle-Color ELISPOT”(CTL公司，货号hIFNg-1M/2-purple)对外周血淋巴细胞进行检测。

1.每孔加入0.1μg SARS-CoV-2S1蛋白(金斯瑞，货号Z03501)和细胞悬液(细胞悬液含5×10⁵外周血淋巴细胞)；置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育24小时。

2.弃去板内细胞悬液，用100μl冷的无菌水，4℃，10min，裂解板内剩余细胞,弃去无菌水，用PBS洗2次，PBST洗两次，每次200μl/孔。

3.用含0.5％FBS无菌PBS稀释一抗biotinylated anti-human IFN-γ到2μg/ml浓度；加入稀释好的一抗，每孔100μl，室温孵育2h；弃去板内抗体溶液，用无菌PBST(200μl/孔)洗涤3次，拍干。

4.用含0.5％FBS无菌PBS稀释二抗streptavidin-alkaline phosphatase 1:500到指定浓度；加入稀释好的二抗，每孔100μl，室温孵育1h；弃去板内抗体溶液，用无菌PBST(200μl/孔)洗涤3次，拍干。

5.每孔加入100μl底物，孵育直至斑点显色，时间最长不超过15min；终止显色：用无菌水洗涤，移去托板，冲洗膜底部；通风避光处晾干，斑点计数(ELIspot reader读板)。

结果见图5。结果显示，用SARS-CoV-2S1蛋白刺激接种亚单位疫苗的猴子外周血淋巴细胞，其外周血淋巴细胞可分泌干扰素γ，证明接种疫苗的猴子体内产生了针对SARS-CoV-2的特异细胞免疫应答。试验对照组动物未检测到针对SARS-CoV-2的特异细胞免疫应答。

五、进行胞内细胞因子染色

1.外周血淋巴细胞(PBMCs)用1640洗两遍，加2ml 10％FBS 1640混匀，取500μl接种(大约是1×10⁷个细胞)到24孔板中。

2.取一无菌EP管，加500μl 10％FBS 1640，再加BFA(1000×)、以及抗原SARS-CoV-2S1蛋白(金斯瑞，货号Z03501)2μg/ml。1ml的移液器混匀后加到上述细胞悬液的孔中。混匀，细胞培养箱活化5h。

3.5h后，将活化的细胞转移到1.5ml EP管，500g离心5min。5％血清的PBS洗一遍。

4.表面染色：100μl体系中加表面染色的抗体(anti-human CD4/CD8 FITC、anti-human CD44 PE)，冰上孵育20min。

5.5％血清的PBS洗1-2遍，离心，去上清。

6.固定：100μl PBS和300μl 4％多聚甲醛，冰上固定25min。

7.加500μl 1×破膜液(9ml双蒸水+1ml 10×破膜液eBiosciense)，离心，去上清。

8.染色：用100μl 1×破膜液吹匀细胞沉淀，加细胞因子抗体即anti-human IFN-γAPC，冰上，暗处孵育30min。

9.加500μl 1×破膜液(9ml双蒸水+1ml 10×破膜液)，离心，去上清。再用1×破膜液洗两遍。

10.用PBS混悬细胞立即检测，或固定待测：100μl PBS和300μl 4％多聚甲醛固定，4℃待测。检测仪器BDFACSCalibur。

11.Flowjo分析软件分析数据。

结果见图6。结果显示，用SARS-CoV-2S1蛋白刺激接种亚单位疫苗的猴子外周血淋巴细胞，其记忆性CD4和CD8 T细胞均分泌干扰素γ，证明接种疫苗的猴子体内产生了针对SARS-CoV-2的特异细胞免疫应答。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种COVID-19亚单位疫苗及其制备方法

<130> GNCYX202088

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1 5 10 15

Arg Ala Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe

20 25 30

Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn

35 40 45

Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn

50 55 60

Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys

65 70 75 80

Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile

85 90 95

Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile

100 105 110

Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile

115 120 125

Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn

130 135 140

Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg

145 150 155 160

Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly

165 170 175

Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln

180 185 190

Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser

195 200 205

Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser

210 215 220

Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys

225 230 235 240

Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly Gly Gly His His

245 250 255

His His His His

260

<210> 2

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggcctctatt 60

gttagatttc ctaatattac aaacttgtgc ccttttggtg aagtttttaa cgccaccaga 120

tttgcatctg tttatgcttg gaacaggaag agaatcagca actgtgttgc tgattattct 180

gtcctatata attccgcatc attttccact tttaagtgtt atggagtgtc tcctactaaa 240

ttaaatgatc tctgctttac taatgtctat gcagattcat ttgtaattag aggtgatgaa 300

gtcagacaaa tcgctccagg gcaaactgga aagattgctg attataatta taaattacca 360

gatgatttta caggctgcgt tatagcttgg aattctaaca atcttgattc taaggttggt 420

ggtaattata attacctgta tagattgttt aggaagtcta atctcaaacc ttttgagaga 480

gatatttcaa ctgaaatcta tcaggccggt agcacacctt gtaatggtgt tgaaggtttt 540

aattgttact ttcctttaca atcatatggt ttccaaccca ctaatggtgt tggttaccaa 600

ccatacagag tagtagtact ttcttttgaa cttctacatg caccagcaac tgtttgtgga 660

cctaaaaagt ctggatatat ccccgaggct cccagagacg gccaggccta tgtgagaaag 720

gacggagagt gggtgctgct gagcaccttt ctgggcggcg gccaccatca ccatcatcac 780

tga 783

<210> 3

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu

1 5 10 15

Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys

20 25 30

Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala

35 40 45

Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn

50 55 60

Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly

65 70 75 80

Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp

85 90 95

Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp

100 105 110

Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu

115 120 125

Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile

130 135 140

Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu

145 150 155 160

Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr

165 170 175

Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu

180 185 190

Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Gly Tyr

195 200 205

Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly

210 215 220

Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly Gly Gly His His His His

225 230 235 240

His His

Claims

1.蛋白质，为如下(a1)、(a2)、(a3)、(a4)、(a5)或(a6)：

S-S-RBD为SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合区。

2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b2)由序列表中序列3所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

3.编码权利要求1或2所述蛋白质的基因。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；

(c3)与(c1)具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

5.一种COVID-19亚单位疫苗，其活性成分为特异蛋白的三聚体和/或特异蛋白的二聚体和/或特异蛋白的单体；所述特异蛋白为权利要求1或2所述蛋白质。

6.一种制备COVID-19亚单位疫苗的方法，包括如下步骤：

(1)将权利要求3或4所述基因插入表达载体，得到重组表达载体；

(3)从所述上清液中纯化权利要求1或2所述蛋白质。

7.权利要求6所述方法制备得到的COVID-19亚单位疫苗。

8.一种用于预防和/或治疗人新型冠状病毒肺炎的疫苗，为(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)一种用于人新型冠状病毒肺炎的疫苗，包括权利要求1或2所述蛋白质；

(d2)一种用于人新型冠状病毒肺炎的疫苗，包括权利要求5所述COVID-19亚单位疫苗；

(d3)一种用于人新型冠状病毒肺炎的疫苗，包括权利要求7所述COVID-19亚单位疫苗。

9.权利要求1或2所述蛋白质、权利要求5所述COVID-19亚单位疫苗或权利要求7所述COVID-19亚单位疫苗在制备用于预防和/或治疗人新型冠状病毒肺炎的疫苗中的应用。

10.组分甲和组分乙在制备用于预防和/或治疗人新型冠状病毒肺炎的疫苗中的应用；

所述组分甲为权利要求1或2所述蛋白质、权利要求5所述COVID-19亚单位疫苗或权利要求7所述COVID-19亚单位疫苗；

所述组分乙为疫苗佐剂。