CN112724209B

CN112724209B - 可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其载体和应用

Info

Publication number: CN112724209B
Application number: CN202110060234.5A
Authority: CN
Inventors: 彭涛; 许煜华; 冯金; 郭伟丽; 陈丽云; 郑燕萍; 王炳彰; 刘双标
Original assignee: South China Vaccine Co ltd
Current assignee: South China Vaccine Co ltd
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2041-01-18
Also published as: CN112724209A

Abstract

本发明公开了可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其载体和应用，冠状病毒重组蛋白为缺失至少部分C末端胞浆尾区的冠状病毒Spiker蛋白。本发明一些实例的冠状病毒重组蛋白，可以有效形成纳米颗粒，结构稳定并具有良好的免疫原性。本发明一些实例的冠状病毒重组蛋白，表达量高，同时易于纯化。本发明一些实例的冠状病毒重组蛋白及其纳米颗粒，有望制备成为冠状病毒的检测试剂原料、疫苗、抗体、预防或治疗性药物。

Description

可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其载体和应用

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白，特别涉及可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其载体和应用。

背景技术

冠状病毒属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)，是许多家畜、宠物包括人类疾病的重要病原，引起多种急慢性疾病。根据系统发育树，冠状病毒可分为四个属：α、β、γ、δ，其中β属冠状病毒又可分为四个独立的亚群A、B、C和D群。

冠状病毒感染在世界各地极为普遍。到目前为止，大约有15种不同冠状病毒株被发现，能够感染多种哺乳动物和鸟类，有些可使人发病。除了近期爆发的新型冠状病毒SARS-CoV-2，还有HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV等六种冠状病毒可以感染人类，其中SARS-CoV和MERS-CoV感染后比较严重，分别引发重症急性呼吸综合征和中东呼吸综合征。

新冠病毒(SARS-CoV-2)有四种主要的结构蛋白：刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)，膜蛋白(Membrane protein，M蛋白)，包膜蛋白(Envelope protein，E蛋白)。其中刺突蛋白S蛋白有两个亚基：S1和S2，受体结合位点(RBD)位于S1亚基上。它以三聚体的形式组成病毒粒子外膜表面的刺突，其主要功能是识别宿主细胞表面受体，介导与宿主细胞的融合。在感染过程中，S蛋白被宿主蛋白酶(S蛋白一个福林酶酶切位点)切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，并从融合前状态转变为融合后状态。

同时S蛋白及其受体结构域RBD主要负责诱导宿主免疫反应和病毒中和抗体，是疫苗设计的关键抗原位点。在疫苗设计时，一般将S蛋白弗林酶酶切位点突变(氨基酸682-685)，将QQ突变为PP(氨基酸986-987)，维持其融合前构象，保持高免疫原性。

以RBD蛋白作为抗原研究存在一些问题，尤其是RBD蛋白分子量太小(约33kDa)，虽然容易表达和纯化，但是不够稳定，容易降解，免疫原性偏弱，一般动物/临床评价需要免疫三针，且免疫剂量相对偏高。融合前的S蛋白(PDB:7JJI_A)全长免疫原性较高，但是在表达分泌/定位于细胞膜时，与细胞内的高尔基体等细胞器结合，易以包涵体存在，产量较低。因此在保持高免疫原性的同时，如何提高S蛋白的产量，具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其表达载体和应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种冠状病毒重组蛋白，其为缺失C末端胞浆尾区末端21个氨基酸(cytoplasmictail)的冠状病毒Spiker蛋白，记为S-△CT。

在一些实例中，所述冠状病毒选自SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1。

在一些实例中，S-△CT的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示。

本发明的第二个方面，提供：

一种核苷酸序列，其可编码本发明第一个方面所述的冠状病毒重组蛋白。

在一些实例中，核苷酸序列根据宿主细胞的不同而进行序列优化。

在一些实例中，核苷酸序列如SEQ ID NO.：2所示。

本发明的第三个方面，提供：

一种表达冠状病毒重组蛋白的载体，包括骨架载体，所述骨架载体插入有本发明第二个方面所述的核苷酸序列。

在一些实例中，所述骨架载体选自pFastBac^TM-SCUVI、pFastBac^TM-Dual载体、pESCURA载体、pVIVO2-mcs载体、pCDNA3.1载体、pBudCE4.1载体或者pET系列载体

在一些实例中，载体的宿主细胞为Spodoptera frugiperda草地夜蛾细胞Sf9、粉纹夜蛾细胞High five、果蝇s2细胞、酿酒酵母、大肠杆菌或哺乳动物细胞。

本发明的第四个方面，提供：

冠状病毒重组蛋白纳米颗粒，由本发明第一个方面所述的冠状病毒重组蛋白自聚得到。

本发明的第五个方面，提供：

冠状病毒重组蛋白及其纳米颗粒的应用，所述冠状病毒重组蛋白如本发明第一个方面所述，所述应用包括制备检测试剂原料、疫苗、抗体、预防或治疗性药物。

本发明的第六个方面，提供：

一种试剂，包括本发明第一个方面所述的冠状病毒重组蛋白，或本发明第四个方面所述的冠状病毒重组蛋白纳米颗粒。

在一些实例中，所述试剂为检测试剂、疫苗、抗原、预防或治疗性药物。

本发明的有益效果是：

本发明一些实例的冠状病毒重组蛋白，可以有效形成纳米颗粒，结构稳定并具有良好的免疫原性。

本发明一些实例的冠状病毒重组蛋白，表达量高，同时易于纯化。

本发明一些实例的冠状病毒重组蛋白及其纳米颗粒，有望制备成为冠状病毒的检测试剂原料、疫苗、抗体、预防或治疗性药物。

附图说明

图1是SARS-CoV-2的S-△21CT和S蛋白氨基酸结构示意图；

图2是SARS-CoV-2的S-△21CT和S蛋白表达WB分析图

图3是SARS-CoV-2的S-△21CT和S蛋白ELISA检测分析图；

图4是SARS-CoV-2的S-△21CT和S蛋白纯化样品SDS-PAGE分析图；

图5是SARS-CoV-2的S-△21CT蛋白纳米颗粒电镜分析分析图；

图6是SARS-CoV-2的S-△21CT蛋白纳米颗粒诱导的总IgG抗体效价分析图，A:针对RBD，B：针对S全长蛋白；

图7是SARS-CoV-2S-21△CT蛋白纳米颗粒诱导中和抗体的分析图(假病毒)。

具体实施方式

核苷酸序列优选根据宿主细胞的偏好性进行密码子优化，以进一步提高其表达量。

所述骨架载体可以业内公知的载体，包括但不限于pFastBac^TM-SCUVI、pFastBac^TM-Dual载体、pESC URA载体、pVIVO2-mcs载体、pCDNA3.1载体、pBudCE4.1载体或者pET系列载体等。

载体的宿主细胞可以是业内周知的表达细胞，包括但不限于Spodopterafrugiperda草地夜蛾细胞Sf9、粉纹夜蛾细胞High five、果蝇s2细胞、酿酒酵母、大肠杆菌或哺乳动物细胞等。

示例性的，表达冠状病毒重组蛋白的方法，包括如下步骤：

1)将冠状病毒重组蛋白载体与线性化的重组杆状病毒杆粒共转染Sf-ɑ昆虫细胞，培养后得到包含编码冠状病毒重组蛋白的重组杆状病毒；

2)使用包含冠状病毒重组蛋白的重组杆状病毒感染昆虫细胞，培养至产生足够的冠状病毒重组蛋白；

3)收集宿主细胞并使用裂解液裂解细胞；

4)去除细胞碎片，得到的清液分别经过强阳离子EMD SO3纯化、外源凝集素亲和介质Lentil Lectin Sepharose 4B和分子筛纯化，得到纯化的冠状病毒重组蛋白。

下面以SARS-Cov-2的Spike蛋白为例，进一步说明本发明的技术方案。

SARS-Cov-2的Spike蛋白结构如图1的S所示，由S1和S2亚基组成，S2亚基通过跨膜区锚定在膜上，它含有膜融合过程所需要的基本元件，包括：一个内在的膜融合肽(fusionpeptide，FP)，两个7肽重复序列(heptad repeat，HR)、一个跨膜临近区(juxamembraindomain，JMD)和一个跨膜结构域(transmembrane domain，TMD)，以及C末端的胞浆区域(cytoplasmic domain，CD)(约40个氨基酸长度)。发明人意外发现，通过缺失CD区末端胞浆尾区(cytoplasmic tail)的部分氨基酸，特别是其C末端的21个氨基酸(图1的S-△21CT)，蛋白表达后，可以被裂解液有效地释放至上清中，显著提高了其产量，同时出人意料地提高了免疫原性(免疫一针时)。

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

材料和试剂：

1主要材料

病毒：假病毒(pCDNA3.1-M-S、和pHIV-Lucifeiace和psPAX2共转染293FT细胞，包装获得的假病毒)；

细胞：无弹状病毒昆虫贴壁细胞Sf-βT(广东华南疫苗有限公司筛选)、无弹状病毒昆虫悬浮细胞Sf-βX(广东华南疫苗有限公司筛选)。

1.2主要试剂

KOD FX高保真酶：东洋纺(上海)生物科技有限公司；卡那霉素、庆大霉素、四环素、

X-gal、IPTG(北京鼎国)；

LB培养基(Sigma)；

Grace's培养基、FBS(Gibco)；

Vigor^TM-S100S培养基(上海倍谙基生物科技有限公司)；

CellfectinⅡ脂质体(Thermo Fisher)；

RBD鼠多抗(利用293T细胞表达的RBD蛋白免疫的小鼠)；

HRP羊抗鼠二抗(北京鼎国)；

S蛋白兔多抗(利用昆虫细胞表达的S蛋白免疫新西兰兔获得血清，并经纯化得到的兔多抗)；

S蛋白豚鼠多抗(利用昆虫细胞表达的S蛋白免疫豚鼠获得血清，并经纯化得到的豚鼠多抗)。

实施例1

SARS-CoV-2重组蛋白为新型冠状病毒SARS-CoV-2Spike蛋白缺失C末端胞浆尾区21个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示。根据宿主细胞的偏好性进行密码子优化，合成优化的蛋白基因序列，如SEQ ID NO.：2所示。置于pOET1质粒的P_polh启动子下。获得穿梭载体pOET1-S-△21CT，即表达新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白的载体。其构建方法包括

1)基因优化合成和载体构建

将新型冠状病毒SARS-CoV-2融合前Spike蛋白，根据宿主细胞Spodopterafrugiperda草地夜蛾(Sf9)细胞系的偏爱性进行密码子虫源优化，PUC57为载体，以Xho I,Kpn I为酶切位点合成S，并将其克隆至PUC57载体中，得重组载体PUC57-S。

2)穿梭载体制备

利用同源重组的方法，将载体PUC57-S中的S克隆至置于pOET1质粒的P_polh启动子下。获得穿梭载体pOET1-S。利用相同的方法，缺失S蛋白C端21个氨基酸，构建穿梭载体pOET1-S-△21CT

3)重组杆状病毒的制备

分别将穿梭载体pOET1-S-△21CT或者pOET1-S和flashBac共转染无弹状病毒昆虫贴壁细胞Sf-βT，获得相应的第一代重组杆状病毒，即重组杆状病毒，分别命名为f-Bac^-S-△21CT和f-Bac^-S。

对上述制得的重组杆状病毒进行以下相关检测。

重组杆状病毒蛋白表达Western blot分析

将上述制得的f-Bac^-S-△21CT或者f-Bac^-S重组杆状病毒以0.5MOI感染无弹状病毒昆虫悬浮细胞Sf-βX，以Vigor^TM-S100S悬浮培养基，培养72小时，分别收集细胞和上清，取细胞和上清样品进行12％的SDS-PAGE电泳，转印PVDF膜，5％的脱脂奶粉封闭过夜，PBST漂洗5次，以1:4000稀释一抗RBD鼠多抗，室温孵育2h，PBST稀释5次，HRP标记的二抗羊抗鼠室温孵育1.5小时，PBST漂洗5次，利用超敏发光液(A液25ml、B液25ml)进行压片显色。检测结果如图2所示，表达3天后的细胞中检测到目的蛋白^-S-△21CT和S(170-180kDa之间)。

新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白S-△21CT及S蛋白的制备、表达分析、蛋白纯化和电镜分析

1)以上述构建得到的重组杆状病毒分别以0.5MOI感染Sf-βX细胞，每个样品表达2L，培养3天收获病毒上清；

2)SARS-CoV-2重组蛋白的纯化：将重组杆状病毒以MOI＝0.5感染Sf-βX悬浮细胞，样品表达2L，培养4天待细胞完全病变后收获细胞沉淀；

3)将收获的细胞以10ml/mg加入裂解液25mM phosphate buffer，pH 8.0；50mMNaCl；0.1％NP9；在冰上均匀搅拌2h，然后将裂解产物使用高速离心收集上清；

4)取部分上清，利用双抗夹心法ELISA(包被豚鼠S蛋白抗体，抗体使用HRP标记的兔抗S蛋白抗体)检测上清中的S或者S-△21CT蛋白表达量；如图3所示，释放至上清的S-21△CT蛋白量是S蛋白的两倍以上，说明S-21△CT更容易释放至上清中，更利于后期的疫苗生产；再将上清液经分别经强阴离子柱EMD TMAE，强阳离子EMD SO3纯化和外源凝集素亲和介质GST-Sepharose 4B填料纯化，即可获得S-△21CT或者S蛋白。

如图4所示，纯化后的S-△CT或者S蛋白大小在170-180kDa之间。

将纯化后的S-△21CT置换为25mM phosphate buffer，pH 8.0；50mM NaCl；0.01％PS80缓冲液，再进行电镜观察，如图5所示，电镜负染结果表明视野中出现高浓度、结构完整的纳米颗粒，其直径大小为30nm。

新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白疫苗效力分析

1)疫苗的制备和免疫程序

购买SPF级6-8周龄BALB/c雌性小鼠，分为7组，每组7只，分别免疫不同剂量的S-△CT和S蛋白，剂量分别为0.25μg，1μg和5μg，使用的佐剂Alhydrogel剂量为100μg，免疫体积为100μl。同时设置只免疫佐剂Alhydrogel的为阴性对照。免疫程序：0，14天进行免疫两次，28天后小鼠眼球采血，收集血清，-80℃分装保存待检测。

2)免疫小鼠血清总IgG抗体效价

取RBD或者S蛋白按50ng/孔在ELISA版中，4℃包被过夜；第二天，小鼠血清以倍比稀释的方式稀释到合适浓度，将稀释后的血清按100μl/孔加入ELISA板中，另加入抗体稀释液作为空白对照，37℃孵育1h；用PBST洗板3次，辣根酶标记山羊抗鼠以1:10000稀释，加入孔板，100μl/孔，37度孵育1h；洗板6次，加入显色液，100μl/孔，37℃避光显色15～20min。取出板子，加入2M H2SO4终止液，50μl/孔，振荡板子混匀，于酶标仪iMark读OD450nm吸光值；若待测孔OD值>0.1且大于阴性对照孔的2.1倍(P/N>2.1，其中P为待测血清在某一稀释倍数测定的OD值，N为阴性血清在相应稀释倍数时测定的OD值)，判定为阳性，以判定为阳性的血清最高稀释倍数为血清抗体效价。

实验结果如图6所示，S-△21CT和S蛋白免疫一针，低剂量(0.25μg)、中剂量(1μg)和高剂量(5μg)时都可以诱导高滴度的RBD或者S蛋白特异性总IgG抗体效价，特别是免疫低剂量-0.25μg时，S-△CT诱导的针对S蛋白蛋白特异性总IgG抗体效价高于融合前S蛋白，差异极显著。当免疫两针时，针对RBD或者S蛋白特异性总IgG抗体效价，S-△21CT/S蛋免疫的小鼠血清都显著提高。

3)免疫小鼠血清中和抗体滴度

假病毒的制备和病毒滴定：按照转染试剂Lipofectamine 3000的操作说明，将带有pCDNA3.1-Spike、和pWPXL-Lucifeiace和psPAX2三种质粒的OPTI-MEM培养基中，与含有适量lipofectamine 3000及P3000转染试剂的OPTI-MEM培养基混合，混匀后室温静置15分钟，将混合液逐滴加入239T细胞中，37℃、5％的CO₂培养8小时候后将培养液弃去，换成新鲜DMEM培养基继续培养，48和72小时后收获含SARS-CoV-2假病毒的上清。1000rpm/min离心5min，0.45um滤膜过滤后收集上清分装于-80℃保存，并进行病毒滴度测定。

血清抗体效价检测：取各组小鼠血清样品，56℃灭活30min，用DMEM培养基倍比稀释。将SARS-CoV-2假病毒用DMEM培养基稀释到200CCID50/100μL。稀释后的病毒液、样品各取100μl，混合均匀，室温孵育30min。吸去293T-ACE2细胞培养上清，取200μl混合液加入到96孔板293T-ACE2细胞中，每个血清稀释度2个复孔。置于CO₂培养箱中培养48小时，取出96孔板，弃去上清，加入裂解液，裂解细胞后加入荧光素酶酶底物，检测荧光素酶活性值。计算血清样品的假病毒中和抑制率，得到中和抗体效价(EC50)

实验结果如图7所示，阴性对照小鼠血清无中和抗体效价，S-△21CT低剂量(0.25μg)免疫一针可以诱导1:165.9的中和抗体效价，高于融合前蛋白S相同剂量的1:80.17，免疫二针可以诱导1：1500左右的中和抗体效价，与融合前S蛋白相当。

综上所述，S-△21CT表达量是S蛋白的两倍以上，且低剂量可以诱导更高的中和抗体效价。上述结果说明，本发明制备的冠状病毒重组蛋白表达量较高，且可以诱导产生的较强的中和抗体效价，表现出较好的免疫原性，因此本发明制备的新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白纳米颗粒疫苗可作为预防新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的肺炎的候选疫苗。

为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内，如将上述实施例中的宿主细胞改为酵母细胞、大肠杆菌或哺乳细胞等等，从而根据宿主细胞选择相应的骨架载体，进行同以上实验例类似的表达冠状病毒重组蛋白载体的构建，以及冠状病毒重组蛋白的制备等，均落在本发明要求的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东华南疫苗股份有限公司

<120> 可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其载体和应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1252

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 1

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Gln Gln Ala Gln Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn

1010 1015 1020

Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys

1025 1030 1035

Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro

1040 1045 1050

Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

1055 1060 1065

Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

1070 1075 1080

Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn

1085 1090 1095

Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln

1100 1105 1110

Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val

1115 1120 1125

Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro

1130 1135 1140

Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1145 1150 1155

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn

1160 1165 1170

Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

1175 1180 1185

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1190 1195 1200

Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu

1205 1210 1215

Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met

1220 1225 1230

Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Ser Cys Gly Ser

1250

<210> 2

<211> 3759

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgttcgtgt tcttggtgtt gttgcctttg gtgtcttctc agtgcgtgaa cctgaccacc 60

aggacccagc tgccccctgc ctacaccaac tccttcaccc gcggtgtcta ctaccccgac 120

aaggtgttcc gctcctccgt gctgcactcc actcaggacc tgttcctgcc tttcttctcc 180

aacgtcacct ggttccacgc tatccacgtc tccggcacta acggtactaa gcgcttcgac 240

aaccccgtcc tgcctttcaa cgacggtgtg tacttcgctt ccaccgagaa gtccaacatc 300

atccgcggtt ggatcttcgg caccaccctc gactccaaga ctcagtcact cctgatcgtg 360

aacaacgcta ccaacgtggt gatcaaggtg tgtgagttcc aattctgcaa cgaccccttc 420

ctgggtgtgt actaccacaa gaacaacaag agctggatgg agtccgaatt ccgcgtgtac 480

tccagtgcca acaactgcac cttcgagtac gtgtcccagc ctttcctgat ggacctcgaa 540

ggaaagcagg gtaacttcaa gaacctgaga gagttcgtgt tcaagaacat cgatggctac 600

ttcaagatct acagcaagca cacacccatc aacctcgtcc gcgacctgcc tcaaggtttc 660

tccgccctgg agcccctggt ggacctgcct atcggtatca acatcacccg tttccagacc 720

ctgctcgccc tgcaccgctc ctacctcacc cctggtgact cctcctccgg ttggaccgct 780

ggtgctgctg cttactacgt gggttacctg cagccccgca ccttcctcct caagtacaac 840

gaaaacggta ctatcaccga cgctgtggac tgcgctctcg accctctgtc cgaaaccaag 900

tgcaccctga agtccttcac cgtcgaaaag ggtatctacc agacctccaa cttccgcgtg 960

cagcctaccg agtccatcgt gcgtttcccc aacatcacca acctctgccc tttcggtgag 1020

gtgttcaacg ctacccgctt cgctagcgtg tacgcctgga accgcaagcg catctccaac 1080

tgcgtggctg actactccgt cctgtacaac tccgcttcct tctccacctt caagtgctac 1140

ggtgtgtccc ctaccaagct gaacgacctc tgcttcacca acgtctacgc cgactccttc 1200

gtgatccgcg gcgacgaggt ccgccaaatc gctcctggtc agaccggaaa gatcgctgat 1260

tacaactaca agctgcccga cgacttcacc ggttgcgtga tcgcctggaa ctccaacaac 1320

ctggactcta aggtgggtgg taactacaac tacctctacc gcctgttccg caagagcaac 1380

ctcaagccct tcgaaaggga catctccaca gagatctacc aagctggctc cacaccttgc 1440

aacggtgtgg aaggtttcaa ctgctacttc cccctgcaat cctacggttt ccagcccacc 1500

aacggtgtgg gataccagcc ttaccgcgtg gtcgtgctct ccttcgagct gctccacgct 1560

cctgctaccg tgtgcggtcc taagaagtcc accaacctcg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620

ttcaacttca acggtctcac cggcaccggt gtcctcaccg agtccaacaa gaagttcctc 1680

cctttccagc agttcggtcg cgacatcgct gataccaccg acgccgtccg cgaccctcag 1740

accctcgaaa tcctcgacat caccccttgc tccttcggtg gtgtgtccgt gatcacccct 1800

ggtactaaca cctccaacca agtcgctgtg ctgtaccaag atgtgaactg caccgaggtg 1860

cctgtggcta tccacgctga ccagctgacc cctacttggc gcgtgtacag caccggttct 1920

aacgtgttcc agacccgcgc tggttgtctc atcggtgctg agcacgtgaa caactcctac 1980

gagtgcgaca tccctatcgg tgctggtatc tgcgcttcct accagactca gactaactcc 2040

cctcagcagg cccaatccgt ggcctcccag tccatcatcg cctacaccat gtccctgggt 2100

gctgaaaact ccgtggctta ctccaacaac tccatcgcca tccctaccaa cttcaccatc 2160

tccgtcacca ccgagatcct ccccgtctcc atgaccaaga cctccgtgga ctgcactatg 2220

tacatctgcg gtgactccac cgaatgctcc aacctgctgc tccaatacgg ctccttctgc 2280

acccaactca accgcgctct caccggcatc gccgtggaac aggacaagaa cacccaggag 2340

gtcttcgctc aggtcaagca gatctacaag acccccccta tcaaggactt cggcggtttc 2400

aacttctcac aaatcctccc cgacccctcc aagccctcca agcgctcctt catcgaagat 2460

ctgctgttca acaaggtcac cctcgctgac gccggcttca tcaagcagta cggtgactgc 2520

ctgggcgaca tcgctgctag agacctcatc tgcgctcaaa agttcaacgg cctgaccgtc 2580

ctcccccccc tgctgactga cgaaatgatc gctcagtaca cctccgccct gttggctggt 2640

actatcactt ccggttggac tttcggcgct ggtgctgccc tccaaatccc tttcgctatg 2700

cagatggctt accgcttcaa cggtatcggt gtgacccaga acgtgctgta cgaaaaccag 2760

aagctgatcg ctaaccagtt caactctgct atcggtaaga tccaggactc cttgtccagc 2820

accgcttccg ctctcggtaa gctgcaggat gtggtgaacc agaacgccca agccctcaac 2880

actctggtca agcaactcag ctccaacttc ggtgccatct cctctgtgtt gaacgacatc 2940

ttgtcccgcc tcgatccccc cgaggctgag gtgcagatcg accgcctgat caccggccgc 3000

ctccagtccc tccaaaccta cgtgacccag cagctgatcc gcgctgctga aatccgcgcc 3060

tccgctaacc tggctgctac caagatgtcc gaatgcgtgc tcggtcagtc caagagagtc 3120

gacttctgcg gcaagggcta ccacctcatg tccttccctc agagtgctcc ccacggtgtg 3180

gtgttcctcc acgtgaccta cgtgcctgct caggagaaga acttcaccac cgcccctgct 3240

atctgtcacg acggtaaggc tcacttccct cgcgagggtg tgttcgtctc caacggtact 3300

cactggttcg tgacccaacg caacttctac gagccccaaa tcatcaccac cgacaacacc 3360

ttcgtctccg gtaactgtga cgtcgtcatc ggtatcgtga acaacaccgt gtacgaccct 3420

ctgcagcctg aactcgactc cttcaaggaa gaactcgaca agtacttcaa gaaccacacc 3480

tcccccgacg tcgacctggg tgacatctcc ggcatcaacg cctccgtggt gaacatccaa 3540

aaggagatcg accgcctcaa cgaagtggct aagaacctga acgagagcct gatcgacctc 3600

caagagctgg gaaagtacga gcagtacatc aagtggcctt ggtacatctg gctgggtttc 3660

atcgctggac tcatcgccat cgtgatggtg accatcatgc tgtgctgcat gacatcctgc 3720

tgttcttgcc tgaagggttg ctgctcctgc ggttcctaa 3759

Claims

1.一种冠状病毒重组蛋白，其为缺失C末端胞浆尾区末端21个氨基酸的冠状病毒Spiker蛋白，记为S-△CT，其氨基酸序列为MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPQQAQSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGS。

2.一种核苷酸序列，其可编码权利要求1所述的冠状病毒重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于：其序列为ATGTTCGTGTTCTTGGTGTTGTTGCCTTTGGTGTCTTCTCAGTGCGTGAACCTGACCACCAGGACCCAGCTGCCCCCTGCCTACACCAACTCCTTCACCCGCGGTGTCTACTACCCCGACAAGGTGTTCCGCTCCTCCGTGCTGCACTCCACTCAGGACCTGTTCCTGCCTTTCTTCTCCAACGTCACCTGGTTCCACGCTATCCACGTCTCCGGCACTAACGGTACTAAGCGCTTCGACAACCCCGTCCTGCCTTTCAACGACGGTGTGTACTTCGCTTCCACCGAGAAGTCCAACATCATCCGCGGTTGGATCTTCGGCACCACCCTCGACTCCAAGACTCAGTCACTCCTGATCGTGAACAACGCTACCAACGTGGTGATCAAGGTGTGTGAGTTCCAATTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGTGTGTACTACCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAGTCCGAATTCCGCGTGTACTCCAGTGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGTCCCAGCCTTTCCTGATGGACCTCGAAGGAAAGCAGGGTAACTTCAAGAACCTGAGAGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGATGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACACCCATCAACCTCGTCCGCGACCTGCCTCAAGGTTTCTCCGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCTATCGGTATCAACATCACCCGTTTCCAGACCCTGCTCGCCCTGCACCGCTCCTACCTCACCCCTGGTGACTCCTCCTCCGGTTGGACCGCTGGTGCTGCTGCTTACTACGTGGGTTACCTGCAGCCCCGCACCTTCCTCCTCAAGTACAACGAAAACGGTACTATCACCGACGCTGTGGACTGCGCTCTCGACCCTCTGTCCGAAACCAAGTGCACCCTGAAGTCCTTCACCGTCGAAAAGGGTATCTACCAGACCTCCAACTTCCGCGTGCAGCCTACCGAGTCCATCGTGCGTTTCCCCAACATCACCAACCTCTGCCCTTTCGGTGAGGTGTTCAACGCTACCCGCTTCGCTAGCGTGTACGCCTGGAACCGCAAGCGCATCTCCAACTGCGTGGCTGACTACTCCGTCCTGTACAACTCCGCTTCCTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGTGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTCTGCTTCACCAACGTCTACGCCGACTCCTTCGTGATCCGCGGCGACGAGGTCCGCCAAATCGCTCCTGGTCAGACCGGAAAGATCGCTGATTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGTTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAACCTGGACTCTAAGGTGGGTGGTAACTACAACTACCTCTACCGCCTGTTCCGCAAGAGCAACCTCAAGCCCTTCGAAAGGGACATCTCCACAGAGATCTACCAAGCTGGCTCCACACCTTGCAACGGTGTGGAAGGTTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAATCCTACGGTTTCCAGCCCACCAACGGTGTGGGATACCAGCCTTACCGCGTGGTCGTGCTCTCCTTCGAGCTGCTCCACGCTCCTGCTACCGTGTGCGGTCCTAAGAAGTCCACCAACCTCGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGTCTCACCGGCACCGGTGTCCTCACCGAGTCCAACAAGAAGTTCCTCCCTTTCCAGCAGTTCGGTCGCGACATCGCTGATACCACCGACGCCGTCCGCGACCCTCAGACCCTCGAAATCCTCGACATCACCCCTTGCTCCTTCGGTGGTGTGTCCGTGATCACCCCTGGTACTAACACCTCCAACCAAGTCGCTGTGCTGTACCAAGATGTGAACTGCACCGAGGTGCCTGTGGCTATCCACGCTGACCAGCTGACCCCTACTTGGCGCGTGTACAGCACCGGTTCTAACGTGTTCCAGACCCGCGCTGGTTGTCTCATCGGTGCTGAGCACGTGAACAACTCCTACGAGTGCGACATCCCTATCGGTGCTGGTATCTGCGCTTCCTACCAGACTCAGACTAACTCCCCTCAGCAGGCCCAATCCGTGGCCTCCCAGTCCATCATCGCCTACACCATGTCCCTGGGTGCTGAAAACTCCGTGGCTTACTCCAACAACTCCATCGCCATCCCTACCAACTTCACCATCTCCGTCACCACCGAGATCCTCCCCGTCTCCATGACCAAGACCTCCGTGGACTGCACTATGTACATCTGCGGTGACTCCACCGAATGCTCCAACCTGCTGCTCCAATACGGCTCCTTCTGCACCCAACTCAACCGCGCTCTCACCGGCATCGCCGTGGAACAGGACAAGAACACCCAGGAGGTCTTCGCTCAGGTCAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCTATCAAGGACTTCGGCGGTTTCAACTTCTCACAAATCCTCCCCGACCCCTCCAAGCCCTCCAAGCGCTCCTTCATCGAAGATCTGCTGTTCAACAAGGTCACCCTCGCTGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGTGACTGCCTGGGCGACATCGCTGCTAGAGACCTCATCTGCGCTCAAAAGTTCAACGGCCTGACCGTCCTCCCCCCCCTGCTGACTGACGAAATGATCGCTCAGTACACCTCCGCCCTGTTGGCTGGTACTATCACTTCCGGTTGGACTTTCGGCGCTGGTGCTGCCCTCCAAATCCCTTTCGCTATGCAGATGGCTTACCGCTTCAACGGTATCGGTGTGACCCAGAACGTGCTGTACGAAAACCAGAAGCTGATCGCTAACCAGTTCAACTCTGCTATCGGTAAGATCCAGGACTCCTTGTCCAGCACCGCTTCCGCTCTCGGTAAGCTGCAGGATGTGGTGAACCAGAACGCCCAAGCCCTCAACACTCTGGTCAAGCAACTCAGCTCCAACTTCGGTGCCATCTCCTCTGTGTTGAACGACATCTTGTCCCGCCTCGATCCCCCCGAGGCTGAGGTGCAGATCGACCGCCTGATCACCGGCCGCCTCCAGTCCCTCCAAACCTACGTGACCCAGCAGCTGATCCGCGCTGCTGAAATCCGCGCCTCCGCTAACCTGGCTGCTACCAAGATGTCCGAATGCGTGCTCGGTCAGTCCAAGAGAGTCGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTCATGTCCTTCCCTCAGAGTGCTCCCCACGGTGTGGTGTTCCTCCACGTGACCTACGTGCCTGCTCAGGAGAAGAACTTCACCACCGCCCCTGCTATCTGTCACGACGGTAAGGCTCACTTCCCTCGCGAGGGTGTGTTCGTCTCCAACGGTACTCACTGGTTCGTGACCCAACGCAACTTCTACGAGCCCCAAATCATCACCACCGACAACACCTTCGTCTCCGGTAACTGTGACGTCGTCATCGGTATCGTGAACAACACCGTGTACGACCCTCTGCAGCCTGAACTCGACTCCTTCAAGGAAGAACTCGACAAGTACTTCAAGAACCACACCTCCCCCGACGTCGACCTGGGTGACATCTCCGGCATCAACGCCTCCGTGGTGAACATCCAAAAGGAGATCGACCGCCTCAACGAAGTGGCTAAGAACCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTCCAAGAGCTGGGAAAGTACGAGCAGTACATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGTTTCATCGCTGGACTCATCGCCATCGTGATGGTGACCATCATGCTGTGCTGCATGACATCCTGCTGTTCTTGCCTGAAGGGTTGCTGCTCCTGCGGTTCCTAA。

4.一种表达冠状病毒重组蛋白的载体，包括骨架载体，其特征在于：所述骨架载体插入有权利要求2或3所述的核苷酸序列。

5.冠状病毒重组蛋白纳米颗粒，由权利要求1所述的冠状病毒重组蛋白自组装得到。

6.一种试剂，包括权利要求1所述的冠状病毒重组蛋白，或权利要求5所述冠状病毒重组蛋白纳米颗粒中的至少一种。