CN109289047B - 一种通用型h5亚型禽流感亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗及其制备方法，属于基因工程领域。该通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗中抗原为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白。本发明通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗具有广谱性，能与H5亚型禽流感不同分支病毒阳性血清发生特异性反应，免疫效力试验表明该抗原安全、无不良反应，可诱导机体产生与商品苗相似的抗体水平，具有较好的免疫效果。

Description

一种通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗及其制备方法。
背景技术
H5亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是危害我国养禽业发展的重要传染病，给养禽业造成了严重的经济损失。目前，在流感病毒编码的蛋白中，以HA蛋白研究最为深入，HA蛋白以三聚体形式存在于病毒粒子表面，HA蛋白包含表面抗原决定簇，其在病毒抗原性、病毒入侵及激发机体产生保护性抗体等方面起着决定性作用，因而成为疫苗研制的重要靶蛋白。
目前，我国防控H5亚型禽流感的主要手段依然是免疫接种。传统灭活疫苗虽然能给家禽提供有效的免疫保护，但同时也存在诸多不足。首先流感病毒抗原易发生变异，由于传统灭活疫苗不具有广谱性，对变异毒株缺乏有效的保护，需经常更换毒株；其次，传统灭活疫苗采用强毒灭活，灭活工艺不严谨常常会导致活毒的污染，生物安全性较低。
因此，急需开发一种高效、通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗来弥补这些不足。但是，现有技术中缺少有效的通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗，为H5亚型禽流感的防控提供更好的预防和控制效果。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗，所述疫苗中抗原为氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示的蛋白。
在本发明中，通过培养携带所述蛋白编码基因的重组杆状病毒制备所述疫苗抗原。
优选的技术方案中，所述蛋白编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明中，所述重组杆状病毒采用如下方法构建：在SEQ ID NO:1的5’端添加kozak序列，3’端添加Leu zip序列，然后插入杆状病毒转移载体pFastBac1中，得到重组杆状病毒转移质粒；将所述重组杆状病毒转移质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭质粒；将所述重组杆状病毒穿梭质粒转染昆虫细胞Sf9，获得表达所述抗原的重组杆状病毒。
优选的技术方案中，采用High Five细胞培养所述重组杆状病毒。
优选的技术方案中，将所述抗原灭活，加入其体积4%的吐温-80，乳化，得到水相；将96体积份白油和4体积份司本-80混合均匀，得到油相；将水相和油相按照体积比1:3混合、乳化，得到所述疫苗。
优选的技术方案中，采用甲醛灭活所述抗原。
本发明通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗具有广谱性，能与H5亚型禽流感不同分支病毒阳性血清发生特异性反应，免疫效力试验表明该抗原安全、无不良反应，可诱导机体产生与商品苗相似的抗体水平，具有较好的免疫效果。将本发明通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗中的抗原基因，克隆进杆状病毒表达系统（Invitrogen），就能够获得该抗原，制备方法简单、高效。
附图说明
图1显示间接免疫荧光鉴定结果，（A）重组HAs杆状病毒感染的Sf9细胞荧光示意图；（B）野生杆状病毒感染的Sf9细胞荧光示意图。
图2显示Western-blot鉴定结果，M:蛋白分子量标记；泳道1，2：重组HAs蛋白；泳道3：阴性对照。
图3显示重组HAs蛋白微量血凝试验结果，每孔上方标出了该孔中重组HAs蛋白的稀释倍数。
图4显示重组HAs蛋白与H5亚型禽流感不同分支病毒阳性血清交叉反应结果，横坐标显示了反应中的四单位检测抗原，纵坐标为血清抗体的HI效价，HAs是重组HAs蛋白的缩写，HAs阳性血清是指重组HAs蛋白抗血清。
图5显示免疫后不同时间各组SPF鸡血清针对Re-6（图5（A））、Re-7（图5（B））、Re-8（图5（C））的HI水平。其中HA是H5亚型禽流感亚单位疫苗的缩写，横坐标wpv是weeks postvaccination的缩写，指免疫后周数；纵坐标是抗不同抗原抗体的HI效价。
具体实施方式
通过以下实验的具体实施方式可更进一步地理解本发明。
用于下列实施例的实验材料如下：
各种限制性内切酶、T4连接酶、rTaq酶等购自Takara公司。引物由金斯瑞公司合成。转染试剂盒及昆虫细胞培养基均购自Invitrogen公司。FITC标记的羊抗鸡荧光抗体购自Thermo公司。H5亚型禽流感检测抗原（H5亚型禽流感病毒Re-6检测抗原、H5亚型禽流感病毒Re-7检测抗原、H5亚型禽流感病毒Re-8检测抗原）、H5亚型禽流感病毒Re-6阳性血清、H5亚型禽流感病毒Re-7阳性血清和H5亚型禽流感病毒Re-8阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司。SPF鸡胚购自勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。H5亚型禽流感阳性血清是利用重组禽流感病毒二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株和H7N9 H7-Re-1株）免疫SPF鸡所得的高免血清。重组HAs蛋白抗血清是利用重组HAs蛋白制备疫苗后免疫SPF鸡所得的血清。重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（Re-4株和Re-6株）和重组禽流感病毒二价灭活疫苗（H5N1Re-8株和H7N9 H7-Re-1株），生产厂家为青岛易邦生物工程有限公司。M13通用引物是根据Bac-to-Bac系统说明书（Invitrogen公司）合成所得。
实施例1
1.H5亚型禽流感疫苗抗原的设计、合成及重组杆状病毒载体的构建
根据NCBI公布的H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白基因，设计多个H5亚型禽流感疫苗抗原，发现只有HAs蛋白具有广谱性和高效性。HAs蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
在HAs蛋白编码基因的5’端添加kozak序列，3’端添加Leu zip序列，得到如SEQ IDNO:3所示序列，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。然后在SEQ ID NO:3所示序列的5’和3’端分别添加BamHI和EcoRI酶切位点，送华大基因公司合成。
将pFastBac1采用BamHI和EcoR I双酶切，回收的片段与合成的基因片段，在T4连接酶的作用下，于4℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经Amp抗性筛选阳性单克隆。提取阳性单克隆内的重组载体，酶切鉴定，并测序。将酶切鉴定正确且测序正确的重组杆状病毒转移质粒命名为pFastBac1-HAs。
2.重组杆状病毒穿梭载体的构建及鉴定
将重组杆状病毒转移质粒pFastBac1-HAs转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素（50μg/mL）、庆大霉素（7μg/mL）、四环素（10μg/mL）、X-gal（100μg/mL）和IPTG（40μg/mL）的LB平板上培养24-48h，通过蓝白斑筛选3代，挑取白色菌落。将白色菌落接种至含有卡那霉素（50μg/mL）、庆大霉素（7μg/mL）和四环素（10μg/mL）的液体LB培养基培养，以M13通用引物进行菌液PCR检测，筛选阳性克隆，提取重组穿梭质粒，并用M13通用引物进行PCR鉴定，PCR片段大小与预期大小一致，将鉴定正确的重组杆状病毒穿梭质粒命名为rBacmid-HAs。
实施例2
本实施例描述重组杆状病毒的获得、噬斑纯化与重组蛋白表达。
1.重组杆状病毒的获得
按照转染试剂盒说明书，将rBacmid-HAs转染处于对数生长期的Sf9细胞，27℃恒温培养箱培养，待细胞出现病变后，收集细胞和上清液即为第1代重组杆状病毒。将重组杆状病毒在Sf9细胞传至第4代，收获第4代细胞和上清，反复冻融后1000rpm离心5min，收集上清液即为第4代重组杆状病毒，并按Reed-Muench法测定TCID50，病毒滴度为107.5TCID50/mL。
2.噬斑纯化
（1）噬斑纯化步骤如下：将Sf9细胞接种于6孔板，每孔细胞数约1×106个，加入1mL含10%胎牛血清的Grace’s培养基，培养24h至细胞达到对数生长期，弃去培养基，用Grace’s培养基洗细胞三次，将稀释后的第4代重组杆状病毒液缓慢加入细胞，并设正常细胞对照，27℃孵育1h。吸去孔中的病毒液，将琼脂糖溶液（将10mL 4%琼脂糖溶液、20mL 20%Grace’s培养基水溶液和10mL灭菌超纯水混合均匀后得到）沿边缘缓慢加至细胞表面，待琼脂糖凝固后将细胞板放置培养箱继续培养7~10d。观察细胞病变，挑取单个噬斑，加入到处于对数生长期的Sf9细胞中，继续培养96~120h，收集细胞和培养上清，得到纯化后的重组杆状病毒，命名为重组HAs杆状病毒，记为rBV-HAs。将重组HAs杆状病毒在Sf9细胞中传至第3代，测定病毒TCID50，病毒滴度为108.7 TCID50/mL。
3.重组蛋白的表达
将重组HAs杆状病毒第3代以MOI=0.5，接种至浓度为1×106个/mL的High Five细胞培养液中，27℃恒温摇床培养96~120h，超声裂解，离心收集上清液，即获得重组HAs蛋白。
实施例3
1.间接免疫荧光试验（IFA）鉴定重组蛋白的表达
将重组HAs杆状病毒接种Sf9细胞，感染72h后，弃去上清，PBS清洗细胞1次，用4%多聚甲醛室温固定20min，自然干燥。以1:150稀释的H5亚型禽流感阳性血清为一抗，37℃孵育1h，PBS洗涤3次；以1:400稀释的FITC标记的羊抗鸡荧光抗体为二抗，37℃孵育1h，PBS洗涤3次，置荧光显微镜下观察结果；同时设野生杆状病毒感染Sf9细胞作阴性对照。结果显示，重组HAs杆状病毒感染的Sf9细胞出现特异性亮绿色荧光，而野生型杆状病毒感染的Sf9细胞未出现特异性荧光，表明HAs蛋白在Sf9细胞中获得正确表达（图1）。
2.免疫印迹法（Western-blot）鉴定重组蛋白的表达
将重组HAs杆状病毒接种High Five细胞，感染96-120h后，收集细胞和培养基，超声裂解，3000rpm离心15min，收集上清液用于Western-blot分析。Western-blot检测中，以1:400稀释的H5亚型禽流感阳性血清为一抗，37℃孵育1h，PBST洗涤3次；以1:4000稀释的HRP标记的羊抗鸡酶标抗体为二抗，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，DAB显色。以野生杆状病毒为阴性对照。结果显示，重组HAs蛋白经Western blot检测，显示了一条大小约为25kD的特异性条带，与预期大小一致（图2），说明HAs蛋白被成功表达且能够与H5亚型禽流感阳性血清反应，因此重组HAs蛋白具有良好的抗原性。
实施例4
1.重组蛋白血凝活性鉴定
将重组HAs杆状病毒接种High Five细胞，感染96-120h后，收集细胞和培养基，超声裂解，3000rpm离心15min，收集上清液，得到重组HAs蛋白，采用微量血凝试验方法检测该重组蛋白的血凝活性。结果显示，HA效价可达14Log2，说明重组HAs蛋白具有较好的血凝活性（图3）。
2.重组蛋白交叉反应试验
以重组HAs蛋白为检测抗原，利用微量血凝抑制试验（HI）检测重组HAs蛋白与H5亚型禽流感病毒Re-6阳性血清、H5亚型禽流感病毒Re-7阳性血清、H5亚型禽流感病毒Re-8阳性血清的交叉反应性，设重组HAs蛋白抗血清为阳性血清对照，SPF鸡阴性血清和PBS缓冲液为阴性对照；另设H5亚型禽流感病毒Re-6检测抗原、H5亚型禽流感病毒Re-7检测抗原和H5亚型禽流感病毒Re-8检测抗原为抗原阳性对照，考察其与H5亚型禽流感病毒Re-6、Re-7、Re-8阳性血清和重组HAs蛋白抗血清的反应性。结果（图4）显示，重组HAs蛋白与H5亚型禽流感病毒Re-6阳性血清、H5亚型禽流感病毒Re-7阳性血清、H5亚型禽流感病毒Re-8阳性血清具有较好的交叉反应性，表明重组HAs蛋白具有H5亚型禽流感广谱性。H5亚型禽流感病毒Re-6检测抗原、H5亚型禽流感病毒Re-7检测抗原和H5亚型禽流感病毒Re-8检测抗原与相对应的阳性血清能较好地反应，而与其他阳性血清交叉反应较弱，与重组HAs蛋白相比，其交叉反应性较差。
实施例5
1.重组HAs蛋白的制备及灭活
将重组HAs杆状病毒以MOI=0.5，接种至浓度为1×106个/mL的High Five细胞培养液中，27℃恒温摇床培养100h，取细胞和培养物上清超声裂解，离心后收集上清液，即获得重组HAs蛋白。
在重组HAs蛋白中添加甲醛溶液，设甲醛最终体积百分浓度分别为0.1%、0.15%、0.2%和0.3%四个浓度梯度，37℃灭活24h。对灭活后的重组HAs蛋白分别进行血凝（HA）效价检测和病毒感染性检测。结果显示，甲醛最终体积百分浓度分别为0.1%、0.15%、0.2%和0.3%时，灭活后抗原HA效价依次为14.5Log2、14Log2、13Log2和12.5Log2。病毒感染性检测结果显示，灭活后的重组HAs蛋白液中不含有感染性病毒。因此确定甲醛最终体积百分浓度为0.1%。
2.H5亚型禽流感亚单位疫苗的制备
制备H5亚型禽流感亚单位疫苗，包括如下步骤：
（1）将注射用白油（见《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录343页）96体积份和司本-80 4体积份混合均匀，经121℃高压灭菌15min，冷却至室温，得到油相。
（2）取灭活后的重组HAs蛋白，加入其体积4%的吐温-80，乳化，得到水相；
（3）将水相和油相按照体积比1:3混合、乳化，得到H5亚型禽流感亚单位疫苗。
实施例6 H5亚型禽流感亚单位疫苗免疫效力
10日龄SPF（Specific Pathogen Free，无特定病原）鸡60只，分四组，每组15只。第一组，颈部皮下注射H5亚型禽流感亚单位疫苗（实施例5制备），0.3mL/只；第二组，颈部皮下注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（Re-4和Re-6，缩写为Re-6商品苗），0.3mL/只；第三组颈部皮下注射重组禽流感病毒二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株和H7N9 H7-Re-1株，缩写为Re-8商品苗），0.3mL/只；第四组为空白对照组。免疫后14d、21d、28d采集各组SPF鸡血清，分别用H5亚型禽流感病毒Re-6检测抗原、H5亚型禽流感病毒Re-7检测抗原和H5亚型禽流感病毒Re-8检测抗原，测定血清抗体HI效价，设H5亚型禽流感病毒Re-6阳性血清、H5亚型禽流感病毒Re-7阳性血清、H5亚型禽流感病毒Re-8阳性血清为对照。结果（图5）显示，各组SPF鸡免疫后14d均可检测到血清HI效价，14d、21d、28d血清HI效价持续上升，第一组SPF鸡血清抗体的产生和发展趋势与第二组、第三组无显著差异；第一组SPF鸡血清与Re-6、Re-7、Re-8检测抗原均有交叉反应性，反应良好；第二组SPF鸡血清仅与Re-6检测抗原反应良好，与Re-7、Re-8检测抗原反应较弱；第三组SPF鸡血清仅与Re-8检测抗原反应良好，与Re-6、Re-7检测抗原反应较弱。结果表明，与商品苗相比，H5亚型禽流感病毒亚单位疫苗不仅具有相似的免疫原性，而且具有更好的广谱性。
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<212> DNA
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atgaaaagcg accatatttg cattggttac catgcaaaca actcgacaaa atatgtgaaa 60
tcaaaaaaat tagtccttgc aactgggctc agaaatagtc ctcaaataga gagaagaaga 120
agaaaaaggg gactgtttgg agctatagca ggttttatag agggaggatg gcagggaatg 180
gtagatggtt ggtatgggta ccatcacagc aatgagcagg ggagtgggta tgctgcagac 240
aaagaatcca ctcaaaaggc aatagataat gcaaaagagc tgggcaacgg ttgtttcgag 300
ttctatcaca aatgtgataa tgaatgtatg gaaagtgtaa gaaacggaac gtatgactac 360
ccgcagtact cagaagaagc aagattaaaa agagaggaaa taagtggagt aaaa 414
<210> 2
<211> 138
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HAs蛋白氨基酸序列
<400> 2
Met Lys Ser Asp His Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr
1 5 10 15
Lys Tyr Val Lys Ser Lys Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn
20 25 30
Ser Pro Gln Ile Glu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala
35 40 45
Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp
50 55 60
Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp
65 70 75 80
Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn
85 90 95
Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser
100 105 110
Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys
130 135
<210> 3
<211> 465
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> HAs蛋白两端添加序列后的片段
<400> 3
gccaccatga aaagcgacca tatttgcatt ggttaccatg caaacaactc gacaaaatat 60
gtgaaatcaa aaaaattagt ccttgcaact gggctcagaa atagtcctca aatagagaga 120
agaagaagaa aaaggggact gtttggagct atagcaggtt ttatagaggg aggatggcag 180
ggaatggtag atggttggta tgggtaccat cacagcaatg agcaggggag tgggtatgct 240
gcagacaaag aatccactca aaaggcaata gataatgcaa aagagctggg caacggttgt 300
ttcgagttct atcacaaatg tgataatgaa tgtatggaaa gtgtaagaaa cggaacgtat 360
gactacccgc agtactcaga agaagcaaga ttaaaaagag aggaaataag tggagtaaaa 420
ggaggcggag gcggcggctc atcatcatca agctcaagct catca 465
<210> 4
<211> 155
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HAs蛋白两端添加序列后的片段
<400> 4
Ala Thr Met Lys Ser Asp His Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn
1 5 10 15
Ser Thr Lys Tyr Val Lys Ser Lys Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu
20 25 30
Arg Asn Ser Pro Gln Ile Glu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe
35 40 45
Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp
50 55 60
Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala
65 70 75 80
Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Asn Ala Lys Glu Leu
85 90 95
Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met
100 105 110
Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu
115 120 125
Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
145 150 155

Claims (7)

1.一种通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗中抗原为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白。
2.根据权利要求1所述通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗，其特征在于通过培养携带所述蛋白编码基因的重组杆状病毒制备所述疫苗抗原。
3.根据权利要求2所述通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗，其特征在于所述蛋白编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求3所述通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗，其特征在于所述重组杆状病毒采用如下方法构建：在SEQ ID NO:1的5’端添加kozak序列，3’端添加Leu zip序列，然后插入杆状病毒转移载体pFastBac1中，得到重组杆状病毒转移质粒；将所述重组杆状病毒转移质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭质粒；将所述重组杆状病毒穿梭质粒转染昆虫细胞Sf9，获得表达所述抗原的重组杆状病毒。
5.根据权利要求4所述通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗，其特征在于采用High Five细胞培养所述重组杆状病毒。
6.根据权利要求5所述通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗，其特征在于将所述抗原灭活，加入其体积4%的吐温-80，乳化，得到水相；将96体积份白油和4体积份司本-80混合均匀，得到油相；将水相和油相按照体积比1:3混合、乳化，得到所述疫苗。
7.根据权利要求6所述通用型H5亚型禽流感亚单位疫苗，其特征在于采用甲醛灭活所述抗原。
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