KR102175885B1 - 재조합 돼지 유래 아미노펩티다아제 N(pAPN) 단백질 및 이를 이용한 항-pAPN 항체 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 돼지 유래 아미노펩티다아제 N 단백질 및 이를 이용한 항-pAPN에 특이적인 항체 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 pAPN 단백질은 곤충세포 발현계에서 구조적으로 안정한 항원 제작이 가능하다. 상기 재조합 pAPN 단백질 항원을 기반으로 마우스에서 다클론항체를 제작할 수 있으며, 이렇게 만들어진 pAPN에 특이적인 항체는 돼지에서 pAPN 발현 여부를 검출할 수 있는 IHC, ELISA, IFA 등의 면역 어세이 개발에 적용 가능하다. 또한, 돼지유행성설사병 바이러스 및 전염성위장염 코로나바이러스 저항성 돼지로서 해당 바이러스의 수용체인 pAPN이 녹아웃(knock out)된 돼지가 개발될 경우, 본 발명에서 개발된 pAPN 항원과 특이 항체는 pAPN 녹아웃 여부를 판별할 수 있는 주요 마커로 활용 가능하다.

Description

재조합 돼지 유래 아미노펩티다아제 N(pAPN) 단백질 및 이를 이용한 항-pAPN 항체 제조 방법{RECOMBINANT PORCINE AMINOPEPTIDASE N PROTEIN AND METHOD FOR PRODUCING ANTI-pAPN ANTIBODY USING THE SAME}

본 발명은 재조합 돼지 유래 아미노펩티다아제 N 단백질 및 이를 이용한 항-pAPN에 특이적인 항체 제조 방법에 관한 것이다.

돼지유행성설사병(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)과 돼지전염성위장염 (Transmissible Gastroenteritis, TEG) 등은 모두 알파코로나바이러스(alphacoronavirus)에 속하는 코로나 바이러스성 감염병이다(Kwonil Jung, et al., 2014). 상기 감염병은 주로 포유자돈(哺乳仔豚)에 감염되며 발생 즉시 이환 및 폐사율이 높고 전파력이 강해 국내외를 막론하고 양돈산업에 막대한 피해를 끼치고 있는 질병이다. 상기 질병은 국내에서 지속적으로 발생이 증가하고 있는 추세이며, 국내뿐만 아니라 북중미 대륙 전체와 남미대륙 일부까지 PED 바이러스가 전파되어 피해를 주고 있는 실정이다.

현재까지 다양한 형태의 PED 백신이 상용화되어 전 세계적으로 사용되고 있으나, PED 바이러스는 지속적으로 진화하여 다양한 유전형이 존재하기 때문에, 바이러스의 통제가 어려운 상황이다.

이러한 바이러스가 소장의 타겟 세포에 결합하기 위해 pAPN을 수용체로 활용하는 것으로 알려져 있다. 상기 수용체가 비발현된 돼지 모델을 개발하기 위해 국내외적으로 유전자가위 벡터시스템 제작 기술을 적용한 형질 전환된 복제 돼지를 개발하려는 시도가 계속되고 있다. pAPN이 비발현된 돼지 모델을 개발할 경우, 부작용을 최소화하면서 PED, TGE 등에 저항성을 가질 수 있어 양돈 산업의 피해를 줄일 수 있는 유의미한 해결 방안이 될 수 있다.

뿐만 아니라, pAPN을 과발현하는 돼지 및 세포주 등을 개발하여 실제 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV) 및 돼지전염성위장염 바이러스(Transmissible Gastroenteritis virus, TGEV), 그리고 이의 수용체의 상호작용과 바이러스의 감염과 증식이 유의미한 상관관계를 갖는 지에 대한 기초 기전 연구가 가능하다. 특히, pAPN 과발현 세포주의 개발을 통해 in vitro 배양 효율을 높여 추후 백신주 생산 시스템의 구축에 활용될 수 있다. pAPN의 제거 또는 발현되었는지를 확인하기 위해서는, pAPN 특이적인 항체를 통한 검증이 필수이나 최근 상용화된 제품은 인간 APN이나 마우스 APN에 특이적인 단클론항체로서 pAPN에 대한 반응성이 현저히 낮거나 없는 것으로 확인되며, 국내외적으로 pAPN 검출을 위한 항체 개발이 필요한 실정이다.

Kwonil Jung, et al., Pathology of US Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain PC21A in Gnotobiotic Pigs, Emerging Infectious Diseases, Vol. 20, No. 4, April 2014, pp. 662-665

본 발명의 목적은 pAPN에 특이적인 항체를 생산하기 위한 재조합 pAPN, pAPN을 검출하기 위한 항체 및 이를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 곤충세포에 돼지 유래 아미노펩티다아제 N(pAPN) 단백질 단편을 코딩하는 유전자가 적재된 발현 벡터를 도입시키는 단계; 및 상기 곤충세포로부터 재조합 pAPN 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 pAPN 단백질 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 재조합 pAPN 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 재조합 pAPN 단백질을 개체에 주입하는 단계; 및 상기 개체로부터 재조합 pAPN 단백질에 특이적인 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 pAPN 단백질에 특이적인 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 pAPN 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 pAPN 발현 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 판별용 키트에 판별 대상으로부터 분리된 시료를 첨가하는 단계를 포함하는 pAPN 발현 여부 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 pAPN 단백질은 곤충세포 발현계에서 구조적으로 안정한 항원 제작이 가능하다. 상기 재조합 pAPN 단백질 항원을 기반으로 마우스에서 다클론항체를 제작할 수 있으며, 이렇게 만들어진 pAPN에 특이적인 항체는 돼지에서 pAPN 발현 여부를 검출할 수 있는 IHC, ELISA, IFA 등의 면역 어세이 개발에 적용 가능하다. 또한, 돼지유행성설사병 바이러스 및 전염성위장염 코로나바이러스 저항성 돼지로서 해당 바이러스의 수용체인 pAPN이 녹아웃(knock out)된 돼지가 개발될 경우, 본 발명에서 개발된 pAPN 항원과 특이 항체는 pAPN 녹아웃 여부를 판별할 수 있는 주요 마커로 활용 가능하다.

도 1은 곤충세포 발현 벡터 pAB-bee-8His-pAPN를 나타낸 것이다.
도 2는 His-태그된 재조합 pAPN 단백질을 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제하여 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 니켈-친화성 크로마토그래피로 일차 정제한 결과물을 HiPrep 16/60 superdex200 겔-여과 크로마토그래피로 이차 정제하여 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 SDS-PAGE를 통해 표준 단백질 BSA와 비교하여 최종 정제된 재조합 pAPN 단백질의 농도 및 순도를 확인한 도이다.
도 5는 곤충세포, 대장균 및 효모에서 제조한 재조합 pAPN 단백질을 이용하여 제조한 면역 항체의 결합력을 ELISA 테스트를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 곤충세포 기반 재조합 pAPN 단백질 항원을 이용하여 제조한 pAPN의 항혈청과 인간 APN의 항혈청의 반응성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 정상 돼지와 pAPN 비발현(knock out) 돼지에 PEDV(Porcine Epidemic Diarrhea Virus)를 감염/비감염한 후 pAPN 특이 마우스 다클론항체로 면역염색한 결과를 나타낸 것이다(현미경배율 100배).
도 8은 정상 돼지와 pAPN 비발현 돼지에 PEDV를 감염/비감염한 후 pAPN 특이 마우스 다클론항체로 면역염색한 결과를 나타낸 것이다(현미경배율 200배).
도 9는 정상 돼지와 pAPN 비발현 돼지에 PEDV를 감염/비감염한 후 상용화된 인간 APN 단클론항체로 면역염색한 결과를 나타낸 것이다(현미경배율 100배).
도 10은 정상 돼지와 pAPN 비발현 돼지에 PEDV를 감염/비감염한 후 상용화된 인간 APN 단클론항체로 면역염색한 결과를 나타낸 것이다(현미경배율 200배).

본 발명은 일 측면으로, 곤충세포에 돼지 유래 아미노펩티다아제 N(pAPN) 단백질 단편을 코딩하는 유전자가 적재된 발현 벡터를 도입시키는 단계; 및 상기 곤충세포로부터 재조합 pAPN 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 pAPN 단백질 생산 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용하는 용어 “아미노펩티다아제 N(aminopeptidase N)”은 ANPEP 유전자에 의해 암호화되는 효소로서, 포유류와 조류 등에 호흡기 질환을 일으키는 코로나바이러스(corona virus)를 수용하는 세포 수용체로서 CD13으로도 알려져 있다. 포유류 중 돼지에서 코로나바이러스를 수용하는 세포 수용체 pAPN 단백질은 서열번호 1로 표시되는 963개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 상기 pAPN 단백질은 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 상기 아미노펩티다아제 N은 멤브레인 알라닐 아미노펩티다아제(membrane alanyl aminopeptidase, ANPEP), 알라닐 아미노펩티다아제(alanyl aminopeptidase), 알라닌 아미노펩티다아제(alanine aminopeptidase)라고도 한다.

본 발명에서 pAPN 단백질은 막관통영역(transmembrane region)을 제외한 pAPN 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 서열번호 1로 표시되는 pAPN 단백질에서 막관통영역을 포함하는 1번 내지 32번 위치의 아미노산 서열 또는 1번 내지 61번 위치의 아미노산 서열은 유동성(무질서구조) 및 비친수성 아미노산 잔기로 인해 단백질 안정화(가용화)에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 상기 pAPN 단백질 또는 이의 단편은, 바람직하게, 서열번호 1로 표시되는 pAPN 단백질에서 막관통영역을 포함하는 1번 내지 32번 위치의 아미노산 서열을 제외한 33번 내지 963번 위치의 아미노산(서열번호 3)일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 pAPN 단백질 또는 이의 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열 중 931개, 930개, 929개, 928개, 927개, 926개, 925개, 924개, 923개, 922개, 921개, 920개, 919개, 918개, 917개, 916개, 915개, 914개, 913개, 912개, 911개, 910개, 909개, 908개, 907개, 906개, 905개, 904개, 903개, 902개 또는 901개의 연속된 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예로서, 상기 pAPN 단백질 또는 이의 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열 중 901개의 연속된 아미노산 서열일 수 있으며, 이는 서열번호 1로 표시되는 pAPN 단백질에서 62번 내지 962번 위치의 아미노산 서열(서열번호 4)일 수 있다.

또한, 본 발명의 pAPN 재조합 단백질 또는 이의 단편은 개체에 투여하였을 때, pAPN 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 한, 아미노산 잔기의 개수에 상관없이 사용할 수 있다. 구체적으로, pAPN 재조합 단백질 또는 이의 단편은 서열번호 1의 33번 위치의 아미노산부터 963번 위치의 아미노산 서열 중 1개 내지 931개, 50개 내지 901개, 100개 내지 800개, 200개 내지 600개 또는 350개 내지 400개의 연속된 아미노산 서열일 수 있으며, 바람직하게는 600개 내지 901개의 연속된 아미노산 서열일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 서열번호 1로 표시되는 pAPN의 아미노산 서열 중 구조적으로 안정한 62번 내지 962번 아미노산(서열번호 4)을 합성하였고, 이를 pAB-bee-8His 벡터의 NotI와 BamHI 부위에 서브클론한 후 곤충세포를 이용하여 과발현하였다.

상기 곤충세포로부터 수득한 재조합 pAPN 단백질은 서열번호 5로 표시되는 919개의 아미노산 서열일 수 있다. 이때, 상기 재조합 pAPN 단백질은 서열번호 6의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어, "유전자가 적재된 발현 벡터"란, 재조합 pAPN 단백질을 PCR로 증폭한 절편을 제한효소를 이용하여 절단한 벡터에 삽입하여 세포 내에서 유전물질을 발현할 수 있게 제작된 것을 의미한다. 이때 상기 벡터는 상기 pAB-bee-8His일 수 있다.

또한, 본 발명에서 곤충세포는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 세포, 리만트리아 디스파(Lymantria dispar) 세포, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포, 드로소필라(Drosophila) 세포 및 모기(mosquito) 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 그러나, 곤충세포의 종류는 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명에서 곤충세포는 스포도프테라 프루기페르다 세포일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 pAPN 단백질 생산 방법에 의해 생산된 재조합 pAPN 단백질을 제공한다. 전술한 바와 같이, 상기 재조합 pAPN 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 재조합 pAPN 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 가질 수 있다

또한, 본 발명에 따른 재조합 pAPN 단백질 생산 방법은 수득된 재조합 pAPN 단백질을 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 정제는 친화성 크로마토그래피 또는 겔-여과 크로마토그래피 기법으로 수행될 수 있으며, 구체적으로, 상기 pAPN 단백질을 정제하는 단계에서 니켈-친화성 크로마토그래피 및 HiPrep 16/60 superdex200 겔-여과 크로마토그래피 기법이 순서대로 수행될 수 있다.

본 발명은 다른 측면으로, 본 발명에 따른 재조합 pAPN 단백질 생산 방법에 의해 생산된 재조합 pAPN 단백질을 개체에 주입하는 단계; 상기 개체로부터 재조합 pAPN 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 항혈청을 수득하는 단계; 및 상기 수득한 항혈청에서 재조합 pAPN 단백질에 특이적인 항체만을 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 pAPN 단백질에 특이적인 항체 제조하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 개체는 마우스, 돼지, 인간 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 항혈청은 항체를 포함한 혈청을 의미하며, 면역혈청이라고도 불리운다. 본 발명에서 항혈청은, 재조합 pAPN 단백질에 특이적인 항체를 가지고 있는 혈청을 의미한다.

또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 재조합 pAPN 단백질 생산 방법에 의해 생산된 재조합 pAPN 단백질을 개체에 주입하는 단계; 및 상기 개체로부터 재조합 pAPN 단백질에 특이적인 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 pAPN 단백질에 특이적인 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 개체는 마우스, 돼지, 인간 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 재조합 pAPN 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 곤충세포 발현 시스템, 대장균 발현 시스템 및 효모 발현 시스템 기반 재조합 pAPN 단백질을 마우스에 근육주사하여 항체 생성 여부를 확인하였다. 그 결과, 각각의 발현 시스템으로 발현된 재조합 항원에 대한 pAPN 항혈청이 면역 항체 형성 효과를 나타내었으며, 특히 곤충세포 발현 시스템을 활용한 전장 기반 pAPN 항원에 대한 항혈청이 상대적으로 높은 반응성과 적은 편차를 나타내었다(도 5). 일반적으로 고등생물의 발현계가 당화 또는 폴딩의 측면에서 유리하다고 알려져 있으며, 이러한 이유로 곤충세포 발현 시스템, 대장균 발현 시스템 및 효모 발현 시스템에서 생산한 단백질이 서로 다른 결합능을 가지는 항체를 생산할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 pAPN 단백질에 특이적인 항체 제조 방법으로 제조된 항-pAPN 특이 항체는 돼지에서 pAPN 발현 여부를 검출할 수 있는 IHC(immunohistochemistry), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), IFA(immunofluorescence assay) 등의 면역 어세이 개발에 활용될 수 있다. 또한, 돼지유행성설사병 바이러스 및 전염성위장염 코로나바이러스 저항성 돼지로서 해당 바이러스의 수용체인 pAPN이 녹아웃(knock out)된 돼지가 개발될 경우, 본 발명에 따른 pAPN 항원 및 이에 특이적으로 결합하는 항체는 pAPN 녹아웃 여부를 판별할 수 있는 주요 마커로 활용될 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면으로, 본 발명은 재조합 pAPN 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 pAPN 발현 판별용 키트를 제공한다. 상기 재조합 pAPN 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 곤충세포 발현 시스템을 통해 제조된 재조합 pAPN 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

상기 재조합 pAPN 단백질은 앞서 기술한 바와 같이, 서열번호 1의 33번 위치의 아미노산부터 963번 위치의 아미노산 서열 중 1개 내지 931개, 50개 내지 901개, 100개 내지 800개, 200개 내지 600개 또는 350개 내지 400개의 연속된 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 pAPN 발현 판별용 키트에 판별 대상에서 분리된 시료를 첨가하는 단계를 포함하는 pAPN의 발현 여부 정보제공 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 곤충세포 발현 시스템을 이용한 재조합 pAPN 단백질 제조

본 발명의 실험에 사용된 pAPN(Sus scrofa alanyl aminopeptidase N) 단백질(963개 아미노산)의 염기 서열은 GenBank No. NM_214277이다. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 구조적으로 안정적인 62번 아미노산부터 962번 아미노산까지 ㈜바이오니아를 통해 합성하였다. 서열번호 4로 표시되는 pAPN 단백질(잔기 62-962)은 pAB-bee-8His 벡터(AB vector)사의 NotI과 BamHI 부위에 서브클론하고 곤충세포(Spodoptera frugiperda)를 이용하여 과발현하였다. 이때, 사용된 곤충세포 발현 벡터 pAB-bee-8His -pAPN를 도 1에 나타내었다.

His-태그된 재조합 pAPN 단백질은 니켈-친화성 크로마토그래피로 일차 정제한 후, 2X PBS 완충용액을 사용하여 HiPrep 16/60 superdex200 겔-여과 크로마토그래피로 한번 더 정제하여, 정제된 재조합 pAPN 단백질을 수득하였다. 이때, 상기 정제된 재조합 pAPN 단백질을 발현하기 위한 염기서열은 서열번호 6으로 표시하였으며, 이에 의해 제조되는 919개의 아미노산 서열을 서열번호 5로 표시하였다. 또한, 상기 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다. 또한, 최종 정제된 재조합 pAPN 단백질의 SDS-PAGE 결과를 표준 단백질인 BSA와 비교하여 농도 및 순도를 확인하였다. 이를 도 4에 나타내었다.

도 2 내지 도 4에 나타난 바와 같이, 재조합 pAPN 단백질이 SDS-PAGE 상에서 확인되었으며(도 2 및 도 3), 크로마토그래피에 의하여 순도 95% 이상으로 정제된 것을 확인하였다(도 4).

실험예 1. 곤충세포, 대장균 및 효모 기반 재조합 pAPN 단백질에 대한 항체 생성 확인

곤충세포 발현 시스템을 이용한 재조합 pAPN 단백질(서열번호 5), 대장균 발현 시스템을 이용한 재조합 pAPN 단백질 단편(MyBioSource), 및 효모 발현 시스템을 이용하여 제조된 재조합 pAPN 단백질 단편(MyBioSource)이 효과적으로 항체 생성을 유도하는지 여부를 확인하였다.

먼저, 정제된 각각의 재조합 단백질을 마우스(코아텍, 한국)에 주사하기 전에 전-면역 혈청(pre-immune serum)을 채취하여 이를 음성 대조군으로 사용하였다. 일차적 면역화를 위하여 항원 100 ug을 프로이드 어쥬번트와 혼합하여 마우스에 각각 근육주사하였다. 2주 후, 동일한 방법으로 1차 부스팅을 진행하였다. 2주 후, 각 마우스를 채혈하고 최종 혈청을 분리하여 ELISA 테스트를 수행하였다. 이때, ELISA 테스트에서 항원은 pAPN 전장 재조합 항원 웰(well) 당 100 ng을 사용하였다. 또한, 면역 혈청은 1XPBS로 1:100 내지 1:10,000,000 비율로 희석하여 사용하였다. ELISA 리더(reader)를 이용하여 광학 밀도 450 nm에서 발색을 검출하여 최종적으로 면역 항체 생성 여부를 확인하였으며, 이를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 각각의 발현된 재조합 항원에 대한 pAPN 항혈청이 면역 항체 형성 효과를 나타내었다. 이 중에서 곤충세포 발현 시스템을 활용한 전장 기반 pAPN 항원에 대한 항혈청(pAPN-Bac)이 상대적으로 높은 반응성과 적은 편차를 확인할 수 있었다. 이는 개체 내에서 해당 항원으로 작용하여 항체를 효과적으로 유도할 수 있다는 것을 의미한다. 한편, pAPN-Yea 및 pAPN-Eco는 각각 효모 및 대장균 발현 시스템을 활용한 pAPN 항원에 대한 항혈청을 나타낸다.

실험예 2. 항- pAPN 특이 항체와 인간 APN 특이 항체의 반응성 비교

곤충세포 발현 시스템을 활용한 전장 기반 pAPN 항원을 이용하여 제조한 pAPN 마우스 항혈청과 상용화된 인간 APN 특이 마우스 단클론항체에 대한 반응성을 비교 실험하였다. 인간 APN 특이 마우스 단클론항체는 시판되고 있는 Mouse anti-CD13 monoclonal antibody(Abcam)를 사용하였으며, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 ELISA를 진행하여 재조합 항원에 대한 반응성 여부를 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 전장 기반 pAPN 항원에 대한 인간 APN 항혈청의 반응성이 현저하게 낮은 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3. pAPN 항혈청 정제 및 pAPN 비발현 돼지를 활용한 pAPN 발현 검출능 확인

정상 돼지와 pAPN 비발현 돼지에 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV)를 감염/비감염 시킨 후, 채취한 소장 조직을 이용하여 항-pAPN 특이 마우스 다클론항체 및 인간 APN에 특이적인 단클론항체에 대한 반응성을 비교해 보고자 면역염색을 수행하였다. 이때, 항-pAPN 특이 마우스 다클론항체 및 인간 APN 특이 단클론항체는 상기 실험예 2와 동일한 것으로 사용하였다. 소장 조직에서 pAPN 발현 여부 검출을 위한 항-pAPN 특이 마우스 다클론항체 적용 가능성을 확인하였으며, 이를 도 7 내지 도 10에 나타내었다.

도 7 내지 도 10에 나타난 바와 같이, PEDV 감염/비감염된 정상돼지 조직에서 항-pAPN 특이 마우스 다클론항체에 대한 반응성이 나타났으며, 인간 APN 특이 단클론항체에 대해서는 심한 비특이 반응이 관찰되었다. 마찬가지로, pAPN 비발현 돼지에서는 면역염색에서 음성으로 확인되어, 개발된 항-pAPN 특이 마우스 다클론항체가 잘 작동됨을 확인할 수 있었다. 이는 pAPN 재조합 항원에 대한 항-pAPN 특이 마우스 다클론항체가 실제 돼지 조직에서 pAPN 검출을 위한 특이 항체의 이용 가능성이 있다는 것을 의미한다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> RECOMBINANT PORCINE AMINOPEPTIDASE N PROTEIN AND METHOD FOR PRODUCING ANTI-pAPN ANTIBODY USING THE SAME <130> FPD/201810-0003 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 963 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pAPN <400> 1 Met Ala Lys Gly Phe Tyr Ile Ser Lys Ala Leu Gly Ile Leu Gly Ile 1 5 10 15 Leu Leu Gly Val Ala Ala Val Ala Thr Ile Ile Ala Leu Ser Val Val 20 25 30 Tyr Ala Gln Glu Lys Asn Lys Asn Ala Glu His Val Pro Gln Ala Pro 35 40 45 Thr Ser Pro Thr Ile Thr Thr Thr Ala Ala Ile Thr Leu Asp Gln Ser 50 55 60 Lys Pro Trp Asn Arg Tyr Arg Leu Pro Thr Thr Leu Leu Pro Asp Ser 65 70 75 80 Tyr Phe Val Thr Leu Arg Pro Tyr Leu Thr Pro Asn Ala Asp Gly Leu 85 90 95 Tyr Ile Phe Lys Gly Lys Ser Ile Val Arg Leu Leu Cys Gln Glu Pro 100 105 110 Thr Asp Val Ile Ile Ile His Ser Lys Lys Leu Asn Tyr Thr Thr Gln 115 120 125 Gly His Met Val Val Leu Arg Gly Val Gly Asp Ser Gln Val Pro Glu 130 135 140 Ile Asp Arg Thr Glu Leu Val 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gattctacat ttccaaggcc ctgggcatcc tgggcatcct cctcggcgtg 60 gcggccgtgg ccaccatcat cgctctgtct gtggtgtacg cccaggagaa gaacaagaat 120 gccgagcatg tcccccaggc ccccacgtcg cccaccatca ccaccacagc cgccatcacc 180 ttggaccaga gcaagccgtg gaaccggtac cgcctaccca caacgctgtt gcctgattcc 240 tacttcgtga cgctgagacc ctacctcact cccaacgcgg atggcctgta catcttcaag 300 ggcaaaagca tcgtccgctt actctgccag gagcccaccg atgtcatcat catccatagc 360 aagaagctca actacaccac ccaggggcac atggtggtcc tgcggggcgt gggggactcc 420 caggtcccag agatcgacag gactgagctg gtagagctca ctgagtacct ggtggtccac 480 ctcaagggct cgctgcagcc cggccacatg tacgagatgg agagtgaatt ccagggggaa 540 cttgccgacg acctggcagg cttctaccgc agcgagtaca tggagggcaa cgtcaaaaag 600 gtgctggcca cgacacagat gcagtctaca gatgcccgga aatccttccc atgctttgac 660 gagccagcca tgaaggccac gttcaacatc actctcatcc accctaacaa cctcacggcc 720 ctgtccaata tgccgcccaa aggttccagc accccacttg cagaagaccc caactggtct 780 gtcactgagt tcgaaaccac acctgtgatg tccacgtacc ttctggccta catcgtgagc 840 gagttccaga gcgtgaatga aacggcccaa aatggcgtcc tgatccggat ctgggctcgg 900 cctaatgcaa ttgcagaggg ccatggcatg tatgccctga atgtgacagg tcccatccta 960 aacttctttg ccaatcatta taatacatcc tacccactcc ccaaatccga ccagattgcc 1020 ttgcccgact tcaatgccgg tgccatggag aactgggggc tggtgaccta ccgggagaac 1080 gcgctgctgt ttgacccaca gtcctcctcc atcagcaaca aagagcgagt tgtcactgtg 1140 attgctcacg agctggccca ccagtggttt ggcaacctgg tgaccctggc ctggtggaat 1200 gacctgtggc tgaatgaggg ctttgcctcc tatgtggagt acctgggtgc tgaccacgca 1260 gagcccacct ggaatctgaa agacctcatc gtgccaggcg acgtgtaccg agtgatggct 1320 gtggatgctc tggcttcctc ccacccgctg accacccctg ctgaggaggt caacacacct 1380 gcccagatca gcgagatgtt tgactccatc tcctacagca agggagcctc ggttatcagg 1440 atgctctcca acttcctgac tgaggacctg ttcaaggagg gcctggcgtc ctacttgcat 1500 gcctttgcct atcagaacac cacctacctg gacctgtggg agcacctgca gaaggctgtg 1560 gatgctcaga cgtccatcag gctgccagac actgtgagag ccatcatgga tcgatggacc 1620 ctgcagatgg gcttccccgt catcaccgtg gacaccaaga caggaaacat ctcacagaag 1680 cacttcctcc tcgactccga atccaacgtc acccgctcct cagcgttcga ctacctctgg 1740 attgttccca tctcatctat taaaaatggt gtgatgcagg atcactactg gctgcgggat 1800 gtttcccaag cccagaatga tttgttcaaa accgcatcgg acgattgggt cttgctgaac 1860 gtcaacgtga caggctattt ccaggtgaac tacgacgagg acaactggag gatgattcag 1920 catcagctgc agacaaacct gtcggtcatc cctgtcatca atcgggctca ggtcatctac 1980 gacagcttca acctggccac tgcccacatg gtccctgtca ccctggctct ggacaacacc 2040 ctcttcctga acggagagaa agagtacatg ccctggcagg ccgccctgag cagcctgagc 2100 tacttcagcc tcatgttcga ccgctccgag gtctatggcc ccatgaagaa atacctcagg 2160 aagcaggtcg aacccctctt ccaacatttc gaaactctca ctaaaaactg gaccgagcgc 2220 ccagaaaatc tgatggacca gtacagtgag attaatgcca tcagcactgc ctgctccaat 2280 ggattgcctc aatgtgagaa tctggccaag acccttttcg accagtggat gagcgaccca 2340 gaaaataacc cgatccaccc caacctgcgg tccaccatct actgcaatgc catagcccag 2400 ggcggccagg accagtggga ctttgcctgg gggcagttac aacaagccca gctggtaaat 2460 gaggccgaca aactccgctc agcgctggcc tgcagcaacg aggtctggct cctgaacagg 2520 tacctgggtt acaccctgaa cccggacctc attcggaagc aagacgccac ctccactatt 2580 aacagcattg ccagcaatgt catcgggcag cctctggcct gggattttgt ccagagcaac 2640 tggaagaagc tctttcagga ctatggcggt ggttccttct ccttctccaa cctcatccag 2700 ggtgtgaccc gaagattctc ctctgagttt gagctgcagc agctggagca gttcaagaag 2760 aacaacatgg atgtgggctt cggctccggc acccgggctc tggagcaagc cctggagaag 2820 accaaggcca acatcaagtg ggtgaaggag aacaaggagg tggtgttgaa ttggttcata 2880 gagcacagct aa 2892 <210> 3 <211> 931 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pAPN(33-963) <400> 3 Tyr Ala Gln Glu Lys Asn Lys Asn Ala Glu His Val Pro Gln Ala Pro 1 5 10 15 Thr Ser Pro Thr Ile Thr Thr Thr Ala Ala Ile Thr Leu Asp Gln Ser 20 25 30 Lys Pro Trp Asn Arg Tyr Arg Leu Pro Thr Thr Leu Leu Pro Asp Ser 35 40 45 Tyr Phe Val Thr Leu Arg Pro Tyr Leu Thr Pro Asn Ala Asp Gly Leu 50 55 60 Tyr Ile Phe Lys Gly Lys Ser Ile Val Arg Leu Leu Cys Gln Glu Pro 65 70 75 80 Thr Asp Val Ile Ile Ile His Ser Lys Lys Leu Asn Tyr Thr Thr Gln 85 90 95 Gly His Met Val Val Leu Arg Gly Val Gly Asp Ser Gln Val Pro 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Met Tyr Glu Met Glu Ser Glu 115 120 125 Phe Gln Gly Glu Leu Ala Asp Asp Leu Ala Gly Phe Tyr Arg Ser Glu 130 135 140 Tyr Met Glu Gly Asn Val Lys Lys Val Leu Ala Thr Thr Gln Met Gln 145 150 155 160 Ser Thr Asp Ala Arg Lys Ser Phe Pro Cys Phe Asp Glu Pro Ala Met 165 170 175 Lys Ala Thr Phe Asn Ile Thr Leu Ile His Pro Asn Asn Leu Thr Ala 180 185 190 Leu Ser Asn Met Pro Pro Lys Gly Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asp 195 200 205 Pro Asn Trp Ser Val Thr Glu Phe Glu Thr Thr Pro Val Met Ser Thr 210 215 220 Tyr Leu Leu Ala Tyr Ile Val Ser Glu Phe Gln Ser Val Asn Glu Thr 225 230 235 240 Ala Gln Asn Gly Val Leu Ile Arg Ile Trp Ala Arg Pro Asn Ala Ile 245 250 255 Ala Glu Gly His Gly Met Tyr Ala Leu Asn Val Thr Gly Pro Ile Leu 260 265 270 Asn Phe Phe Ala Asn His Tyr Asn Thr Ser Tyr Pro Leu Pro Lys Ser 275 280 285 Asp Gln Ile Ala Leu Pro Asp Phe Asn Ala Gly Ala Met Glu Asn Trp 290 295 300 Gly Leu Val Thr Tyr Arg Glu Asn Ala Leu Leu Phe Asp Pro Gln Ser 305 310 315 320 Ser Ser Ile Ser Asn Lys Glu Arg Val Val Thr Val Ile Ala His Glu 325 330 335 Leu Ala His Gln Trp Phe Gly Asn Leu Val Thr Leu Ala Trp Trp Asn 340 345 350 Asp Leu Trp Leu Asn Glu Gly Phe Ala Ser Tyr Val Glu Tyr Leu Gly 355 360 365 Ala Asp His Ala Glu Pro Thr Trp Asn Leu Lys Asp Leu Ile Val Pro 370 375 380 Gly Asp Val Tyr Arg Val Met Ala Val Asp Ala Leu Ala Ser Ser His 385 390 395 400 Pro Leu Thr Thr Pro Ala Glu Glu Val Asn Thr Pro Ala Gln Ile Ser 405 410 415 Glu Met Phe Asp Ser Ile Ser Tyr Ser Lys Gly Ala Ser Val Ile Arg 420 425 430 Met Leu Ser Asn Phe Leu Thr Glu Asp Leu Phe Lys Glu Gly Leu Ala 435 440 445 Ser Tyr Leu His Ala Phe Ala Tyr Gln Asn Thr Thr Tyr Leu Asp Leu 450 455 460 Trp Glu His Leu Gln Lys Ala Val Asp Ala Gln Thr Ser Ile Arg Leu 465 470 475 480 Pro Asp Thr Val Arg Ala Ile Met Asp Arg Trp Thr Leu Gln Met Gly 485 490 495 Phe Pro Val Ile Thr Val Asp Thr Lys Thr Gly Asn Ile Ser Gln Lys 500 505 510 His Phe Leu Leu Asp Ser Glu Ser Asn Val Thr Arg Ser Ser Ala Phe 515 520 525 Asp Tyr Leu Trp Ile Val Pro Ile Ser Ser Ile Lys Asn Gly Val Met 530 535 540 Gln Asp His Tyr Trp Leu Arg Asp Val Ser Gln Ala Gln Asn Asp Leu 545 550 555 560 Phe Lys Thr Ala Ser Asp Asp Trp Val Leu Leu Asn Val Asn Val Thr 565 570 575 Gly Tyr Phe Gln Val Asn Tyr Asp Glu Asp Asn Trp Arg Met Ile Gln 580 585 590 His Gln Leu Gln Thr Asn Leu Ser Val Ile Pro Val Ile Asn Arg Ala 595 600 605 Gln Val Ile Tyr Asp Ser Phe Asn Leu Ala Thr Ala His Met Val Pro 610 615 620 Val Thr Leu Ala Leu Asp Asn Thr Leu Phe Leu Asn Gly Glu Lys Glu 625 630 635 640 Tyr Met Pro Trp Gln Ala Ala Leu Ser Ser Leu Ser Tyr Phe Ser Leu 645 650 655 Met Phe Asp Arg Ser Glu Val Tyr Gly Pro Met Lys Lys Tyr Leu Arg 660 665 670 Lys Gln Val Glu Pro Leu Phe Gln His Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn 675 680 685 Trp Thr Glu Arg Pro Glu Asn Leu Met Asp Gln Tyr Ser Glu Ile Asn 690 695 700 Ala Ile Ser Thr Ala Cys Ser Asn Gly Leu Pro Gln Cys Glu Asn Leu 705 710 715 720 Ala Lys Thr Leu Phe Asp Gln Trp Met Ser Asp Pro Glu Asn Asn Pro 725 730 735 Ile His Pro Asn Leu Arg Ser Thr Ile Tyr Cys Asn Ala Ile Ala Gln 740 745 750 Gly Gly Gln Asp Gln Trp Asp Phe Ala Trp Gly Gln Leu Gln Gln Ala 755 760 765 Gln Leu Val Asn Glu Ala Asp Lys Leu Arg Ser Ala Leu Ala Cys Ser 770 775 780 Asn Glu Val Trp Leu Leu Asn Arg Tyr Leu Gly Tyr Thr Leu Asn Pro 785 790 795 800 Asp Leu Ile Arg Lys Gln Asp Ala Thr Ser Thr Ile Asn Ser Ile Ala 805 810 815 Ser Asn Val Ile Gly Gln Pro Leu Ala Trp Asp Phe Val Gln Ser Asn 820 825 830 Trp Lys Lys Leu Phe Gln Asp Tyr Gly Gly Gly Ser Phe Ser Phe Ser 835 840 845 Asn Leu Ile Gln Gly Val Thr Arg Arg Phe Ser Ser Glu Phe Glu Leu 850 855 860 Gln Gln Leu Glu Gln Phe Lys Lys Asn Asn Met Asp Val Gly Phe Gly 865 870 875 880 Ser Gly Thr Arg Ala Leu Glu Gln Ala Leu Glu Lys Thr Lys Ala Asn 885 890 895 Ile Lys Trp Val Lys Glu Asn Lys Glu Val Val Leu Asn Trp Phe Ile 900 905 910 Glu His His His His His His 915 <210> 6 <211> 2760 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAPN recombinant protein <400> 6 gcccatcacc accatcacca ccatcacgga gcggccgctg accagagcaa gccgtggaac 60 cggtaccgcc tacccacaac gctgttgcct gattcctact tcgtgacgct gagaccctac 120 ctcactccca acgcggatgg cctgtacatc ttcaagggca aaagcatcgt ccgcttactc 180 tgccaggagc ccaccgatgt catcatcatc catagcaaga agctcaacta caccacccag 240 gggcacatgg tggtcctgcg gggcgtgggg gactcccagg tcccagagat cgacaggact 300 gagctggtag agctcactga gtacctggtg gtccacctca agggctcgct gcagcccggc 360 cacatgtacg agatggagag tgaattccag ggggaacttg ccgacgacct ggcaggcttc 420 taccgcagcg agtacatgga gggcaacgtc aaaaaggtgc tggccacgac acagatgcag 480 tctacagatg cccggaaatc cttcccatgc tttgacgagc cagccatgaa ggccacgttc 540 aacatcactc tcatccaccc taacaacctc acggccctgt ccaatatgcc gcccaaaggt 600 tccagcaccc cacttgcaga agaccccaac tggtctgtca ctgagttcga aaccacacct 660 gtgatgtcca cgtaccttct ggcctacatc gtgagcgagt tccagagcgt gaatgaaacg 720 gcccaaaatg gcgtcctgat ccggatctgg gctcggccta atgcaattgc agagggccat 780 ggcatgtatg ccctgaatgt gacaggtccc atcctaaact tctttgccaa tcattataat 840 acatcctacc cactccccaa atccgaccag attgccttgc ccgacttcaa tgccggtgcc 900 atggagaact gggggctggt gacctaccgg gagaacgcgc tgctgtttga cccacagtcc 960 tcctccatca gcaacaaaga gcgagttgtc actgtgattg ctcacgagct ggcccaccag 1020 tggtttggca acctggtgac cctggcctgg tggaatgacc tgtggctgaa tgagggcttt 1080 gcctcctatg tggagtacct gggtgctgac cacgcagagc ccacctggaa tctgaaagac 1140 ctcatcgtgc caggcgacgt gtaccgagtg atggctgtgg atgctctggc ttcctcccac 1200 ccgctgacca cccctgctga ggaggtcaac acacctgccc agatcagcga gatgtttgac 1260 tccatctcct acagcaaggg agcctcggtt atcaggatgc tctccaactt cctgactgag 1320 gacctgttca aggagggcct ggcgtcctac ttgcatgcct ttgcctatca gaacaccacc 1380 tacctggacc tgtgggagca cctgcagaag gctgtggatg ctcagacgtc catcaggctg 1440 ccagacactg tgagagccat catggatcga tggaccctgc agatgggctt ccccgtcatc 1500 accgtggaca ccaagacagg aaacatctca cagaagcact tcctcctcga ctccgaatcc 1560 aacgtcaccc gctcctcagc gttcgactac ctctggattg ttcccatctc atctattaaa 1620 aatggtgtga tgcaggatca ctactggctg cgggatgttt cccaagccca gaatgatttg 1680 ttcaaaaccg catcggacga ttgggtcttg ctgaacgtca acgtgacagg ctatttccag 1740 gtgaactacg acgaggacaa ctggaggatg attcagcatc agctgcagac aaacctgtcg 1800 gtcatccctg tcatcaatcg ggctcaggtc atctacgaca gcttcaacct ggccactgcc 1860 cacatggtcc ctgtcaccct ggctctggac aacaccctct tcctgaacgg agagaaagag 1920 tacatgccct ggcaggccgc cctgagcagc ctgagctact tcagcctcat gttcgaccgc 1980 tccgaggtct atggccccat gaagaaatac ctcaggaagc aggtcgaacc cctcttccaa 2040 catttcgaaa ctctcactaa aaactggacc gagcgcccag aaaatctgat ggaccagtac 2100 agtgagatta atgccatcag cactgcctgc tccaatggat tgcctcaatg tgagaatctg 2160 gccaagaccc ttttcgacca gtggatgagc gacccagaaa ataacccgat ccaccccaac 2220 ctgcggtcca ccatctactg caatgccata gcccagggcg gccaggacca gtgggacttt 2280 gcctgggggc agttacaaca agcccagctg gtaaatgagg ccgacaaact ccgctcagcg 2340 ctggcctgca gcaacgaggt ctggctcctg aacaggtacc tgggttacac cctgaacccg 2400 gacctcattc ggaagcaaga cgccacctcc actattaaca gcattgccag caatgtcatc 2460 gggcagcctc tggcctggga ttttgtccag agcaactgga agaagctctt tcaggactat 2520 ggcggtggtt ccttctcctt ctccaacctc atccagggtg tgacccgaag attctcctct 2580 gagtttgagc tgcagcagct ggagcagttc aagaagaaca acatggatgt gggcttcggc 2640 tccggcaccc gggctctgga gcaagccctg gagaagacca aggccaacat caagtgggtg 2700 aaggagaaca aggaggtggt gttgaattgg ttcatagagc accaccacca ccaccactaa 2760 2760

Claims (10)

1. (1) 곤충세포에 돼지 유래 아미노펩티다아제 N(pAPN) 단백질 단편을 코딩하는 유전자가 적재된 발현 벡터를 도입시키는 단계; 및
   (2) 상기 곤충세포로부터 재조합 pAPN 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 pAPN 단백질 생산 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 pAPN 단백질 단편은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 pAPN 단백질 생산 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 재조합 pAPN 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 pAPN 단백질 생산 방법.
4. 제3항에 있어서,
   상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 재조합 pAPN 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 갖는 것인, 재조합 pAPN 단백질 생산 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 곤충세포는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 세포, 리만트리아 디스파(Lymantria dispar) 세포, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포, 드로소필라(Drosophila) 세포 및 모기(mosquito) 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 재조합 pAPN 단백질 생산 방법.
6. 제1항의 방법에 의해 생산된 재조합 pAPN 단백질.
7. (1) 제6항의 재조합 pAPN 단백질을 인간을 제외한 개체에 주입하는 단계; 및
   (2) 상기 개체로부터 재조합 pAPN 단백질에 특이적인 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 pAPN 단백질에 특이적인 항체를 제조하는 방법.
8. 제7항의 방법에 의해 제조된 재조합 pAPN 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편.
9. 제8항의 항체 또는 이의 항원결합 단편을 유효성분으로 포함하는 pAPN 발현 판별용 키트.
10. 제9항에 따른 판별용 키트에 판별 대상으로부터 분리된 시료를 첨가하는 단계를 포함하는 pAPN 발현 여부 정보제공 방법.

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