CN108107217B

CN108107217B - 猪瘟病毒截短e2蛋白及其应用

Info

Publication number: CN108107217B
Application number: CN201711119596.7A
Authority: CN
Inventors: 仇华吉; 罗玉子; 孙元; 孟星宇; 李素; 李永锋
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-11-14
Filing date: 2017-11-14
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2037-11-14
Also published as: CN108107217A

Abstract

本发明公开了一种基于蛋白空间结构设计的猪瘟病毒截短E2蛋白及其应用。本发明根据牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的晶体结构，模拟出猪瘟病毒E2蛋白的空间结构并对其进行截短表达，截短蛋白E2^B/C/D/A的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，其保留了E2蛋白完整的抗原性、且与牛病毒性腹泻病毒抗体无交叉反应。本发明进一步构建了稳定表达截短蛋白E2^B/C/D/A的CHO细胞系，其微生物保藏编号为CGMCC No.14722。本发明还公开了一种用于猪瘟病毒抗体检测的间接ELISA试剂盒，其中包被抗原为猪瘟病毒截短蛋白E2^B/C/D/A，该试剂盒能够特异性检测猪瘟病毒抗体，特异性、敏感性和重复性好。

Description

猪瘟病毒截短E2蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及猪瘟病毒截短E2蛋白，还涉及猪瘟病毒截短E2蛋白在检测猪瘟病毒抗体中的应用，属于猪瘟病毒E2蛋白的截短表达及应用领域。

背景技术

猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fevervirus,CSFV)引起的一种严重危害全球养猪业的高度传染性疾病。CSFV属于黄病毒科、瘟病毒属成员。瘟病毒属的其它成员包括牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)和边界病病毒(border disease virus,BDV)。BVDV不仅可以感染牛，也可以感染猪。CSFV是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长12.3kb。基因组包含一个大的开放阅读框，编码一个约3,900个氨基酸组成的多聚蛋白，该多聚蛋白在病毒自身及宿主蛋白酶的作用下加工水解产生4种结构蛋白(C、E^rns、E1和E2)和8种非结构蛋白(N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)(Meyers G,Thiel HJ.Molecular characterization ofpestiviruses.Adv Virus Res.1996,47:53–118.)。

CSFV E2蛋白锚定在病毒粒子的表面，在感染过程中诱导机体产生中和抗体。在E2蛋白N端存在4个抗原结构区，依次为B/C/D/A，除D区外均含有中和性抗原表位(WensvoortG.Topographical and functional mapping of epitopes on hog cholera virus withmonoclonal antibodies.J Gen Virol.1989,70(11):2865–76；Huang YL,Deng MC,WangFI,Huang CC,Chang CY.The challenges of classical swine fever control:modifiedlive and E2subunit vaccines.Virus Res.2014,179:1–11.)。B、C区之间通过C⁶⁹³和C⁷³⁷之间的二硫键形成一个独立的抗原结构域(B/C)；D、A区之间通过C⁷⁹²和C⁸⁵⁶以及C⁸¹⁸和C⁸²⁸之间的二硫键形成一个独立的抗原结构域(D/A)(Wensvoort G,Terpstra C,Boonstra J,Bloemraad M,Van Zaane D.Production of monoclonal antibodies against swinefever virus and their use in laboratory diagnosis.Vet Microbiol.1986,12(2):101–8；Wensvoort G,Boonstra J,Bodzinga BG.Immunoaffinity purification andcharacterization of the envelope protein E1of hog cholera virus.J GenVirol.1990,71(3):531–40；Wensvoort G.Topographical and functional mapping ofepitopes on hog cholera virus with monoclonal antibodies.J Gen Virol.1989,70(11):2865–76；van Rijn PA,Miedema GK,Wensvoort G,van Gennip HG,MoormannRJ.Antigenic structure of envelope glycoprotein E1of hog cholera virus.JVirol.1994,68(6):3934–42.)。CSFV和BVDV在病毒粒子结构和基因组构成等方面很相似，在序列上具有较高的同源性，导致二者存在血清学交叉反应(Kumar R,Rajak KK,ChandraT,Muthuchelvan D,Saxena A,Chaudhary D,Kumar A,Pandey AB.Sequence-basedcomparative study of classical swine fever virus genogroup 2.2isolate withpestivirus reference strains.Vet World.2015,8(9):1059–62.)。另外，目前中国主要通过广泛接种猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)来防控猪瘟，细胞源猪瘟活疫苗生产中需要用到胎牛血清，但由于缺乏有效的监测，很多BVDV污染的胎牛血清被用于猪瘟疫苗生产，导致猪瘟疫苗接种猪群产生BVDV抗体(徐国栋.国内猪用疫苗中牛病毒性腹泻污染状况.中国动物保健.2017b,19(4):5–8.)，从而干扰CSFV抗体的检测(Lin GZ,Zheng FY,Zhou JZ,Cao XA,Gong XW,Wang GH,Qiu CQ.An indirect ELISA of classical swine fever virus basedon quadruple antigenic epitope peptide expressed in E.coli.Virol Sin.2010,25(1):71–6.)。因此，急需一种能够有效鉴别CSFV和BVDV抗体的诊断抗原及检测方法。

目前，BVDV E2蛋白的晶体结构已得以解析，鉴定出两个免疫球蛋白样结构域和一个细长的β折叠结构域，推测这种独特的蛋白质结构也可能存在于同属的CSFV(Li Y,WangJ,Kanai R,Modis Y.Crystal structure of glycoprotein E2from bovine viraldiarrhea virus.Proc Natl Acad Sci USA.2013,110(17):6805–10.)。因此，参考BVDV E2蛋白晶体结构，模拟出CSFV E2蛋白的空间结构，并基于模拟的结构将CSFV E2蛋白进行截短表达，以获得保留E2蛋白的抗原性、且与BVDV抗体无交叉反应的截短E2蛋白，将对于特异性检测CSFV抗体具有重要的意义和应用价值。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种基于蛋白空间结构设计的猪瘟病毒截短E2蛋白；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一株稳定表达所述猪瘟病毒截短E2蛋白的CHO细胞系；

本发明所要解决的第三个技术问题是提供所述的猪瘟病毒截短E2蛋白在特异性检测CSFV抗体中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明基于已解析的BVDV E2蛋白晶体结构，通过同源建模分析，模拟出CSFV E2蛋白的空间结构，并基于模拟的蛋白结构对CSFV E2蛋白进行了不同位点的截短表达，以期在保证截短蛋白抗原性的同时，降低或消除与BVDV的血清学交叉反应。截短位点分别为：aa690-aa1030、aa690-aa879和aa770-aa879，不同位点的截短蛋白分别为：E2_aa690-1030、E2_aa690-879和E2_aa770-879。应用ELISA对各截短蛋白的反应性进行初步验证显示，E2_aa690-1030与E2_aa690-879与CSFV抗体具有良好的反应性，而E2_aa770-879反应性相对较低。本发明进一步对反应性良好的E2_aa690-1030和E2_aa690-879的特异性进行初步验证，结果显示，截短蛋白E2_aa690-879(即E2^B/C/D/A)保留了E2蛋白的抗原性、且与BVDV抗体无交叉反应。

本发明所述的猪瘟病毒截短E2蛋白E2_aa690-879(即E2^B/C/D/A)，其氨基酸序列为SEQID NO：1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。

本发明进一步公开了含有所述猪瘟病毒截短E2蛋白编码基因的重组表达载体或重组宿主细胞。其中，所述的重组表达载体优选为重组真核表达载体。

本发明提取CSFV石门株病毒RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板，通过PCR扩增E2截短序列片段，分别在PCR引物的5′和3′端引入了EcoRI和XhoI限制性酶切位点，引物序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。为了实现分泌性表达及纯化和鉴定重组CSFV截短E2蛋白，本发明在3′末端引入了Strep标签，同时在截短蛋白序列的5′端引入了一段信号肽序列；添加信号肽及纯化标签的E2^B/C/D/A的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示。通过PCR方法扩增目的基因，然后进行双酶切，将产物连接至pCAGGS载体上，获得重组质粒pCAGGS-E2_aa690-879(E2^B/C/D/A)。

本发明进一步构建了稳定表达所述截短蛋白E2^B/C/D/A的CHO真核细胞系。

本发明将重组质粒pCAGGS-E2_aa690-879(E2^B/C/D/A)进行双酶切，并连接至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1上，获得重组质粒pLVX-E2^B/C/D/A。将重组质粒pLVX-E2^B/C/D/A与包装质粒pMD2.G和psPAX2共转染至HEK293T细胞中，得到包装好质粒pLVX-E2^B/C/D/A的慢病毒，然后转导慢病毒至CHO细胞中。本发明通过对细胞系进行筛选，成功筛选出9株表达E2^B/C/D/A的阳性克隆。SDS-PAGE分析结果显示，细胞克隆CHO-E2^B/C/D/A-1表达量相对较高。

本发明将稳定表达所述猪瘟病毒截短E2蛋白(E2^B/C/D/A)的CHO细胞系CHO-E2^B/C/D/A-1提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14722；分类命名为：稳定表达猪瘟病毒截短E2蛋白的CHO细胞系；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2017年9月20日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明还公开了所述的猪瘟病毒截短E2蛋白或其编码基因在制备诊断、预防或治疗猪瘟的试剂或药物中的应用。

本发明还公开了所述的猪瘟病毒截短E2蛋白或其编码基因在制备猪瘟病毒抗体检测的试剂中的应用。

本发明还公开了稳定表达猪瘟病毒截短E2蛋白(E2^B/C/D/A)的CHO细胞系CHO-E2^B ^/C/D/A-1在制备诊断、预防或治疗猪瘟的试剂或药物中的应用。

本发明还公开了稳定表达猪瘟病毒截短E2蛋白(E2^B/C/D/A)的CHO细胞系CHO-E2^B ^/C/D/A-1在制备猪瘟病毒抗体检测的试剂中的应用。

本发明进一步公开了一种用于猪瘟病毒抗体检测的间接ELISA试剂盒，包括：包被抗原的固相载体、辣根过氧化酶标记的兔抗猪IgG、洗涤液、显色液和终止液；其中所述抗原为猪瘟病毒截短E2蛋白(E2^B/C/D/A)。

本发明建立了基于重组蛋白E2^B/C/D/A的间接ELISA方法，该方法可特异性检测CSFV抗体。本发明对ELISA反应条件的优化结果表明，当抗原包被浓度为2.5μg/mL，血清以100倍稀释，HRP标记抗体以20,000倍稀释时，反应效果最佳。特异性检测结果显示，除了CSFV抗体阳性血清外，其余BVDV、PRV、PRRSV或PCV2血清的OD值均小于Cutoff值，表明该方法具有良好的特异性。敏感性检测结果显示，当血清中和抗体效价(ND₅₀)大于0时，均能检测到CSFVE2抗体的存在，表明该方法具有良好的敏感性。重复性验证结果表明，变异系数在0.769％-6.315％之间，均小于10％，说明该方法具有较好的重复性。利用本发明建立的ELISA方法对已知背景的282份猪血清进行检测，并与中和试验和IDEXX CSFV抗体检测试剂盒的检测结果进行对比，其符合率分别为92.9％(262/282)和89.4％(252/282)，相对敏感性分别为93.7％(119/127)和93.5％(115/123)，相对特异性分别为92.3％(143/155)和93.2％(137/147)，表明本发明方法具有良好的敏感性和特异性。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

鉴于目前基于完整的CSFV E2蛋白的ELISA方法不能有效区分CSFV和BVDV抗体，本发明基于预测的CSFV E2蛋白结构对E2蛋白进行了截短，截短蛋白依然涵盖了E2蛋白所有的抗原区，在保留CSFV E2蛋白抗原性的同时，可降低或消除与其它瘟病毒的血清学交叉反应。经试验证实，表达的截短蛋白E2_aa690-879(即E2^B/C/D/A)与BVDV抗体无交叉反应。本发明进一步构建了稳定表达截短蛋白E2^B/C/D/A的CHO真核细胞系，大大降低了生产成本。本发明基于重组蛋白E2^B/C/D/A建立了间接ELISA方法，该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，能够特异性检测CSFV抗体。本发明为CSFV特异性血清学检测及与BVDV的鉴别诊断提供了新的思路，为猪瘟的防控及净化奠定了基础。

附图说明

图1为CSFV E2蛋白结构预测及截短位点；其中，A：CSFV E2蛋白模拟结构示意图；B：CSFV E2蛋白截短示意图；

图2为Western blotting验证重组蛋白的表达情况；其中，M：蛋白marker；1：pCAGGS；2：截短蛋白E2_aa690-aa1030；3：截短蛋白E2_aa690-aa879；4：截短蛋白E2_aa770-aa879；

图3为重组蛋白的抗原性和特异性验证；其中，A：ELISA初步验证截短蛋白的反应性；Positive sera为阳性血清，Negative sera为阴性血清；B：ELISA初步验证截短蛋白的特异性；

图4为使用倒置荧光显微镜观测CHO-E2^B/C/D/A细胞系表达情况；其中，A：空白对照；B：转导后，CHO-E2^B/C/D/A表达情况；

图5为SDS-PAGE鉴定筛选的CHO-E2^B/C/D/A细胞系表达情况；其中，1～9：有限稀释法筛选出的CHO-E2^B/C/D/A细胞克隆；

图6为E2^B/C/D/A-ELISA反应条件的优化；其中，A：蛋白包被浓度；B：血清稀释度；C：HRP标记抗体的稀释度；

图7为间接ELISA的特异性；分别选取BVDV(7份)、PRV(4份)、PRRSV(5份)、PCV2(6份)以及CSFV(15份)抗体阳性血清评估间接ELISA的特异性；

图8为间接ELISA的敏感性；其中，P1、P2、P3、P4为CSFV抗体阳性血清；N1、N2为CSFV抗体阴性血清。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1基于蛋白空间结构设计的猪瘟病毒截短E2蛋白的真核细胞表达及其应用

1、材料和方法

1.1细胞、病毒和血清

CHO细胞用含有5％胎牛血清的DME/F-12培养基、在37℃和5％CO₂条件下培养；HEK293T细胞用含有10％胎牛血清的DMEM培养基、在37℃和5％CO₂条件下培养。CSFV石门株(GenBank登录号AF092448.2)由本实验室保存。本发明中用到的BVDV阳性血清由德国汉诺威兽医大学OIE猪瘟参考实验室提供和本实验室制备保存；所有的猪瘟阳性血清和阴性血清由本实验室保存；其它用于评价本发明方法特异性的相关猪病特异性血清由本实验室保存，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)。

1.2基于BVDV E2蛋白晶体结构对CSFV E2抗原结构的预测和分析

研究者通过对CSFV E2蛋白的深入研究，已经模拟了其二维结构，鉴定了一些线性和构象表位(van Rijn PA,Miedema GK,Wensvoort G,van Gennip HG,MoormannRJ.Antigenic structure of envelope glycoprotein E1of hog cholera virus.JVirol.1994,68(6):3934–42；Wensvoort G,Boonstra J,Bodzinga BG.Immunoaffinitypurification and characterization of the envelope protein E1of hog choleravirus.J Gen Virol.1990,71(3):531–40；Wensvoort G,Terpstra C,Boonstra J,Bloemraad M,Van Zaane D.Production of monoclonal antibodies against swinefever virus and their use in laboratory diagnosis.Vet Microbiol.1986,12(2):101–8；Wensvoort G.Topographical and functional mapping of epitopes on hogcholera virus with monoclonal antibodies.J Gen Virol.1989,70(11):2865–76；Huang YL,Deng MC,Wang FI,Huang CC,Chang CY.The challenges of classical swinefever control:modified live and E2subunit vaccines.Virus Res.2014,179:1–11.)。将CSFV石门株E2序列输入到Swiss model服务器上，进行在线同源建模(http://swissmodel.expasy.org/workspace/)，并基于E2蛋白抗原表位研究进展，选取合适的氨基酸位点对其进行不同位点的截短，以期在保证截短蛋白抗原性的同时，降低或消除与BVDV的血清学交叉反应。

1.3 CSFV E2^B/C/D/A重组真核表达载体的构建

采用TRIzol法提取CSFV石门株病毒RNA，并反转录成cDNA，以cDNA为模板，通过PCR扩增E2截短序列片段。分别在PCR引物的5′和3′端引入了EcoRI和XhoI限制性酶切位点，引物序列见表1。为了实现分泌性表达及纯化和鉴定重组CSFV截短E2蛋白，在3′末端引入了Strep标签，同时在各截短蛋白序列的5′端引入了一段信号肽序列。通过PCR方法扩增目的序列，然后进行双酶切，将产物分别连接至pCAGGS载体上，获得重组质粒pCAGGS-E2_aa690-1030、pCAGGS-E2_aa690-879和pCAGGS-E2_aa770-879。

表1特异性引物序列

1.4稳定表达截短蛋白的CHO细胞系的构建及其纯化

将重组质粒pCAGGS-E2_aa690-879(E2^B/C/D/A)进行双酶切，并连接至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1上，获得重组质粒pLVX-E2^B/C/D/A。将重组质粒pLVX-E2^B/C/D/A与包装质粒pMD2.G和psPAX2共转染至HEK293T细胞中，转染后48h收集细胞培养上清，用0.22μm孔径的滤膜过滤、浓缩即为包装好质粒pLVX-E2^B/C/D/A的慢病毒。以10个转导单位的MOI转导慢病毒至CHO细胞中。转导后48h收集上清，用Western blotting分析蛋白表达情况。然后通过有限稀释法对转导后的CHO细胞进行筛选，将表达E2^B/C/D/A的阳性细胞克隆(CHO-E2^B/C/D/A)扩大培养，收集细胞培养上清，用0.22μm孔径的滤膜过滤。应用制备型液相层析系统

对抗体进行纯化，并用Western blotting进行验证。

1.5 ELISA方法的建立及反应条件的优化

应用纯化的E2^B/C/D/A作为包被抗原，建立间接ELISA方法。首先对ELISA的各个反应参数进行优化，通过棋盘滴定法确定最佳抗原包被浓度、血清稀释度和辣根过氧化酶(HRP)标记二抗的稀释度。将纯化的蛋白稀释至2.5μg/mL，包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜。次日，每孔加入300μL PBS清洗2次后，加入200μL含5％脱脂乳的PBS于37℃封闭板子2h，用PBST洗2次后，加入用含5％脱脂乳的PBST进行100倍稀释的血清，37℃孵育1h，用PBST洗板5次后，加入HRP标记的兔抗猪IgG(1：20,000)(catalog no.A5670；Sigma)，每孔100μL，37℃孵育1h，用PBST洗5次，然后，加入TMB显色液(catalog no.T0040；Sigma)，每孔100μL，显色12min后，应用2M H₂SO₄终止反应，每孔100μL，最后，应用酶标仪(ELx808；BioTek)在450nm波长下读数。

1.6间接ELISA的评价

特异性试验：

分别选取BVDV、PRRSV、PCV2、PRV和CSFV抗体阳性血清对间接ELISA的特异性进行评价。

敏感性试验：

随机挑取4份CSFV抗体阳性血清和2份阴性血清，用中和试验对其中和滴度进行测定，并将血清样本进行倍比稀释(1：100～12,800)后，用本发明建立的ELISA方法进行检测，评价该方法的敏感性。

符合性试验：

应用建立的诊断方法对已知背景的282份猪血清进行检测，并与IDEXX阻断ELISA和中和试验结果进行对比。

1.7统计学分析

应用GraphPad Prism软件分析所有的数据。误差线表示图中所有平均值(SD)的标准偏差，认为p值<0.05时差异是显著的。

2、结果

2.1预测的CSFV E2蛋白结构

Wensvoort等通过单克隆抗体竞争结合和抗原捕捉试验等，对CSFV E2蛋白的抗原结构进行了分析，结果表明，在E2蛋白的氨基端上存在4个不同的抗原区域，依次为B、C、D和A(Wensvoort G,Terpstra C,Boonstra J,Bloemraad M,Van Zaane D.Production ofmonoclonal antibodies against swine fever virus and their use in laboratorydiagnosis.Vet Microbiol.1986,12(2):101–8；Wensvoort G,Boonstra J,BodzingaBG.Immunoaffinity purification and characterization of the envelope proteinE1of hog cholera virus.J Gen Virol.1990,71(3):531–40；WensvoortG.Topographical and functional mapping of epitopes on hog cholera virus withmonoclonal antibodies.J Gen Virol.1989,70(11):2865–76.)。本发明将E2基因的核苷酸序列上传至Swiss Model服务器上，系统自动匹配模板。BVDV E2蛋白的晶体结构[Protein Data Bank(PDB)code 4jnt.1.B]被认为是最合适的模板，然后服务器自动建模。接下来本发明根据模拟的结构对CSFV E2蛋白进行截短表达。截短位点分别为aa690-aa1030、aa690-aa879和aa770-aa879(图1)。

2.2重组蛋白的反应性

首先，本发明通过瞬时转染的方法验证了截短蛋白的表达情况，Westernblotting分析结果表明，截短蛋白均能成功表达(图2)，与预期大小相符。然后，分别选取CSFV抗体阴性、阳性的血清各3份，通过ELISA对各截短蛋白的反应性进行了初步验证，结果显示，E2_aa690-1030与E2_aa690-879与CSFV抗体具有良好的反应性，而E2_aa770-879反应性相对较低(图3A)。随后，对反应性良好的E2_aa690-1030和E2_aa690-879的特异性进行了初步验证，选取了BVDV抗体阳性的血清4份进行检测，结果表明，E2_aa690-879与BVDV反应性最低(图3B)。然后，构建了稳定表达E2_aa690-879(即E2^B/C/D/A)的CHO细胞系。本发明利用慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1构建重组质粒pLVX-E2^B/C/D/A，转导至CHO细胞后，在倒置荧光显微镜下观测到绿色荧光(图4A和B)。

2.3细胞系的筛选

通过有限稀释法对细胞系进行筛选，成功筛选出9株表达E2^B/C/D/A的阳性克隆，然后对其进行SDS-PAGE分析，结果显示，其中细胞克隆CHO-E2^B/C/D/A-1表达量相对较高(图5)。

本发明将稳定表达猪瘟病毒截短E2蛋白(E2^B/C/D/A)的CHO细胞系CHO-E2^B/C/D/A-1提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.14722。

2.4优化的间接ELISA反应条件

为了建立高效的间接ELISA诊断方法，对ELISA的反应条件进行了优化，通过棋盘滴定法确定了最佳的抗原包被浓度(图6A)、血清稀释度(图6B)及HRP标记抗体的稀释度(图6C)。结果表明，当包被浓度为2.5μg/mL，血清以100倍稀释，HRP标记抗体以20,000倍稀释时，反应效果最佳。

2.5基于E2^B/C/D/A的间接ELISA的判定标准

根据优化的ELISA反应条件，对经本实验室验证的CSFV抗体阴性和阳性血清共282份进行了检测，并应用SigmaPlot分析软件确定Cutoff值为0.2(Aebischer A,Müller M,Hofmann MA.Two newly developed E(rns)-based ELISAs allow the differentiationof Classical Swine Fever virus-infected from marker-vaccinated animals andthe discrimination of pestivirus antibodies.Vet Microbiol.2013,161(3-4):274–85.)。当OD_450nm≥0.2时，即判定为阳性；OD_450nm＜0.2时，即为阴性。

2.6间接ELISA的特异性

为了验证E2^B/C/D/A反应的特异性，分别选取BVDV、PRV、PRRSV、PCV2和CSFV抗体阳性血清进行了特异性检测，结果显示，除了CSFV抗体阳性血清外，其余血清的OD值均小于Cutoff值(图7)，表明该方法具有良好的特异性。

2.7间接ELISA的敏感性

随机挑取了4份CSFV抗体阳性血清和2份阴性血清，用中和试验对其中和滴度进行测定，并将血清样品进行倍比稀释(1:100～12,800等)后，用已建立的ELISA方法对血清进行检测。结果显示，当血清ND₅₀大于0时，均能检测到CSFV E2抗体的存在(图8)，表明该诊断方法具有良好的敏感性。

2.8间接ELISA的重复性

用5份CSFV阳性血清和3份阴性血清对建立的ELISA方法的重复性进行了验证，每个样品做3个重复。结果表明，变异系数在0.769％-6.315％之间，均小于10％，说明该方法具有较好的重复性(表2)。

表2间接ELISA的重复性

2.9间接ELISA与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒和血清中和试验的符合性

利用建立的ELISA方法对本实验室已知背景的282份猪血清进行了检测，并与中和试验和IDEXX CSFV抗体检测试剂盒的检测结果进行对比，其符合率分别为92.9％(262/282)和89.4％(252/282)，相对敏感性分别为93.7％(119/127)和93.5％(115/123)；相对特异性分别为92.3％(143/155)和93.2％(137/147)(表3)。结果表明，该方法具有良好的敏感性和特异性。

表3 E2^B/C/D/A-ELISA与中和试验和IDEXX CSFV抗体检测试剂盒对比

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120> 猪瘟病毒截短E2蛋白及其应用

<130> HLJ-2001-170802A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 190

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 1

Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Thr Asn

1 5 10 15

Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr Trp Glu Glu

20 25 30

Tyr Ser His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val Lys Ala Ile Cys

35 40 45

Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg

50 55 60

Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Gly Ala Leu Leu Thr Ser Val Thr Phe

65 70 75 80

Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp

85 90 95

Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys

100 105 110

Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val

115 120 125

Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro

130 135 140

Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg Glu Lys Pro

145 150 155 160

Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp

165 170 175

Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys

180 185 190

<210> 2

<211> 570

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

cggctagcct gcaaggaaga ttacaggtac gcactatcgt caaccaatga gatagggcta 60

ctcggggccg gaggtctcac taccacctgg gaagaataca gccacgattt gcaactgaat 120

gacgggaccg ttaaggccat ttgcgtggca ggttccttta aagtcacagc acttaatgtg 180

gtcagtagga ggtatttggc atcattgcat aagggggctt tactcacttc cgtgacattc 240

gagctcctgt tcgacgggac caacccatca accgaagaaa tgggagatga cttcgggttc 300

gggctgtgcc cgtttgatac gagtcctgtt gtcaagggaa agtacaatac aaccttgttg 360

aacggtagtg ctttctacct tgtctgccca atagggtgga cgggtgttat agagtgcaca 420

gcagtgagcc caacaactct gagaacagaa gtggtaaaga ccttcaggag agagaagcct 480

ttcccacaca gaatggattg tgtgaccacc acagtggaaa atgaagatct attctactgt 540

aagttggggg gcaactggac atgtgtgaaa 570

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

cggaattcgc caccatggta ttaagaggac agatcgtgc 39

<210> 4

<211> 80

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

atctcgagtt acttctcgaa ctgggggtgg gaccatgctg aatgatgatg atgatgatgc 60

cctttcacac atgtccagtt 80

<210> 5

<211> 231

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 5

Ala Thr Met Val Leu Arg Gly Gln Ile Val Gln Gly Val Ile Trp Leu

1 5 10 15

Leu Leu Val Thr Gly Ala Gln Gly Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr

20 25 30

Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly

35 40 45

Gly Leu Thr Thr Thr Trp Glu Glu Tyr Ser His Asp Leu Gln Leu Asn

50 55 60

Asp Gly Thr Val Lys Ala Ile Cys Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr

65 70 75 80

Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Gly

85 90 95

Ala Leu Leu Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn

100 105 110

Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro

115 120 125

Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu

130 135 140

Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val

145 150 155 160

Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val

165 170 175

Lys Thr Phe Arg Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val

180 185 190

Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly

195 200 205

Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly His His His His His His Ser Ala Trp

210 215 220

Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

225 230

<210> 6

<211> 696

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 6

gccaccatgg tattaagagg acagatcgtg caaggtgtga tatggctgct actagtaact 60

ggggcacaag gccggctagc ctgcaaggaa gattacaggt acgcactatc gtcaaccaat 120

gagatagggc tactcggggc cggaggtctc actaccacct gggaagaata cagccacgat 180

ttgcaactga atgacgggac cgttaaggcc atttgcgtgg caggttcctt taaagtcaca 240

gcacttaatg tggtcagtag gaggtatttg gcatcattgc ataagggggc tttactcact 300

tccgtgacat tcgagctcct gttcgacggg accaacccat caaccgaaga aatgggagat 360

gacttcgggt tcgggctgtg cccgtttgat acgagtcctg ttgtcaaggg aaagtacaat 420

acaaccttgt tgaacggtag tgctttctac cttgtctgcc caatagggtg gacgggtgtt 480

atagagtgca cagcagtgag cccaacaact ctgagaacag aagtggtaaa gaccttcagg 540

agagagaagc ctttcccaca cagaatggat tgtgtgacca ccacagtgga aaatgaagat 600

ctattctact gtaagttggg gggcaactgg acatgtgtga aagggcatca tcatcatcat 660

cattcagcat ggtcccaccc ccagttcgag aagtaa 696

Claims

1.一种猪瘟病毒截短E2蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述猪瘟病毒截短E2蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQID NO：2所示。

3.含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体。

4.一株稳定表达权利要求1所述猪瘟病毒截短E2蛋白的CHO细胞系，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14722。

5.权利要求1所述的猪瘟病毒截短E2蛋白在制备诊断、预防或治疗猪瘟的试剂或药物中的应用。

6.权利要求1所述的猪瘟病毒截短E2蛋白在制备猪瘟病毒抗体检测的试剂中的应用。

7.权利要求2所述的编码基因在制备诊断、预防或治疗猪瘟的试剂或药物中的应用。

8.权利要求2所述的编码基因在制备猪瘟病毒抗体检测的试剂中的应用。

9.权利要求4所述的CHO细胞系在制备诊断、预防或治疗猪瘟的试剂或药物中的应用，或者在制备猪瘟病毒抗体检测的试剂中的应用。

10.一种用于猪瘟病毒抗体检测的间接ELISA试剂盒，包括：包被抗原的固相载体、辣根过氧化酶标记的兔抗猪IgG、洗涤液、显色液和终止液；其特征在于：所述抗原为权利要求1所述的猪瘟病毒截短E2蛋白。