CN102485749A - 猪瘟合成肽疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种猪瘟合成肽疫苗及其制备方法，具体涉及用于猪瘟合成肽疫苗的多肽，以及含有该多肽的疫苗及它们的制备方法。所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。由该多肽制成的疫苗可以有效应对猪瘟病毒的抗原变异，也不存在生物安全性问题，易于大规模合成，具有良好的应用前景。

Description

猪瘟合成肽疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于猪瘟合成肽疫苗的多肽，以及含有该多肽的疫苗及它们的制备方法。
背景技术
猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是严重危害养猪业的重要病毒性传染病，其主要表现为特征性病理变化、内脏出血、梗塞和坏死，死亡率高达80％～90％，几乎遍及全世界(除北美洲和大洋洲外)，给养猪业造成重大的经济损失。国际动物卫生组织将猪瘟列入A类烈性传染病。猪瘟在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生。此外患病和弱毒株感染的母猪也可以经胎盘垂直感染胎儿，产生弱仔猪、死胎等。该病的潜伏期一般为5～7天，根据临床症状可分为最急性、急性、慢性和温和型四种类型。
猪瘟病毒(CSFV)属黄病毒科(Flavividae)瘟病毒属(Pestivirus)，基因组为单股正链RNA病毒，大小约为12.3kb，含有一个开放阅读框架(ORF)，编码一个含3898aa的多聚前体蛋白。CSFV基因组由11个基因组成，已定位的蛋白有5种：Npro、C、E0、E1和E2，未明确定位的有6种：NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，其中C为核衣壳蛋白，E0、E1和E2为结构糖蛋白，其余均为非结构蛋白。在结构蛋白中，最具有免疫防治研究价值的是E0和E2基因。
E2囊膜糖蛋白(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白，具有种属特异性。E2基因的变异将影响CSFV的免疫原性和抗原性。E2存在A、B、C和D 4个相对独立的抗原区域，而A又进一步分为A1、A2和A3三个亚区。A1、A2亚区在CSFV不同分离毒株间是保守的，而A3、B、C、D均呈不同程度的变异性。A、B和C区是中和抗原表位区，可诱导动物的中和反应，且A1和B、A1和C之间诱导的中和反应存在协同作用。在所有抗原区或亚区中，只有A1亚区诱导产生的单克隆抗体不仅对病毒感染具有中和作用，而且能识别所有CSFV分离毒株，并与相关病毒BVDV和BDV无交叉反应。因此，A1抗原区的精确定位及克隆、表达，对CSFV的诊断、免疫研究具有重要价值。A、B、C和D各区域的抗原表位数分别是：8、6、3和1，而A1、A2和A3的抗原表位数分别为：4、3和1。有研究进一步确定了E2蛋白上4个相对独立的抗原区域的抗原表位的位置：所有抗原位点均在E2的N端690～866的176aa之上，其中B的所有表位和C的一个表位位于第1～83aa残基之间，C区域的其它表位所处区域较宽，在第1～110aa残基之间，A1位于第86～176aa残基之间，A2、A3位于第86～123aa残基之间，D区域仅有一个抗原表位，位于第86～110aa残基之间。
目前已经报道的猪瘟B细胞线性表位有：E2上的TAVSPTTLR(aa829-837)、SPTTL(aa 289-293)、CTAVSPTTLRTEVVK(aa 828-842)、LFDGTNP(aa 772-778)和Erns上的DKN(aa 117-119)，这些抗原表位的确定将有助于促进猪瘟病毒的诊断分析和表位标记疫苗的发展。
传统疫苗是将病原体灭活或减毒制成的，存在生物危害性和遗传变异致使原疫苗效力丧失等问题。表位疫苗是用抗原表位制备的疫苗，是目前研制感染性疾病疫苗的方向。相对于传统的弱毒苗和灭活苗以及其他几种新型的疫苗，肽类疫苗安全、无毒、稳定，由于其分子结构小而简单，很少会出现严重的并发症及医源性感染问题。肽类疫苗可精确定位，合成T、B细胞抗原表位且可以进行不同的组合，制成针对多种病原体的疫苗。特别是可选用微生物中无突变的小片段制备合成肽疫苗。有些病原(如流感病毒)可通过快速而高频的突变逃避宿主免疫系统，若选择无突变的小肽片段作为疫苗就可克服其自身蛋白的局限性。研制合成多肽疫苗最重要的一步是寻找抗原表位。
解放军军需大学军事兽医研究所的刘思国等人在CSFV E2基因遗传变异分析的基础上，根据推导的氨基酸序列，通过计算机分析、预测E2蛋白的抗原表位，合成短肽。与抗mE2蛋白的兔血清(或单克隆抗体)进行反应，鉴定短肽的反应原性，并与载体蛋白(BSA)偶联后免疫实验动物，测定免疫原性。结果显示，仅其中一条多肽能产生抗体。Dong等报道合成5段猪瘟石门株B/C区693-777位氨基酸，偶联BSA制成合成肽苗，结果免疫猪能产生高滴度的抗体，并能完全保护强毒的攻击。以此多肽制备高免血清，此血清1∶4和1∶6稀释后能抑制C株的兔体热反应，而用合成多肽对高免血清进行亲和层析处理后，则不能抑制C株的兔体热反应。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种用于猪瘟合成肽疫苗的多肽，以及含有该多肽的疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种上述多肽以及上述疫苗的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一方面，本发明提供一种用于猪瘟合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供一种猪瘟合成肽疫苗，其中包括一种或多种氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的多肽；优选地，所述疫苗包含佐剂。
此外，本发明还提供了上述多肽的制备方法，其中包括以下步骤：
(1)去保护反应：在体积比为15％-30％的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，脱除树脂氨基上的9-芴甲氧羰基保护基团，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤；
(2)氨基酸的活化：将合成用的带有9-芴甲氧羰基保护基团的各个氨基酸与1-羟基苯丙三唑反应合成氨基酸-1-羟基苯丙三唑酯；
(3)缩合反应：使用多肽合成仪将上述各种氨基酸和树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂；
(4)乙酰化反应：使用重量体积比(g/ml)为1.5％-4％的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-28℃条件下反应20-40分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；
(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复步骤(1)～(4)，反应完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽树脂；
(6)多肽与树脂的分离：向干燥的多肽树脂中加入裂解试剂，匀速搅拌1-4小时后置于0℃下反应10分钟，恢复至室温，挥去三氟乙酸，将叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，搅拌洗涤，过滤得多肽溶液；
(7)超滤纯化多肽及无菌处理：使用膜包在20-28℃条件下超滤多肽，使用0.22微米在线滤器除菌保存。
上述多肽的制备方法中，所述裂解试剂的组分体积比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶乙二硫醇∶苯酚∶水＝85∶8∶3∶3∶1。
本发明还提供了上述疫苗的制备方法，其中包括以下步骤：
(1)用注射用水将多肽稀释至200μg/ml制得抗原水相；
(2)在20-28℃条件下，按照抗原水相∶佐剂＝1∶1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，90-150转/分钟慢速搅拌1.5-3分钟；
(3)缓慢加入抗原水相，搅拌20-30分钟；
(4)高速搅拌15-30分钟后静置5分钟，分装后即得。
在上述疫苗的制备方法中，所述高速搅拌为8000-10000转/分钟。
本发明进一步提供了上述的多肽或疫苗在制备治疗和/或预防猪瘟的药物中的用途。
综上所述，本发明通过对猪瘟毒株的序列测定，研究猪瘟主要抗原位点的变异情况，同时结合计算机辅助方法进行猪瘟抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，进而经过大量的动物试验对候选多肽抗原进行筛选，得到免疫反应水平高，可以很好地保护动物免受猪瘟毒株的攻击的多肽抗原，并基于此研制出一种效力好、安全性高、生产工艺稳定且成本低的抗猪瘟病毒的合成肽疫苗。对这些多肽进行的疫苗安全性和效力试验结果表明，本发明提供的疫苗可以有效应对猪瘟病毒的抗原变异，也不存在生物安全性问题，易于大规模合成，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例3中的血清检测结果。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：合成肽疫苗多肽抗原的固相合成
本实施例为本发明所提供的合成肽疫苗的多肽抗原的固相合成。本发明的多肽抗原可以通过ABI 433A全自动多肽合成仪，利用Merrifield固相合成法制备，其中采用了9-芴甲氧羰基(Fmoc)修饰的氨基酸，固相载体为Rink Amide MBHA树脂。生产过程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原纯化与除菌保存。
1、合成原料的准备
合成肽疫苗多肽抗原序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ INNO.3和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
依据上述多肽抗原序列以及1mmol的合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸，加入相应的Cartridge(装氨基酸的小瓶)中。同样按要求称量RinkAmide MBHA树脂，放入反应腔中，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成的肽的名称，批号，反应腔的皮重以及所称取树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制合成试剂包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、已酰咪唑(AIM)、哌啶(PIP)、甲醇等并放置到对应的试剂瓶中。
2、合成仪状态的检测
检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查N2是否充足，系统表压是否正常。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪：发送Flow Ratel-18到合成仪，选择Main Menu-ModuleTest-按Prer或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A-按Start-按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求。
3、合成肽疫苗多肽抗原的制备
(1)去保护反应：在15％-30％(体积/体积)的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，脱除树脂氨基上的9-芴甲氧羰基保护基团，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤；
(2)氨基酸的活化：将合成用的带有9-芴甲氧羰基保护基团的各个氨基酸与1-羟基苯丙三唑反应合成氨基酸-1-羟基苯丙三唑酯；
(3)缩合反应：使用多肽合成仪将上述各种氨基酸和树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂；
(4)乙酰化反应：使用1.5％-4％(重量/体积)的乙酰咪唑N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-28℃条件下反应20-40分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；
(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复步骤(1)～(4)，反应完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽树脂；
(6)多肽与树脂的分离：向干燥的多肽树脂中加入裂解试剂(各组分的体积比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶乙二硫醇∶苯酚∶水＝85∶8∶3∶3∶1)，匀速搅拌1-4小时后置于0℃下反应10分钟，恢复至室温，挥去三氟乙酸，将叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，搅拌洗涤，过滤得多肽溶液；
(7)超滤纯化多肽及无菌处理：使用膜包在20-28℃条件下超滤多肽，使用0.22微米在线滤器除菌保存。
实施例2：合成肽疫苗的配制
本实施例为本发明所提供的合成肽疫苗的配制。
用注射用水将多肽溶液分别稀释到50μg/ml，制成抗原水相；将SEPPICMONTANIDE ISA 50V油佐剂经121℃，30分钟灭菌，备用作为油相。在22℃条件下，按照抗原水相与灭菌的油相50V为1∶1的体积比，先将油相加入乳化罐内，100转/分钟慢速搅拌2分钟，缓慢加入水相，加完后搅拌30分钟，再高速9000转/分钟搅拌20分钟，然后静置5分钟，分装后即得抗禽流感病毒的合成肽疫苗，即SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的合成肽疫苗、SEQID NO.2所示氨基酸序列的合成肽疫苗，SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的合成肽疫苗、SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的合成肽疫苗。
实施例3：合成肽疫苗的效力试验
本实施例提供了本发明合成肽疫苗的效力试验，具体详述如下。
1、试验方法：采用阻断ELISA检测实施例2所配制的猪瘟合成肽疫苗免疫猪血清的效力。
四批合成肽疫苗一共设为四组，试验动物为40日龄经检测CSF抗原、抗体为阴性的健康猪16头，具体分组情况见表1。分别于免疫前和2次免疫21d耳缘静脉采血分离血清，作为检测血清。
表1疫苗分组情况
  分组   注射疫苗   试验动物数(头)   免疫剂量(ml/头)
  1组   SEQ ID NO.1多肽疫苗   4   2
  2组   SEQ ID NO.2多肽疫苗   4   2
  3组   SEQ ID NO.3多肽疫苗   4   2
  4组   SEQ ID NO.4多肽疫苗   4   2
应用IDEXX CSFV抗体检测试剂盒(购自北京爱得士元亨生物科技有限公司)进行检测，具体方法如下：分别将50μl样品稀释液加入每个检测孔和对照孔中，加入检测的血清50μl，阴性和阳性对照血清50μl，混合后，将微量反应板在室温条件下湿盒中感作2小时，弃去反应孔中的液体，应用PBST(pH7.4，0.01mol/L磷酸盐(PBS)缓冲液，含有0.05％Tween-20)洗板3次，加入抗CSFV酶标二抗，100μl/孔，室温感作30分钟，应用PBST洗板3次，加入底物溶液三甲氧基苯甲醛(TMB)，100μl/孔，室温避光感作10分钟，加入100μl/孔的终止液0.5M H2SO4，采用美国Bio-Tek全自动酶标仪ELx800检测OD450nm。
按照阻断率＝(ODNeg-ODTest)/ODNeg*100％计算阻断率，其中ODNeg为阴性血清的OD450nm值，ODTest为被测血清的OD450nm值。阳性血清对照阻断率大于50％，阴性对照平均OD450nm应大于0.5，阻断率小于30％为阴性，阻断率在30％～40％之间为可疑，大于40％为阳性。
2、试验结果：
根据IDEXX试剂盒的判定标准，阳性血清对照阻断率大于50％，阴性对照平均OD450nm大于0.5，本次试验标准阳性血清的阻断率为86％，阴性血清的OD450nm为1.115，显示本次试验成立。
免疫接种前的血清均为阴性(阻断率小于30％为阴性，阻断率在30％～40％之间为可疑，大于40％为阳性)；免疫后的血清均为阳性，血清检测结果如图1所示，其中编号1-4代表在实施例2中配制的氨基酸序列为SEQID NO.1-4所示的合成肽疫苗。图1所示结果表明，猪瘟合成肽疫苗能够诱导猪产生免疫应答。
实施例4：合成肽疫苗的安全试验
本实施例提供了本发明合成肽疫苗的安全试验。分别采用实施例2所配制的猪瘟合成肽疫苗注射实验动物，包括豚鼠、小鼠及仔猪，连续观察15日，判定实验动物是否出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应。具体过程详述如下：
用体重350～450g的豚鼠20只，每批疫苗注射5只，每只皮下注射2ml；
用体重18～22g的小鼠20只，每批疫苗注射5只，疫苗每只皮下注射0.5ml；
用27日龄的健康易感仔猪20只，每批疫苗注射5只，每只皮下注射2ml。观察结果见表2。
表2疫苗对豚鼠、小鼠和仔猪的安全性试验结果
Figure G200910235802XD00081
从本试验结果可以看出，本发明的猪瘟合成肽疫苗免疫豚鼠、小鼠和仔猪后连续观察15日，均没有出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应。在整个试验过程中，豚鼠、小鼠和仔猪均没有出现死亡现象，说明本发明所提供的猪瘟合成肽疫苗对于豚鼠、小鼠和仔猪是安全的。
序列表
<110>中牧实业股份有限公司
<120>猪瘟合成肽疫苗及其制备方法
<130>DIC09110082
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>47
<212>PRT
<213>CFSV抗原
<400>1
Ala Gln Gly Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Asn Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr
            20                  25                  30
Trp Lys Glu Tyr Ser His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val
        35                  40                  45
<210>2
<211>47
<212>PRT
<213>CSFV抗原
<400>2
Lys Ala Ile Cys Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val
1               5                   10                  15
Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Gly Ala Leu Leu Thr
            20                  25                  30
Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr
        35                  40                  45
<210>3
<211>67
<212>PRT
<213>CSFV抗原
<400>3
Ala Gln Gly Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser
1                5                  10                  15
Ser Thr Asn Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr
            20                  25                  30
Trp Lys Glu Tyr Ser His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val Lys
        35                   40                 45
Ile Ser Ile Thr Glu Ile Gly Lys Val Ile Val Lys Thr Ile Glu Gly
    50                  55                  60
Ile Leu Phe
65
<210>4
<211>67
<212>PRT
<213>CSFV抗原
<400>4
Lys Ala Ile Cys Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val
1               5                   10                  15
Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Gly Ala Leu Leu Thr
        20                      25                  30
Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Lys
        35                  40                  45
Ile Ser Ile Thr Glu Ile Gly Lys Val Ile Val Lys Thr Ile Glu Gly
    50                  55                  60
Ile Leu Phe
65

Claims (8)

1.一种用于猪瘟合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
2.一种猪瘟合成肽疫苗，其中包括一种或多种权利要求1所述的多肽。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含佐剂。
4.一种权利要求1所述多肽的制备方法，其中包括以下步骤：
(1)去保护反应：在体积比为15％-30％的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，脱除树脂氨基上的9-芴甲氧羰基保护基团，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤；
(2)氨基酸的活化：将合成用的带有9-芴甲氧羰基保护基团的各个氨基酸与1-羟基苯丙三唑反应合成氨基酸-1-羟基苯丙三唑酯；
(3)缩合反应：使用多肽合成仪将上述各种氨基酸和树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂；
(4)乙酰化反应：使用重量体积比为1.5％-4％的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-28℃条件下反应20-40分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；
(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复步骤(1)～(4)，反应完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽树脂；
(6)多肽与树脂的分离：向干燥的多肽树脂中加入裂解试剂，匀速搅拌1-4小时后置于0℃下反应10分钟，恢复至室温，挥去三氟乙酸，将叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，搅拌洗涤，过滤得多肽溶液；
(7)超滤纯化多肽及无菌处理：使用膜包在20-28℃条件下超滤多肽，使用0.22微米在线滤器除菌保存。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述裂解试剂的组分体积比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶乙二硫醇∶苯酚∶水＝85∶8∶3∶3∶1。
6.一种权利要求2或3所述疫苗的制备方法，其中包括以下步骤：
(1)用注射用水将多肽稀释至200μg/ml制得抗原水相；
(2)在20-28℃条件下，按照抗原水相∶佐剂＝1∶1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，90-150转/分钟慢速搅拌1.5-3分钟；
(3)缓慢加入抗原水相，搅拌20-30分钟；
(4)高速搅拌15-30分钟后静置5分钟，分装后即得。
7.根据权利要求6所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述高速搅拌为8000-10000转/分钟。
8.根据权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述的疫苗在制备治疗和/或预防猪瘟的药物中的用途。
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