WO2007091627A1 - ペプチドのｃ末端のペプチド結合を切断する方法、及びペプチドのｃ末端アミノ酸配列の決定方法 - Google Patents

ペプチドのｃ末端のペプチド結合を切断する方法、及びペプチドのｃ末端アミノ酸配列の決定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2007091627A1
WO2007091627A1 PCT/JP2007/052204 JP2007052204W WO2007091627A1 WO 2007091627 A1 WO2007091627 A1 WO 2007091627A1 JP 2007052204 W JP2007052204 W JP 2007052204W WO 2007091627 A1 WO2007091627 A1 WO 2007091627A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
amino acid
terminal
acid sequence
molecular weight
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/052204
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kenji Miyazaki
Ken'ichi Kamijo
Akira Tusgita
Original Assignee
Nec Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nec Corporation filed Critical Nec Corporation
Priority to EP07708225A priority Critical patent/EP1983346A4/en
Priority to JP2007557882A priority patent/JP4771296B2/ja
Priority to US12/278,878 priority patent/US20100167326A1/en
Publication of WO2007091627A1 publication Critical patent/WO2007091627A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C07K1/128—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6818—Sequencing of polypeptides
    • G01N33/6821—Sequencing of polypeptides involving C-terminal degradation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a method for cleaving a peptide bond at the C-terminal of a peptide and a method for determining the C-terminal amino acid sequence of a peptide.
  • peptides Information on amino acid sequences of peptides and proteins collected from nature (hereinafter collectively referred to as peptides) is indispensable when studying their biological properties and functions.
  • peptides all amino acid sequences of peptides and proteins have corresponding gene information, i.e.
  • amino acid sequence of the protein itself is determined by various methods for directly analyzing the peptide sequence. In that case, knowledge of the partial amino acid sequence of the peptide is still necessary in order to identify the genomic gene encoding the peptide or cDNA prepared from mRNA.
  • the N-terminal amino acid sequence and the C-terminal amino acid sequence of peptides are particularly useful as knowledge of partial amino acid sequences of the peptides.
  • a nucleic acid probe can be prepared and the target cDNA can be selected using the obtained probe. It is also possible to selectively amplify the target cDNA by applying a PCR method using oligonucleotide primers prepared based on the amino acid sequences at both ends.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 As a technique for analyzing the N-terminal amino acid sequence of a peptide, a technique has been used in which an Edman degradation method is used to identify a generated amino acid derivative while sequentially decomposing the N-terminal amino acid. Yes.
  • the C-terminal amino acid sequence of a peptide As a means of analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide, the C-terminal amino acid is sequentially decomposed by a chemical method, and the shortened peptide molecular weight obtained as a reaction product and the original peptide From the difference from the molecular weight of the protein, a method for identifying the degraded C-terminal amino acid has been proposed (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • Non-Patent Document 1 discloses a method of sequentially decomposing a C-terminal amino acid by a chemical method. In this method, the dried peptide is heated to 90 ° C., and a highly concentrated aqueous solution of pentafluoropropanoic acid (C F CF COOH) or heptafluorobutanoic acid (CF CF CF COOH) is used.
  • C F CF COOH pentafluoropropanoic acid
  • CF CF CF COOH heptafluorobutanoic acid
  • This is a method that promotes the selective hydrolysis of the C-terminal amino acid of the peptide by the action of the generated steam.
  • Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3 describe a solution of an acetonitrile solution of pentafluoropropanoic anhydride ((CF CF CO) 2 O) in place of a highly concentrated aqueous solution of perfluoroalkanoic acid.
  • a method for selectively cleaving terminal amino acids is disclosed. At this time, for example, while cooling to 18 ° C., the vapor generated by the solution force is allowed to act on the dried peptide so that water molecules evaporating from the solution are not included in the system, thereby causing a side reaction. It is said that this can be avoided.
  • reaction formula (I) a dehydration reaction represented by the following reaction formula (I) and a reaction represented by the following reaction formula (II).
  • reaction formula (I) the C-terminal amino acid force is also used as a reaction intermediate to form an oxazolone ring structure.
  • perfluoroalkanoic acid acts on this oxazolone ring to achieve a selective decomposition reaction of the C-terminal amino acid.
  • Patent Document 1 discloses a method of sequentially decomposing peptides under mild conditions using alkanoic anhydride such as acetic anhydride and formamide. However, this reaction often suffers from a decrease in sensitivity.
  • Patent Document 1 International Publication No. 2005Z078447 Pamphlet
  • Non-Patent Document l Tsugita, A. et al., Eur. J. Biochem., 206 ⁇ , 691-696, 199 2 years
  • Non-Patent Document 2 Tsugita, A. et al., Chem. Lett., 235-238, 1992
  • Non-Patent Document 3 Takamoto, K. et al., Eur. J. Biochem., 228-362, 362-372 , 1
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and confirms that the decrease in sensitivity is due to a novel cleavage reaction in the determination of the C-terminal amino acid sequence by conventional sequential degradation of peptides. Based on these findings and characteristics, a method for cleaving the peptide bond at the C-terminal of a peptide with suppressed side reactions with little decrease in sensitivity and a method for determining the C-terminal amino acid sequence of a peptide are provided. Means for solving the problem
  • the method for cleaving the peptide bond at the C-terminal of the peptide according to the present invention is a method for cleaving the peptide bond at the C-terminal of the peptide, wherein the peptide has a glutamic acid residue esterified. And a solution of a perhalogenated carboxylic acid containing alcohol, and the peptide and an alkanoic acid anhydride so as to obtain a C-terminal-deficient peptide in which the C-terminal amino acid residues of the peptide are sequentially deleted. And a step of reacting.
  • the method for determining the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the present invention is a method for determining the C-terminal amino acid sequence of a peptide, comprising a peptide and an alcohol so as to esterify a glutamic acid residue of the peptide. Reacting with a perhalogenated carboxylic acid solution, and reacting the peptide with an alkanoic acid anhydride to obtain a C-terminal-deficient peptide in which the C-terminal amino acid residues of the peptide are sequentially deleted. Measuring the molecular weight of the C-terminal deletion peptide, And grasping the peptide.
  • the method for determining the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the present invention is a method for determining the C-terminal amino acid sequence of a peptide, wherein the peptide and alcohol are used so as to esterify the glutamic acid residue of the peptide. And reacting with a solution of a perhalogenated carboxylic acid having a C-terminal deletion peptide in which the C-terminal amino acid residues of the peptide are sequentially deleted, and the peptide and the alkanoic acid anhydride.
  • the method includes a step of measuring the molecular weight of the fragment, and a step of grasping the peptide based on the molecular weight.
  • the method for determining the C-terminal amino acid sequence of a peptide supported on a carrier is a method for determining the C-terminal amino acid sequence of a peptide supported on a carrier, wherein the glutamic acid residue of the peptide is esterified.
  • a step of reacting a peptide supported on a carrier with a solution of an alcohol-containing perhalogenated carboxylic acid and a c-terminal deletion peptide in which the C-terminal amino acid residue of the peptide is sequentially deleted are obtained.
  • the method includes a step of measuring the molecular weight of a peptide fragment derived from a c-terminal deletion peptide, and a step of grasping the peptide based on the molecular weight.
  • FIG. 1 is a diagram showing the amino acid sequence of soybean trypsin inhibitor and the sequence of a digested fragment predicted to be obtained by trypsin digestion.
  • FIG. 2 Mass spectrometry spectrum of the 48th to 63rd peptide fragments of trypsin inhibitor.
  • FIG. 3 is a mass spectrometric spectrum for the 112th to 119th peptide fragments of trypsin inhibitor.
  • FIG. 4 is a mass spectrometry spectrum of the 66th to 76th peptide fragments of trypsin inhibitor.
  • FIG. 5 is a mass spectrometric spectrum for the 31st to 38th peptide fragments of trypsin inhibitor.
  • FIG. 6 is a mass spectrometric spectrum showing the influence of the esterification reaction on the analytical method according to the present invention, in which (A) does not apply the esterification reaction, and (B) shows the esterification reaction. The chemical reaction is applied.
  • FIG. 7 is a mass spectrometric spectrum showing the effect of esterification reaction on the analytical method according to the present invention.
  • FIG. 8 Mass spectrometry spectrum of the 49th to 63rd peptide fragments of trypsin inhibitor It is.
  • the present inventors have performed sequential cleavage of a peptide under mild conditions using a conventional alkanoic acid anhydride such as acetic anhydride and formamide, and at the N-terminal side of a glutamic acid residue. It has been found that a specific and specific cleavage reaction has occurred. We have also found that this cutting mode is completely new.
  • Fig. 6 (a) shows a mixture of gel containing gel trypsin digested by trypsin digestion after soaking a gel containing soybean trypsin inhibitor after SDS-PAGE in a 30% acetic acid 'formamide solution at 60 ° C for 1 hour. Analyzed MALDI—TOF—MS spectrum. As shown in Fig. 6 (a), when trypsin is digested with trypsin inhibitor, the 48th to 63rd amino acids have 48th asparagine residues that are considered to be theoretically cleaved by trypsin digestion after sequential cleavage treatment. In addition to the peak (mass 1805.
  • a peptide fragment obtained by dehydration of a peptide fragment having a glutamic acid residue is also referred to as a dehydrated body. Notation is an array starting with.
  • the method for cleaving the C-terminal peptide bond of the peptide according to the present invention cleaves the peptide bond at the C-terminal end of the peptide.
  • a method of reacting a peptide with a solution of a perhalogenated carboxylic acid having an alcohol so that the glutamic acid residue of the peptide is esterified, and the C-terminal amino acid residue of the peptide is sequentially
  • a step of reacting the peptide with an alkanoic acid anhydride so as to obtain a C-terminal-deficient peptide deficient in.
  • they are referred to as an esterification step and a cutting step, respectively.
  • the esterification process may be performed in a solution or in a carrier.
  • the carrier is not particularly limited as long as it is a composition that can hold the peptide, for example, polyacrylamide gel.
  • the carrier may be a gel electrophoresis method that is used in the conventional SDS-PAGE method in which electrophoresis is performed in a one-dimensional direction, and may be one to which a two-dimensional electrophoresis method is applied.
  • the alcohol described above is not particularly limited as long as it is a compound having an alcoholic hydroxyl group that can undergo an esterification reaction with an amino acid residue.
  • an alcohol having 1 to 5 carbon atoms may be used. Examples of these are, for example, methanol, ethanol, propanol, Examples include lower alcohols such as butanol and pentanol. Of these, methanol power S is more preferable.
  • the atoms (groups) other than the hydroxyl group of the alcohol may have a certain mass as long as they do not inhibit the esterification reaction between the amino acid residue and the alcohol. .
  • the above-mentioned peptides are not particularly limited. Those peptides have intramolecular Z-intermolecular bonds such as S—S bonds, metals coordinated, etc., and the state of the side chain changes depending on the redox state. Those that undergo post-translational modifications such as phosphoric acid and sugar chains may also be used. In addition, when performed in a carrier, the peptide is not particularly limited as long as it can be retained in the carrier.
  • the perhalogenated carboxylic acid described above may have a lower carbon chain that is not particularly limited as long as it is a powerful rubonic acid having a halogen such as fluorine, chlorine or bromine.
  • a halogen such as fluorine, chlorine or bromine.
  • examples thereof include trichlorodiacetic acid, trifluoroacetic acid, pentafluoropropionic acid and heptafluorobutyric acid. Of these, trifluoroacetic acid is preferred from the viewpoint of permeability to the carrier.
  • the perhalogenated carboxylic acid solution containing alcohol is not particularly limited as long as it is a solvent capable of bringing alcohol and perhalogenated carboxylic acid into a solution state.
  • a solvent capable of bringing alcohol and perhalogenated carboxylic acid into a solution state As water and alcohol. That is, examples of the solution of the perhalogenated carboxylic acid having alcohol include an aqueous solution and an alcohol solution.
  • the temperature, time, concentration and pH may be adjusted as appropriate.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as the peptide does not elute from the carrier and the liquid phase can maintain a liquid state, but it is preferably 4 to 40 ° C, for example, 20 to 30 ° C is more preferable. A preferred room temperature to 25 ° C is particularly preferred. If the temperature is less than 0 ° C, the reaction rate of the ester ester decreases, and if it exceeds 40 ° C, side reactions such as peptide cleavage by perhalogenated carboxylic acid occur.
  • the reaction time may be changed depending on the reaction temperature and may be about 6 hours depending on the reaction temperature. If it is less than 120 minutes, the esterification reaction of the dartamic acid residue with perhalogenated carboxylic acid does not proceed sufficiently, and if it is longer than 2 days, the background increases due to oxidation and sample elution, resulting in a signal. The quality of will deteriorate.
  • the concentration of each component of the solution of the perhalogenated carboxylic acid having an alcohol used in the esterification step is not particularly limited, but the perhalogenated carboxylic acid preferably has an alcohol concentration of 5 to 30 vZv%. And 10 to 40 vZv% is preferable.
  • the alcohol supplied to glutamic acid is consumed in the reaction with the acid, resulting in a shortage of alcohol. If the alcohol concentration is greater than 60vZv%, the gel is dehydrated and contracted. The progress of the reaction is hindered. If the perhalogenated carboxylic acid concentration is less than 1 ⁇ %, the acid is consumed due to the esterification reaction with alcohol, resulting in a lack of catalyst. If it is higher than 60vZv%, unnecessary dehydration proceeds, which is good. Does not affect.
  • the perhalogenated carboxylic acid aqueous solution containing the alcohol has a water: methanol: trifluoroacetic acid ratio of 100 to 600. : 150 to 350: 300 to 700 Power S, preferably 100: 50: 100 to 500: 250: 500 Power S is preferable.
  • the carboxyl group of the glutamic acid residue of the peptide supported on the carrier by the esterification step is mainly an esterification corresponding to the alcohol used in the above reaction (for example, methyl carboxyl in the case of methanol). Group).
  • the peptide bond of the peptide is sequentially cleaved using alkanoic acid anhydride.
  • alkanoic acid anhydride By reacting the peptide to be cleaved with alkanoic anhydride, the peptide bond at the C-terminal of the peptide is sequentially cleaved, and the C-terminal force is also sequentially lost at the amino acid residue.
  • a c-terminal deletion peptide can be obtained.
  • alkanoic acid anhydride that can be used in the cleavage step include substituted or unsubstituted alkanoic acid anhydrides. Perfluoroalkane acids and anhydrides thereof are not included.
  • an alkanoic acid anhydride substituted with an atom other than halogen it is preferable to use an alkanoic acid anhydride substituted with an atom other than halogen.
  • a symmetric acid anhydride of an alkanoic acid having about 2 to 6 carbon atoms can be used. This ensures proper reactivity when the temperature is raised to the reaction temperature.
  • a symmetric acid anhydride of an alkanoic acid having about 2 to 4 carbon atoms can be used. By doing so, steric hindrance can be reduced.
  • a symmetric acid anhydride of a linear alkanoic acid having about 2 to 6 carbon atoms can be used.
  • a symmetric acid anhydride of a linear alkanoic acid having about 2 to 4 carbon atoms can be used. By doing this, it is possible to reduce the standing disorder. More specifically, a symmetric acid anhydride of a straight-chain alkanoic acid having 2 carbon atoms, that is, acetic anhydride can be used.
  • the alkanoic acid anhydride is preferably a compound that does not cause steric hindrance in the orientation in order to activate the C-terminal carboxyl group and adopt a configuration suitable for forming a 5-oxazolone ring.
  • acetic anhydride is preferably used.
  • the alkanoic anhydride is consumed according to the reaction, it is a large excess of the amount consumed for the reaction with the peptide in the dipolar aprotic solvent previously used for the swelling of the carrier. It is desirable to dissolve the solution to suppress the decrease in the concentration.
  • the concentration of the alkanoic anhydride in the reaction solution can be 1% by volume to 30% by volume, preferably 10% by volume to 20% by volume.
  • the reaction temperature can be, for example, 50 ° C or higher, preferably 60 ° C or higher. By doing so, sequential cutting can be performed efficiently.
  • the reaction temperature can be, for example, 100 ° C or lower, preferably 80 ° C or lower. In this way, sequential cutting can be performed stably.
  • the reaction may be performed for about 4 to 110 hours.
  • the reaction conditions may be, for example, 110 hours at 50 ° C., 50 to 60 hours at 60 ° C., 24 hours at 80 ° C., 4 hours at 100 ° C.
  • the alkanoic acid anhydride may be dissolved in a bipolar non-protonic solvent such as formamide in the cleavage step.
  • the dipolar aprotic solvent is a solvent that can infiltrate into the carrier at a temperature of about 50 to 90 ° C.
  • the dipolar aprotic solvent exhibits high dipolarity capable of maintaining the ratio of its enol form during the ketoenol-compatible isomeric process in the reaction shown in the above formula (I). Further, it may be an excellent solvent for the alkanoic acid anhydride of the solute molecule and the alkanoic acid which is a reaction byproduct. In addition, a bipolar aprotic solvent that does not volatilize or evaporate at the above reaction temperature is preferred.
  • the cutting step may be performed in a dry atmosphere from which oxygen is removed.
  • the reaction system is made airtight to prevent intrusion of moisture and oxygen from the outside of the system.
  • a method performed under an inert gas atmosphere such as argon.
  • oxidation may be avoided by using a compound containing a reducing sulfate group (SH) such as DTT having an antioxidant effect.
  • SH reducing sulfate group
  • a reaction accelerator may be used in the cutting step!
  • the reaction accelerator include basic nitrogen-containing aromatic ring compounds, and may be, for example, a pyridine base or a derivative thereof. Since the pyridine base functions as a proton acceptor, for example, the removal of the protons to be removed accompanying the acylation to an amino group can be performed more rapidly.
  • Specific examples of the pyridine base include pyridine, picoline (methylpyridine), lutidine (dimethylpyridine), collidine (trimethylpyridine), ethylmethylpyridine, and parvoline (tetramethylpyridine).
  • the basic nitrogen-containing aromatic ring compound include fused azalanes.
  • bicyclic basic nitrogen-containing aromatic ring compounds such as quinoline, isoquinoline and indole, or derivatives thereof may be used.
  • a tricyclic basic nitrogen-containing aromatic ring compound such as azaanthracene such as benzoquinoline, benzoisoquinoline, and atalidine, or phenanthridine, or a derivative thereof may be used.
  • pyridine When pyridine is used as a reaction accelerator, it is 1 ⁇ % or more and 40vZv% or less, preferably It is 10vZv% or more and 30vZv% or less. This reliably increases the rate of sequential cleavage of the C-terminus. Further, when the carrier is immersed in this solution, the operation of immersing the carrier at room temperature for 20 minutes may be repeated three times. Thereafter, excess catalyst and moisture are removed from the support using a polar aprotic solvent, and the subsequent sequential cleavage reaction with an acid anhydride may be achieved.
  • alkanoic acid anhydride which is a reaction reagent infiltrated in the carrier, is added with water, a bipolar aprotic solvent, It may be carried out by diluting and removing with a polar aprotic solvent or the like.
  • a polar aprotic solvent having an affinity for the alkanoic acid anhydride and the dipolar aprotic solvent without causing dissolution of the carrier material may be used.
  • examples of polar aprotic solvents include -tolyl having 4 or less carbon atoms such as acetonitrile and ketones having 4 or less carbon atoms such as acetone.
  • the 5-oxazolone ring formed by reacting the peptide with the alkanoic acid anhydride is hydrolyzed to form a carboxylic acid terminal.
  • the hydrolysis reaction is not particularly limited as long as it is a variety of known methods, but a basic nitrogen-containing aromatic ring compound or a tertiary amine may be used as a catalyst.
  • a basic nitrogen-containing aromatic ring compound or a tertiary amine may be used as a catalyst.
  • a basic nitrogen-containing aromatic ring compound a monocyclic nitrogen-containing aromatic ring compound showing high solubility in a polar non-hydrophilic solvent may be used.
  • pyridine or pyridine base is preferable.
  • a compound having a basicity comparable to the relatively weak basicity shown by the pyridine base is used as the tertiary amine compound.
  • DMAE dimethylamine ethanol: (CH 3) 2 N—CH 2 CH 2 OH
  • Pyridine as a basic nitrogen-containing aromatic ring compound
  • this hydrolysis reaction may be performed at 50 ° C or higher, and may be performed at 100 ° C or lower when the reaction is performed in a sealed reaction vessel.
  • the hydrolysis reaction may proceed simultaneously with the reaction of forming a 5-oxazolone ring with the alkanoic acid anhydride.
  • sequential cleavage reaction of C-terminal peptide bond The reaction temperature is lowered to stop the reaction, and the aqueous solution containing the organic base is removed. This causes inactivation of the alkanoic acid anhydride and its elution from the carrier. For this reason, the sequential cleavage reaction of the C-terminal peptide bond is stopped, and the reaction reagent is inactivated and removed. Subsequently, the reaction product is subjected to water treatment, and finally a re-dehydration treatment step using a polar non-protonic solvent is performed.
  • an esterification reaction specific to a glutamic acid residue proceeds in the esterification step, and an alcohol (for example, methanol) used in the esterification step. ) (E.g., methyl group) corresponding to).
  • an alcohol for example, methanol
  • the peptide bond at the C-terminal of the peptide is sequentially cleaved by the cleaving step. Since glutamic acid residues are esterified, the above-mentioned glutamic acid residues
  • Sequential cleavage reaction proceeds specifically at the C-terminus without cleaving the N-terminal bond. Therefore, the peptide, which is the target cleaved product, is not supported by the carrier force, and the cleavage reaction proceeds sequentially while being supported in the carrier, so that the quantitativeness of the reaction product can be maintained, leading to a decrease in sensitivity. It can be used for various applications such as mass spectrometry.
  • the method for determining the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the present invention is a method for determining the C-terminal amino acid sequence of a peptide, and is a perhalogenation having a peptide and an alcohol so as to esterify a glutamic acid residue of the peptide. Reacting with a carboxylic acid solution, reacting the peptide with an alkanoic acid anhydride to obtain a C-terminal-deficient peptide in which the C-terminal amino acid residues of the peptide are sequentially deleted, Measuring the molecular weight of the C-terminal deletion peptide; And grasping the peptide.
  • This embodiment includes the above-described esterification step and the cutting step, and further includes a step of measuring the molecular weight of the C-terminal-deficient peptide and a step of grasping the peptide based on this molecular weight.
  • a measurement process and a grasping process This is called a measurement process and a grasping process.
  • the esterification step and the cleavage step may be performed in the same manner as described above in addition to those described below.
  • This embodiment can be applied to any peptide having any molecular weight as long as it is supported by the carrier, but is suitably used when a peptide having a relatively small molecular weight is to be identified for the c-terminal amino acid sequence. Its molecular weight may be, for example, less than 5000.
  • the digestion step using the site-specific cleavage reagent described below may be performed after the cleavage step and before the measurement step.
  • the measurement step is a step of measuring the molecular weight of peptides such as C-terminal deletion peptides.
  • a mass spectrometer may be used for this step, as long as various molecular weight grasping means are used.
  • the mass spectrometer for example, an ion trap mass spectrometer, a quadrupole mass spectrometer, a magnetic field mass spectrometer, a time-of-flight (TOF) mass spectrometer, a Fourier transform mass spectrometer, or the like may be used. it can.
  • ionization methods include electrospray ionization (ESI), matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI), and fast atomic collision ionization (FAB).
  • MALDI-TOF-MS is preferably used.
  • MALDI-TOF-MS it is possible to suppress the loss of some atomic groups from the amino acid residue constituting the peptide fragment in the ionic process.
  • a relatively high molecular weight peptide fragment can be suitably measured.
  • both the corresponding anion and cation are removed. It can be measured. From these facts, the analysis with higher reproducibility can be performed by using MALDI-TOF-MS.
  • the length of the peptide fragment subjected to mass spectrometry in the measurement step may be 30 to 50 amino acid residues or 20 to 30 amino acid residues or less at maximum. This The peptide fragment can be reliably ionized and measured with high accuracy.
  • the molecular weight of the peptide may be in a range not exceeding 4000, preferably not exceeding 3000. In this way, when identifying the corresponding amino acid based on the difference in molecular weight, for example, asparagine residue (Asn) and aspartate residue (Asp), glutamine residue (G1 n) and glutamate residue ( As in (Glu), amino acid residues having a difference in formula weight of 1 can be distinguished with high accuracy.
  • the grasping step is a step of grasping the peptide based on the molecular weight of the C-terminal deletion peptide or the original peptide obtained in the above measurement step. This process compares the difference between the molecular weight of the C-terminal deletion peptide having various amino acid lengths obtained by sequential cleavage as described above and the molecular weight of the original peptide, and compares the difference between the molecular weight of the original peptide and the C-terminal amino acid of the original peptide. It may be done by grasping the sequence.
  • the cleavage reaction on the N-terminal side of a glutamic acid residue is suppressed, so that sequential cleavage proceeds specifically to the C-terminal amino acid sequence.
  • the resulting C-terminal deletion peptide is the one in which the C-terminal side amino acid residue is deleted step by step without being cleaved non-specifically at the amino acid residue constituting the peptide other than the C-terminal side. . Therefore, without considering other possibilities, the C-terminal amino acid sequence can be determined based on the difference between the molecular weight of the C-terminal deletion peptide obtained as described above and the molecular weight of the original peptide. .
  • Another embodiment of the method for determining the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the present invention is a method for determining the C-terminal amino acid sequence of a peptide supported on a carrier, wherein the dartamic acid residue of the peptide is esterified. And a step of reacting a peptide supported on a carrier with a solution of a perhalogenated carboxylic acid containing alcohol, and obtaining a C-terminal deletion peptide in which the C-terminal amino acid residue of the peptide is sequentially deleted.
  • the step of reacting the peptide with alkanoic anhydride and the carrier is immersed in a solution having a site-specific cleavage reagent to obtain a peptide derived from the C-terminal deletion peptide derived from the C-terminal deletion peptide.
  • This aspect is characterized by having the above-described esterification step, cutting step, measuring step, and grasping step, and further performing a digesting step between the cutting step and the measuring step.
  • This embodiment is suitably used when a peptide having a relatively large molecular weight is to be determined for the c-terminal amino acid sequence, and the molecular weight may be, for example, 5 kDa to 300 kDa.
  • the esterification process, cutting process, measurement process and grasping process in this embodiment may be performed as described above in addition to those described below.
  • the esterification step of a peptide supported on a carrier is a method of reacting with a solution of a perhalogenated carboxylic acid having an alcohol as described above.
  • a perhalogenated carboxylic acid alcohol solution is allowed to act on a carrier that has been dehydrated and contracted with alcohol, and water produced when the perhalogenated carboxylic acid reacts with the alcohol.
  • the digestion step is a step of immersing a carrier supporting a peptide in a solution having a site-specific cleavage reagent such as a protease, and various peptide fragments are obtained by this step.
  • a site-specific cleavage reagent such as a protease
  • various peptide fragments are obtained by this step.
  • a protease having a cleavage site specificity such as trypsin
  • the site-specific cleavage reagent that can be used in the digestion step may be trypsin or other proteases having specificity at the cleavage position, such as V8 protease that cleaves the C-terminal side of glutamic acid residues.
  • a chemical reagent such as CNBr that has specificity for cleavage of the methionine residue at the C-terminal amide bond may be used.
  • the digestion step is performed in a state where the peptide is supported in the carrier.
  • the liquid phase used in the digestion step is used. Is eluted.
  • the mixture of peptide fragments obtained by the digestion step contains a series of reactions in which the C-terminal side peptide fragment group derived from the original peptide and a predetermined number of amino acid residues are removed respectively. At least a group of C-terminal peptide fragments derived from the product is included.
  • Peptides obtained in this embodiment include the peptide derived from the original peptide, the peptide fragment derived from the C-terminal-deficient peptide, and the peptide fragment on the N-terminal side together with the original peptide and the C-terminal deleted peptide It is. Therefore, after identifying the peaks caused by the C-terminal peptide fragment group derived from the original peptide and a series of reaction products and the peaks caused by other peptide fragments on the N-terminal side with high accuracy, The versatility can be further improved by adopting a method that can accurately determine the molecular weight of each peak derived from the C-terminal peptide fragment group derived from the target peptide and a series of reaction products. It becomes.
  • the amino acid residue constituting the C-terminal peptide fragment does not contain an arginine residue.
  • other peptide fragments obtained in the digestion step contain arginine residues having a guazino group rich in proton acceptability. Therefore, it is possible to stabilize the cationic species derived from them.
  • various measurement conditions may be selected according to the characteristics of the peptide cleavage mode of the site-specific cleavage reagent used in the digestion process.
  • an arginine residue is located on the C-terminal side. You may distinguish the peak resulting from the peptide fragment which has in common.
  • the mass spectrometric spectrum of the anionic species it is possible to easily identify the peak due to the original peptide chain and a series of C-terminal peptide fragments generated by the sequential cleavage reaction of the C-terminal amino acid residue. Moyo.
  • the above-described method for cleaving the peptide bond at the C-terminal of the peptide according to the present invention and the method for determining the C-terminal amino acid sequence of the peptide further include various pretreatment and post-treatment steps in addition to the above steps. May be.
  • the carrier may be dehydrated using a polar aprotic solvent that does not cause dissolution of the components constituting the carrier such as a gel substance and has an affinity for water.
  • a polar aprotic solvent that does not cause dissolution of the components constituting the carrier such as a gel substance and has an affinity for water.
  • the peptide to be analyzed can be maintained in a state of being retained in the carrier as a separated spot or band even after the dehydration operation is completed.
  • polar aprotic solvents used for dehydration include, for example, acetonitrile (CHCN), which has a high affinity for water, and the like.
  • ketones can be used. Also, these polar aprotic solvents are easier to evaporate than water. When the polar aprotic solvent evaporates and the carrier dries, its bulk volume decreases and shrinks. The operation of immersing in acetonitrile is repeated several times. For example, do the operation of immersing the carrier piece for 20 minutes at room temperature three times.
  • the peptides supported in the carrier may be cross-linked.
  • the crosslinking agent is not particularly limited as long as it has a linking group at both ends of the compound.
  • it may have an aldehyde group such as formaldehyde and glutaraldehyde.
  • the peptides are cross-linked in the carrier supporting the peptides, A network structure is formed, and the carrier and protein are intertwined with each other, so that elution of protein can be suppressed.
  • the peptide is cross-linked by immersing the carrier in an aqueous solution of glutaraldehyde at a concentration of 1 picomole Z ⁇ L or more and 1000 nanomoles ⁇ ⁇ L or less for a period of 30 minutes to 2 hours. It may be done.
  • a molecular group related to intramolecular intermolecular bonding or post-translational modification of the peptide of interest may be subjected to treatment such as decomposition or cleavage using an appropriate treating agent.
  • treatment such as decomposition or cleavage using an appropriate treating agent.
  • the S—S bond may be eliminated by reducing with a reducing agent such as DTT.
  • the S group obtained by reducing the S—S bond may be further treated with an alkylating agent so as not to form the S—S bond again.
  • ⁇ monohydroxyl group such as serine residue or threonine residue
  • ⁇ -amino group ⁇ NH group
  • gin residues Dimethylated and acetylated forms of gin residues are not cleaved by trypsin, a type of protease used in the digestion process, so the sensitivity of lysine residues to trypsin is uniform throughout the peptide.
  • the ⁇ -NH group may be protected for the purpose of
  • the lysine residue becomes a substituent in which the ⁇ ⁇ group is protected together with the naturally occurring dimethyl and acetylene isomers, so that trypsin can cleave the lysine residue at the ⁇ terminal side.
  • Such protection is not particularly limited as long as it is a known protecting group for a hydroxyl group and an amino group, but may be carried out using, for example, an acylation reaction or an acylation reaction.
  • the above-described acylation reaction may be performed by stirring the carrier piece in a mixture obtained by adding a small amount of alkanoic acid to an alkanoic anhydride. At this time, the alkanoic acid anhydride becomes an electrophilic acylating agent.
  • alkanoic acid promotes the reaction of an alkanoic anhydride with an amino group and a hydroxy group due to its proton donating ability, thereby causing acylation and acylation.
  • the stop of this reaction is the reaction that occurs in the cutting process. It may be performed according to the stop.
  • a solvent removal treatment may be performed after the cutting step.
  • the solvent removal treatment is not particularly limited! /, But may be performed according to the dehydration of the carrier!
  • the mixture containing the peptide group and Z or peptide fragment group to be measured may be desalted prior to performing the measurement step.
  • the recovered and dried peptide fragments do not form various salts but become the original peptide alone.
  • a freeze-dried soybean trypsin inhibitor (SEQ ID NO: 1) having the amino acid sequence shown in the upper part of FIG. 1 and methanol were mixed at a ratio of 10 mg: lmL, and cooled to 5 ° C.
  • 6N hydrochloric acid was added dropwise with stirring at 5 ° C. so as to be 0.01N.
  • 6N hydrochloric acid was further added dropwise to reach 0.02N, and further 24 hours later, 6N hydrochloric acid was further added dropwise to reach 0.03N, followed by further stirring for 3 days. This was collected with an appropriate amount of pipettor, vacuum-dried, and the solvent was distilled off to obtain dried product 1.
  • the lower part of FIG. 1 shows the number of residues from the N-terminus of the peptide fragment estimated from digestion of trypsin inhibitor with trypsin and its theoretical molecular weight.
  • Dry material 1 prepared in Treatment Example 1 was used as a buffer for SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS—PAGE) (final concentration 50 mM Tris—HCl (pH 6.8), 1% 2-mercaptoethanol and 1% SDS). SDS-PAGE was performed. The obtained band was cut out with lmm ⁇ 1 mm, and this was immersed in a 1.25 ngZ L trypsin solution at 37 ° C. for 16 hours for trypsin in-gel digestion. Thereafter, each peptide fragment eluted from the gel into the liquid phase was analyzed by MALDI-TOF-MS. The measurement was performed in positive ion mode and reflector mode. The obtained results are shown in FIGS.
  • SDS—PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresis
  • Figures 2 to 5 are mass spectrometry spectra of peptide fragments obtained by trypsin digestion of trypsin inhibitor.
  • Figure 2 shows the 48th to 63rd positions (SEQ ID NO: 21)
  • Figure 3 shows the 112th to 119th positions ( SEQ ID NO: 22)
  • FIG. 4 corresponds to the 66th to 76th positions (SEQ ID NO: 24) and 166th to 175th positions (SEQ ID NO: 23)
  • FIG. 5 corresponds to the 31st to 38th peptide fragments (SEQ ID NO: 25), respectively.
  • the horizontal axis indicates the mass number
  • the vertical axis indicates the relative intensity (the same applies to FIG. 7 below).
  • the peptide fragment corresponding to SEQ ID NO: 26 obtained with the peptide fragment of the group having been subjected to the treatment described in Example 1 of Example 1 was separated on a reverse phase column by nano LC, and then the obtained composition Were analyzed by MSZMS. The results are shown in Fig. 8. From the theoretical molecular weight of the peptide fragment shown in SEQ ID NO: 26, each peptide fragment containing the N-terminal glutamic acid residue obtained in this analysis (corresponding to b3 to bl4 in FIG. 8 and corresponding to SEQ ID NOs: 37 to 47, respectively). The difference between the corresponding molecular weights was 18. As for the overall molecular weight, a peak was observed at a mass smaller by 18 than the theoretical value. Considering the results obtained in Example 1 below, the glutamic acid residue at the N-terminus is dehydrated to become a pyroglutamic acid residue. I understand.
  • Dry material 1 prepared in Treatment Example 1 was used as a buffer for SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS—PAGE) (final concentration 50 mM Tris—HCl (pH 6.8), 1% 2-mercaptoethanol and 1% SDS). SDS-PAGE was performed. Thereafter, the gel piece containing the trypsin inhibitor was shredded into lmm cubes and subjected to the cutting process described below. The results are shown in Fig. 6.
  • Fig. 6 (a) is a mass spectrometry spectrum related to a group of peptide fragments that were not treated in Example 1
  • Fig. 6 (b) was a mass spectrometry spectrum related to a peptide fragment in the group that was treated in Example 1. Is a vector.
  • peaks are observed at mass numbers 1673.69 and 1805.79, which correspond to the dehydrated product having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27, respectively.
  • peaks are observed at mass numbers 1673.97 and 1806.11. Each of these corresponds to the amino acid sequence of FIG. 6 (a).
  • the peak intensity associated with the dehydrated form of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 is significantly reduced in the group treated according to Treatment Example 1, and conversely, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27
  • the peak intensity related to was significantly increased in the group treated according to Treatment Example 1.
  • Considering the results shown in Fig. 2 it was found that methylation of the dartamic acid residue specifically suppressed the N-terminal cleavage of the glutamic acid residue that occurred during the cleavage step treatment.
  • the glutamic acid residue generated during the cleavage step can also be obtained by methylating the glutamic acid residue obtained in the esterification step described above.
  • the cleavage reaction at the N-terminus of the group was significantly suppressed.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of soybean trypsin inhibitor (Genbank No. 1AVU, the same applies hereinafter)
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence from 1 to 30 of soybean trypsin inhibitor
  • SEQ ID NO: 3 31-38th amino acid sequence of soybean trypsin inhibitor
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence from positions 39 to 47 of soybean trypsin inhibitor
  • Sequence number 5 The 48th-52nd amino acid sequence of soybean trypsin inhibitor
  • SEQ ID NO: 6 Amino acid sequence from positions 53 to 63 of soybean trypsin inhibitor
  • SEQ ID NO: 7 Amino acid sequence of amino acids 64 to 65 of soybean trypsin inhibitor
  • SEQ ID NO: 8 amino acid sequence at positions 66 to 76 of soybean trypsin inhibitor
  • SEQ ID NO: 9 77-106 amino acid sequence of soybean trypsin inhibitor
  • SEQ ID NO: 10 107-111 amino acid sequence of soybean trypsin inhibitor
  • SEQ ID NO: 11 112-119 amino acid sequence of soybean trypsin inhibitor
  • SEQ ID NO: 12 120-122 amino acid sequence of soybean trypsin inhibitor
  • SEQ ID NO: 13 soybean
  • SEQ ID NO: 14 Amino acid sequence from position 133 to 144 of soybean trypsin inhibitor
  • SEQ ID NO: 15 Amino acid sequence from position 145 to 159 of soybean trypsin inhibitor
  • SEQ ID NO: 16 Position 160 of soybean trypsin inhibitor Amino acid sequence

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

　本発明は、感度の低下が少なく、副反応を抑制したペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法及びペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法を提供する。本発明によるペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法は、ペプチドのＣ末端のペプチド結合を切断する方法であって、前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基が逐次的に欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、を有することを特徴とする。本発明によるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法は、ペプチドのＣ末端アミノ酸配列の決定方法であって、前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸残基が逐次的に欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、前記Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する工程と、前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、を有することを特徴とする。 　 　

Description

明 細 書
ペプチドの C末端のペプチド結合を切断する方法、及びペプチドの C末 端アミノ酸配列の決定方法
技術分野
[0001] 本発明は、ペプチドの C末端のペプチド結合を切断する方法及びペプチドの C末 端アミノ酸配列の決定方法に関する。
背景技術
[0002] 天然より採取されるペプチドやタンパク質 (以下、総称して、ペプチドとも言う。 )のァ ミノ酸配列に関する情報は、その生物学的性質や機能を研究する際、不可欠である 。現在、ペプチドやタンパク質の全アミノ酸配列は、対応する遺伝子情報、すなわち
、これらのペプチドをコードして!/、るゲノム遺伝子や mRNAより調製された cDNAの 塩基配列に基づいて、推定されるアミノ酸配列として決定されている。或いは、これら のアミノ酸配列は、ペプチドの配列を直接分析する種々の方法により、タンパク質自 体のアミノ酸配列が決定されている。その際、当該ペプチドをコードしているゲノム遺 伝子や mRNAより調製された cDNAを特定する上で、ペプチドの部分的なアミノ酸 配列の知見は、依然として必要である。
[0003] このペプチドの部分的なアミノ酸配列の知見として、一般に、ペプチドの N末端アミ ノ酸配列と C末端アミノ酸配列とが、特に有用とされている。例えば、多数の mRNAよ り調製された cDNAライブラリーから目的とするペプチドをコードしている cDNAを選 別する際、仮に、 N末端アミノ酸配列と C末端アミノ酸配列とが判明していると、両末 端のアミノ酸配列に基づ 、て核酸プローブを作製し、得られたプローブを利用して、 目標とする cDNAを選別することが可能となる。また、両末端のアミノ酸配列に基づき 作製されたオリゴヌクレオチドプライマーを利用して、 PCR法を適用し、 目標とする c DNAを選択的に増幅することも可能となる。
[0004] ペプチドの N末端アミノ酸配列を解析する手法として、従来から、エドマン分解法を 利用して、 N末端アミノ酸を逐次的に分解しつつ、生成するアミノ酸誘導体を同定す る手法が利用されている。 [0005] 一方、ペプチドの C末端アミノ酸配列を解析する手段として、化学的手法により C末 端アミノ酸を逐次的に分解し、その反応産物として得られる短縮されたペプチドの分 子量と元のペプチドの分子量との差から、分解された C末端アミノ酸を特定する方法 が提案されて ヽる (非特許文献 1乃至 3)。
[0006] 非特許文献 1は、化学的手法により C末端アミノ酸を逐次的に分解する方法を開示 する。この方法は、乾燥したペプチドを 90°Cに加熱し、ペンタフルォロプロパン酸（C F CF COOH)の高濃度水溶液又はヘプタフルォロブタン酸（CF CF CF COOH
3 2 3 2 2
)の高濃度水溶液力 発生した蒸気を作用させて、ペプチドの C末端アミノ酸の選択 的な加水分解を促進させる方法である。
[0007] 非特許文献 2及び非特許文献 3は、パーフルォロアルカン酸高濃度水溶液に代え て、無水ペンタフルォロプロパン酸（（CF CF CO) O)のァセトニトリル溶液又は無
3 2 2
水ヘプタフルォロブタン酸（（CF CF CF CO) O)のァセトニトリル溶液を用いて、 C
3 2 2 2
末端アミノ酸を選択的に分解する方法を開示する。このとき、例えば、 18°Cに冷却 しつつ、この溶液力 発生した蒸気を、乾燥したペプチドに作用させ、溶液から蒸発 する水分子を系内に含まないようにすることにより、副次的反応の発生を回避するこ とができるとされている。
[0008] これらの従来の C末端アミノ酸を分解する方法は、下記反応式 (I)で示される脱水 反応と下記反応式 (II)で示される反応とにより進行すると報告されている。つまり、反 応式 (I)によると、 C末端アミノ酸力も反応中間体として、ォキサゾロン環構造がいった ん形成される。次いで、パーフルォロアルカン酸がこのォキサゾロン環に作用し、 C末 端アミノ酸の選択的な分解反応が達成されると考えられる。
[0009] [化 1]
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000004_0002
[0010] [化 2]
Figure imgf000005_0001
[0011] これらの非特許文献に開示の方法によると、 目的とする C末端アミノ酸配列の選択 的な分解以外にも、ペプチドのセリン残基（― NH— CH (CH OH)— CO— )の N末
2
端側の切断、トレオニン残基の N末端側の切断、ァスパラギン酸残基の C末端側の ペプチドの切断等が起き、 C末端アミノ酸配列のみを選択的に分解するには問題が あった。また、これら目的としない切断の要因であるセリン残基の α位のアミノ酸と j8 位のヒドロキシ基との間、及びトレォニン残基の α位のアミノ酸と j8—ヒドロキシ基（ j8 — OH基）との間の N, O—ァシル転位反応に起因して、 C末端アミノ酸配列の逐次 的な分解反応がこの転移部位で阻害される可能性もあった。
[0012] これらの実状に鑑み、特許文献 1は、無水酢酸などのアルカン酸無水物とホルムァ ミドとを用い、緩和な条件でペプチドの逐次分解を行う方法を開示する。しかしながら 、この反応では、しばしば感度の低下が問題となっていた。
特許文献 1：国際公開第 2005Z078447号パンフレット
非特許文献 l :Tsugita, A.ら著、 Eur. J. Biochem.、 206卷、 691〜696頁、 199 2年
非特許文献 2 :Tsugita, A.ら著、 Chem. Lett.、 235— 238頁、 1992年 非特許文献 3 :Takamoto, K.ら著、 Eur. J. Biochem.、 228卷、 362— 372頁、 1
995年
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] 本発明は、上述の問題に鑑みてなされたものであり、従来のペプチドの逐次分解に よる C末端アミノ酸配列の決定において感度の低下が新規の切断反応によるもので あることを確認し、この知見及び特性を踏まえて、感度の低下が少なぐ副反応を抑 制したペプチドの C末端のペプチド結合を切断する方法及びペプチドの C末端アミノ 酸配列の決定方法を提供する。 課題を解決するための手段
[0014] 本発明によるペプチドの C末端のペプチド結合を切断する方法は、ペプチドの C末 端のペプチド結合を切断する方法であって、前記ペプチドのグルタミン酸残基をエス テル化するように、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液と を反応させる工程と、前記ペプチドの C末端アミノ酸残基が逐次的に欠損した C末端 欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と 、を有することを特徴とする。
[0015] 本発明によるペプチドの C末端アミノ酸配列の決定方法は、ペプチドの C末端アミノ 酸配列の決定方法であって、前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステルイ匕するよう に、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる 工程と、前記ペプチドの C末端アミノ酸残基が逐次的に欠損した C末端欠損ペプチド を得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、前記 C末端 欠損ペプチドの分子量を測定する工程と、
Figure imgf000006_0001
、て前記ペプチドを把 握する工程と、を有することを特徴とする。
[0016] また、本発明によるペプチドの C末端アミノ酸配列の決定方法は、ペプチドの C末 端アミノ酸配列の決定方法であって、前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステルイ匕 するように、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応 させる工程と、前記ペプチドの C末端アミノ酸残基が逐次的に欠損した C末端欠損べ プチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、前記 ペプチドを部位特異的切断試薬を有する溶液と反応させて、前記 C末端欠損べプチ ドに由来する C末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る工程と、前記 C末端欠損 ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する工程と、前記分子量に基づいて前 記ペプチドを把握する工程と、を有することを特徴とする。
[0017] 本発明による担体に支持されたペプチドの C末端アミノ酸配列の決定方法は、担体 に支持されたペプチドの C末端アミノ酸配列の決定方法であって、前記ペプチドのグ ルタミン酸残基をエステルイ匕するように、担体に支持されたペプチドと、アルコールを 有する過ハロゲンィ匕カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、前記ペプチドの C末端 アミノ酸残基が逐次的に欠損した c末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、 アルカン酸無水物とを反応させる工程と、前記担体を部位特異的切断試薬を有する 溶液に浸漬して、前記 C末端欠損ペプチドに由来する C末端欠損ペプチド由来ぺプ チド断片を得る工程と、前記 c末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定 する工程と、前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、を有することを 特徴とする。
発明の効果
[0018] 本発明によれば、グルタミン酸残基を特異的にエステル化することにより、 C末端の ペプチド結合の逐次切断によるグルタミン酸残基の N末端側でのペプチドの切断を 抑制し、 C末端アミノ酸残基のみを特異的且つ効率的に切断し得るようになる。また、 逐次切断で得た C末端欠損ペプチド及びこの C末端欠損ペプチドに由来するぺプチ ドの帰属が容易となる。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1]大豆トリプシンインヒビターのアミノ酸配列及びこれをトリプシン消化して得られる と予測される消化断片の配列を示す図である。
[図 2]トリプシンインヒビターの 48〜63番目のペプチド断片に係る質量分析スペクトル である。
[図 3]トリプシンインヒビターの 112〜119番目のペプチド断片に係る質量分析スぺク トルである。
[図 4]トリプシンインヒビターの 66〜76番目のペプチド断片に係る質量分析スペクトル である。
[図 5]トリプシンインヒビターの 31〜38番目のペプチド断片に係る質量分析スペクトル である。
[図 6]本発明による分析方法に対するエステル化反応の影響を示す質量分析スぺク トルであって、（A)は、エステル化反応を適用しなかったものであり、（B)は、エステル 化反応を適用したものである。
[図 7]本発明による分析方法に対するエステル化反応の影響を示す質量分析スぺク トルである。
[図 8]トリプシンインヒビターの 49〜63番目のペプチド断片に係る質量分析スペクトル である。
発明を実施するための最良の形態
[0020] <導入〜逐次切断による新規な切断反応及び切断様式〜 >
本発明に係り、本発明者らは、従来の無水酢酸などのアルカン酸無水物とホルムァ ミドとを用いた緩和な条件で行うペプチドの逐次切断にぉ 、て、グルタミン酸残基の N末端側で、これまで知られて 、な力つた特異的な切断反応が生じて 、ることを見出 した。また、この切断様式は、全く新しいものであることも見出した。これらの知見を以 下に示す。
[0021] 図 6 (a)は、 SDS— PAGE後の大豆トリプシンインヒビターを含むゲルを 30%無水 酢酸'ホルムアミド溶液に 60°Cで 1時間浸漬した後、トリプシン消化してゲル力も溶出 した混合物を分析した MALDI— TOF— MSスペクトルである。図 6 (a)に示すように 、トリプシンインヒビターをトリプシン消化した際、逐次切断処理後のトリプシン消化に より理論的に切断されると考えられる 48番目のァスパラギン残基を有する 48〜63番 目の配列（配列番号 27)のピーク（質量 1805. 79)の他に、 1673. 69近傍に他のピ ークが認められた。このピークは、その質量力も判断して、トリプシンインヒビターの 49 番目のグルタミン酸残基を含むペプチド断片、つまり、 49〜63番目のペプチド断片 ( 配列番号 26)であると想定された。し力しながら、 48〜63番目のペプチド断片に対 応するピークと比較しても、 1673. 69近傍のピークにグルタミン酸残基が含まれると 仮定するには、約 18だけ分子量が少ないことが分力つた。そこで、このピークの由来 を同定するため、この断片を MSZMS分析した結果が図 8である。図 8から明らかな ように、 C末端のアルギニン (一文字記号 R)を含む断片群 (y3乃至 y 11)では、理論 値通りの質量にピークが見出されたところ、 N末端のアミノ酸残基を含む断片では、 いずれも理論値力も 18だけ差分した質量位置にピークが見出された。
[0022] これらの結果をまとめると、
(1)従来のアルカン酸無水物とホルムアミドとを用いたペプチドの逐次切断におい て、グルタミン酸残基の N末端で特異的な切断反応が起こって 、ること、
(2)この切断反応で得た末端は、予測されるアミノ酸残基の分子量力も 18だけ少な い末端となっていること、 が分かった。
[0023] これらの結果は、上述の逐次切断で生じたペプチド断片のうち、 N末端側にグルタ ミン酸残基を有するペプチド断片が脱水されていることを強く示すものと考えられる。 また、グルタミン酸残基が脱水することにより生じる分子団として、その構造から、ピロ グルタミン酸残基となって ヽることが強く示唆された。この切断反応及び切断様式は、 上述の従来の逐次切断反応において見出されていな力つた、全く新規のものであつ て、本発明は、この知見に基づいて、感度の低下が少なぐ副反応を効果的に抑制 したペプチドの C末端のペプチド結合を切断する方法、及びペプチドの C末端アミノ 酸配列の決定方法を提供する。
[0024] なお、以下、逐次切断反応によって生じたペプチド断片のうち、グルタミン酸残基を 有するペプチド断片が脱水したペプチド断片を脱水体とも称し、各図では、このぺプ チド断片の脱水体を pyrで始まる配列で表記する。
[0025] <本発明によるペプチドの C末端のペプチド結合を切断する方法に係る一態様 > 本発明によるペプチドの C末端のペプチド結合を切断する方法は、ペプチドの C末 端のペプチド結合を切断する方法であって、前記ペプチドのグルタミン酸残基をエス テル化するように、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液と を反応させる工程と、前記ペプチドの C末端アミノ酸残基が逐次的に欠損した C末端 欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と 、を有することを特徴とする。以下、それぞれ、エステル化工程、切断工程と称する。
[0026] (エステル化工程）
エステルイ匕工程は、溶液中で行っても、担体中で行ってもよい。ペプチドを担体中 に支持してエステル化工程を行う場合、担体は、ペプチドを保持し得る組成物であれ ば特に制約はなぐ例えば、ポリアクリルアミドゲルが挙げられる。担体は、ゲル電気 泳動法として、一次元方向に電気泳動を行う従来の SDS— PAGE法で用いられるも のはもちろんのこと、二次元泳動法を適用されたものでもよい。
[0027] 上述のアルコールは、アミノ酸残基とエステル化反応し得るアルコール性水酸基を 有する化合物であれば特に制約はなぐ例えば、炭素数が 1以上 5以下のアルコー ルであってもよい。これらの例として、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、 ブタノール、ペンタノールなどの低級アルコールが挙げられる。なかでも、メタノール 力 Sさらに好ましい。また、このアルコールの水酸基以外を構成する原子（団）は、ァミノ 酸残基とアルコールとのエステル化反応を阻害しな 、ものであれば、 、かなる質量を 有するものであってもよ 、。
[0028] 上述のペプチドは、特に制約はなぐ S— S結合などの分子内 Z分子間結合を有す るものや、金属などが配位したものや、酸化還元状態によって側鎖の状態が変化す るものや、リン酸や糖鎖など翻訳後修飾を受けるものであってもよい。また、担体中で 行う場合には、ペプチドは、担体中に保持され得るものであれば特に制約はない。
[0029] 上述の過ハロゲン化カルボン酸は、フッ素、塩素、臭素などのハロゲンを有する力 ルボン酸であれば、特に制約はなぐ低級の炭素鎖を有するものであってもよい。例 えば、トリクロ口酢酸、トリフルォロ酢酸、ペンタフルォロプロピオン酸及びへプタフル ォロブチル酸が挙げられる。なかでも、担体への浸透性の点で、トリフルォロ酢酸が 好ましい。
[0030] 本発明にお 、て、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液としては、ァ ルコールと過ハロゲンィ匕カルボン酸とを溶液の状態とし得る溶媒であれば、特に制約 はなぐ例えば、溶媒として、水及びアルコールが挙げられる。即ち、アルコールを有 する過ハロゲンィ匕カルボン酸の溶液としては、水溶液及びアルコール溶液が挙げら れる。
[0031] エステル化工程を行う際、温度、時間、濃度及び pHは、適宜調節すればよ!ヽ。
[0032] 反応温度は、担体からペプチドが溶出せず液相が液体状態を保持し得る限り特に 制約はないが、例えば 4〜40°Cであることが好ましぐ 20〜30°Cがさらに好ましぐ室 温〜 25°Cが特に好ましい。 0°C未満であると、エステルイ匕の反応速度が低下してしま い、 40°Cを越えると、過ハロゲンィ匕カルボン酸によるペプチドの切断反応などの副反 応が起きてしまう。
[0033] 反応時間は、反応温度に依存して種々変更すればよぐ反応温度によっては、 6時 間程度であってもよい。 120分未満であると、過ハロゲンィ匕カルボン酸によるダルタミ ン酸残基のエステル化反応が十分に進行せず、 2日よりも長い場合、酸化やサンプ ル溶出のため、バックグラウンドが高くなりシグナルの質が低下してしまう。 [0034] エステル化工程に用いるアルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液の各 成分の濃度は、特に限定されないが、アルコール濃度で、 5〜30vZv%であることが 好ましぐ過ハロゲン化カルボン酸で、 10〜40vZv%であることが好ましい。アルコ ールの濃度が 1νΖν%未満であると、グルタミン酸へ供給されるアルコールが酸との 反応に消費されてアルコールが不足してしまい、 60vZv%よりも大きい場合には、ゲ ルが脱水収縮し反応の進行が妨げられる。過ハロゲン化カルボン酸濃度が 1νΖν% 未満であると、酸がアルコールとのエステルイ匕反応により消費されて触媒不足となり、 60vZv%よりも大きい場合には、不必要な脱水が進むなど、結果に良い影響を与え ない。これらの濃度のうち、アルコールとしてメタノールを、過ハロゲン化カルボン酸と してトリフルォロ酢酸を用いる場合、アルコールを有する過ハロゲンィ匕カルボン酸水 溶液は、水：メタノール：トリフルォロ酢酸の割合では、 100〜600 : 150〜350 : 300 〜700であること力 S好ましく、 100： 50： 100〜500： 250： 500であること力 Sより好まし い。
[0035] 担体に保持されたペプチドをエステルイ匕する際は、その反応収率を高めるために アルコールで脱水収縮をあえて生じせしめた後、過ハロゲン化カルボン酸アルコー ル溶液に浸漬させて、過ハロゲンィ匕カルボン酸とアルコールとが反応する際に生成 する水分を利用して担体の膨潤を達成して試薬のペプチドへの到達を促すことがで きる。たとえばアルコールとしてメタノール、過ハロゲン化カルボン酸として TF Aを使 用する場合、メタノールで脱水収縮した担体にメタノール: TFA= 250 : 500の割合 の溶液を作用させることで、室温数時間の内にゲルの穏やかな膨潤が達成され、グ ルタミン酸に特異的なエステルイ匕反応が進行する。
[0036] エステルイ匕工程により、担体に支持されたペプチドのグルタミン酸残基のカルボキ シル基は、主に、上述の反応に用いるアルコールに対応したエステルイ匕体 (例えば、 メタノールである場合は、メチルカルボキシル基）となる。
[0037] (切断工程）
切断工程では、アルカン酸無水物を用いてペプチドのペプチド結合を逐次的に切 断する。切断の対象となるペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させて、ペプチドの C末端のペプチド結合を逐次的に切断し、 C末端力も逐次的にアミノ酸残基が欠損し た c末端欠損ペプチドを得ることができる。切断工程に用い得るアルカン酸無水物と して、置換又は無置換のアルカン酸無水物が挙げられる力 パーフルォロアルカン 酸及びその無水物は含まない。なお、アルカン酸無水物の置換体を用いる場合は、 ハロゲン以外の原子で置換されたアルカン酸無水物を用いることが好まし 、。ぺプチ ドの C末端カルボキシル基の活性ィ匕に利用されるアルカン酸無水物として、炭素数 2 〜6程度のアルカン酸の対称型酸無水物を用いることができる。こうすることにより、 反応温度まで昇温した際に、適正な反応性が確保される。また、好ましくは、炭素数 2〜4程度のアルカン酸の対称型酸無水物を用いることができる。こうすることにより、 立体障害を低減することができる。また、酸無水物として、炭素数 2〜6程度の直鎖ァ ルカン酸の対称型酸無水物を用いることができる。また、好ましくは、炭素数 2〜4程 度の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることができる。こうすることにより、立 体障害を低減することができる。さらに具体的には、炭素数 2の直鎖アルカン酸の対 称型酸無水物、すなわち無水酢酸を用いることができる。
[0038] また、アルカン酸無水物は、 C末端カルボキシル基の活性化を図り、 5—ォキサゾロ ン環形成に適する配置をとる上で、その配向における立体障害を生じることの少ない 化合物とするとよい。その点でも、無水酢酸は好ましく用いられる。
[0039] なお、アルカン酸無水物は、反応に従って消費されるため、予め担体の膨潤に利 用する双極性非プロトン性溶媒中に、ペプチドとの反応に消費される量に対して大 過剰量を溶解しておき、その濃度低下を抑制することが望ましい。反応溶液中のアル カン酸無水物の含有濃度を 1体積％以上 30体積％以下、好ましくは 10体積％以上 20体積％以下とすることができる。また、反応温度は、例えば 50°C以上、好ましくは 60°C以上とすることができる。こうすることにより、逐次切断を効率よく行うことができる 。また、反応温度を例えば 100°C以下、好ましくは 80°C以下とすることができる。こう することにより、逐次切断を安定的に行うことができる。また、無水酢酸を用いる場合、 4〜110時間程度の反応させてもよい。このとき、反応条件としては、例えば、 50°Cに て 110時間、 60°Cにて 50〜60時間、 80°Cにて 24時間、 100°Cにて 4時間等とする ことができる。反応温度が低いほど、緩和な条件とすることができ、副反応をより一層 抑帘 Uすることができる。 [0040] 一方、切断工程にお!、て、アルカン酸無水物は、ホルムアミドなどの双極性非プロ トン性溶媒に溶解されてもよい。双極性非プロトン性溶媒は、担体の脱水後、 50〜9 0°C程度の温度において担体内に浸潤でき、膨潤状態に維持可能である溶媒とする 。また、比較的分子サイズが小さぐ担体片の材料に対する親和性に優れた有機溶 媒が用いられる。また、双極性非プロトン性溶媒は、上記式 (I)に示した反応中のケト ーェノール互換異性ィ匕の過程にぉ 、て、そのエノール体の比率を維持可能な高 ヽ 双極性を示すとともに、溶質分子のアルカン酸無水物及び反応副生成物であるアル カン酸に対して、優れた溶媒であってもよい。また、上述の反応温度において、揮発 、蒸散することの少な!ヽ双極性非プロトン性溶媒が好ま ヽ。
[0041] 切断工程は、酸素が除去された乾燥雰囲気下で行われてもよい。この雰囲気とす る方法として、例えば、反応を行う系を気密状態とし、系外からの水分及び酸素の侵 入を防止するとともに、反応に用いる液体の注入及び排出操作も、乾燥処理した窒 素、アルゴン等の不活性気体雰囲気下で行う方法が挙げられる。また、酸化防止効 果を有する DTTなどの還元性のスルファ-ル基（ SH)を含む化合物を利用して、 酸ィ匕を回避してもよい。酸素を除去することにより、メチォニン残基のィォゥの酸ィ匕が 防止され、測定工程における分子量の確度が向上される。
[0042] 切断工程にぉ ヽて、反応促進剤を用いてもよ!ヽ。反応促進剤としては、塩基性含 窒素芳香環化合物が挙げられ、例えばピリジン塩基又はその誘導体等であってもよ い。ピリジン塩基は、プロトン受容体として機能するため、例えば、ァミノ基へのァシル 化に伴う離脱すべきプロトンの除去がより速やかになされる。ピリジン塩基として、具 体的には、例えば、ピリジン、ピコリン (メチルピリジン）、ルチジン (ジメチルピリジン）、 コリジン（トリメチルピリジン）、ェチルメチルピリジン、パルボリン (テトラメチルピリジン） が挙げられる。塩基性含窒素芳香環化合物として、縮合環系のァザァレーンが挙げ られ、例えば、キノリン、イソキノリン、インドール等の二環式塩基性含窒素芳香環化 合物又はその誘導体を用いてもよい。また、塩基性含窒素芳香環化合物としては、 例えば、ベンゾキノリン、ベンゾイソキノリン、アタリジン等のァザアントラセンやフエナ ントリジン等の三環式塩基性含窒素芳香環化合物又はその誘導体を用いてもよい。
[0043] 反応促進剤としてピリジンを用いる場合、 1νΖν%以上 40vZv%以下、好ましくは 10vZv%以上 30vZv%以下である。これにより、 C末端の逐次切断の速度を確実 に増加させることができる。また、担体をこの溶液に浸積させる際、室温中で担体を 2 0分間浸漬させる操作を 3回繰り返して行ってもよい。その後、極性非プロトン性溶媒 を用いて担体中から過剰の触媒及び水分を除去することで、後の酸無水物による逐 次切断反応を達成してもよ ヽ。
[0044] なお、切断工程で起こる反応の停止は、反応系の温度を低下させるとともに、担体 中に浸潤している反応試薬であるアルカン酸無水物を、水、双極性非プロトン性溶 媒、極性非プロトン性溶媒などで、希釈、除去することにより、行われてもよい。この際 、担体の材料の溶解を引き起こさず、アルカン酸無水物及び双極性非プロトン性溶 媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いてもょ 、。ポリアクリルアミド ゲルを用いる場合、極性非プロトン性溶媒として、ァセトニトリルなどの炭素数 4以下 の-トリル類、アセトンなどの炭素数 4以下のケトン類が挙げられる。
[0045] 次に、上述の通り、ペプチドとアルカン酸無水物とを反応させて形成された 5—ォキ サゾロン環を加水分解してカルボン酸末端を形成させる。この加水分解反応は、種 々の公知の手法であれば特に制約はないが、塩基性含窒素芳香環化合物又は第 三アミン類を触媒として用いてもよい。塩基性含窒素芳香環化合物として、極性非プ 口トン性溶媒に高い溶解性を示す、単環式の含窒素芳香環化合物を用いてもよい。 具体的には、ピリジン又はピリジン塩基等が好ましい。また、第三アミンィ匕合物として は、ピリジン塩基が示す比較的弱い塩基性と同程度の塩基性を有するものが用いら れる。第三アミンィ匕合物として、具体的には、例えば、 DMAE (ジメチルアミンェタノ ール：（CH ) N-CH CH OH)が好ましい。塩基性含窒素芳香環化合物としてピリ
3 2 2 2
ジンを用いる場合、水溶液全体の体積に対して、 5体積％以上 15体積％以下、より 具体的には 10体積％であってもよい。また、 DMAEを利用する場合、水溶液全体の 体積に対して、 1体積％以上 20体積％以下、より具体的には 10体積％であってもよ い。また、この加水分解反応は、 50°C以上で行ってもよぐ密閉された反応容器内で 反応を行う場合、 100°C以下であってもよい。
[0046] さらに、加水分解反応は、アルカン酸無水物による 5—ォキサゾロン環を形成させる 反応と同時に進行させてもよい。この場合、 C末端のペプチド結合の逐次的切断反 応の反応温度を下げてその反応停止を図りつつ、有機塩基を含有する水溶液をカロ える。こうすると、アルカン酸無水物の不活ィ匕及びその担体中からの溶出が生じる。こ のため、 C末端のペプチド結合の逐次的切断反応の停止と、反応試薬の不活化、除 去がなされる。引き続き、反応産物に対する加水処理を行い、最終的に、極性非プロ トン性溶媒を利用する再脱水処理工程を施す。こうすれば、有機塩基を含有する水 溶液とともに、アルカン酸無水物に対応するアルカン酸及び双極性非プロトン性溶媒 の除去と再脱水が起こる。このため、極性非プロトン性溶媒による洗浄、除去操作を 中間に設ける場合と、実質的に差異のない処理を簡便に行うことができる。
[0047] 本発明によるペプチドの C末端のペプチド結合を切断する方法によると、エステル 化工程によりグルタミン酸残基に特異的なエステルイ匕反応が進行して、エステル化工 程に用いたアルコール (例えば、メタノール）に対応するエステルイ匕体 (例えばメチル 基）となる。次に、切断工程によりペプチドの C末端のペプチド結合が逐次的に切断 される。グルタミン酸残基はエステルイ匕されているため、上述したグルタミン酸残基の
N末端側の結合が切断されることなく C末端特異的に逐次切断反応が進行する。従 つて、対象とする切断物であるペプチドが担体力 溶出されることなく担体中に支持 されたまま逐次切断反応が進行するため、反応産物の定量性が保たれるので感度 の低下を引き起こすことなぐ質量分析などのさらに種々の用途に用いることが可能と なる。
[0048] <本発明によるペプチドの C末端アミノ酸配列の決定方法に係る一態様 >
本発明によるペプチドの C末端アミノ酸配列の決定方法は、ペプチドの C末端アミノ 酸配列の決定方法であって、前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステルイ匕するよう に、ペプチドと、アルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させる 工程と、前記ペプチドの C末端アミノ酸残基が逐次的に欠損した C末端欠損ペプチド を得るように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、前記 C末端 欠損ペプチドの分子量を測定する工程と、
Figure imgf000015_0001
、て前記ペプチドを把 握する工程と、を有することを特徴とする。この態様は、上述のエステルイ匕工程と、切 断工程とを有するとともに、さらに、 C末端欠損ペプチドの分子量を測定する工程と、 この分子量に基づいてペプチドを把握する工程とを有する。これらの工程を、それぞ れ測定工程及び把握工程と称する。本態様において、エステル化工程及び切断ェ 程は、下述する他、上述と同様に行えばよい。この態様は、担体に支持される限り、 どのような分子量を有するペプチドについても適用可能であるが、比較的小さな分子 量を有するペプチドを c末端アミノ酸配列の同定対象とする際に好適に用いられ、そ の分子量は、例えば、 5000未満であってもよい。また、この態様において、下述する 部位特異的切断試薬を用いた消化工程を、切断工程の後、測定工程の前に行って ちょい。
[0049] (測定工程）
測定工程は、 C末端欠損ペプチドなどのペプチド類の分子量を測定する工程であ る。この工程は、種々の分子量把握手段を用いればよぐ例えば、質量分析装置が 例示される。質量分析装置として、例えば、イオントラップ質量分析計、四重極型質 量分析計、磁場型質量分析計、飛行時間 (TOF)型質量分析計、フーリエ変換型質 量分析計などを用いることができる。また、イオン化法として、エレクトロスプレーィォ ン化法 (ESI法）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI)法、高速原子衝 突イオン化 (FAB)法などが挙げられる。
[0050] このうち、例えば MALDI—TOF— MSが好適に用いられる。 MALDI—TOF— MSを用いることにより、イオンィ匕過程において、ペプチド断片を構成するアミノ酸残 基から一部の原子団が欠落することを抑制することができる。また、比較的高分子量 のペプチド断片の測定を好適に行うことができる。さらに、測定対象のペプチドを担 体中で電気泳動により分離し、担体中で上述の処理を施した後、回収して測定に供 する場合にも、対応する陰イオンと陽イオンとの両方を測定可能である。これらのこと から、 MALDI—TOF— MSを用いることにより、さらに再現性の高い分析を行うこと ができる。
[0051] 測定工程に MALDI—TOF— MSを用いる場合、 MALDI—TOF— MSのイオン 化過程では、ペプチド断片にプロトン (H+)が付加された陽イオン種と、ペプチド断片 力もプロトンが離脱された陰イオン種とをそれぞれ測定してもよい。
[0052] なお、測定工程において質量分析に供するペプチド断片の長さは、最大で、 30〜 50アミノ酸残基であってもよぐ 20〜30アミノ酸残基以下であってもよい。これにより 、ペプチド断片を確実にイオンィ匕し、高い精度で測定を行うことができる。また、ぺプ チドの分子量は、 4000を越えない範囲、好ましくは、 3000を越えない範囲であって もよい。こうすることにより、分子量差に基づいて対応するアミノ酸の特定を行う際に、 例えば、ァスパラギン残基 (Asn)とァスパラギン酸残基 (Asp)や、グルタミン残基 (G1 n)とグルタミン酸残基 (Glu)のように、式量の差異が 1のアミノ酸残基相互の区別を 高い精度で行うことができる。
[0053] (把握工程）
把握工程は、上述の測定工程で得た C末端欠損ペプチドや元のペプチドなどの分 子量に基づいて、ペプチドを把握する工程である。この工程は、上述の通り逐次切断 して得た種々のアミノ酸長を有する C末端欠損ペプチドの分子量と元のペプチドの分 子量との間の差を比較して、元のペプチドの C末端アミノ酸配列を把握することで、 行われてもよい。
[0054] 本発明によるペプチドの C末端アミノ酸配列の決定方法では、グルタミン酸残基の N末端側の切断反応が抑制されることから、 C末端アミノ酸配列に特異的に逐次切断 が進行することとなる。得られる C末端欠損ペプチドは、 C末端側以外のペプチドを 構成するアミノ酸残基で非特異的に切断されることなぐ逐次切断により段階的に C 末端側のアミノ酸残基が欠失したものとなる。従って、他の可能性を考慮することなく 、上述の通り得た C末端欠損ペプチドの分子量と元のペプチドの分子量との差に基 づ 、て、 C末端アミノ酸配列を把握することが可能となる。
[0055] <本発明によるペプチドの C末端アミノ酸配列の決定方法に係る他の態様 >
本発明によるペプチドの C末端アミノ酸配列の決定方法に係る他の態様は、担体に 支持されたペプチドの C末端アミノ酸配列の決定方法であって、前記ペプチドのダル タミン酸残基をエステルイ匕するように、担体に支持されたペプチドと、アルコールを有 する過ハロゲンィ匕カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、前記ペプチドの C末端ァ ミノ酸残基が逐次的に欠損した C末端欠損ペプチドを得るように、前記ペプチドと、ァ ルカン酸無水物とを反応させる工程と、前記担体を部位特異的切断試薬を有する溶 液に浸漬して、前記 C末端欠損ペプチドに由来する C末端欠損ペプチド由来べプチ ド断片を得る工程と、前記 C末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定す る工程と、前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、を有することを特 徴とすることを特徴とする。この態様は、上述のエステル化工程と、切断工程と、測定 工程と、把握工程とを有するとともに、さらに切断工程と測定工程との間で、消化工程 を行うことを特徴とする。この態様は、比較的大きな分子量を有するペプチドを c末端 アミノ酸配列の決定対象とする際に好適に用いられ、その分子量は、例えば、 5kDa 〜300kDaであってもよい。この態様におけるエステルイ匕工程、切断工程、測定工程 及び把握工程は、それぞれ、下述する他、上述の通り行えばよい。
[0056] (エステル化工程）
担体に支持されたペプチドのエステルイ匕工程は、前述のとおりアルコールを有する 過ハロゲンィ匕カルボン酸の溶液と反応させる方法である。また、このエステル化工程 として、アルコールで脱水収縮を行った担体に対して過ハロゲン化カルボン酸アルコ ール溶液を作用させ、過ハロゲンィヒカルボン酸とアルコールとが反応する際に生成 する水を利用して担体の膨潤と試薬の浸潤を同時に達成する方法を用いてもょ 、。 この方法によれば、より速やかなエステルイ匕反応の達成が可能となる。
[0057] (消化工程）
消化工程は、ペプチドを支持する担体を蛋白分解酵素などの部位特異的切断試 薬を有する溶液に浸漬する工程であって、この工程により、種々のペプチド断片を得 るものである。上述のペプチドの C末端のペプチド結合を切断する方法を行った後、 元のペプチドの C末端力 所定の数のアミノ酸残基がそれぞれ除去された一連の反 応産物を含む混合物に対して、所定のアミノ酸残基の結合部位において、ペプチド 鎖の切断を選択的に行う。このとき、例えば、切断部位特異性を有するプロテアーゼ 、例えば、トリプシンを用い、比較的分子量の大きいペプチド鎖の酵素消化を行って もよい。消化工程に用い得る部位特異的切断試薬は、トリプシンの他、グルタミン酸 残基の C末端側を切断する V8プロテアーゼ等、切断位置の特異性を有する他のプ 口テアーゼを用いてもよい。また、メチォニン残基の C末端側アミド結合における開裂 に特異性を有する CNBr等の化学的な試薬を用いてもょ 、。
[0058] 消化工程は、担体中にペプチドが支持された状態で行うが、ペプチド群及び Z又 はペプチド断片群は、担体に支持され得る長さ以下となると、消化工程で用いる液相 に溶出される。消化工程を施して得られるペプチド断片の混合物には、元のペプチド に由来する C末端側ペプチド断片群と、所定の数のアミノ酸残基がその C末端力 そ れぞれ除去された一連の反応産物に由来する C末端側ペプチド断片群とが少なくと も含まれる。
[0059] (測定工程）
この態様において得られるペプチド類には、元のペプチド、及び C末端欠損べプチ ドとともに、元のペプチドに由来するペプチド断片、 C末端欠損ペプチドに由来する ペプチド断片及び N末端側のペプチド断片も含まれる。従って、元のペプチド及び 一連の反応産物に由来する C末端側ペプチド断片群に起因するピークと、それ以外 の N末端側の複数のペプチド断片に起因するピークとを高い精度で識別した上で、 目的とする元のペプチド及び一連の反応産物に由来する C末端側ペプチド断片群 に起因するピークの各分子量をより精度よく決定可能な手法を採用することにより、 汎用性のより一層の向上が可能となる。
[0060] ここで、測定工程は、消化工程の後に行われるので、消化工程にトリプシンを用い る場合、 C末端側ペプチド断片を構成するアミノ酸残基中にはアルギニン残基が含ま れていない。一方、消化工程で得られる他のペプチド断片は、プロトン受容能に富む グァ-ジノ基を有するアルギニン残基が含まれることとなる。そのため、これらに由来 する陽イオン種の安定ィ匕が図られる。このように、測定工程では、消化工程に用いる 部位特異的切断試薬のペプチドの切断の態様の特徴に応じて、測定条件を種々選 択すればよい。
[0061] このため、質量分析において、陽イオン種を測定した結果と、陰イオン種を測定し た結果とを比較すると、 C末端側ペプチド断片と他のペプチド断片とは、その相対強 度が異なる。この現象を利用して、 MALDI— TOF— MS装置によって測定される複 数種のピークのうち、一連の C末端側ペプチド断片に起因するピークを識別し、特定 してちよい。
[0062] 陽イオン種の質量分析スペクトル中では、 C末端にアルギニン残基を有するぺプチ ド断片群に起因するピーク強度が相対的に強くなる。一方、アルギニン残基を有さな V、C末端側ペプチド断片は、プロトン供与能を示すカルボキシル基をその C末端に 有する。このため、 MALDI— TOF— MS装置で測定される陰イオン種の質量分析 スペクトル中において、 C末端側ペプチド断片群に起因するピーク強度が相対的に 強くなる。このように、 MALDI—TOF— MSにおける陽イオン種の質量分析スぺタト ル及び陰イオン種の質量分析スペクトルを対比した際の相対的強度の相違を利用し て、 C末端側にアルギニン残基を共通して有するペプチド断片に起因するピークを区 別してもよい。また、陰イオン種の質量分析スペクトル中において、元のペプチド鎖と 、C末端アミノ酸残基の逐次的な切断反応で生成する一連の C末端側ペプチド断片 群に起因するピークを容易に特定してもよ 、。
[0063] <更なる工程 >
上述の本発明によるペプチドの C末端のペプチド結合を切断する方法及びべプチ ドの C末端アミノ酸配列の決定方法は、上述の工程の他、種々の前処理、後処理等 の工程をさらに有してもよい。
[0064] (担体の脱水）
ゲル状物質など担体を構成する成分の溶解を弓 Iき起こさず、且つ水に対して親和 性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、担体を脱水してもよい。この方法を用い ると、脱水処理操作を終えた後も、分析対象のペプチドを、分離されたスポット又は バンドとして担体中に保持された状態に維持できる。担体がポリアクリルアミドである 場合、脱水に利用する極性非プロトン性溶媒として、例えば、水に対する親和性に富 むァセトニトリル (CH CN)などの炭素数 4以下の-トリル類、アセトンなどの炭素数 4
3
以下のケトン類を用いることができる。また、これらの極性非プロトン性溶媒は、水より も蒸散し易い。極性非プロトン性溶媒が蒸散し、担体が乾固すると、その嵩体積が減 少し、収縮する。ァセトニトリル中に浸積する操作を数回繰り返して行う。例えば、担 体片を室温で 20分間浸積する操作を 3回行ってもょ 、。
[0065] (ペプチドの架橋）
エステルイ匕工程を行う前に、担体中に支持されるペプチド同士を架橋させてもよい 。架橋剤としては、この化合物の両末端に結合基を有するものであれば特に制約は なぐ例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド基を持つもので あってもよい。これにより、ペプチドを支持する担体中でペプチド同士が架橋されて、 網目構造が形成され、担体とタンパク質とが絡み合って、タンパク質の溶出を抑える ことが可能となる。架橋剤としてダルタルアルデヒドを用いる場合、ペプチドの架橋は 、 1ピコモル Z μ L以上 1000ナノモル Ζ μ L以下の濃度のグルタルアルデヒド水溶 液中に担体を 30分以上 2時間以下の時間、浸積して行われてもよい。
[0066] (分子内 Ζ分子間結合、翻訳後修飾に対する処理）
本発明において、対象となるペプチドの分子内 Ζ分子間結合や翻訳後修飾に係る 分子団を、適当な処理剤を用いて、分解 Ζ切断等の処理を行ってもよい。例えば、 分子内又は分子間に S— S結合を有するペプチドを対象とする場合、 DTTなどの還 元剤で還元処理して S— S結合を解消してもよい。また、 S— S結合を還元して得た S Η基を、更にアルキル化剤などを用いて、再び S— S結合を形成させないように処理 してちよい。
[0067] (Ν, Ο—保護）
本発明にお 、て、上述の切断工程にお!、てペプチドの逐次切断の反応中に起こる 可能性のある上述の Ν, Ο ァシル転移反応及びこの転移反応に続く切断反応を回 避する目的で、セリン残基ゃトレオニン残基などの β一水酸基（ |8— ΟΗ基)及び Ζ 又はリジン残基の ε—ァミノ基（ ε NH基)を保護してもよい。また、天然由来のリ
2
ジン残基のジメチル化体や、ァセチル化体は、消化工程で用いるプロテア一ゼのー 種であるトリプシンによる切断を受けな 、ことから、リジン残基のトリプシンに対する感 受性をペプチド全体で一様とすることを目的として、 ε—NH基の保護を行ってもよ
2
い。この場合、リジン残基は、天然由来のジメチルイ匕体やァセチルイ匕体とともに ε ΝΗ基を保護された置換基となり、トリプシンによるリジン残基の Ν末端側での切断が
2
起こらなくなる。これらの保護は、水酸基及びアミノ基の公知の保護基であれば特に 制限はないが、例えば、 Ο ァシルイ匕及び Ν ァシルイ匕反応を用いて行われてもよ い。例えば、上述のァシルイ匕反応は、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添カロし てなる混合物中で担体片を攪拌して行われてもよい。このとき、アルカン酸無水物が 求電子的なァシル化剤となる。また、アルカン酸は、そのプロトン供与能により、アル カン酸無水物とアミノ基及びヒドロキシ基との反応が促進されて、 Ν ァシル化及び Ο ーァシルイ匕が起こる。なお、このァシルイ匕反応の停止は、切断工程で起こる反応の 停止に準じて行えばよい。
[0068] (後処理）
切断工程の後、脱溶媒処理を行ってもよい。脱溶媒処理は、特に限定されたもので はな!/、が、上述の担体の脱水に準じて行ってもよ!、。
[0069] 測定工程を行う前に、測定対象物となるペプチド群及び Z又はペプチド断片群を 含む混合物を脱塩処理してもよい。これにより、回収、乾燥されるペプチド断片は、各 種の塩を形成するものではなく、本来のペプチド単体となる。
[0070] さらに、再膨潤した担体中に保持されているペプチド鎖の C末端に対して無水酢酸 を加熱温度で作用させると、ァセチル化と同時にペプチド鎖の C末端のアミノ酸残基 の選択的な切断反応が進行する。具体的には、ペプチドの C末端において、上記式
(I)及び (Π)の反応経路を経て、 5—ォキサゾロン環形成を介するペプチド鎖の C末 端アミノ酸の逐次的切断反応が進行すると推定される。
[0071] C末端アミノ酸の逐次的な切断反応が進行すると、担体中には、段階的に C末端ァ ミノ酸が除去された一連の反応産物と、ァセチルイ匕により保護された元のペプチドと が含まれた混合物が残される。
[0072] 以上、本発明を各態様に分けて詳細に説明した。これらの態様は、例示であり、種 々変更され得ること、またこのような変更もまた、本発明の範囲にあることは当業者に 理解され得るところである。
実施例
[0073] (処理例 1)
図 1の上段に示すアミノ酸配列を有し凍結乾燥した大豆トリプシンインヒビター（配 列番号 1)とメタノールとを 10mg : lmLの割合で混和し、 5°Cに冷却した。この混液に 、 0. 01Nとなるように、 6N塩酸を 5°Cで攪拌しながら滴下した。 16時間後、 0. 02N となるように、 6N塩酸をさらに滴下し、さらに 24時間後、 0. 03Nとなるように 6N塩酸 をさらに滴下し、さらに 3日間攪拌した。これを適当量ピぺッターで分取し、真空乾燥 させて溶媒を留去して、乾燥物 1を得た。なお、図 1の下段は、トリプシンインヒビター をトリプシンを用いて消化して得られると推測されるペプチド断片の N末端からの残 基数及びその理論分子量である。 [0074] (参考例 1)
処理例 1により調製した乾燥物 1を SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS— P AGE)用バッファー（終濃度 50mMの Tris— HCl (pH6. 8)、 1%の 2—メルカプトェ タノール及び 1%SDS)に溶力して、 SDS— PAGEを行った。得たバンドを lmm X 1 mmで切り出し、これを、 1. 25ngZ Lのトリプシン溶液に、 37°Cで、 16時間浸漬し て、 trypsin in -gel digestionを行った。その後、ゲルから液相に溶出された各ぺ プチド断片を MALDI—TOF— MSで分析した。測定は、 positive ion mode, re flector modeで行った。得た結果を図 2乃至図 5に示す。図 2乃至図 5は、トリプシ ンインヒビターのトリプシン消化で得たペプチド断片に係る質量分析スペクトルであつ て、図 2は、 48〜63番目（配列番号 21)、図 3は、 112〜119番目（配列番号22)、 図 4は、 66〜76番目（配列番号 24)及び 166〜175番目（配列番号 23)、並びに図 5は、 31〜38番目のペプチド断片 (配列番号 25)にそれぞれ対応する。なお、横軸 は、質量数を示し、縦軸は、相対強度を示す (以下、図 7まで同様)。
[0075] 図 2乃至図 5から明らかなように、処理例 1により処理して得たトリプシンインヒビター をトリプシン消化して得た各ペプチド断片のうち、グルタミン酸残基を有するペプチド 断片（配列番号 21、配列番号 23及び配列番号 25)でのみ、メチル化体に対応する ピーク（図 2では、 1777. 0432、図 4では、 1225. 7784,図 5では、 829. 4880)力 S 観察された。このことから、これらのペプチド断片のグルタミン酸残基は、処理例 1の 処理により、メチルイ匕されたことが分力つた。
[0076] (参考例 2)
上述の実施例 1の処理例 1に記載の処理をほどこさな力つた群のペプチド断片で 得た配列番号 26に対応するペプチド断片をナノ LCにより逆相カラムで分離した後、 得た組成物を MSZMS分析した。その結果を図 8に示す。配列番号 26に示すぺプ チド断片の理論分子量から、この分析で得た N末端のグルタミン酸残基を含む各べ プチド断片（図 8中、 b3〜bl4に対応し、配列番号 37〜47にそれぞれ対応する）に 係る分子量を差分すると、 18となった。また、全体の分子量については、理論値から 18だけ小さい質量にピークが観測された。下述の実施例 1で得た結果を考えあわせ ると、 N末端のグルタミン酸残基は脱水され、ピログルタミン酸残基となっていることが 分かる。
[0077] (実施例 1)
処理例 1により調製した乾燥物 1を SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS— P AGE)用バッファー（終濃度 50mMの Tris— HCl (pH6. 8)、 1%の 2—メルカプトェ タノール及び 1%SDS)に溶力して、 SDS— PAGEを行った。その後、トリプシンイン ヒビターを含むゲル片を lmm立方に細断し、下述の切断工程処理を行った。結果を 図 6に示す。図 6 (a)は、処理例 1を行わなカゝつた群のペプチド断片に係る質量分析 スペクトルであり、図 6 (b)は、処理例 1を行った群のペプチド断片に係る質量分析ス ベクトルである。
[0078] 図 6 (a)では、質量数 1673. 69と 1805. 79とにピークが認められ、それぞれ、配列 番号 26に示すアミノ酸配列を有する脱水体、及び配列番号 27に示すアミノ酸配列 に相当する。また、図 6 (b)では、質量数 1673. 97と 1806. 11とにピークが認められ 、それぞれ、図 6 (a)のアミノ酸配列に相当する。図 6から明らかなように、配列番号 2 6に示すアミノ酸配列の脱水体に係るピーク強度は、処理例 1により処理を行った群 で顕著に減少し、逆に、配列番号 27に示すアミノ酸配列に係るピーク強度は、処理 例 1により処理を行った群で顕著に増加した。図 2の結果を考えあわせると、ダルタミ ン酸残基をメチル化することにより、切断工程処理の際に起こるグルタミン酸残基の N末端の切断は、特異的に抑制されることが分力つた。
[0079] (実施例 2)
トリプシンインヒビター 5 μ g (配列番号 1)を SDS— PAGEにより電気泳動し、バンド を CBB染色した。染色したバンドを lmm X lmmでゲル片を切り出し、水：メタノール ： TFA= 500 : 250 : 500 L)の溶液に浸漬し、室温で 16時間載置した。その後、 このゲル片に下述の切断工程処理を行った。その結果を図 7に示す。
[0080] 図 6 (a)で得た結果と比較して明らかなように、上述のエステル化工程で得たグルタ ミン酸残基をメチルイ匕することによっても、切断工程の際に起こるグルタミン酸残基の N末端での切断反応が顕著に抑制された。
[0081] <切断工程処理 >
1. 25pmolZ Lのダルタルアルデヒド溶液で固定を行った。次に、固定されたゲ ル片をピリジン溶液で処理した後、ァセトニトリルで脱水を行い、 30%無水酢酸'ホル ムアミド溶液に、 60°C、 1時間浸漬した。その後、ゲル片を、 10%ジメチルァミンエタ ノール溶液で、 60°C、 2時間浸漬して、加水分解反応を行った。その後、参考例 1〖こ 記載のトリプシン消ィ匕による in— gel digestionを行い、得た tryptic fragmentsを MALDI— TOF— MSにて分析した。測定は positive ion mode, linear mode で行った。
[0082] (各配列番号に示す配列について）
本願に添付した明細書、請求の範囲及び図面に記載のアミノ酸配列を、配列番号 毎に以下に列挙する。
[0083] 配列番号 1 :大豆トリプシンインヒビター（Genbank No. 1AVU、以下同様）のアミ ノ酸配列
配列番号 2：大豆トリプシンインヒビターの 1〜30番目のアミノ酸配列
配列番号 3：大豆トリプシンインヒビターの 31〜38番目のアミノ酸配列
配列番号 4：大豆トリプシンインヒビターの 39〜47番目のアミノ酸配列
配列番号 5：大豆トリプシンインヒビターの 48〜52番目のアミノ酸配列
配列番号 6：大豆トリプシンインヒビターの 53〜63番目のアミノ酸配列
配列番号 7：大豆トリプシンインヒビターの 64〜65番目のアミノ酸配列
配列番号 8：大豆トリプシンインヒビターの 66〜76番目のアミノ酸配列
配列番号 9：大豆トリプシンインヒビターの 77〜106番目のアミノ酸配列
配列番号 10 :大豆トリプシンインヒビターの 107〜 111番目のアミノ酸配列 配列番号 11：大豆トリプシンインヒビターの 112〜 119番目のアミノ酸配列 配列番号 12 :大豆トリプシンインヒビターの 120〜 122番目のアミノ酸配列 配列番号 13 :大豆トリプシンインヒビターの 123〜 132番目のアミノ酸配列 配列番号 14 :大豆トリプシンインヒビターの 133〜144番目のアミノ酸配列 配列番号 15 :大豆トリプシンインヒビターの 145〜 159番目のアミノ酸配列 配列番号 16：大豆トリプシンインヒビターの 160番目のアミノ酸配列
配列番号 17 :大豆トリプシンインヒビターの 161〜165番目のアミノ酸配列 配列番号 18 :大豆トリプシンインヒビターの 166〜175番目のアミノ酸配列 配列番号 19 大豆トリ'プシンインヒビターの 176 178番目のアミノ酸配列 配列番号 20 大豆トリ'プシンインヒビターの 179 181番目のアミノ酸配列 配列番号 21 大豆トリ'プシンインヒビターの 48へ '63番目のアミノ酸配列 配列番号 22 大豆トリ'プシンインヒビターの 112 119番目のアミノ酸配列 配列番号 23 大豆トリ'プシンインヒビターの 166 175番目のアミノ酸配列 配列番号 24 大豆トリ'プシンインヒビターの 66へ 6番目のアミノ酸配列 配列番号 25 大豆トリ'プシンインヒビターの 31へ '38番目のアミノ酸配列 配列番号 26 大豆トリ'プシンインヒビターの 49 '63番目のアミノ酸配列 配列番号 27 大豆トリ'プシンインヒビターの 48へ '63番目のアミノ酸配列 配列番号 28 大豆トリ'プシンインヒビターの 61 '63番目のアミノ酸配列 配列番号 29 大豆トリ'プシンインヒビターの 60 '63番目のアミノ酸配列 配列番号 30 大豆トリ'プシンインヒビターの 59 '63番目のアミノ酸配列 配列番号 31 大豆トリ'プシンインヒビターの 58へ '63番目のアミノ酸配列 配列番号 32 大豆トリ'プシンインヒビターの 57へ '63番目のアミノ酸配列 配列番号 33 大豆トリ'プシンインヒビターの 56へ '63番目のアミノ酸配列 配列番号 34 大豆トリ'プシンインヒビターの 55へ '63番目のアミノ酸配列 配列番号 35 大豆トリ'プシンインヒビターの 54 '63番目のアミノ酸配列 配列番号 36 大豆トリ'プシンインヒビターの 53へ '63番目のアミノ酸配列 配列番号 37 大豆トリ'プシンインヒビターの 49 '51番目のアミノ酸配列 配列番号 38 大豆トリ'プシンインヒビターの 49 '52番目のアミノ酸配列 配列番号 39 大豆トリ'プシンインヒビターの 49へ '53番目のアミノ酸配列 配列番号 40 大豆トリ'プシンインヒビターの 49へ '54番目のアミノ酸配列 配列番号 41 大豆トリ'プシンインヒビターの 49 '55番目のアミノ酸配列 配列番号 42 大豆トリ'プシンインヒビターの 49へ '56番目のアミノ酸配列 配列番号 43 大豆トリ'プシンインヒビターの 49へ '57番目のアミノ酸配列 配列番号 44 大豆トリ'プシンインヒビターの 49へ '58番目のアミノ酸配列 配列番号 45 大豆トリ'プシンインヒビターの 49へ '59番目のアミノ酸配列 配列番号 46 大豆トリ'プシンインヒビターの 49 '60番目のアミノ酸酉己歹 IJ 配列番号 47：大豆トリプシンインヒビターの 49〜62番目のアミノ酸配列
以上、本発明の好適な実施の形態により本発明を説明した。ここでは特定の具体 例を示して本発明を説明したが、特許請求の範囲に定義された本発明の広範な趣 旨および範囲力 逸脱することなぐこれら具体例に様々な修正および変更を加える ことができることは明らかである。すなわち、具体例の詳細および添付の図面により本 発明が限定されるものと解釈してはならない。

Claims

請求の範囲
[1] ペプチドの c末端のペプチド結合を切断する方法であって、
前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、ペプチドと、アルコール を有する過ハロゲンィ匕カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、
前記ペプチドの C末端アミノ酸残基が逐次的に欠損した C末端欠損ペプチドを得る ように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、
を有することを特徴とするペプチドの c末端のペプチド結合を切断する方法。
[2] 前記のペプチドとアルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液とを反応させ る工程は、該ペプチドを担体に支持して行う工程であることを特徴とする請求項 1に 記載の方法。
[3] 前記担体は、ポリアクリルアミドゲルであることを特徴とする請求項 2に記載の方法。
[4] 前記のアルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液は、水溶液及びアルコ ール溶液力 なる群力も選択された溶液であることを特徴とする請求項 1乃至 3のい ずれか一項に記載の方法。
[5] 前記アルコールは、炭素数 1以上 5以下であることを特徴とする請求項 1乃至 4のい ずれか一項に記載の方法。
[6] 前記アルコールは、メタノールであることを特徴とする請求項 5に記載の方法。
[7] 前記過ハロゲン化カルボン酸は、トリクロ口酢酸、トリフルォロ酢酸、ペンタフルォロ プロピオン酸及びヘプタフルォロブチル酸からなる群から選択されたものであることを 特徴とする請求項 1乃至 6のいずれか一項に記載の方法。
[8] 前記過ハロゲン化カルボン酸は、トリフルォロ酢酸であることを特徴とする請求項 7 に記載の方法。
[9] 前記過ハロゲン化カルボン酸の溶液は、水：メタノール: TFAの容量比で、 100以 上 600以下： 150以上 350以下： 300以上 700以下であることを特徴とする請求項 1 乃至 8の 、ずれか一項に記載の方法。
[10] ペプチドの C末端アミノ酸配列の決定方法であって、
前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、ペプチドと、アルコール を有する過ハロゲンィ匕カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、 前記ペプチドの c末端アミノ酸残基が逐次的に欠損した c末端欠損ペプチドを得る ように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、
前記 c末端欠損ペプチドの分子量を測定する工程と、
前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、
を有することを特徴とするペプチドの c末端アミノ酸配列の決定方法。
[11] 前記の分子量に基づいてペプチドを把握する工程は、前記ペプチドの分子量と、 前記 C末端欠損ペプチドの分子量との差に基づ 、て、前記ペプチドの C末端アミノ 酸配列を把握する工程であることを特徴とする請求項 10に記載の方法。
[12] ペプチドの C末端アミノ酸配列の決定方法であって、
前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステル化するように、ペプチドと、アルコール を有する過ハロゲンィ匕カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、
前記ペプチドの C末端アミノ酸残基が逐次的に欠損した C末端欠損ペプチドを得る ように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、
前記ペプチドを部位特異的切断試薬を有する溶液と反応させて、前記 C末端欠損 ペプチドに由来する C末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る工程と、
前記 c末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する工程と、 前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、
を有することを特徴とするペプチドの c末端アミノ酸配列の決定方法。
[13] 前記部位特異的切断試薬は、トリプシン、 V8プロテアーゼ及び CNBrからなる群か ら選択された試薬であることを特徴とする請求項 12に記載の方法。
[14] 担体に支持されたペプチドの C末端アミノ酸配列の決定方法であって、
前記ペプチドのグルタミン酸残基をエステルイ匕するように、担体に支持されたぺプ チドと、アルコールを有する過ハロゲンィ匕カルボン酸の溶液とを反応させる工程と、 前記ペプチドの C末端アミノ酸残基が逐次的に欠損した C末端欠損ペプチドを得る ように、前記ペプチドと、アルカン酸無水物とを反応させる工程と、
前記担体を部位特異的切断試薬を有する溶液に浸潰して、前記 C末端欠損ぺプ チドに由来する C末端欠損ペプチド由来ペプチド断片を得る工程と、
前記 C末端欠損ペプチド由来ペプチド断片の分子量を測定する工程と、 前記分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程と、
を有することを特徴とする担体に支持されたペプチドの c末端アミノ酸配列の決定 方法。
[15] 前記の分子量に基づいて前記ペプチドを把握する工程は、前記 C末端欠損ぺプ チド由来ペプチド断片の分子量と、該ペプチド断片に対応し前記ペプチドに由来す るペプチド断片の分子量との差に基づ 、て、前記ペプチドの C末端アミノ酸配列を把 握する工程であることを特徴とする請求項 14に記載の方法。
[16] 前記のアルコールを有する過ハロゲン化カルボン酸の溶液は、メタノール: TFAの 容量比で、 150以上 350以下： 300以上 700以下であることを特徴とする請求項 14 又は 15に記載の方法。
[17] 前記部位特異的切断試薬は、トリプシン、 V8プロテアーゼ及び CNBrからなる群か ら選択された試薬であることを特徴とする請求項 14乃至 16のいずれか一項に記載 の方法。
[18] 前記担体は、ポリアクリルアミドゲルであることを特徴とする請求項 14乃至 17のい ずれか一項に記載の方法。
PCT/JP2007/052204 2006-02-08 2007-02-08 ペプチドのｃ末端のペプチド結合を切断する方法、及びペプチドのｃ末端アミノ酸配列の決定方法 WO2007091627A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07708225A EP1983346A4 (en) 2006-02-08 2007-02-08 METHOD FOR CLEAVING A PEPTIDE BOND AT THE C-TERMINAL END OF A PEPTIDE, AND A METHOD FOR DETERMINING THE C-TERMINAL END-ACE AMINO ACID SEQUENCE OF A PEPTIDE
JP2007557882A JP4771296B2 (ja) 2006-02-08 2007-02-08 ペプチドのｃ末端のペプチド結合を切断する方法、及びペプチドのｃ末端アミノ酸配列の決定方法
US12/278,878 US20100167326A1 (en) 2006-02-08 2007-02-08 Method for cleavage of peptidic bond at c terminal of peptide and a method for determination of c terminal amino acid sequence of peptide

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006-031097 2006-02-08
JP2006031097 2006-02-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007091627A1 true WO2007091627A1 (ja) 2007-08-16

Family

ID=38345221

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/052204 WO2007091627A1 (ja) 2006-02-08 2007-02-08 ペプチドのｃ末端のペプチド結合を切断する方法、及びペプチドのｃ末端アミノ酸配列の決定方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20100167326A1 (ja)
EP (1) EP1983346A4 (ja)
JP (1) JP4771296B2 (ja)
CN (1) CN101379402A (ja)
WO (1) WO2007091627A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102485749A (zh) * 2009-10-09 2012-06-06 中牧实业股份有限公司 猪瘟合成肽疫苗及其制备方法
JP2018109525A (ja) * 2016-12-28 2018-07-12 株式会社島津製作所 分析用試料の調製方法および分析方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002526778A (ja) * 1998-10-01 2002-08-20 ブラックス グループ リミテッド 開裂およびマススペクトル分析によりポリペプチドを特徴付ける方法
JP2004191123A (ja) * 2002-12-10 2004-07-08 Nec Corp ペプチドのｃ末端アミノ酸配列解析方法
WO2005078447A1 (ja) 2004-02-17 2005-08-25 Nec Corporation ペプチドのｃ末端アミノ酸配列の分析方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5468843A (en) * 1994-09-08 1995-11-21 Perkin-Elmer Acetic anhydride activation for C-terminal protein sequencing
JP2000053773A (ja) * 1998-08-06 2000-02-22 Fuji Oil Co Ltd 改質大豆たん白質及びその製法
EP2336763A1 (en) * 2002-02-14 2011-06-22 Ajinomoto Co., Inc. Method for analysis of compounds with amino group and analytical reagent thereof
JP4102581B2 (ja) * 2002-03-25 2008-06-18 日本電気株式会社 ペプチドのｃ末端アミノ酸配列解析方法
JP4257492B2 (ja) * 2002-11-29 2009-04-22 日本電気株式会社 ペプチドのｃ末端アミノ酸配列解析方法
JP3534191B1 (ja) * 2002-12-26 2004-06-07 日本電気株式会社 質量分析法を利用するペプチドｃ末端アミノ酸配列解析方法
US7422865B2 (en) * 2003-01-13 2008-09-09 Agilent Technologies, Inc. Method of identifying peptides in a proteomic sample

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002526778A (ja) * 1998-10-01 2002-08-20 ブラックス グループ リミテッド 開裂およびマススペクトル分析によりポリペプチドを特徴付ける方法
JP2004191123A (ja) * 2002-12-10 2004-07-08 Nec Corp ペプチドのｃ末端アミノ酸配列解析方法
WO2005078447A1 (ja) 2004-02-17 2005-08-25 Nec Corporation ペプチドのｃ末端アミノ酸配列の分析方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RIED W.: "Peptide, IV Glutathion-Synthese nach der Pyrazolid-methode", ANNALEN DER CHEMIE, vol. 644, 1961, pages 141 - 145, XP003016760 *
See also references of EP1983346A4
TAKAMOTO, K. ET AL., EUR. J. BIOCHEM., vol. 228, 1995, pages 362 - 372
TSUGITA, A. ET AL., EUR. J. EIOCHEM., vol. 206, 1992, pages 691 - 696
TSUGITA,· A. ET AL., CHEM. LETT., 1992, pages 235 - 238

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102485749A (zh) * 2009-10-09 2012-06-06 中牧实业股份有限公司 猪瘟合成肽疫苗及其制备方法
CN102485749B (zh) * 2009-10-09 2014-06-04 中牧实业股份有限公司 猪瘟合成肽疫苗及其制备方法
JP2018109525A (ja) * 2016-12-28 2018-07-12 株式会社島津製作所 分析用試料の調製方法および分析方法
US10877043B2 (en) 2016-12-28 2020-12-29 Shimadzu Corporation Method of preparing sample for analysis and analysis method

Also Published As

Publication number Publication date
EP1983346A1 (en) 2008-10-22
JPWO2007091627A1 (ja) 2009-07-02
JP4771296B2 (ja) 2011-09-14
CN101379402A (zh) 2009-03-04
US20100167326A1 (en) 2010-07-01
EP1983346A4 (en) 2010-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Freitas et al. Application of mass spectrometry to the identification and quantification of histone post‐translational modifications
Steen et al. A new derivatization strategy for the analysis of phosphopeptides by precursor ion scanning in positive ion mode
Pedrero Zayas et al. Hemoglobin as a major binding protein for methylmercury in white-sided dolphin liver
Rauniyar et al. Characterization of 4-hydroxy-2-nonenal-modified peptides by liquid chromatography− tandem mass spectrometry using data-dependent acquisition: Neutral loss-driven MS3 versus neutral loss-driven electron capture dissociation
JP4771296B2 (ja) ペプチドのｃ末端のペプチド結合を切断する方法、及びペプチドのｃ末端アミノ酸配列の決定方法
Dreiocker et al. Collision‐induced dissociative chemical cross‐linking reagent for protein structure characterization: applied Edman chemistry in the gas phase
JP4604345B2 (ja) タンパク質のｎ末端のアミノ酸配列決定方法
JP3534191B1 (ja) 質量分析法を利用するペプチドｃ末端アミノ酸配列解析方法
Glocker et al. Characterization of Surface Topology and Binding Area in Complexes of the Elongation Factor Proteins EF‐Ts and EF‐Tu⋅ GDP from Thermus thermophilus: A Study by Protein Chemical Modification and Mass Spectrometry
Kim et al. C-terminal de novo sequencing of peptides using oxazolone-based derivatization with bromine signature
JP4102581B2 (ja) ペプチドのｃ末端アミノ酸配列解析方法
Wei et al. Tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 excises the 3′-DNA-ALKBH1 cross-link and its application for 3′-DNA-ALKBH1 cross-link characterization by LC-MS/MS
Yoneda et al. Binding position analysis of target proteins with the use of amidopyrene probes as LA-LDI enhancing tags
JP4289355B2 (ja) ペプチドのｃ末端アミノ酸配列の分析方法
EP3929587A1 (en) Crosslinking reagent for bioconjugation for use in crosslinking proteomics, in particular crosslinking mass spectrometry analysis
JP4086642B2 (ja) ペプチドのｃ末端アミノ酸配列解析方法
US7670841B2 (en) Method of analyzing C-terminal amino acid sequence of peptide
Li et al. Chemoenzymatic enrichment of phosphotyrosine-containing peptides
Ozdanovac et al. N-Terminal Derivatization of Peptides with 4'-Formylbenzo-18-crown-6-ether for Protein and Species Identification
WO2014200346A1 (en) Quantification of alpha b-crystallin
JP2008232915A (ja) Ｃ末端逐次分解反応に由来する塩形成回避法
Šulc et al. Structural analysis of binding of a diamantoid substrate to cytochrome P450 2B4: possible role of Arg 133 in modulation of function and activity of this enzyme
Grassoa et al. MALDI, AP/MALDI and ESI techniques for the MS detection of amyloid-peptides
JP2002372517A (ja) 質量分析法によるタンパク質の構造解析方法
JPWO2005049636A1 (ja) タンパク質の分析方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007708225

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2007557882

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200780004947.8

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12278878

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE