CN107513101B

CN107513101B - 猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒

Info

Publication number: CN107513101B
Application number: CN201710843271.7A
Authority: CN
Inventors: 张蕾; 董春娜; 肖进; 李静; 巴利民; 张欣; 王楠; 宋芳; 栗利芳; 张艳宾; 王振豹; 齐鹏; 赵洪涛; 张君
Original assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Current assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2037-09-18
Also published as: CN107513101A

Abstract

本发明公开了一种猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。它包括口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽及序列4所示的多肽。本试剂盒使用化学合成非结构蛋白抗原肽包被反应板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在口蹄疫病毒感染。本发明试剂盒特异性好、敏感、高效，具有良好的市场前景。

Description

猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，特别是猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的一种烈性传染病。口蹄疫的致死率很低，但是感染率很高。发病的主要症状为：口腔粘膜、舌、唇、鼻镜、蹄叉、乳头等部位发生水疱，破溃形成烂斑，病畜蹄痛卧地、严重者蹄壳边缘溃裂或脱壳。不同动物的症状稍有不同，妊娠母牛可能流产，而后导致繁殖力降低；猪则以破蹄为最主要症状；山羊和绵羊的症状通常比牛温和。口蹄疫传染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊等牲畜常导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，严重危害畜牧业的发展和畜产品的生产供应。由于其在世界范围内广泛分布，能感染70多种家养和野生动物，且发病率极高(约为100％)，严重影响畜牧业生产和国际贸易，因而受到各国的高度重视，被世界动物卫生组织(Office International DesEpizooties,OIE)列为法定报告动物疫病。

口蹄疫病毒(FMDV)是小RNA病毒科(picornavi-ridae)，口蹄疫病毒属(aphthovirus)的成员，由一条长约8500个核苷酸的单股、正链RNA和衣壳蛋白组成。病毒衣壳由4种结构蛋白即VP1、VP2、VP3和VP4各60个拷贝组成，其中VP1和VP3是主要免疫性抗原。口蹄疫病毒(FMDV)具有多型性、易变性等特点，具有7个血清型，分别为A、O、C、SATI、SATII、SATIII及AsiaI型，每个型又可分为若干个亚型，目前发现的亚型有70多个。由于不断发生抗原漂移，因此并不能严格区分亚型。血清型间几乎无交叉免疫反应，同一型内部不同毒株之间抗原性也有一定变化，这就给口蹄疫的诊断和防治工作带来很大难度。

口蹄疫病毒基因所编码产生的非结构蛋白有L、2A、2BC、3AB、3ABC、3D等，其中L蛋白的免疫原性比其他非结构蛋白弱，感染动物不一定能产生抗体，即使产生抗体，维持的时间也比较短。2C抗体由于消退的比3ABC快，且免疫牛中可检测到2C抗体，因此也不能作为检测指标。3D又称病毒感染相关抗原，没有型特异性，检测其抗体水平是评价动物是否接触过抗原的重要指标，也是国际贸易必检项目。目前认为仅检测3D抗体不能区分感染动物与免疫动物，因为疫苗中往往含有痕量的非结构抗原，经过多次免疫后，在免疫动物体内也能检测到3D抗体。2B、3A、3B和3C蛋白免疫原性较强，含有优势B细胞表位，可以作为区别自然感染与疫苗免疫的重要指标。有研究者指出，若血清中同时存在至少2种非结构蛋白抗体(3D除外)就可以断定该动物感染过FMDV，但血清中不存在一种或所有的非结构蛋白抗体，并不能肯定该动物从来没有感染过FMDV。

口蹄疫的防控主要是疫苗免疫及屠宰感染和可疑畜群。我国对口蹄疫施行强制性免疫，每年春秋进行一次集中免疫，两次之间对新补栏家畜及时进行补免。在实际生产中如何鉴别诊断易感动物是进行了疫苗免疫还是感染了口蹄疫病毒对口蹄疫防疫体系的建立、检验检疫都是十分重要的。用于口蹄疫诊断的血清学技术有补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒中和试验(VNT)、间接血凝试验(IHA)等，其中ELISA是最常用的方法。ELISA的基本原理是将抗原或者抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，通过底物显色后用肉眼或者分光光度计判定结果。ELISA方法具有特异、敏感、快速、简便、可靠性好等特点，且能自动化操作，并能迅速的检测大量样品，在FMD的诊断中日益受到人们的重视，现已成为国际上检测易感动物猪、牛等是否疫苗免疫或感染病毒的常规方法之一。

间接ELISA方法过程简单易于操作，并且有较高的敏感性。1997年意大利的De等建立了基于FMDV非结构蛋白的间接捕获ELISA技术，这种ELISA用单抗来捕获在大肠杆菌中表达的FMDV非结构蛋白，用此ELISA检测了大量疫苗免疫动物和感染动物，所有经过攻毒试验的动物其ELISA试验的OD值都大于0.2，超过99％的经过疫苗免疫动物ELISA结果为阴性(即小于0.2)。以上数据显示该方法敏感性很高。后经特异性试验证实，该方法的特异性超过99.5％。此方法可在免疫后8天测出非结构蛋白抗体，1年后仍能测出此抗体。2003年朱彩珠等建立了一种用于区分FMDV感染动物和疫苗免疫动物的间接ELISA，这种ELISA利用大肠杆菌表达的FMDV3ABC非结构蛋白作为抗原。试验结果证明，该ELISA方法的准确性比病毒感染相关抗原琼脂糖凝胶免疫扩散试验(VIAAAGID)高。

口蹄疫是关系到国家经济安全的重大动物疫病，相关关键技术应该牢牢掌握在自己手里。一旦我们拥有自主知识产权，将利于保障我国的经济安全。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的用于口蹄疫易感动物猪疫苗免疫与病毒感染的鉴别诊断的酶联免疫检测试剂盒。

基于此，本发明提供猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽，其为序列表中序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽或序列4所示的多肽。

进一步的，本发明还提供一种猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽组合物，该多肽组合物为序列表中序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽和序列4所示的多肽中的一种或两种以上任意组合。

当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽和序列4所示的多肽中的两种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1；当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽和序列4所示的多肽中的三种时，任意三种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1；当所述多肽组合物由序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽和序列4所示的多肽组成时，它们的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1：1。

更进一步的，本发明提供的猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括猪口蹄疫病毒非结构蛋白2B、3A、3B、3C抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述猪口蹄疫病毒非结构蛋白2B、3A、3B、3C抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽及序列4所示的多肽。

所涉及的包被抗原采用固相化学合成的方法生产，包被抗原含有猪口蹄疫病毒非结构蛋白的主要抗原位点多肽，可与口蹄疫病毒感染后产生的非结构蛋白抗体特异结合。

所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶；所述酶标记抗抗体为酶标记兔抗猪IgG多克隆抗体，采用商品化酶标记兔抗猪IgG多克隆抗体(购自sigma公司，货号A5670)作为原液进行1:30000稀释后制得的。

所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述猪口蹄疫病毒非结构蛋白2B、3A、3B、3C抗原表位多肽为化学人工合成得到。

本发明通过以下方式实现：采用猪口蹄疫病毒非结构蛋白2B、3A、3B、3C的人工化学合成多肽包被的可拆96孔聚苯乙烯酶联反应板。同时，试剂盒中含有以辣根过氧化物酶标记的兔抗猪的IgG多克隆抗体酶结合物，阴性对照血清，阳性对照血清，样品稀释液，TMB底物溶液，20倍浓缩洗涤液和终止液等组分。以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测样品中的非结构蛋白抗体。

所涉及的酶联反应板的最佳制备条件是：包被时将多肽抗原溶于pH2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔200ng抗原，在2～8℃下放置过夜(8～12h)使多肽抗原与酶联反应板充分结合。然后按照300μl/孔加入封闭液(含1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)、0.5％酪蛋白(g/ml)pH 7.4的PBS缓冲液)，37℃封闭处理2～3h，洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后密封2～8℃保存。

所述试剂盒中含有显色液和终止液；显色液由底物液A液和底物液B液组成，所述底物液A液为含0.06％(g/ml)过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B液为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液；使用时两者以1：1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为健康猪血清用样品稀释液进行1:20倍稀释制得的；所述阳性对照血清为用口蹄疫O型乳鼠毒(O/Mya98/XJ/2010株)对动物进行攻毒后制备的血清；

所涉及的阴性对照血清具体是用健康猪隔离观察7日后，前腔静脉无菌采集血液，离心并分离血清，56℃灭活30分钟，检验合格后用样品稀释液进行1:20倍稀释，无菌定量分装(1.5ml/管)，作为试剂盒的阴性对照血清。

所涉及的阳性对照血清根据阳性储备血清的效价用样品稀释液进行适当的稀释后制备而成。阳性储备血清为用口蹄疫O型乳鼠毒(O/Mya98/XJ/2010株)对动物进行攻毒，攻毒后35日对血清抗体水平进行监测，当血清抗体水平满足OD_450nm值≥2.0时，前腔静脉无菌采集血液，离心并分离血清，56℃灭活30分钟，检验合格后作为阳性储备血清。取阳性储备血清用样品稀释液进行适当稀释(使其满足用ELISA方法检测OD_450nm值在0.9～2.0之间)，作为试剂盒的阳性对照血清。

所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.5％(g/ml)酪蛋白的pH 7.4的PBS缓冲液(过滤径为0.2μm滤膜)；所述20倍浓缩洗涤液为含有0.5％(ml/ml)Tween-20的pH 7.4的PBS缓冲液(经过滤径为0.2μm的滤膜除菌)。

本发明试剂盒的检测程序为：

1.平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30分钟后使用，液体试剂用前混匀。

2.洗涤液配制使用前，将20倍浓缩洗涤液恢复至室温，如果有沉淀，37℃水浴使其溶解，然后用去离子水稀释20倍备用。

3.样品稀释在血清稀释板中按1:20的比例稀释待检血清，阴、阳性对照血清已稀释，可直接使用。

4.加样：取抗原包被板，将稀释好的待检血清、阴性对照和阳性对照加入到抗原包被板中，100μl/孔。每份待检血清设1孔，阴性对照和阳性对照各设2孔，加样过程时间跨度应尽量短。

5.温育：震荡混匀，置37℃温箱内孵育30分钟。

6.洗板：弃去反应液，各孔加入稀释后的洗涤液300μl，浸泡15秒，甩弃洗液，连续洗板5次后拍干。

7.加酶：各孔加100μl辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。

8.温育：置37℃温箱内孵育30分钟。

9.洗板：弃去反应液，各孔加入稀释后的洗涤液300μl，浸泡15秒，甩弃洗涤液，连续洗板5次后拍干。

10.显色：各孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱内避光反应15分钟。

11.终止：各孔加入显色终止液各50μl，振荡混匀终止反应。

12.测定：用空白对照孔调零后测定各孔450nm的OD值。

本发明试剂盒的检测结果的判定：

1.阴性对照OD平均值应该≤0.15，否则无效。

2.阳性对照每个检测值应该在0.9到2.0之间，否则无效。

3.临界值的计算：临界值＝0.17×阳性对照平均OD值。

4.结果判定：样本测定OD值≥临界值者判为阳性；样本测定OD值<临界值者判为阴性。

本发明的上述试剂盒，可以用于检测所述口蹄疫病毒病，具体可以为猪口蹄疫病毒引起的猪口蹄疫病毒病。

本发明的积极效果在于：本发明采用生物信息学方法对非结构蛋白的抗原表位进行精确分析，从2B、3A、3B、3C蛋白上的主要抗原表位上筛选出适合ELISA检测用的肽段，具有灵敏性高、特异性强的优点。

同时，采用先进的固相合成肽技术合成多肽抗原用于包被酶标反应板的制备。

另外，由于试剂盒中使用的包被抗原是化学合成多肽，不含杂蛋白，纯度高，进一步提高检测口蹄疫非结构蛋白抗体的效率，以判断被检动物是否感染口蹄疫病毒。

总之，本试剂盒采用化学合成2B、3A、3B、3C抗原肽包被反应板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地鉴别口蹄疫易感动物猪是感染了病毒还是接受了疫苗免疫。本发明试剂盒特异性好、敏感、高效，具有良好的市场前景。实验结果表明，试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高。可以有效地检测口蹄疫病毒感染后产生的非结构蛋白抗体，以判断被检动物是否感染口蹄疫病毒。能满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。

本发明所涉及的猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒用于口蹄疫易感动物猪疫苗免疫与病毒感染的鉴别诊断，有利于减少我国口蹄疫爆发所带来的损失，也有利于我国口蹄疫防控体系的建立。

附图说明

图1为本发明多肽间接ELISA方法效果检测结果。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包被抗原制备

本发明采用生物信息学方法对非结构蛋白的抗原表位进行精确分析，从2B、3A、3B、3C蛋白上的主要抗原表位上筛选出适合ELISA检测用的肽段，即口蹄疫病毒非结构蛋白2B、3A、3B、3C抗原表位多肽，其序列如序列表中序列1、序列2、序列3及序列4所示。将该多肽组合物作为本发明试剂盒的包被原制备猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。

本发明的包被抗原可使用Applied Biosystem全自动多肽合成仪(型号433A)制备。运用Merrifield固相合成法，采用的是Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，9-芴甲氧羰基)修饰的氨基酸，使用Rink Amide MBHA树脂做为固相载体。生产过程包括多肽抗原固相合成、多肽裂解和鉴定、抗原纯化、冷冻干燥以及保存五部分。以下分别进行说明：

一、包被抗原固相合成

1、合成试剂的准备

合成包被抗原氨基酸序列如下：

序列1：LEILDSTFVVKKISDSLSSLFHVPAPVFSFGAPTL

序列2：FEIVA LCLTLLANIVIMI

序列3：ERQKPLKVKAKAPVVKEGPYEGPVKKPVALKVKAKNLI

序列4：VGRLIFSGEALTYKDIVVCMD

依据包被抗原序列以及合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸(购自NOVA公司)，加入至相应的氨基酸小瓶中。同样按要求合成规模称取树脂5g，放入反应腔，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称，批号，反应腔的TARE及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制适量的合成试剂包括包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、已酰咪唑(AIM)、哌啶(PIP)、甲醇等放置到相对应的试剂瓶中。

2、合成仪状态的检测

检查多肽合成仪器是否正常运行。开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查氮气是否充足，系统表压是否正常。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。发送Flow Rate1-18到合成仪，选择MainMenu—Module Test—按Prer或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A)—按Start—按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求。

3、包被抗原合成开始

在433A合成仪的程序中将要合成的氨基酸序列发送Std Fmoc 1.0Sol DIC90到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查Chemistry；Sequence是否为所存名字；设定Cycles；保存。最后发送到合成仪上。

Main Menu—Cycle Monitor—begin，开始运行。

4、包被抗原合成进行

如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照给定的顺序，依次不断地重复如下合成步骤：

(1)脱保护反应：将上述氨基树脂置于体积百分比为15％～30％的六氢吡啶的NMP溶液中，在20～28℃条件下反应25～40分钟脱除氨基树脂上的Fmoc保护基团；

(2)洗涤：氮气吹干，NMP洗涤氨基树脂；

(3)缩合反应：加入HOBT、DIC与Fmoc保护的氨基酸在20～28℃条件下反应0.5-2.5小时；

(4)洗涤：氮气吹干，NMP洗涤氨基树脂；

(5)封闭反应：加入重量体积百分比为1.5％～4％的乙酰咪唑的NMP溶液，在20～28℃条件下反应20～40分钟。

5、包被抗原合成结束

包被抗原合成结束后合成仪将自动停止，并且肽树脂(肽现在还连接在树脂上)基本洗涤干净。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100％甲醇洗涤肽树脂3次后，在通风橱内吹干，然后将多肽树酯全部转移至棕色的聚乙烯瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。

二、包被抗原的裂解及鉴定

1、多肽抗原的裂解

按照体积比例(三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TIS)/苯酚/水＝85/8/6/1)配制裂解液，然后从冰箱内取出合成的多肽树脂，放入圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶内加入配制好的裂解液和磁搅拌子，然后稳定地放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1h直至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30～120分钟除去粗产品中的TFA。接着使用乙醚收集、沉淀多肽，然后用二甲基甲酰胺(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂芯漏斗过滤出来，即得到多肽抗原。

2、包被抗原的鉴定

多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞试时间质谱法(MODAL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析，用常见的氨基酸分析来鉴定所合成的肽。

3、包被抗原纯化

将环化后的多肽抗原使用循环式切向过滤膜包进行超滤(用PALL公司生产的Tangential Flow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵)，多肽抗原作为大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm滤膜除菌，将最后所得溶液分装到无菌塑料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件，分装后，储存于-20℃或-40℃备用。

4、包被抗原冷冻干燥

为了便于长期保存和运输，需要将包被抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冻好的包被抗原放置于Labconco的冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的包被抗原。包装后贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。

实施例2、猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的组成

一、联合B细胞表位的评价

为了提高检测方法的阳性检出率，分别以筛选出的来源于非结构蛋白2B、3A、3B、3C优势B细胞表位单条肽序列1(Seq1)、序列2(Seq2)、序列3(Seq3)、序列4(Seq4)以及混合4条肽的混合肽(MIX)联合起来作为包被抗原(1.0μg/ml/肽)，按照常规间接ELISA方法分别对27份猪口蹄疫O型病毒感染血清进行检测。结果显示(图1)，序列1、序列2、序列3、序列4和混合肽对27份感染血清的阳性检出率分别为81.5％、88.9％、92.3％、85.2％和100％，结果表明，联合B细胞表位的混合肽能够将感染血清全部检出，阳性检出率显著高于单条肽的阳性检出率，因此将混合4条肽的混合肽作为猪口蹄疫病毒非结构蛋白ELISA抗体检测试剂盒的包被抗原。

二、猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的制备

猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包括：

(1)包被有猪口蹄疫病毒非结构蛋白2B、3A、3B、3C抗原表位化学合成多肽的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板，96孔/块，2块/盒。

(2)阳性对照血清：是用口蹄疫O型乳鼠毒(O/Mya98/XJ/2010株)对动物进行攻毒后制备的血清，用样品稀释液进行适当稀释(使其满足用ELISA方法检测OD_450nm值在0.9～2.0之间)，作为试剂盒的阳性对照血清，1管(1.5ml)。

(3)阴性对照血清：是健康猪血清用样品稀释液进行1:20倍稀释制得的作为试剂盒阴性对照血清，1管(1.5ml)。

(4)辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体，2瓶(各12ml)。

(5)样品稀释液：含有0.5％(g/ml)酪蛋白的pH值＝7.4的PBS缓冲液，过0.2μm滤膜，1瓶(24ml)。

(6)底物液A：为含0.06％(g/ml)过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓液，1瓶(12ml)。

(7)底物液B：为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液，1瓶(12ml)。

(8)20倍浓缩洗涤液：含有0.5％(ml/ml)Tween-20pH值＝7.4的PBS缓冲液，，后经过0.2μm滤膜除菌，2瓶(各50ml)。

(9)显色终止液：2mol/L的硫酸溶液，1瓶(12ml)。

(10)血清稀释板：为可拆聚苯乙烯酶联反应板，96孔/块，2块/盒。

其中，包被有合成肽包被抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板的制备方法为：将实施例1制备的多肽抗原溶于pH2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔200ng抗原(其中序列表中序列1所示的多肽为50ng，序列表中序列2所示的多肽为50ng，序列表中序列3所示的多肽为50ng，序列表中序4所示的多肽为50ng)，在2～8℃下放置过夜使多肽抗原与酶联反应板充分结合。然后按照300μl/孔加入封闭液(含1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)、0.5％酪蛋白(g/ml)pH 7.4的PBS缓冲液)，37℃封闭2～3h，用洗涤缓冲液(20倍浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液)洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后2～8℃密封保存。

实施例3、猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的检测方法

1.1样品制备取动物全血，待血液凝固后，以3500r/min离心10分钟，收集上清，也可采集血液，待凝固后自然析出血清，要求血清清亮，无溶血。

1.2洗涤液配制使用前，将20倍浓缩洗涤液恢复至室温，如果有沉淀，37℃水浴使其溶解，然后用去离子水稀释20倍备用。

1.3样品稀释在血清稀释板中按1:20的比例稀释待检血清，阴、阳性对照血清已稀释，可直接使用。

1.4操作步骤

1.4.1加样取抗原包被板，将稀释好的待检血清、阴性对照和阳性对照加入到抗原包被板中，100μl/孔。每份待检血清设1孔，阴性对照和阳性对照各设2孔，加样过程时间跨度应尽量短。

1.4.2温育震荡混匀(勿溢出)，置37℃温箱内孵育30分钟。

1.4.3洗板弃去反应液，各孔加入洗涤液300μl，浸泡15秒，甩弃洗涤液，连续洗板5次后拍干。

1.4.4加酶各孔加入兔抗猪酶标二抗100μl。

1.4.5温育置37℃温箱内孵育30分钟。

1.4.6洗板弃去反应液，各孔加入洗涤液300μl，浸泡15秒，甩弃洗涤液，连续洗板5次后拍干。

1.4.7显色各孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱内避光反应15分钟。

1.4.8终止各孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应，15分钟内测定结果。

2判定在酶标仪上测各孔OD_450nm值。

2.1试验成立的条件是：阳性对照孔OD_450nm值应介于0.9～2.0之间，阴性对照孔OD_450nm值均应≤0.15；

2.2临界值(Cut-off值)＝阳性对照孔OD_450nm均值×0.17；

2.3待检血清测定OD_450nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD_450nm值<临界值者判为阴性。

2.4本试剂盒与猪口蹄疫相应结构蛋白ELISA抗体检测试剂盒配套使用时，按下列标准进行最终判定。

实施例4、猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒敏感性试验

1、敏感性试验

使用实施例2制备的三批猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒(批次号ZMNS701、ZMNS702、ZMNS703)，依照实施例3中猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法，猪口蹄疫O型病毒感染血清90份、猪口蹄疫A型病毒感染猪血清89份进行检测，对试剂盒的敏感性进行评价。

对90份猪口蹄疫O型病毒感染血清的检测结果显示，本发明的试剂盒阳性检出率是98.9％。对89份猪口蹄疫A型病毒感染血清的检测结果显示，本发明的试剂盒阳性检出率均为100.0％。综上所述，本发明的试剂盒对90份猪口蹄疫O型病毒感染血清和89份猪口蹄疫A型病毒感染血清检测的敏感性为99.4％。

2、最低检测限量试验

随机抽取10份血清(包括4份强阳性、4份弱阳性和2份阴性血清)和1份敏感性质控血清倍比稀释，用实验室试制的3批试剂盒和瑞士Prionics公司口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒同时进行检测，检测对比两者的最低检测限量，结果显示本试剂盒可以检测到1:320倍稀释的阳性血清，Prionics公司试剂盒能够检测到1:160倍稀释的阳性血清，因此本试剂盒的敏感性更高。

实施例5、猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的特异性试验

使用实施例4中的三批试剂盒依照实施例3中所述的猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法检测猪瘟、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征等相关病原的阳性血清，结果均呈阴性，说明感染以上各病的猪血清对本试剂盒不会出现交叉反应。对300份健康猪血清的检测结果显示，3批试剂盒的特异性均为99.0％。对90份猪口蹄疫O型疫苗免疫血清的检测结果显示的检测结果显示，3批试剂盒的特异性均为97.8％。以上结果证明该试剂盒的特异性较高。

实施例6、猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒保存期试验

猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的实际保存期试验操作如下：

本研究用实验室试制的3批猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，每批随机抽取12个试剂盒，置2～8℃保存，分别于0、3、6、9、12和15个月取出进行检测。结果表明：试剂盒在2～8℃保存0、3、6、9、12和15个月后试剂盒性状和无菌检验均符合试剂盒检验标准；试剂盒敏感性检验符合标准；特异性检测18份特异性质控血清均为阴性。考虑到实际应用中的不确定因素，为保证试剂盒能够达到最佳使用效果，因而将试剂盒的保存期暂定为2～8℃保存12个月。

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120> 猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒

<130> WHOI170065

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

Leu Glu Ile Leu Asp Ser Thr Phe Val Val Lys Lys Ile Ser Asp Ser

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Phe His Val Pro Ala Pro Val Phe Ser Phe Gly Ala

20 25 30

Pro Thr Leu

35

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Phe Glu Ile Val Ala Leu Cys Leu Thr Leu Leu Ala Asn Ile Val Ile

1 5 10 15

Met Ile

<210> 3

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys

1 5 10 15

Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val

20 25 30

Lys Ala Lys Asn Leu Ile

35

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

Val Gly Arg Leu Ile Phe Ser Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys Asp Ile

1 5 10 15

Val Val Cys Met Asp

20

Claims

1.一种猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽组合物，由序列表中序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽和序列4所示的多肽组成。

2.根据权利要求1所述的猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物中序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽和序列4所示的多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)。

3.根据权利要求1所述的猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物中序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽和序列4所示的多肽的质量比为1：1：1：1。

4.一种猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽为权利要求1-3中任意一项所述的猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽组合物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶；所述酶标记抗抗体为酶标记兔抗猪IgG多克隆抗体。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽为化学人工合成得到。

7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽组合物包被的酶联反应板的获得方法是将所述猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽溶于100μl的pH 2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔200ng猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽组合物，2～8℃下放置8～12小时使猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位多肽组合物与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有0.01g/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后2～8℃密封保存。

8.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有显色液和终止液；显色液由底物液A液和底物液B液组成，所述底物液A液为含0.0006g/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B液为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

9.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为健康猪血清用样品稀释液进行1:20倍稀释制得的；所述阳性对照血清为用口蹄疫O型乳鼠毒对动物进行攻毒后制备的血清用样品稀释液进行适当稀释后的制得的；和/或，所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.005g/ml酪蛋白的pH7.4的PBS缓冲液；所述20倍浓缩洗涤液为0.01mol/L，pH 7.4，含有体积百分含量为0.5％的Tween-20的磷酸盐缓冲液。

10.权利要求1-3中任意一项所述的多肽组合物在制备检测是否感染动物口蹄疫病毒病的试剂盒中的应用；其中，动物口蹄疫病毒病为猪口蹄疫病毒病。