CN101116749A - 一种猪瘟复制子载体疫苗、其制备方法及应用 - Google Patents

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李娜
赵建军
罗玉子
涂长春
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Abstract

本发明公开了一种新的猪瘟复制子载体疫苗、其制备方法及应用。该猪瘟复制子载体疫苗由载体pSFV1CS和猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因组成。本发明将猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因插入载体pSFV1CS中，得到猪瘟复制子载体疫苗。该复制子载体疫苗可直接转染细胞，能高效表达猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2。动物免疫攻毒试验表明，该复制子载体疫苗能有效诱导接种猪产生猪瘟特异性抗体，并能抵抗致死性猪瘟强毒的攻击，说明该复制子载体疫苗可用于猪瘟的免疫预防。

Description

一种猪瘟复制子载体疫苗、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种疫苗，尤其涉及一种猪瘟复制子载体疫苗、其制备方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术
猪瘟(classical swine fever，CSF)是猪的一种烈性传染病，被国际动物卫生组织列为A类传染病，主要流行亚洲、欧洲和南美洲，对世界养猪业威胁极大。猪瘟的病原为猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)，CSFV的分类地位如下：
病毒界(Vira)
黄病毒科(Flaviviridae)
瘟病毒属(Pestivirus)
猪瘟病毒(classical swine fever virus)
瘟病毒属还有牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和绵羊边界病病毒(BDV)等成员。CSFV为单股正链RNA病毒，其基因组约为12.5kb，含有唯一的开放阅读框架，编码一个大的多聚蛋白，经蛋白酶水解加工后，产生4种结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和7种非结构蛋白(Npro、p7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[J Virol.1999，73(9)：7787-94]。猪只感染CSFV后，可产生针对E2、Erns和Npro蛋白的抗体。E2蛋白是一种囊膜糖蛋白，可诱导猪产生中和抗体，能对猪瘟强毒攻击提供完全的免疫保护[J Virol.1993，67(9)：5435-42]；Erns是可分泌蛋白，也能诱生中和抗体，可对强毒攻击提供部分保护[J Virol.1995，69(10)：6479-86]。
通常采用疫苗接种来预防猪瘟，著名的中国猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)、日本GPE-株和法国的Thiverval株等减毒活疫苗至今仍在一些国家和地区应用。然而用这些常规疫苗接种猪后，无法通过血清学方法将疫苗接种猪与野毒感染猪相区分，因此，近年来，国内外有许多学者致力于研制“标记疫苗”(marker vaccines，或DIVAvaccine)[J Biotechnol.1999，73(2-3)：195-205]。迄今问世的各种猪瘟基因工程标记疫苗基本上是以E2蛋白为基础：如用重组杆状病毒生产的猪瘟病毒E2亚单位疫苗[JVirol.1993，67(9)：5435-42；Vet Microbiol.1999，66(2)：101-14]；表达猪瘟病毒E2的重组伪狂犬病病毒[J Virol.1991，65(5)：2761-5；J Gen Virol.1997，78(12)：3311-5]、重组腺病毒[Vaccine.2000，18(11-12)：1040-50]或重组猪痘病毒[J Virol Methods.2001，93(1-2)：49-56]等病毒活载体疫苗；基于E2基因的DNA疫苗[Vaccine.2000，18(18)：1932-8；Vaccine.2001，19(17-19)：2480-4]；缺失Erns基因的猪瘟cDNA克隆衍生病毒[J Virol.2000，74(7)：2973-80；Vaccine.2002，20(11-12)：1544-56]和用BVDV Erns基因置换CSFV相应区域的嵌合猪瘟病毒[Vaccine.2000，9(4-5)：447-59；Vaccine.2001，9(11-12)：1467-76]等反向遗传操作疫苗。这些疫苗的共同特征是，以E2蛋白作为保护性抗原，不含有或不表达Erns蛋白，因此可用基于Erns抗原的Erns-ELISA诊断方法对疫苗接种猪和野毒感染猪进行鉴别诊断[Vet Microbiol.2000，73(2-3)：209-19]。不过，由于安全性(如反向遗传操作疫苗或载体疫苗)或免疫效力(如亚单位疫苗和DNA疫苗)等方面的原因这些新型疫苗并未获得广泛临床应用。
基于传统载体的DNA疫苗存在很多缺点：外源基因表达水平低，诱导抗体产生慢，接种剂量大，特别令人担心的是，常规DNA疫苗有整合和转化染色体的潜在危险[Ann N YAcad Sci.1995，772：30-9]。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的猪瘟复制子载体疫苗。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：
一种猪瘟复制子载体疫苗，该复制子载体疫苗由载体pSFV1CS和猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因(SEQ ID NO：1)组成。将本发明复制子载体疫苗(重组质粒pSFV1CS-E2)按照常规方法转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109得到重组菌株pSFV1CS-E2/JM109，其微生物保藏号是：CGMCC No.1771；其分类命名是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；保藏时间是：2006年08月01号；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
pSFV1是衍生于SFV复制子的真核表达载体，其特点是病毒传代速度快，宿主细胞谱广，RNA复制和表达水平高，可用于表达多种外源蛋白。通过以Semliki Forest病毒(SFV)复制子衍生的载体pSFV1为基础，对其进行了改造，插入CMV立即早期启动子和SV40PolyA信号，构建得到复制子载体pSFV1CS。该复制子载体中，启动子并不直接指导外源基因的表达，而是控制具有自主复制能力的甲病毒复制子(自主复制RNA)的表达，甲病毒RNA可翻译产生病毒复制酶复合物，进而介导插入的外源基因在细胞浆内大量转录复制，使得外源基因编码的mRNA和蛋白获得高效表达，克服，原载体需体外转录制备RNA的弊端，外源基因插入载体后，可直接转染细胞并表达外源蛋白，应用起来更加方便，具有安全、操作方便、表达效率高等优点。
本发明将猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因插入该载体中，得到重组质粒pSFV1CS-E2，该质粒可直接转染细胞，并能高效表达猪瘟病毒囊膜糖蛋白，诱导接种动物产生猪瘟特异性抗体。通过动物免疫接种试验表明，本发明重组质粒pSFV1CS-E2能诱导接种猪产生猪瘟特异性抗体，并能抵抗致死性猪瘟强毒的攻击，说明本发明重组质粒是一种有效的抗猪瘟DNA疫苗。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备本发明猪瘟复制子载体疫苗的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术途径来实现的：
一种制备本发明猪瘟复制子载体疫苗的方法，包括以下内容：
将猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因(SEQ ID NO：1)可操作的连接到载体pSFV1CS上，得到本发明重组质粒pSFV1CS-E2。
作为优选的一种技术方案如下：用BamHI和EcoRV将1.2kb的完整CSFV E2基因从pcDST(系将含有CSFV E2基因的BamHI/EcoRI片段插入真核表达质粒pcDNA3.1中构建而得的重组质粒)[中国病毒学，2000，15(3)：264-271]中切下，将其亚克隆于复制子载体pSFV1CS[中国生物工程杂志，2004，24(5)：69-72]的BamHI和SmaI位点之间，得到本发明的重组质粒pSFV1CS-E2。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种疫苗组合物，该疫苗组合物含有预防上有效量的本发明的猪瘟复制子载体疫苗和药学上可接受的载体。
本发明疫苗的免疫程序是，每头猪通过肌肉注射途径接种100μg本发明疫苗，间隔3周后，以同样剂量和同样途径再加强免疫一次。本发明疫苗适用于各种品种的断乳后猪只。
附图说明
图1pSFV1CS-E2质粒图谱。nsP，SFV非结构蛋白；SP6，SP6启动子；AmpR，氨苄青霉素抗性基因；ori，原核细胞复制原点；MCS，多克隆位点；PCMV，CMV立即早期启动子；SV40 PolyA，SV40早期RNA聚腺苷酸化信号；E2为CSFV E2基因，来自pcDST中的1.2kb BamHI-EcoRV片段(EcoRV位点位于pcDST中EcoRI位点的紧下游)；ΔEcoRV和ΔSmaI表示连接后消失了的EcoRV和SmaI。
图2用本发明猪瘟复制子载体疫苗pSFV1CS-E2免疫的猪攻毒后体温变化。
图3用本发明猪瘟复制载子体疫苗pSFV1CS-E2免疫猪产生的猪瘟抗体曲线。↑：加强免疫；
Figure A20061011130400061
强毒攻击。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例本发明重组质粒pSFV1CS-E2的构建
用BamHI和EcoRV将1.2kb的完整CSFV E2基因(SEQ ID NO：1)从pcDST(系将含有CSFV E2基因的BamHI/EcoRI片段插入真核表达质粒pcDNA3.1中构建而得的重组质粒)[中国病毒学，2000，15(3)：264-271]中切下，将其亚克隆于复制子载体pSFV1CS[中国生物工程杂志，2004，24(5)：69-72]的BamHI和SmaI位点之间，用SpeI酶切鉴定重组质粒(pSFV1CS载体上有2个SpeI位点和E2基因上有1个SpeI位点)，得到为pSFV1CS-E2(图1)，通过测序验证了插入的E2基因序列(SEQID NO：1)，其阅读框架与已发表的石门株E2基因序列(GenBank accession No.AF092448)一致。
试验例1本发明重组质粒pSFV1CS-E2转染BHK-21细胞试验
用纯化试剂盒WizardPureFection Plasmid DNA Purification System(Promega公司，美国)按厂家说明书纯化重组质粒pSFV1CS-E2，用脂质体转染试剂盒LipofectamineTM PLUS(Invitrogen公司，美国)按说明书将纯化的pSFV1CS-E2转染长至70-80％单层的BHK-21细胞(中国兽医药品监察所)，同时用pSFV1CS-EGFP[中国生物工程杂志，2004，24(5)：69-72]和pcDST[中国病毒学，2000，15(3)：264-271]转染BHK-21细胞，作为阳性对照，用空质粒pSFV1CS转染BHK-21细胞，作为阴性对照。用pSFV1CS-EGFP转染BHK-21单层细胞，12h后在荧光显微镜下可见亮绿色荧光，至36h发荧光细胞明显增多；转染后60h，pcDST转染的BHK21细胞和重组质粒pSFV1CS-E2转染的BHK21细胞经间接免疫荧光试验(IFA)检测，可见特异性亮绿色胞浆荧光，pSFV1CS转染细胞对照则未见特异性荧光。
试验例2本发明疫苗(重组质粒pSFV1CS-E2)的免疫效力试验
从无猪瘟病史的猪场选购10头40日龄健康仔猪，分成两组，每组5头，第一组每头猪通过股四头肌多点注射各接种100μg本发明重组质粒pSFV1CS-E2，第二组每头猪按同样途径各接种100μg pSFV1CS，共免疫两次，其间间隔3周，加强免疫后3周，所有猪用致死剂量的1ml猪瘟石门株血毒(中国兽医药品监察所)进行攻击。免疫后每周和攻毒后每隔一天采血分离血清，用阻断ELISA检测猪瘟中和抗体。
结果表明，本发明疫苗免疫组除部分猪有短暂(2天左右)体温升高外(图2)，无其它异常临床症状和病理变化，同居接触猪也没有异常临床表现和病理变化，而空载体pSFV1CS对照组中所有猪出现典型猪瘟临床症状(稽留高热、寒战、厌食、便秘、后躯乏力)和病理变化(扁桃体坏死、淋巴结出血和水肿、肾脏出血点、脾脏边缘梗死、回盲瓣扣状肿、膀胱出血点等)；ELISA检测结果表明，加强免疫后，本发明猪瘟疫苗免疫组所有猪的猪瘟抗体开始升高，持续到攻毒前，到攻毒后第4天抗体迅速升高，一直持续到攻毒后16天(图3)，而对照组从免疫后到攻毒后4天内未检出特异性抗体，仅在攻毒后第6天起，抗体才开始升高(图3)；RT-PCR检测结果表明，在攻毒后第二天从2头猪血液中检测到猪瘟病毒RNA，其余时间点均为检测到病毒RNA(表1)，攻毒后第2天直至试验结束，对照组所有猪均可检测到病毒RNA。
表1用本发明猪瘟复制子载体疫苗pSFV1CS-E2免疫的猪攻毒后血液中猪瘟病毒RNA检测结果
  疫苗   猪只编号   攻毒后天数
  0   2   4   6   8   5
pSFV1CS-E2pSFV1CS   12345678910   ----------   +-+--+++++   -----+++++   -----+/+++   -----+///+ 10
注：“+”代表：阳性；“-”代表：阴性；“/”代表：死亡。
冰冻组织切片免疫组化分析显示，除1头猪扁桃体隐窝可检测到少量猪瘟病毒抗原外，其余所有猪各组织均未检测猪瘟特异性抗原，而在pSFV1CS对照组所有猪的扁桃体隐窝可检测到大量猪瘟病毒抗原。
综合上述试验结果表明，本发明猪瘟复制子载体疫苗pSFV1CS-E2具有良好的保护效力，可作为猪瘟疫苗用于猪瘟的预防和免疫治疗。
序列表
<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120>一种猪瘟复制子载体疫苗、其制备方法及应用
<130>008
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1212
<212>DNA
<213>classical swinefever
<400>1
ggatccgcca ccatggtatt aagaggacag atcgtgcaag gtgtgatatg gctgctacta  60
gtaactgggg cacaaggccg gctagcctgc aaggaagatt acaggtacgc actatcgtca  120
accaatgaga tagggctact cggggccgga ggtctcacta ccacctggga agaatacagc  180
cacgatttgc aactgaatga cgggaccgtt aaggccattt gcgtggcagg ttcctttaaa  240
gtcacagcac ttaatgtggt cagtaggagg tatttggcat cattgcataa gggggcttta  300
ctcacttccg tgacattcga gctcctgttc gacgggacca acccatcaac cgaagaaatg  360
ggagatgact tcgggttcgg gctgtgcccg tttgatacga gtcctgttgt caagggaaag  420
tacaatacaa ccttgttgaa cggtagtgct ttctaccttg tctgcccaat agggtggacg  480
ggtgttatag agtgcacagc agtgagccca acaactctga gaacagaagt ggtaaagacc  540
ttcaggagag agaagccttt cccacacaga atggattgtg tgaccaccac agtggaaaat  600
gaagatctat tctactgtaa gttggggggc aactggacat gtgtgaaagg tgaaccagtg  660
gtctacacag gggggcaagt aaaacaatgc aaatggtgtg gcttcgactt caacgagcct  720
gacggactcc cacactaccc cataggtaag tgcattttgg caaatgagac aggttacaga  780
atagtagatt caacggactg taacagagat ggcgttgtaa tcagcgcaga ggggagtcat  840
gagtgcttga tcggcaacac aactgtcaag gtgcatgcat cagatgagag actgggccct  900
atgccatgca gacctaaaga gattgtctct agtgcaggac ctgtaaggaa aacttcctgt  960
acattcaact acgcaaaaac tttgaagaac aagtactatg agcccaggga cagctacttc    1020
cagcaatata tgctcaaggg cgagtatcag tactggtttg acctggacgt gacagaccgc    1080
cactcagatt acttcgcaga atttgttgtc ttggtggtgg tagcactgtt aggaggaaga    1140
tatgtcctgt ggctgatagt gacctacata gttctaacag aacaactcgc cgctggtcta    1200
cagtaggaat tc                                                        1212

Claims (7)

1.一种猪瘟复制子载体疫苗，该复制子载体疫苗由载体pSFV1CS和SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列组成。
2.含有权利要求1猪瘟复制子载体疫苗的宿主细胞。
3.按照权利要求2的宿主细胞，其特征是该宿主细胞的微生物保藏号是：CGMCC No.1771。
4.一种制备权利要求1猪瘟复制子载体疫苗的方法，包括以下内容：将猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因可操作地连接到载体pSFV1CS上，即得。
5.按照权利要求4的方法，其特征是：用限制性内切酶BamHI和EcoRV将1.2kb的完整CSFV E2基因从pcDST中切下，将其亚克隆于载体pSFV1CS的BamHI和SmaI位点之间，即得。
6.一种疫苗组合物，其特征是含有免疫上有效量的权利要求1猪瘟复制子载体疫苗和药学上可接受的载体。
7.权利要求1的猪瘟复制子载体疫苗在制备预防猪瘟药物中的用途。
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