CN116068175B - 一种基于e2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种基于e2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于E2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒及其应用，属于体外诊断产品技术领域。本发明提供的试剂盒包括猪瘟病毒管式化学发光抗体检测反应体系，其中包含的磁微粒混悬液中含有磁微粒偶联猪瘟病毒E2二聚体蛋白。与猪瘟病毒E2单聚体蛋白制备的试剂盒以及商品ELISA检测试剂盒相比，本发明所述试剂盒不仅能准确定量检测猪血清中猪瘟病毒的特异性抗体，并且具有自动化、高敏感性、高重复性检测特点，具有较高的市场竞争力。

Description

一种基于E2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试 剂盒及其应用
技术领域
本发明属于体外诊断产品技术领域，具体涉及一种基于E2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒及其应用。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine feverVirus，CSFV)引起的是一种危害全球养猪业的传染病。
现有检测猪瘟病毒抗体的技术方法有病毒中和实验，正向间接血凝、酶联免疫吸附(ELISA)、试纸条等，其中，中和实验需要进行活毒操作，实验条件苛刻，安全防护级别要求较高，临床应用较少；正向间接血凝检测方法敏感性低，试剂盒保存期短；试纸条虽然检测方便，但是不能定量；故 ELISA是目前使用最为广泛的检测方法，但其缺点在于耗时较长、不能准确定量检测、自动化困难。所以建立一种能准确定量、高敏感性、全自动化、快速检测猪瘟病毒抗体的方法很有必要。
化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)技术是将化学发光体系和免疫学方法结合起来的一种诊断技术，通过将免疫信号放大转化为化学发光信号，检测发光强度从而检测相应物质的含量。第一代的 CLIA技术是在发光板上进行反应，除底物变为化学发光体系外，其余步骤和ELISA基本相同，故也存在大量检测费时费力、自动化难度高等问题。第二代CLIA技术使用纳米材料作为固相反应载体，使得抗原抗体反应在反应管中以更接近液相的体系进行，即管式化学发光法，其减少空间位阻的影响，使得抗原抗体反应更为充分，从而实现自动化、高敏感性检测。虽然此方法已经用于人医乙肝三项、肿瘤标志物等的检测，兽医上也开始使用此方法检测口蹄疫O、A、Asia 1型抗体等，但是由于检测对象的不同，使用抗原、抗体等关键原料不同，其检测体系并不能通用，检测效果相差很大。目前缺乏自动化、高敏感性检测猪瘟病毒的试剂盒。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于E2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒，能够定量检测猪血清中猪瘟病毒的特异性抗体，并且实现自动化、高敏感性、高重复性检测，可满足临床检测中使用方便操作简便的要求。
本发明提供了一种基于E2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括猪瘟病毒管式化学发光抗体检测反应体系；
所述猪瘟病毒管式化学发光抗体检测反应体系包括磁微粒混悬液、稀释液、酶标抗体工作液；
所述磁微粒混悬液中含有磁微粒偶联猪瘟病毒E2二聚体蛋白。
优选的，所述磁微粒偶联猪瘟病毒E2二聚体蛋白为每1mg磁微粒偶联 1μg～10μg猪瘟病毒E2二聚体蛋白。
优选的，所述磁微粒为磁性Fe3O4微粒。
优选的，所述酶标抗体工作液中酶包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标抗体工作液中抗体为兔抗猪IgG。
优选的，所述稀释液为0.1M pH值为7的MOPS缓冲液；
所述MOPS缓冲液为含质量百分含量0.1％～2％的BSA、体积百分含量 0.01～0.5％的Tween-20、体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M 的MgCl2、0.01～0.5M的NaCl、质量百分含量0.05～3％的水解乳蛋白和质量百分含量0.1～1％的PEG的水溶液。
优选的，所述试剂盒还包括样本稀释液、标准品、标准品稀释液、质控品、浓缩洗涤液和发光底物。
优选的，所述标准品稀释液为0.1M pH值为7的PBS缓冲液；
所述PBS缓冲液为质量百分含量为含质量百分含量0.1～2％的BSA、质量百分含量0.1～1％的PEG、质量百分含量0.5～5％的海藻糖、质量百分含量 0.1～0.5％的明胶和体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300的水溶液；
所述质控品包括质控品1和质控品2；所述质控品1为0～10U的抗血清，质控品2为80U～120U的抗血清；
所述标准品为血清猪瘟抗体含量为0U、3.125U、6.25U、12.5U、25U、 50U、100U、200U、400U、800U、1600U、3200U的抗血清；
所述浓缩洗涤液为浓度0.01M、pH值为7的PBS缓冲液或者0.05M、 pH值为8的Tris缓冲液，所述浓缩洗涤液还含有体积百分含量0.1～0.5％的 Tween-20；
所述样本稀释液为含有质量百分含量0.1％～1％BSA、质量百分含量 0.1％～1％葡萄糖的0.1M、pH值为7.0的PBS缓冲液。
本发明提供了所述检测试剂盒在非诊断目的的检测猪瘟病毒抗体中的应用。
优选的，所述瘟病毒抗体样本为猪瘟疫苗免疫或感染样本。
优选的，本试剂盒检测范围为0U～3200U，超出检测范围需稀释样本浓度到检测范围内，再进行检测。
本发明提供的基于E2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒，利用磁微粒偶联猪瘟病毒E2二聚体蛋白，建立管式化学发光免疫分析检测方法，使得抗体和磁微粒偶联的猪瘟病毒E2蛋白发生特异性反应，同时配套自动化化学发光免疫分析仪、标准曲线，可实现高敏感性、高特异性的精准定量、全自动化检测；检测效果特异性明显优于用E2单体蛋白偶联磁珠获得的效果。本发明实施例中，采用所述试剂盒通过全自动化学发光免疫分析仪定量检测猪瘟病毒特异性抗体含量，CLIA检测RLU(稀释1： 2)/RLU(N)为827.77倍，而IDEXX的ELISA试剂盒检测OD(N)/OD(稀释1：2)仅为5.52倍，具有明显的检测优势；同时检测田间样本186份，检测田间样阳性符合率为98.11％，而IDEXX的ELISA试剂盒总符合率为 97.15％；所述试剂盒检测背景清楚的10份阳性样本，阳性率为100％，而以 E2单体蛋白为抗原的检测方法阳性率为60％，说明本发明以E2二聚体蛋白制备的试剂盒检测敏感性好；使用所述试剂盒进行检测6种相关病原抗体阳性样本，检测抗体含量很低，均为阴性，检测田间血清阴性符合率为88.2％，本试剂盒特异性高。本试剂盒和目前使用的检测方法、试剂盒相比，能实现自动化、高敏感性、高重复性检测，其检测步骤少、使用方便、操作简单，可供临床检测猪瘟病毒抗体使用。
进一步的，所述试剂盒还包括样本稀释液、标准品、标准品稀释液、质控品、浓缩洗涤液和发光底物。本发明通过不同配方配制成标准品稀释液、样品稀释液等，使得试剂盒在试用期内各个组分保持稳定，加之使用自动化仪器检测，检测重复性好。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的“猪瘟E2蛋白二聚体的鉴定”结果；其中 A为还原性SDS-PAGE电泳结果，B为非还原性SDS-PAGE电泳结果，泳道 1、2、3、4、5和6为洗脱蛋白的不同组分；
图2为本发明实施例1提供的“猪瘟E2蛋白单体的鉴定”结果；其中A 为还原性SDS-PAGE电泳结果，B为非还原性SDS-PAGE电泳结果，泳道1、 2、3、4、5和6为洗脱蛋白的不同组分；
图3为本发明实施例1提供的“一种猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒”猪瘟抗体检测标准曲线；
图4为本发明实施例3提供的“一种猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒”检测不同病原抗体阳性血清后检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种基于E2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括猪瘟病毒管式化学发光抗体检测反应体系；
所述猪瘟病毒管式化学发光抗体检测反应体系包括磁微粒混悬液、稀释液、酶标抗体工作液；
所述磁微粒混悬液中含有磁微粒偶联猪瘟病毒E2二聚体蛋白。
在本发明中，所述磁微粒偶联猪瘟病毒E2二聚体蛋白优选为每1mg磁微粒偶联1μg～10μg猪瘟病毒E2二聚体蛋白。磁微粒混悬液中磁微粒偶联猪瘟病毒E2二聚体蛋白用于与待检测样本中抗猪瘟病毒抗体特异性结合。实验表明，猪瘟病毒E2二聚体蛋白比E2单体蛋白制备的试剂盒具有更高的检测阳性率。所述磁微粒优选为磁性Fe3O4微粒。磁性Fe3O4微粒的粒径优选为0.1～5μm，更有选为1～3μm，最优选为3μm。磁性Fe3O4微粒的表面含有丰富的官能团，例如羟基、羧基、氨基、环氧基或磺酰基，有利于磁珠和抗原/抗体通过化学键偶联，形成稳定结合物。在本发明实施例中，磁性Fe3O4微粒购自JSR公司3μm的羧基磁珠。所述E2二聚体蛋白在哺乳动物CHO 悬浮细胞中表达产生，能够正确折叠，真实展示猪瘟病毒E2蛋白构象，具有完整糖基化修饰，且纯度高、成分均一特征。
在本发明中，所述酶标抗体工作液中酶优选包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。所述酶标抗体工作液中抗体优选为兔抗猪IgG。所述酶标抗体工作液的作用是与抗猪瘟病毒的抗体结合，形成磁微粒偶联猪瘟病毒E2二聚体蛋白-抗猪瘟病毒抗体-酶标抗体三元复合物。所述过氧化物酶、碱性磷酸酶均购自sigma公司。
在本发明中，所述稀释液用于稀释磁微粒混悬液和酶标抗体工作液。所述稀释液优选为0.1M pH值为7的MOPS缓冲液。所述MOPS缓冲液为含质量百分含量0.1％～2％的BSA、体积百分含量0.01～0.5％的Tween-20、体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl2、0.01～0.5M的NaCl、质量百分含量0.05～3％的水解乳蛋白和质量百分含量0.1～1％的PEG的水溶液。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括样本稀释液、标准品、标准品稀释液、质控品、浓缩洗涤液和发光底物。所述标准品优选为血清猪瘟抗体效价大于1：5000的抗血清经纯化得到。所述标准品稀释液用于稀释标准品至不同的稀释倍数制备标准曲线。所述标准品稀释液优选为0.1M pH值为7的 PBS缓冲液；所述PBS缓冲液为质量百分含量为含质量百分含量0.1～2％的 BSA、质量百分含量0.1～1％的PEG、质量百分含量0.5～5％的海藻糖、质量百分含量0.1～0.5％的明胶和体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300的水溶液。所述质控品优选包括质控品1和质控品2；所述质控品1优选为0～10U 的抗血清，更优选为0U血清，质控品2优选为80U～120U的抗血清，更优选为100U的抗血清。所述标准品中抗体含量以U为单位。定义ELISA检测的可疑血清抗体含量为100U(此份血清1:32稀释)，则1：64稀释血清含量为50U,1:128稀释血清含量为25U,同理，1：16稀释血清抗体含量为200U, 以此类推。
在本发明中，所述浓缩洗涤液为浓度0.01M、pH值为7的PBS缓冲液或者0.05M、pH值为8的Tris缓冲液，所述浓缩洗涤液还含有体积百分含量0.1～0.5％的Tween-20。所述浓缩洗涤液在检测过程中洗涤反应体系使用。所述浓缩洗涤液使用时稀释25倍。
在本发明中，所述样本稀释液为含有质量百分含量0.1％～1％BSA、质量百分含量0.1％～1％葡萄糖的0.1M、pH值为7.0的PBS缓冲液，更优选为质量百分含量0.5％BSA、质量百分含量0.5％葡萄糖的0.1M、pH值为7.0 的PBS缓冲液。
在本发明中，所述发光底物与酶标记抗体工作液中酶对应。当酶为辣根过氧化物酶时，发光底物为鲁米诺及衍生物；当酶为碱性磷酸酶时，发光底物为金刚烷胺。
本发明提供了所述检测试剂盒在非诊断目的的检测猪瘟病毒抗体中的应用。
在本发明中，所述瘟病毒抗体样本为猪瘟疫苗免疫或感染样本，本试剂盒检测范围为0U～3200U，超出检测范围需稀释样本浓度到检测范围内，再进行检测。
在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选如下：检测抗体含量以U为单位表示并定量，具体计算方法是：以抗体含量(U)为横坐标，发光度(RLU) 为纵坐标制作标准曲线，然后代入加入待检血清后体系的RLU值，计算出待检血清中猪瘟病毒特异性抗体的含量。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于E2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.猪瘟病毒E2蛋白二聚体的表达、纯化
1.1表达猪瘟病毒E2蛋白真核质粒的构建方法
猪瘟病毒E2蛋白自然状态是以二聚体蛋白形式存在，是一种高度糖基化病毒囊膜蛋白，适用于真核哺乳动物细胞表达。为体外表达E2二聚体蛋白(E2-dimer)，参考猪瘟病毒C株E2基因序列(Z46258.1)为基础，在E2 基因N端引入鼠免疫球蛋白kappa链基因信号肽序列(MDIRAPAQFLGILLL WFPGA，SEQ ID NO:1)，并在C端引入组氨酸标签(HHHHHH，SEQ ID NO:2)；使用柔性接头连接肽段(GGGSSS，SEQ ID NO:3)进行连接，避免组氨酸标签分子对E2蛋白空间结构的干扰，形成融合蛋白(SEQ ID NO:4)。以上融合蛋白基因参照中国仓鼠卵巢细胞(CHO)密码子使用进行基因序列优化，然后在以上融合基因起始密码子前引入KOZAK核酸序列 (GCCACC)。以上融合基因序列交由金斯瑞公司合成，通过Not1和Age1 酶切位点插入到pcDNA3.4表达载体，获得融合表达质粒 E2-dimer-pcDNA3.4。
为对比单体蛋白和二聚体蛋白作为诊断抗原的应用效果差异，同时设计了生产猪瘟病毒E2单体(E2-mono)的表达质量E2-mono-pcDNA3.4。首先参考猪瘟病毒C株E2基因序列(Z46258.1)为基础，把E2蛋白C端第241， 256，277，294位半胱氨酸(C)突变成丙氨酸(A)，破环蛋白分子间二硫键形成。然后同上在N端引入信号肽和C端加入组氨酸标签，经CHO密码子基因优化，起始密码前引入KOZAK核酸序列，通过过Not1和Age1酶切位点插入到pcDNA3.4表达载体，最终获得融合表达质粒 E2-mono-pcDNA3.4。
1.2无内毒素质粒E2-dimer-pcDNA3.4和E2-mono-pcDNA3.4的制备方法
取1μg E2-dimer-pcDNA3.4质粒(或E2-mono-pcDNA3.4质粒)转入100 μl DH5a感受态细胞，挑取单克隆菌落至5mL LB培养基，37℃过夜培养，然后按1:50比例转接至200mLLB培养基，继续培养16h。8228×g离心3min 收集菌体，参考无内毒素质粒大提试剂盒(北京天根公司)说明书进行无内毒素质粒提取；使用微量分光光度计测定质粒浓度。
1.3猪瘟病毒E2蛋白的表达
悬浮细胞CHO培养于8％CO2的37℃恒温培养箱，摇动振幅直径为50 mm，转速设置为225转/分钟。转染前一天，调整CHO细胞密度至3×106个/mL，继续培养18h，然后更换预热新鲜培养基并调整细胞至6×106个/mL。转染时，首先取30μg无内毒素质粒E2-pcDNA3.4((或E2-mono-pcDNA3.4)、转染试剂PEI 80μL(1μg/μL)分别放入1.5mL EP管，然后均加入2×MEM 培养基稀释至1000μL，上下轻轻颠倒4～5次，静置2min。然后把制备的质粒和转染试剂二者混合，上下轻轻颠倒4～5次，形成复合物，然后把该复合物缓慢加入至约1.5×108个CHO细胞，边加边搅拌，确保在5min内把混合物加入完毕。转染后CHO细胞放37℃恒温培养箱入，连续培养9天。按 5000×g，离心30min，收取细胞培养上清，用于后续纯化E2蛋白。
1.4猪瘟E2蛋白的纯化
取细胞上清50mL，在纯化之前先经0.22μM滤器过滤，然后使用镍柱 (Histrap HP，5mL,GE Bioscience)，通过亲和层析，在AKTA蛋白纯化系统上纯化E2蛋白，具体操作步骤如下。首先依次使用5个柱体积的ddH2O、 PBS平衡镍柱。调整流速至0.5mL/min，开始上样。上样结束后，调整流速至2mL/min，用5个柱体积的PBS冲洗。然后，使用含20mM咪唑PBS液 (pH＝7.4)洗脱杂蛋白，使用含200mM咪唑PBS液(pH＝7.4)洗脱目的蛋白。洗脱蛋白透析置换至PBS缓冲液中。-20℃保存备用。
1.5猪瘟E2蛋白二聚体和单体的鉴定
取纯化的E2二聚体蛋白，平均分成两份，分别加入还原性SDS上样缓冲液(含DTT)和非还原性SDS上样缓冲液(不含DTT)，95℃加热5min。使用浓度为12％SDS-PAGE胶，上样30μL/孔，100V恒压电泳1h。待电泳结束后，取出胶块，放入考马斯亮蓝染色液中，轻摇作用30min。使用甲醇脱色液进行脱色，摇晃作用15min。更换脱色液三次，至胶块背景清晰，拍照成像。
SDS-PAGE电泳结果(图1)如下，蛋白清晰可见，无杂带，条带单一，说明E2蛋白成分均一性较好。还原性SDS-PAGE电泳(图1中A)结果，发现E2蛋白电泳条带约55kDa，比单纯氨基酸数量估算值偏大，说明的E2 蛋白经过了糖基化修饰，获得的E2为糖基化蛋白；非还原性SDS-PAGE电泳(图1中B)结果，发现电泳条带110kDa，恰好是还原性SDS-PAGE电泳条带大小两倍，说明E2蛋白以双分子形式存在，为二聚体蛋白。综上，表达获得猪瘟E2是糖基化二聚体蛋白。
取纯化的E2单体蛋白，方法同上，平均分成两份，分别加入还原性SDS 上样缓冲液(含DTT)和非还原性SDS上样缓冲液，加热、上样、脱色和拍照成像。SDS-PAGE电泳结果(图2)如下，蛋白清晰，条带单一无杂带。发现还原性SDS-PAGE电泳(图2中A)结果与非还原性蛋白电泳结果(图 2中B)条带一致，大小约55kDa，说明表达出的E2蛋白以单体形式存在。
实施例2
磁微粒工作液的制备方法
1磁微粒活化
取1mg磁珠，分别用PH 5.00.1M 2-吗啉乙磺酸(MES)稀释至10mg/mL，用磁铁充分吸附磁珠，弃去上清液，进行清洗，重复清洗1次。再加入100μL 0.1M MES(pH5.0)，混匀磁珠。
从-20℃取出1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，恢复至室温。称取EDC、NHS。分别用0.1M MES(pH5.0) 溶解，配制成10mg/mL。
分别向磁珠中加入NHS溶液10μL、EDC溶液10μL，常温混匀反应 30min。清洗磁珠：用磁铁充分吸附磁珠，弃去上清液，再加入100μL 0.1M MES(pH值5.0)，混匀磁珠。制得活化磁微粒。
2.磁微粒偶联E2蛋白
在1活化磁微粒溶液中加入E2蛋白5μg，混匀，常温震荡包被3h。加入10μL封闭液，常温震荡封闭3h。用洗涤液(1×洗液)清洗3次，用4mL保存液分散为磁微粒工作液，4℃储存。
实施例3
酶标抗体工作液的制备方法
1AP酶活化：配制高碘酸钠(NaIO4)15mg/mL，AP 10mg/mL，以m:m 为1.5:1混震荡混匀，37℃反应30min；再加入等体积乙二醇(1％)，4℃45min， AP活化完成。
2AP酶标记兔抗猪抗体
用pH9.60.5M碳酸盐缓冲液将兔抗猪抗体透析过夜，加入到上述活化AP酶液中，AP:Ab为2:1(m:m)，置于pH值9.60.5M碳酸盐缓冲液中透析，4℃过夜。
在上述混合液中按每mg碱性磷酸酶加入80μL的NaBH4(2mg/mL)， 4℃，2h，使用超滤管5000r/min，离心10min，换液浓缩标记物，用含甘油 50％的PBS溶解，用酶标抗体稀释液1：50000稀释为酶标抗体工作液，4℃备用。
实施例4
标准品、质控品的制备
1猪瘟病毒抗体高浓度血清的制备方法
使用猪瘟弱毒活疫苗(齐鲁动物保健有限公司)免疫90日龄SPF猪，按2头份剂量，颈部肌肉注射接种。总共进行3次免疫，免疫间隔为30天，在第3次免疫后21天，采集颈部静脉血，3000rpm离心，分离血清。对所获血清进行稀释，使用IDEXX“猪瘟病毒抗体检测试剂盒”ELISA试剂盒进行检测，最终所得高浓度血清猪瘟抗体效价大于1：5000。血清保存于-20℃，备用。
2猪瘟病毒抗体高浓度标准血清的纯化
使用AKTA蛋白纯化系统和ProteinA柱进行抗体纯化，纯水冲洗AKTA 蛋白纯化仪管道3次，接入蛋白纯化ProteinA柱，纯水平衡直至仪器各项参数稳定，换0.02M磷酸盐缓冲液(PB)仪器各项参数稳定，进样1mL/5mL，用0.02M磷酸盐缓冲液(PB)洗脱杂质，后用0.1M柠檬酸缓冲液(SSC) 洗脱样本，在UV在200以上接样，调pH至7.0，检测OD280nm，计算抗体浓度，备用。
3标准品的制备与标定
使用标准品稀释液梯度稀释项2中制备的抗体，使用IDEXX公司生产的“猪瘟病毒抗体检测试剂盒”ELISA试剂盒进行检测，检测结果如表1所示，在1:32稀释时检测为可疑，1:64及更大倍数稀释检测为阴性。CLIA检测结果如表2所示，在稀释倍数为1:2048时，仍然和1:1024、阴性拉开1.25倍～ 2倍，RLU(1:64)/RLU(1:32)≈2倍。ELISA和CLIA分别以1:32和1:2048作为最低检测限，CLIA敏感性较ELISA高64倍。
CSFV抗体定量单位的定义：因为CLIA敏感性比ELISA高64倍以上，故定义ELISA检测的可疑血清抗体含量为100U(此份血清1:32稀释)，则标准品1～标准品12的抗体含量如表1所示，分别为0U、1.56U、3.125U、6.25U、12.5U、25U、50U、100U、200U、400U、800U、1600U、3200U。
表1 IDEXX“猪瘟病毒抗体检测试剂盒”(ELISA)检测标准品
稀释倍数 含量(U) OD PI 判定
标准品1 N 定义为0U 2.369 10.32 阴性
1:4096 2.443 7.51 阴性
标准品2 1:2048 定义1.56U 2.59 1.95 阴性
标准品3 1:1024 定义3.125U 2.429 8.04 阴性
标准品4 1:512 定义6.25U 2.308 12.63 阴性
标准品5 1:256 定义12.5U 1.48 43.97 阳性
标准品6 1:128 定义为25U 2.086 21.03 阴性
标准品7 1:64 定义为50U 1.892 28.37 阴性
标准品8 1:32 定义为100U 1.611 39.01 可疑
标准品9 1:16 定义为200U 1.24 53.06 阳性
标准品10 1:8 定义为400U 0.904 65.78 阳性
标准品11 1:4 定义为800U 0.597 77.40 阳性
标准品12 1:2 定义1600U 0.429 83.76 阳性
根血清 定义3200U 0.306 88.42 阳性
表2本试剂盒检测标准品
实施例5
标准曲线的制备方法
分别取标准品1～标准品12不小于300μL于1.5mL尖底离心管，置于专用样品架，放入全自动化学发光仪样品仓中，按要求设置全自动化学发光仪各项参数，开始检测反应步骤如下(为仪器全自动)：
(1)取30μL待检样品，用样本稀释液10倍稀释，取稀释后样本10μL 加入反应杯；
(2)加入25μL磁性微粒工作液、55μL酶标抗体工作液，37℃孵育10 分钟；
(3)清洗4次，加入酶标抗体工作液100μL,37℃孵育10分钟；
(4)洗4次，加入100μL化学发光底物，孵育3分钟；读取发光值。
(5)标准曲线制作：用化学发光仪检测化学发光值，以抗体浓度为横坐标，发光值(RLU)为纵坐标，绘制四参数标准曲线Y＝(a-d)/[1+(x/c)×b]+d，标准曲线如图3所示。
实施例6
一种猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒
取上述制备的磁性微粒工作液、稀释液、酶标抗体溶液，按不同规格分别定量装入试剂船相应位置，组装成“猪瘟病毒管式化学发光抗体检测反应体系”；配制样本稀释液、浓缩液、化学发光底物等；分装阴性血清和抗体含量为100U的标准品作为质控品1、质控品2；按相应规格需求组装成猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒，试剂盒包括：猪瘟病毒管式化学发光抗体检测反应体系、样本稀释液、标准品、质控品、浓缩洗涤液，发光底物等。
实施例7
一种猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒的检测步骤
1.检测前准备
样本要求：血清样本若在一周内检测，可置2℃～8℃条件下保存，若超过一周检测，应置于-15℃以下冷冻保存。
2.试剂平衡
使用前，将试剂从冷藏中取出，常温放置20min以上，平衡至室温后使用。
3.磁微粒试剂重新悬浮
第一次装机前，需要混合磁微粒试剂，使运输过程中沉淀下来的磁微粒重新悬浮。首次装载磁微粒试剂后，无需进一步混合。
4溶液配制
洗液(1×洗液)：将本试剂盒配备的25×浓缩洗液用无离子水或蒸馏水做1:25稀释；
5仪器准备
阅读仪器说明书，按已经确定的条件设置好仪器参数，放置相关试剂、样本、所需耗材，开始检测。(具体设置方式参考仪器说明书)。
6标准曲线校准
取抗体含量分别为0U、3.125U、12.5U、50U、200U、800U的标准品作为校准品，按仪器说明书对标准曲线进行校准，校准后标准曲线R2≥0.99 时，可进行质控品检测。
7质控
需要时检测质控品，检测值必须在参考范围内，方可继续样品检测，如下情况需检测质控品：
a.每次试剂盒批号改变或校准后；
b.至少24小时内需检测1次。
9.样品检测
a.取30μL待检样品，用样本稀释液10倍稀释，取稀释后样本10μL加入反应杯；
b.加入25μL磁性微粒工作液、55μL酶标抗体工作液，37℃孵育10分钟；
c.清洗4次，加入酶标抗体工作液100μL,37℃孵育10分钟；
d.清洗4次，加入100μL化学发光底物，孵育3分钟；读取发光值。
10.结果
①判定依据：检测浓度≥15U为阳性，＜15U为阴性
②判定：检测完成后，查样品猪瘟病毒抗体含量，判断样品猪瘟病毒抗体阴阳性。
实施例8
一种猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒特性
试剂盒的敏感性
1.1对阳性血清进行梯度稀释，分别用管式CLIA和ELISA检测试剂盒(购自IDEXX公司)进行检测，检测结果如表3所示，ELISA检测结果为 OD值，和抗体含量呈负相关，CLIA检测结果为相对发光强度(RLU)，和抗体含量呈正相关。计算OD(N)/OD(稀释样本)如表3所示，OD(N) /OD(稀释1：2)为5.52倍；而CLIA检测结果中，RLU(稀释1：2)/RLU(N) 为827.77倍；相对于ELISA，CLIA检测结果阴阳性检测结果差值更大，敏感性更好。
表3敏感性检测结果1
1.2阳性样本检出率
检测背景清楚的阳性样本10份，比较分别以猪瘟病毒E2二聚体蛋白和猪瘟E2蛋白单聚体为抗原的方法的敏感性，检测结果如表4所示，结果显示以E2二聚体蛋白为抗原的检测方法检测阳性率为100％，但是以E2单聚体蛋白为抗原的检测方法检测阳性率为60％，4份血清检测为阴性，敏感性差。
表4敏感性检测结果
2试剂盒的特异性
分别选取不同病原抗体阳性血清，包括口蹄疫O型、A型免疫或感染猪血清、猪瘟病毒、塞尼卡谷病毒、猪瘟呼吸与繁殖综合征病毒、非洲猪瘟病毒7种相关病原抗体阳性样本，使用本试剂盒进行检测，结果如图4所示，检测对照血清CSFV样本(1:32稀释)抗体含量最高，其余6种样本检测抗体含量很低，均为阴性。说明本试剂盒特异性很好。
3试剂盒检测符合率
使用IDEXX的ELISA试剂盒和本试剂盒分别检测田间样本186份，检测结果如表5所示，其中IDEXX“猪瘟病毒抗体检测试剂盒”ELISA检测阴性17份，阳性血清159份，可疑血清10份；“猪瘟病毒管式CLIA抗体检测试剂盒”检测阴性血清22份，检测阳性血清164份，因CLIA试剂盒未设置可疑血清的检测，检测IDEXX检测10份可疑血清中4份检测结果为阴性，6份为阳性，此10份血清后续需用其他方法再检测，以确定其阴阳性。目前检测结果“猪瘟管式CLIA抗体检测试剂盒”和IDEXX的ELISA试剂盒检测 186份血清的总符合率为97.15％(统计时除ELISA试剂盒检测可疑血清10 份，ELISA未确定阴阳性)，阴性符合率88.2％，阳性符合率未98.11％，符合性很好。
表5田间样本检测结果比较
本发明所述试剂盒通过用偶联E2二聚体蛋白的磁性微粒取代96孔板，使得反应在移动的反应管中进行，可实现检测的全自动化，同时实现精准定量、高敏感性、高重复性检测，且结果以活性单位(U)表示，计算结果及判定方法适用于实际使用，符合实际要求，有利于各个诊断方法检测结果之间的统一与比较。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于E2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括猪瘟病毒管式化学发光抗体检测反应体系；
所述猪瘟病毒管式化学发光抗体检测反应体系由磁微粒混悬液、稀释液、酶标抗体工作液组成；
所述磁微粒混悬液中含有磁微粒偶联猪瘟病毒E2二聚体蛋白；
所述猪瘟病毒E2二聚体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述磁微粒偶联猪瘟病毒E2二聚体蛋白为每1mg磁微粒偶联1μg～10μg猪瘟病毒E2二聚体蛋白。
2.根据权利要求1所述猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒为磁性Fe3O4微粒。
3.根据权利要求1所述猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体工作液中酶包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标抗体工作液中抗体为兔抗猪IgG。
4.根据权利要求1所述猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液为0.1M pH值为7的MOPS缓冲液；
所述MOPS缓冲液为含质量百分含量0.1％～2％的BSA、体积百分含量0.01～0.5％的Tween-20、体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl2、0.01～0.5M的NaCl、质量百分含量0.05～3％的水解乳蛋白和质量百分含量0.1～1％的PEG的水溶液。
5.根据权利要求1所述猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本稀释液、标准品、标准品稀释液、质控品、浓缩洗涤液和发光底物。
6.根据权利要求5所述猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标准品稀释液为含质量百分含量0.1％～2％的BSA、质量百分含量0.1～1％的PEG、质量百分含量0.5～5％的Prionex、质量百分含量0.1～0.5％的明胶和体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300的PBS缓冲液；
所述质控品包括质控品1和质控品2；所述质控品1为0～10U的抗血清，质控品2为80U～120U的抗血清；
所述标准品为血清猪瘟抗体含量为0U、3.125U、6.25U、12.5U、25U、50U、100U、200U、400U、800U、1600U、3200U的抗血清；
所述浓缩洗涤液为浓度0.01M、pH值为7的PBS缓冲液或者0.05M、pH值为8的Tris缓冲液，所述浓缩洗涤液还含有体积百分含量0.1～0.5％的Tween-20；
所述样本稀释液为含有质量百分含量0.1％～1％BSA、质量百分含量0.1％～1％葡萄糖的0.1M、pH值为7.0的PBS缓冲液。
7.权利要求1～6任意一项所述检测试剂盒在非诊断目的的检测猪瘟病毒抗体中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述猪瘟病毒抗体样本为猪瘟疫苗免疫或感染样本。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述试剂盒的检测范围为0U～3200U，超出检测范围需稀释样本浓度到检测范围内，再进行检测。
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猪瘟病毒E2蛋白A-D抗原表位区的原核表达与蛋白纯化;潘小慧;福建畜牧兽医;20201231;42(003);全文 *
猪瘟病毒重组E2蛋白PPA-ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用;李娇;王金良;祖立闯;谢金文;沈志强;;中国兽医学报;20111015(10);全文 *

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