CN118130808A

CN118130808A - 一种基于n蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒

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Publication number: CN118130808A
Application number: CN202410181881.5A
Authority: CN
Inventors: 刘新生; 林密; 包艳芳; 张莉萍; 潘丽; 何莉; 王永录; 李善涛; 方玉珍; 潘晓乐; 周鹏; 蒋涛; 张中旺; 李昕; 吕建亮; 孙燕燕; 杨光; 郭慧琛; 张永光
Original assignee: Lanzhou Animal Research Biotechnology Co ltd; Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Animal Research Biotechnology Co ltd; Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2023-06-06
Filing date: 2024-02-18
Publication date: 2024-06-04

Abstract

本发明提供了一种基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，属于体外诊断产品技术领域。所述试剂盒包括偶联有猪流行性腹泻病毒N蛋白的磁微粒悬浊液和酶标抗体溶液。与商品ELISA检测试剂盒相比，本发明提供的基于N蛋白检测猪流行性腹泻病毒抗体试剂盒不仅能高特异性、高准确性的定量检测猪血清中猪流行性腹泻病毒的抗体，并且具有自动化、高敏感性、高重复性检测特点，具有较高的市场竞争力。

Description

一种基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒

技术领域

本发明属于体外诊断产品技术领域，具体涉及一种基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒。

背景技术

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染猪引起的急性，高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻、脱水和仔猪高死亡率为主要特征，严重危害养猪业。不同日龄的猪对PEDV均易感，PEDV主要侵染小肠等消化道器官。PEDV与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，猪轮状病毒(APRoVA)等感染导致的症状极其相似，临床上鉴别诊断比较困难，必须依靠实验室检测进行确诊。因此开展PEDV快速，精准诊断方法的相关研究，对于其综合防控意义重大。

现检测猪流行性腹泻病毒抗体的技术方法有病毒中和实验、酶联免疫吸附(ELISA)、试纸条、RT-PCR方法等，其中中和实验需要进行活病毒操作，安全防护级别要求较高，实验条件苛刻，临床应用较少。虽然试纸条检测方便，但不能进行定量；因此ELISA是目前使用最广泛的检测方法，但其缺点在于耗时较长、不能准确定量、自动化困难。所以建立一种能准确定量、高敏感性、全自动化、快速检测猪流行性腹泻病毒抗体的方法非常必要。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)技术是将化学发光体系和免疫学方法结合起来的一种诊断技术，通过将免疫信号放大转化为化学发光信号，检测发光强度从而检测相应物质的含量。第一代的CLIA技术是在发光板上进行反应，除底物变为化学发光体系外，其余步骤和ELISA基本相同，故也存在大量检测费时费力、自动化难度高等问题。第二代CLIA技术使用纳米材料作为固相反应载体，使得抗原抗体反应在反应管中以更接近液相的体系进行，即管式化学发光法，其减少空间位阻的影响，使得抗原抗体反应更为充分，从而实现自动化、高敏感性检测。虽然此方法已经用人医乙肝三项、肿瘤标志物等的检测，兽医上也逐渐开始使用此方法用于检测口蹄疫A、O、Asia 1型抗体等，但是由于检测对象的不同，使用抗原、抗体等关键原料不同，其检测体系并不能通用，检测效果相差很大。目前针对猪流行性腹泻的精准防控和免疫评价，缺乏自动化、高敏感性检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，以N蛋白作为检测抗原，能够定量检测猪血清中猪流行性腹泻病毒的特异性抗体，并且实现自动化、高敏感性、高重复性检测，可满足临床检测中使用方便操作简便的要求。

本发明提供了一种基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，包括偶联有猪流行性腹泻病毒N蛋白的磁微粒悬浊液和酶标抗体溶液。

优选的，所述偶联有猪流行性腹泻病毒N蛋白的磁微粒悬浊液中，所述磁微粒和偶联猪流行性腹泻病毒N蛋白的质量比为1000g：1～10。

优选的，所述猪流行性腹泻病毒N蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述酶标抗体溶液中酶包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述抗体为抗猪IgG。

优选的，所述试剂盒还包括以下至少一种或几种：稀释液、样本稀释液、标准品稀释液、标准品、质控品、浓缩洗涤液和发光底物。

优选的，所述稀释液为pH值7.0的0.1M的MOPS缓冲液；

所述MOPS缓冲液为含质量百分含量0.1％～2％的BSA、体积百分含量0.01～0.5％的Tween-20、体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl₂、0.01～0.5M的NaCl、质量百分含量0.05～3％的水解乳蛋白和质量百分含量0.1～1％的PEG 6000的水溶液。

优选的，所述标准品稀释液为含质量百分含量0.1～2％的BSA、质量百分含量0.1～1％的PEG、质量百分含量0.5～5％的Prionex、质量百分含量0.1～0.5％的明胶和体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300的PBS缓冲液；

所述样本稀释液为含质量百分含量0.1％～1％BSA、质量百分含量0.1％～1％葡萄糖的0.1M、pH值为7.0的PBS缓冲液。

优选的，所述质控品包括质控品1和质控品2；所述质控品1为0～10U的抗血清，质控品2为100U～160U的抗血清；

所述标准品为血清猪流行性腹泻抗体含量0U、20U、40U、80U、160U、640U的抗血清；

所述浓缩洗涤液为含体积百分含量0.1～0.5％的Tween-20的pH值为7.0的0.01M的PBS缓冲液或者含体积百分含量0.1～0.5％的Tween-20的pH值为8.0的0.05M Tris缓冲液。

本发明提供了所述试剂盒在非诊断目的的检测猪流行性腹泻病毒抗体中的应用。

优选的，所述猪流行性腹泻病毒抗体样本为猪流行性腹泻疫苗免疫样本或自然感染样本；

所述试剂盒的抗体检测范围为0U～640U。

本发明提供的基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，利用磁微粒偶联猪流行性腹泻病毒N蛋白，建立管式化学发光免疫分析检测方法，使得抗体和磁微粒偶联的猪流行性腹泻病毒N蛋白发生特异性反应，同时配套自动化化学发光免疫分析仪、标准曲线，可实现高敏感性、高特异性的精准定量、全自动化检测。在本发明实施例中，采用所述试剂盒通过全自动化学发光免疫分析仪定量检测猪流行性腹泻病毒特异性抗体含量，检测田间样本286份，阳性符合率为91.07％，样本总符合率为98.25％；所述试剂盒检测背景清楚的阳性样本20份，阴性样本5份，符合率均为100％；使用所述试剂盒进行检测6种相关病原抗体阳性样本，检测抗体含量很低，均为阴性，本试剂盒特异性高。所述试剂盒和目前使用的试剂盒或检测方法相比，能实现自动化、高敏感性、高重复性检测，检测步骤减少、使用方便、操作简单，可用于临床检测猪流行性腹泻病毒抗体。

进一步的，所述试剂盒还包括样本稀释液、标准品、标准品稀释液、质控品、浓缩洗涤液和发光底物。本发明通过配制标准品稀释液、样品稀释液等，使得试剂盒在试用期内各个组分保持稳定，加之应用自动化仪器检测，检测结果重复性好。

附图说明

图1为重组N蛋白的纯化鉴定结果，其中泳道1为Marker，泳道2～7表示为纯化的重组N蛋白样品；

图2为本发明提供的检测试剂盒对猪流行性腹泻病毒抗体检测标准曲线；

图3为本发明检测试剂盒特异性检测结果。

具体实施方式

在本发明中，所述试剂盒的检测原理是将偶联有猪流行性腹泻病毒N蛋白的磁微粒悬浊液和待检样本中抗N蛋白抗体特异性结合形成二元复合物，在磁场力作用下洗涤，二元复合物重悬后与酶标抗体溶液反应，形成三元复合物，在磁场力作用下洗涤洗去未结合的酶标抗体，重悬后添加发光底物，检测发光度，根据标准曲线，计算出检样本中猪流行性腹泻病毒特异性抗体的含量。

在本发明中，所述偶联有猪流行性腹泻病毒N蛋白的磁微粒悬浊液中，所述磁微粒和偶联猪流行性腹泻病毒N蛋白的质量比优选为1000g：1～10。所述猪流行性腹泻病毒N蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。实验表明，在猪感染PEDV的早期，可以检测到抗N蛋白的高水平抗体。PEDV重组蛋白N作为诊断抗原在检测病毒感染及评价疫苗免疫效果。所述磁微粒优选为磁性Fe₃O₄微粒。所述磁性Fe₃O₄微粒的粒径优选为0.1～5μm，更有选为1～3μm，最优选为3μm。磁性Fe₃O₄微粒的表面含有丰富的官能团，例如羟基、羧基、氨基、环氧基或磺酰基等，有利于磁珠和抗原/抗体通过化学键偶联，形成稳定的结合物。在本发明实施例中，磁性Fe₃O₄微粒购自JSR公司3μm的羧基磁珠。所述偶联有猪流行性腹泻病毒N蛋白的磁微粒悬浊液的工作浓度优选为0.25-0.5mg/ml，更优选为0.3mg/ml。

在本发明中，所述酶标抗体溶液中酶优选包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。所述过氧化物酶、碱性磷酸酶均购自sigma公司。所述抗体为兔抗猪IgG。所述酶标抗体溶液的工作浓度优选为1:5000-1:20000，更优选为1:10000。所述酶标抗体工作液的作用是与抗体结合，形成磁微粒偶联猪流行性腹泻病毒N蛋白-抗猪流行性腹泻病毒抗体-酶标抗体三元复合物。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括以下至少一种或几种：稀释液、样本稀释液、标准品稀释液、标准品、质控品、浓缩洗涤液和发光底物。

在本发明中，所述稀释液优选为pH值7.0的0.1M的MOPS缓冲液；所述MOPS缓冲液优选为含质量百分含量0.1％～2％的BSA、体积百分含量0.01～0.5％的Tween-20、体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl₂、0.01～0.5M的NaCl、质量百分含量0.05～3％的水解乳蛋白和质量百分含量0.1～1％的PEG的水溶液。所述稀释液的作用是稀释磁微粒混悬液和酶标抗体工作液。

在本发明中，所述标准品稀释液优选为含质量百分含量0.1～2％的BSA、质量百分含量0.1～1％的PEG、质量百分含量0.5～5％的Prionex、质量百分含量0.1～0.5％的明胶和体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300的PBS缓冲液。所述标准品稀释液是用于稀释标准品至目标梯度浓度。所述标准品优选为血清猪流行性腹泻抗体含量0U、20U、40U、80U、160U、640U的抗血清。所述标准品中抗体含量以U为单位。定义ELISA检测的可疑血清抗体含量为80U(此份血清1:32稀释)，则1：64稀释血清含量为40U，1:128稀释血清含量为20U，同理，1：16稀释血清抗体含量为160U，以此类推。

在本发明中，所述样本稀释液优选为含质量百分含量0.1％～1％BSA、质量百分含量0.1％～1％葡萄糖的0.1M、pH值为7.0的PBS缓冲液。所述样本稀释液的作用是稀释待测样本血清。

在本发明中，所述质控品优选包括质控品1和质控品2；所述质控品1优选为0～10U的抗血清，质控品2优选为100U～160U的抗血清。

在本发明中，所述浓缩洗涤液优选为含体积百分含量0.1％～0.5％的Tween-20的pH值为7.0的0.01M的PBS缓冲液或者含体积百分含量0.1～0.5％的Tween-20的pH值为8.0的0.05M Tris缓冲液。所述浓缩洗涤液的工作时，稀释倍数为25倍。所述浓缩洗涤液用于检测过程中洗涤反应体系。

在本发明中，所述发光底物与酶标记抗体工作液中酶对应。当酶为辣根过氧化物酶时，发光底物为鲁米诺及衍生物；当酶为碱性磷酸酶时，发光底物为金刚烷胺。

在本发明中，所述猪流行性腹泻病毒抗体样本优选为猪流行性腹泻疫苗免疫样本或自然感染样本。所述试剂盒的抗体检测范围为0U～640U。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种猪流行性腹泻病毒N蛋白二聚体的表达、纯化及鉴定

1.主要试验材料

PEDV CH/HNPJ/2017(GIIb)毒株(保藏编号：CGMCC：16216)由中国农业科学院兰州兽医研究所国家重点实验室保存；

大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自宝生物工程(北京)有限公司；

三色预染蛋白Marker(10kDa～250kDa)购自上海雅酶生物医药科技有限公司；

高亲和Ni-NTA纯化介质购于德国凯杰生物公司；

Tris、NaCl、Na₂CO₃、NaHCO₃、Urea、IPTG、卡那霉素等常规试剂购于上海生工生物工程公司；

山羊抗猪IgG(HRP)购于Abcam公司；

PEDVN蛋白抗体检测试剂盒购于加拿大Biovet公司；

猪PEDV阴性、阳性参考血清由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫防控技术团队制备并保存。

2.PET-24a-S2重组表达载体的构建

PEDV CH/HNPJ/2017(GIIb)毒株(P10)N基因序列交由金开瑞生物公司优化合成并构建于PET-24a载体上，转化BL21(DE3)感受态细胞。

3.重组蛋白的表达与纯化

将重组表达菌株BL21-PET-24a-N接种于含50μg/mL卡那霉素的1000ml LB液体培养基中，在37℃，220r/min摇床振荡培养4～5h直至OD₆₀₀值达到0.6～0.8时，向其中加入终浓度为0.1mmol/L IPTG进行诱导表达，继续培养6h后离心收集菌体。将收集的菌体用1/20培养体积的BufferA(20mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0)充分重悬，置冰上进行超声破碎裂解，当菌液完全破碎变清亮时再次离心并分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，分析该融合蛋白的表达形式。收集含有目的蛋白的样品，参考Ni-NTA Superflow Cartridge手册进行镍柱亲和层析纯化PET-24a-N重组蛋白，纯化后的蛋白样品进行SDS-PAGE分析其纯度。收集纯度高的蛋白样品用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，并将其稀释至1mg/ml，装入透析袋中，置于100倍蛋白体积的透析Buffer 1(20mM Tris，300mM NaCl，2M Urea，pH 8.0)中缓慢搅拌透析12h，然后从透析Buffer 1中取出，置于透析Buffer 2(20mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0)中缓慢搅拌透析12h，收集透析好的蛋白溶液，重新测定蛋白浓度，并用0.22μm滤器过滤，进行无菌分装，短时间4℃保存，长时间-80℃保存备用。

4.重组蛋白的纯化结果

SDS-PAGE结果显示，重组蛋白主要以包涵体形式表达，分子量大小约为57kDa，与预期一致。进一步经镍柱亲和层析纯化，获得了纯度较高(≥90％)的重组蛋白(序列见SEQID NO:1，检测结果见图1)。

实施例2

一种检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒及其制备方法和检测方法

1.试剂盒包括偶联有猪流行性腹泻病毒N蛋白的磁微粒悬浊液、酶标抗体溶液、稀释液、样本稀释液、标准品稀释液、标准品、质控品、浓缩洗涤液和发光底物。

其中，稀释液：0.1M pH值为7的MOPS缓冲液。所述MOPS缓冲液为含质量百分含量0.1％～2％的BSA、体积百分含量0.01～0.5％的Tween-20、体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl₂、0.01～0.5M的NaCl、质量百分含量0.05～3％的水解乳蛋白和质量百分含量0.1～1％的PEG水溶液。

样本稀释液：含质量百分含量0.1％～1％BSA、质量百分含量0.1％～1％葡萄糖的0.1M、pH值为7.0的PBS缓冲液。

标准品稀释液：0.1M pH值为7.0的PBS缓冲液；所述PBS缓冲液为含质量百分含量0.1～2％的BSA、质量百分含量0.1～1％的PEG、质量百分含量0.5～5％的海藻糖、质量百分含量0.1～0.5％的明胶和体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300的水溶液。

浓缩洗涤液：浓度0.01M、pH值7.0的PBS缓冲液或者0.05M、pH值8.0的Tris缓冲液，所述浓缩洗涤液其中含有体积百分含量0.1～0.5％的Tween-20。所述浓缩洗涤液使用时需稀释25倍。

发光底物：所述发光底物与酶的种类相适应。当酶标抗体溶液中酶为碱性磷酸酶时，发光底物为金刚烷胺。所述发光底物的浓度0.5g/L。

偶联有猪流行性腹泻病毒N蛋白的磁微粒悬浊液的制备方法，包括以下步骤：

1)磁微粒活化

取1mg磁珠，分别用pH 5.00.1M 2-吗啉乙磺酸(MES)稀释至10mg/mL，用磁铁充分吸附磁珠，弃去上清液，进行清洗，重复清洗1次。再加入100μL0.1M MES(pH5.0)，混匀磁珠。

从-20℃取出1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，恢复至室温。称取EDC、NHS。分别用0.1M MES(pH5.0)溶解，配制成10mg/mL。

分别向磁珠中加入NHS溶液10μL、EDC溶液10μL，常温混匀反应30min。清洗磁珠：用磁铁充分吸附磁珠，弃去上清液，再加入100μL 0.1MMES(pH值5.0)，混匀磁珠。制得活化磁微粒。

2)磁微粒偶联N蛋白

在1活化磁微粒溶液中加入N蛋白10μg，混匀，常温震荡包被3h。加入10μL封闭液，常温震荡封闭3h。用洗涤液(1×洗液)清洗3次，用4mL保存液分散为磁微粒工作液，4℃储存。

酶标抗体工作液的制备方法

1)AP酶活化：配制高碘酸钠(NaIO₄)15mg/mL，AP 10mg/mL，以质量比为1.5:1比例混合混震荡混匀，37℃反应30min；再加入等体积乙二醇(1％)，4℃45min，AP活化完成。

2)AP酶标记兔抗猪抗体

用pH 9.60.5M碳酸盐缓冲液将兔抗猪抗体透析过夜，加入到上述活化AP酶液中，AP:Ab为2:1(m:m)，置于pH值9.60.5M碳酸盐缓冲液中透析，4℃过夜。

在上述混合液中按每mg碱性磷酸酶加入80μL的NaBH₄(2mg/mL)，4℃，2h，使用超滤管5000r/min，离心10min，换液浓缩标记物，用含甘油50％的PBS溶解，用酶标抗体稀释液1：10000稀释为酶标抗体工作液，4℃备用。

标准品、质控品的制备

1)猪流行性腹泻病毒抗体高浓度血清的制备方法

使用猪流行性腹泻弱毒活疫苗免疫90日龄SPF猪，按2头份剂量，颈部肌肉注射接种。总共进行3次免疫，免疫间隔为30天，在第3次免疫后21天，采集颈部静脉血，3000rpm离心，分离血清。使用ID.Vet的ELISA试剂盒“猪流行性腹泻病毒抗体检测试盒”进行检测，最终所得高浓度血清效价大于120％。血清保存于-20℃，备用。

2)猪流行性腹泻病毒抗体高浓度标准血清的纯化

使用AKTA蛋白纯化系统和ProteinA柱进行抗体纯化，纯水冲洗AKTA蛋白纯化仪管道3次，接入蛋白纯化ProteinA柱，纯水平衡直至仪器各项参数稳定，换0.02M磷酸盐缓冲液(PB)仪器各项参数稳定，进样1mL/5mL，用0.02M磷酸盐缓冲液(PB)洗脱杂质，后用0.1M柠檬酸缓冲液(SSC)洗脱样本，在UV在200以上接样，调pH至7.0，检测OD_280nm，计算抗体浓度，备用。

3)标准品的制备与标定

使用标准品稀释液梯度稀释抗体血清，使用ID.Vet公司生产的“猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒”ELISA试剂盒进行检测，检测结果如表1所示，在1:32稀释时检测为可疑，1:64及更大倍数稀释检测为阴性。CLIA检测结果如表1所示。

PEDV抗体定量单位的定义：ELISA检测的可疑血清抗体含量为80U(此份血清1:32稀释)，则标准品1～标准品6的抗体含量如表2所示，分别为0U、20U、40U、80U、160U、640U。

表1ID.Vet“猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒”(ELISA)检测标准品

ELISA标准品	稀释倍数	含量(U)	OD	PI	判定
						标准品1	N	定义为0U	0.103	10.2％	阴性
	1:256		0.112	12.2％	阴性
						标准品2	1:128	定义20U	0.163	21.6％	阴性
标准品3	1:64	定义40U	0.245	30.7％	阴性
						标准品4	1:32	定义80U	0.387	55.6％	阴性
标准品5	1:16	定义160U	0.492	78.2％	阳性
						标准品6	1:8	定义320U	0.651	85.6％	阳性
标准品7	1:4	定义640U	0.856	91.3％	阳性
						标准品8	1:2	定义1280U	1.03	115.2％	阳性
	根血清		1.306	128.4％	阳性

表2本试剂盒(CLIA)检测标准品

实施例3

采用实施例2中试剂盒制备标准曲线的方法

分别取标准品1～标准品6不小于300μL，于1.5mL尖底离心管，置于专用样品架，放入全自动化学发光仪样品仓中，按要求设置全自动化学发光仪各项参数，开始检测反应步骤如下(为仪器全自动)：

(1)取20μL待检样品；

(2)加入20μL磁性微粒工作液、60μL样本稀释液，37℃孵育10分钟；

(3)清洗4次，加入酶标抗体工作液100μL,37℃孵育10分钟；

(4)清洗4次，加入100μL化学发光底物，孵育3分钟；读取发光值。

(5)标准曲线制作：用化学发光仪检测化学发光值，以抗体浓度为横坐标，发光值(RLU)为纵坐标，绘制四参数标准曲线(见图2)，得到标准曲线回归方程，具体见公式I。

Y＝(a-d)/[1+(x/c)×b]+d公式I

实施例4

一种检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒的检测步骤

1.检测前准备

样本要求：血清样本若在一周内检测，可置2℃～8℃条件下保存，若超过一周检测，应置于-15℃以下冷冻保存。

2.试剂平衡

使用前将试剂从冷藏中取出，常温放置20min以上，平衡至室温后使用。

3.磁微粒试剂重新悬浮

第一次装机前，需要混合磁微粒试剂，使运输过程中沉淀下来的磁微粒重新悬浮。首次装载磁微粒试剂后，无需进一步混合。

4溶液配制

洗液(1×洗液)：将本试剂盒配备的25×浓缩洗液用无离子水或蒸馏水做1:25稀释；

5仪器准备

阅读仪器说明书，按已经确定的条件设置好仪器参数，放置相关试剂、样本、所需耗材，开始检测。(具体设置方式参考仪器说明书)。

6标准曲线校准

取抗体含量分别为0U、20U、40U、80U、160U、640U的标准品作为校准品，按仪器说明书对标准曲线进行校准，校准后标准曲线R2≥0.99时，可进行质控品检测。

7质控

需要时检测质控品，检测值必须在参考范围内，方可继续样品检测，如下情况需检测质控品：

a.每次试剂盒批号改变或校准后；

b.至少24小时内需检测1次。

9.样品检测

a.取20μL待检样品，用样本稀释液10倍稀释，取稀释后样本20μL加入反应杯；

b.加入20μL磁性微粒工作液、60μL样本稀释液，37℃孵育10分钟；

c.清洗4次，加入酶标抗体工作液100μL,37℃孵育10分钟；

d.清洗4次，加入100μL化学发光底物，孵育3分钟；读取发光值。

10.结果

①判定依据：检测浓度≥18U为阳性，＜18U为阴性

②判定：检测猪流行性腹泻病毒抗体含量，判断样品阴阳性。

实施例5

PEDV为冠状病毒科冠状病毒属成员，其基因组编码4个主要的结构蛋白(S、M、E、N)，同S蛋白(SEQ ID NO:2)和M蛋白(SEQ ID NO:3)分别按照实施例1的方法制备重组表达S蛋白和M蛋白。为了筛选早期诊断时检测标志物的种类，开展了以下实验。

取背景清楚的40份猪阳性血清和40份猪阴性血清，分别用PEDV S、M、N作为检测抗原按照实施例3中的检测方法检测。

结果如表3。以N蛋白作为检测抗原的灵敏性(100％)和特异性(97.5％)均最高，较S蛋白和M蛋白的检测灵敏度和特异性均有较明显的优势。

表3PEDV不同抗原检测结果比较

在猪感染PEDV的早期，可以检测到抗N蛋白的高水平抗体，并且核衣壳N蛋白在冠状病毒中高度保守，在PEDV的结构蛋白中所占比例最大。PEDV重组蛋白N作为诊断抗原在检测病毒感染及评价疫苗免疫效果中具有很高的应用价值。因此，本研究以可溶性表达的重组N蛋白作为检测抗原，建立检测PEDV血清抗体的间接ELISA方法，为临床检测PEDV感染及流行病学调查奠定基础。

实施例6

一种基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒的特性检测

1.试剂盒的敏感性

1.1对阳性血清进行梯度稀释，分别用管式CLIA和ELISA检测试剂盒(购自ID.Vet公司)进行检测。

检测结果如表4所示，ELISA检测结果为OD值，和抗体含量呈正相关，CLIA检测结果为相对发光强度(RLU)，和抗体含量呈正相关。计算OD(N)/OD(稀释样本)如表3所示，OD(N)/OD(稀释1：2)为16.17倍；而CLIA检测结果中，RLU(稀释1：2)/RLU(N)为213.5倍；相对于ELISA，CLIA阴阳性检测结果差值更大，敏感性更好。

表4敏感性检测结果

1.2阳性样本检出率

检测背景清楚的阳性样本20份，阴性样本5份，本试剂盒检测阴阳性结果，与背景符合率100％；检测结果如表5所示，使用ID.Vet试剂盒ELISA检测20血清中有18份阳性，和背景符合率为90.0％；但其中2份血清的PI值分别为57.24％、59.05％，接近临界值，阴性样本ELISA检测结果符合率100％。ID.Vet试剂盒判定标准“PI≥60％判为PEDV阳性，PI<60％判为PEDV阴性”，可以看出，本试剂盒敏感性较高。

表5背景清晰血清检测结果

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2.试剂盒的特异性

分别选取不同病原抗体阳性血清，包括口蹄疫O型、A型免疫或感染猪血清、猪瘟病毒、塞尼卡谷病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、非洲猪瘟病毒6种相关病原抗体阳性样本，使用本试剂盒进行检测。

结果如图3所示，检测PEDV样本抗体含量最高，其余6种样本检测抗体含量很低，均为阴性。说明本试剂盒特异性很好。

3.试剂盒检测符合率

使用ID.Vet的ELISA试剂盒和本试剂盒分别检测田间样本286份，检测结果如表6所示，其中ID.Vet的ELISA方法“猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒”检测阴性235份，阳性血清51份，可疑血清0份；“猪流行性腹泻病毒管式CLIA抗体检测试剂盒”检测阳性血清56份，检测阴性血清230份。目前检测结果“猪流行性腹泻管式CLIA抗体检测试剂盒”和ID.Vet的ELISA试剂盒检测286份血清阴性符合率为98.87％，阳性符合率为91.07％，总符合率为98.25％，符合性好。

表6田间样本检测结果比较

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本发明所述试剂盒通过偶联的磁性微粒取代96孔板，使得反应在移动的反应管中进行，可实现检测的全自动化，同时实现精准定量、高敏感性、高重复性检测，且结果以活性单位(U)表示，计算结果及判定方法适用于实际使用，符合实际要求，有利于各个诊断方法检测结果之间的统一与比较。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，包括偶联有猪流行性腹泻病毒N蛋白的磁微粒悬浊液和酶标抗体溶液。

2.根据权利要求1所述基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述偶联有猪流行性腹泻病毒N蛋白的磁微粒悬浊液中，所述磁微粒和偶联猪流行性腹泻病毒N蛋白的质量比为1000g：1～10。

3.根据权利要求1所述基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒N蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求1所述基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体溶液中酶包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述抗体为抗猪IgG。

5.根据权利要求1所述基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下至少一种或几种：稀释液、样本稀释液、标准品稀释液、标准品、质控品、浓缩洗涤液和发光底物。

6.根据权利要求1所述基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述稀释液为pH值7.0的0.1M的MOPS缓冲液；

7.根据权利要求1所述基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述标准品稀释液为含质量百分含量0.1～2％的BSA、质量百分含量0.1～1％的PEG、质量百分含量0.5～5％的Prionex、质量百分含量0.1～0.5％的明胶和体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300的PBS缓冲液；

8.根据权利要求1～7中任意一项所述基于N蛋白的检测猪流行性腹泻病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述质控品包括质控品1和质控品2；所述质控品1为0～10U的抗血清，质控品2为100U～160U的抗血清；

9.权利要求1～8中任意一项所述试剂盒在非诊断目的的检测猪流行性腹泻病毒抗体中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒抗体样本为猪流行性腹泻疫苗免疫样本或自然感染样本；

所述试剂盒的抗体检测范围为0U～640U。