CN118112255A - 一种检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒及其应用 - Google Patents
一种检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒及其应用，属于体外诊断产品技术领域。所述试剂盒包括偶联猪德尔塔冠状病毒N蛋白的磁微粒悬浊液和酶标抗体溶液。与商品ELISA检测试剂盒相比，本发明提供的基于N蛋白检测猪德尔塔冠状病毒抗体试剂盒不仅能高特异性、高准确性的检测猪血清中猪德尔塔冠状病毒的抗体，并且具有自动化、高敏感性、高重复性检测特点，具有较高的市场竞争力。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断产品技术领域，具体涉及一种检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒及其应用。
背景技术
猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一种新型猪肠道冠状病毒，可引起呕吐、水样腹泻、脱水和食欲下降等，各年龄段的猪群均易感，但主要引起新生仔猪的腹泻。仔猪一旦感染其发病突然、传播迅速，一般持续腹泻3～4d会因脱水而死，其病死率大概30％～40％，但有时可高达100％。
现有技术检测猪德尔塔冠状病毒抗体的技术方法有病毒中和实验、酶联免疫吸附(ELISA)、试纸条等，其中，中和实验需要进行活毒操作，实验条件苛刻，安全防护级别要求较高，临床应用较少；虽然试纸条检测方便，但是不能定量；故ELISA是目前使用最为广泛的检测方法，但其缺点在于耗时较长、自动化困难。所以建立一种能高敏感性、全自动化、快速检测猪德尔塔冠状病毒抗体的方法很有必要。
化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)技术是将化学发光体系和免疫学方法结合起来的一种诊断技术，通过将免疫信号放大转化为化学发光信号，检测发光强度从而检测相应物质的含量。第一代的CLIA技术是在发光板上进行反应，除底物变为化学发光体系外，其余步骤和ELISA基本相同，故也存在大量检测费时费力、自动化难度高等问题。第二代CLIA技术使用纳米材料作为固相反应载体，使得抗原抗体反应在反应管中以更接近液相的体系进行，即管式化学发光法，其减少空间位阻的影响，使得抗原抗体反应更为充分，从而实现自动化、高敏感性检测。虽然此方法已经用于人医乙肝三项、肿瘤标志物等的检测，兽医上也开始使用此方法检测口蹄疫O、A、Asia 1型抗体等，但是由于检测对象的不同，使用抗原、抗体等关键原料不同，其检测体系并不能通用，检测效果相差很大。因此，使用优质生物材料建立化学发光免疫分析法检测猪德尔塔冠状病毒抗体，实现检测的高敏感性、高通量、自动化检测仍然具有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，基于N蛋白作为检测抗原，能够特异性检测猪血清中猪德尔塔冠状病毒抗体，并且实现自动化、高敏感性、高重复性检测。
本发明提供了一种检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，包括偶联猪德尔塔冠状病毒N蛋白的磁微粒悬浊液和酶标抗体溶液。
优选的，所述偶联猪德尔塔冠状病毒N蛋白的磁微粒悬浊液中，磁微粒和猪德尔塔冠状病毒N蛋白的质量比为1000：(1～10)。
优选的，所述猪德尔塔冠状病毒N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述酶标抗体溶液中酶为碱性磷酸酶；
所述抗体为抗猪IgG。
优选的，所述试剂盒还包括以下任意一种或几种：稀释液、样本稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、浓缩洗涤液和发光底物。
优选的，所述稀释液为pH值7的0.1M的MOPS缓冲液；
所述MOPS缓冲液为含有质量百分含量为0.1％～2％的BSA、0.01％～0.5％的Tween-20、0.01％～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl2、0.01～0.5M的NaCl、0.05％～3％的水解乳蛋白和0.1％～1％的PEG 6000的水溶液。
优选的，所述浓缩洗涤液为含有体积浓度0.1％～0.5％的Tween-20的pH值7的PBS缓冲液或者含有体积浓度0.1％～0.5％的Tween-20的pH值8的0.05M的Tris缓冲液；
所述样本稀释液为含质量百分含量0.1～2％的BSA、质量百分含量0.1～1％的PEG6000、质量百分含量0.5～5％的Prionex、质量百分含量0.1～0.5％的明胶和体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300的PBS缓冲液。
所述阳性对照血清为猪德尔塔冠状病毒N蛋白高免血清使用血清稀释液稀释8倍的血清。
本发明提供了所述检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒在非诊断目的的检测猪德尔塔冠状病毒抗体中的应用。
优选的，所述应用中检测样本包括德尔塔冠状病毒的自然感染血清样本或人工免疫血清样本。
本发明提供了一种检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，包括偶联猪德尔塔冠状病毒N蛋白的磁微粒悬浊液和酶标抗体溶液。本发明基于猪感染猪德尔塔冠状病毒早期，可以检测到抗N蛋白的高水平抗体，因此，本发明提供了一种基于N蛋白作为检测抗原的管式磁微粒化学发光试剂盒，将磁微粒偶联猪德尔塔冠状病毒N蛋白，建立管式化学发光免疫分析检测方法，使得抗体和磁微粒上的猪德尔塔冠状病毒蛋白发生特异性反应。可见，本发明提供的试剂盒可通过全自动化学发光免疫分析仪定量检测猪德尔塔冠状病毒特异性抗体含量，使用本试剂盒测试攻毒及免疫样本符合率高。本试剂盒能实现自动化、高敏感性、高重复性检测，其检测步骤少、使用方便、操作简单，可供检测猪德尔塔冠状病毒抗体使用。
同时，所述试剂盒还限定了稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液等，使得试剂盒在试用期内各个组分保持稳定，加之使用自动化仪器检测，检测重复性好。
附图说明
图1为猪德尔塔冠状病毒N蛋白的纯化鉴定结果；泳道M为Marker，泳道1～3表示重组N蛋白；
图2为不同病原抗体阳性血清使用本试剂盒检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，包括偶联猪德尔塔冠状病毒N蛋白的磁微粒悬浊液和酶标抗体溶液。
在本发明中，所述试剂盒的检测原理为将偶联有猪德尔塔冠状病毒N蛋白的磁微粒悬浊液和待检样本中抗N蛋白抗体特异性结合形成二元复合物，在磁场力作用下去除溶液，经洗涤和重悬，再与酶标抗体溶液反应，形成三元复合物，在磁场力作用下去除溶液，洗涤洗和重悬，再添加发光底物，检测发光度，抗体含量以S/N值判定标准，比值越大则特异性抗体的含量越高。S/N计算方法：待测血清发光度与阴性对照血清发光度的比值。
在本发明中，所述偶联猪德尔塔冠状病毒N蛋白的磁微粒悬浊液中，磁微粒和猪德尔塔冠状病毒N蛋白的质量比优选为1000：(1～10)，更优选为1000：3～8，更优选为1000：5。所述磁微粒优选包括Fe3O4磁微粒，粒径为0.1～5μm，表面官能团为羟基、羧基、氨基、环氧基或磺酰基的磁性微粒。所述磁微粒购自JSR公司3μm的羧基磁珠。所述猪德尔塔冠状病毒N蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:1所示，为猪德尔塔冠状病毒强毒力中国分离株CH/XJYN/2016(保藏编号：CGMCC No.17383)N蛋白，在大肠杆菌重组表达时稳定表达，且具有纯度高、成分均一的特点。所述偶联猪德尔塔冠状病毒N蛋白的磁微粒悬浊液的工作浓度优选为0.2mg/mL～0.7mg/mL，更优选为0.5mg/mL。
在本发明中，所述酶标抗体溶液中酶优选为碱性磷酸酶。本发明实施例中所述碱性磷酸酶购自sigma公司。所述抗体优选为山羊抗猪IgG，优选购自Abcam公司。所述酶标抗体溶液的工作浓度优选为1:1万～1:5万，更优选为1:4万。所述偶联猪德尔塔冠状病毒N蛋白的磁微粒悬浊液和酶标抗体溶液作为反应体系成分捕获目标抗体。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括以下任意一种或几种：稀释液、样本稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、浓缩洗涤液和发光底物。
在本发明中，所述稀释液优选为pH值7的0.1M的MOPS缓冲液。所述MOPS缓冲液优选为含有质量百分含量为0.1％～2％的BSA、0.01％～0.5％的Tween-20、0.01％～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl2、0.01～0.5M的NaCl、0.05％～3％的水解乳蛋白和0.1％～1％的PEG 6000的水溶液。所述稀释液的作用是用于稀释偶联猪德尔塔冠状病毒N蛋白的磁微粒悬浊液和酶标抗体溶液。
在本发明中，所述浓缩洗涤液优选为含有体积浓度0.1％～0.5％的Tween-20的pH值7的PBS缓冲液或者含有体积浓度0.1％～0.5％的Tween-20的pH值8的0.05M的Tris缓冲液。所述浓缩洗涤液的作用是用于反应过程中洗涤使用。所述浓缩洗涤液在使用时稀释倍数优选为25倍。
在本发明中，所述样本稀释液优选为含质量百分含量0.1～2％的BSA、质量百分含量0.1～1％的PEG 6000、质量百分含量0.5～5％的Prionex、质量百分含量0.1～0.5％的明胶和体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300的PBS缓冲液。所述样本稀释液的作用是用于阳性对照血清制备。
在本发明中，所述发光底物与酶的种类相适应。当酶标抗体溶液中酶为碱性磷酸酶时，发光底物为金刚烷胺。所述发光底物的浓度优选为0.1g/L～1.0g/L，更优选为0.5g/L。
所述阳性对照血清为猪德尔塔冠状病毒N蛋白高免血清使用血清稀释液稀释8倍的血清。所述高免血清是指经10倍稀释后检测仍为阳性的抗血清。
本发明提供了所述检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒在非诊断目的的检测猪德尔塔冠状病毒抗体中的应用。
在本发明中，所述应用中检测样本优选包括德尔塔冠状病毒的自然感染血清样本或人工免疫血清样本。
下面结合实施例对本发明提供的一种检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种猪德尔塔冠状病毒N蛋白的表达和纯化方法
1.主要试验材料
PDCoV(Gen Bank登录号:MN064712)毒株由中国农业科学院兰州兽医研究所国家重点实验室保存；
大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自宝生物工程(北京)有限公司；
三色预染蛋白Marker(10kDa～250kDa)购自上海雅酶生物医药科技有限公司；
高亲和Ni-NTA纯化介质购于德国凯杰生物公司；
Tris、NaCl、Na2CO3、NaHCO3、Urea、IPTG、卡那霉素等常规试剂购于上海生工生物工程公司；
山羊抗猪IgG(HRP)购于Abcam公司；
猪PDCoV阴性、阳性参考血清由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫防控技术团队制备并保存。
2.PET-24a-N重组表达载体的构建方法
PDCoVN基因(编码PDCoVN蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO:1，交由金开瑞生物公司优化合成并构建于PET-24a载体上，转化BL21(DE3)感受态细胞。
3.重组蛋白的表达与纯化
将重组表达菌株BL21-PET-24a-N接种于含50μg/mL卡那霉素的1000ml LB液体培养基中，在37℃，220r/min摇床振荡培养4～5h直至OD600值达到0.6～0.8时，向其中加入终浓度为0.1mmol/LIPTG进行诱导表达，继续培养6h后离心收集菌体。将收集的菌体用1/20培养体积的BufferA(20mM Tris，300mMNaCl，pH 8.0)充分重悬，置冰上进行超声破碎裂解，当菌液完全破碎变清亮时再次离心并分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，分析该融合蛋白的表达形式。收集含有目的蛋白的样品，参考Ni-NTASuperflow Cartridge手册进行镍柱亲和层析纯化PET-24a-N重组蛋白，纯化后的蛋白样品进行SDS-PAGE分析其纯度。收集纯度高的蛋白样品用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，并将其稀释至1mg/ml，装入透析袋中，置于100倍蛋白体积的透析Buffer 1(20mM Tris，300mM NaCl，2MUrea，pH 8.0)中缓慢搅拌透析12h，然后从透析Buffer 1中取出，置于透析Buffer2(20mM Tris，300mMNaCl，pH 8.0)中缓慢搅拌透析12h，收集透析好的蛋白溶液，重新测定蛋白浓度，并用0.22μm滤器过滤，进行无菌分装，短时间4℃保存，长时间-80℃保存备用。
4.重组蛋白的纯化结果
SDS-PAGE结果显示，重组蛋白主要以包涵体形式表达，分子量大小约为42kDa，与预期一致。进一步经镍柱亲和层析纯化，获得了纯度较高(≥90％)的重组蛋白(见图1)。
实施例2
一种检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒及其制备方法
试剂盒包括偶联有猪德尔塔冠状病毒N蛋白的磁微粒悬浊液、酶标抗体溶液、稀释液、样本稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、浓缩洗涤液和发光底物。
其中，所述稀释液为pH值7的0.1M的MOPS缓冲液。MOPS缓冲液为含有质量百分含量为0.1％～2％的BSA、0.01％～0.5％的Tween-20、0.01％～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl2、0.01～0.5M的NaCl、0.05％～3％的水解乳蛋白和0.1％～1％的PEG 6000的水溶液。
样本稀释液为含质量百分含量0.1～2％的BSA、质量百分含量0.1～1％的PEG6000、质量百分含量0.5～5％的Prionex、质量百分含量0.1～0.5％的明胶和体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300的PBS缓冲液；
浓缩洗涤液为含体积百分含量0.1～0.5％的Tween-20的pH值为7.0的0.01M的PBS缓冲液或者含体积百分含量0.1～0.5％的Tween-20的pH值为8.0的0.05M Tris缓冲液；
发光底物为含有0.5g/L金刚烷胺的水溶液；
阳性对照血清的制备方法为：高免血清进行8倍稀释制备为阳性对照血清。
阴性对照血清的制备方法为：由阴性猪直接采血按常规方法制备；
偶联有猪德尔塔冠状病毒N蛋白的磁微粒悬浊液的制备方法，包括以下步骤：
1)磁微粒活化
取1mg磁珠，分别用pH 5.00.1M 2-吗啉乙磺酸(MES)稀释至10mg/ml，用磁铁充分吸附磁珠，弃去上清液，进行清洗，重复清洗1次。再加入100μL0.1M MES(pH5.0)，混匀磁珠。
从-20℃取出1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，恢复至室温。称取EDC、NHS。分别用0.1M MES(pH5.0)溶解，配制成10mg/ml。
分别向磁珠中加入NHS溶液10μL、EDC溶液10μL，常温混匀反应30min。清洗磁珠：用磁铁充分吸附磁珠，弃去上清液，再加入100μL 0.1MMES(pH值5.0)，混匀磁珠。制得活化磁微粒。
2)磁微粒偶联蛋白
在步骤1)活化磁微粒溶液中加入蛋白5μg，混匀，常温震荡包被3h。加入10μL封闭液，常温震荡封闭3h。用洗涤液(1×洗液)清洗3次，用4ml保存液分散为磁微粒工作液，4℃储存。
酶标抗体溶液的制备方法，包括以下步骤：
1)AP酶活化：将15mg/ml高碘酸钠(NaIO4)和10mg/mlAP以质量比为1.5:1的比例混合混震荡混匀，37℃反应30min；再加入等体积乙二醇(1％)，4℃45min，AP活化完成。
2)AP酶标记兔抗猪抗体
用pH值9.6、0.5M碳酸盐缓冲液将兔抗猪抗体透析过夜，加入到上述活化AP酶液中，AP:Ab为2:1(m:m)，置于pH值9.6的0.5M碳酸盐缓冲液中透析，4℃过夜。
在上述混合液中按每mg碱性磷酸酶加入80μL的NaBH4(2mg/ml)，4℃，2h，使用超滤管5000r/min，离心10min，换液浓缩标记物，用含甘油50％的PBS溶解，用酶标抗体稀释液1：50000稀释为酶标抗体工作液，4℃备用。
阳性对照血清制备包括以下步骤：
1)使用纯化后的猪德尔塔冠状病毒N蛋白免疫90日龄SPF猪，颈部肌肉注射接种。总共进行3次免疫，免疫间隔为30天，在第3次免疫后21天，采集颈部静脉血，3000rpm离心，分离血清，为高免血清。
2)高免血清使用血清稀释液稀释8倍后制备为阳性对照血清，按照1ml/管分装，-80℃保存。
阴性对照血清制备包括以下步骤：
1)选择猪德尔塔冠状病毒抗原、抗体阴性猪作为阴性对照血清制备动物。(病原用PCR或者RT-PCR方法检测，抗体用ELISA方法检测)
2)猪德尔塔病毒阴性对照血清由上述阴性猪直接采血，按照常规方法制备。采集颈部静脉血，3000rpm离心，分离血清，按照1ml/管分装，-80℃保存。
实施例2
一种检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒的检测方法
1.检测前准备
1.1样本要求
血清样本若在一周内检测，可置2℃～8℃条件下保存，若超过一周检测，应置于-15℃以下冷冻保存。
1.2试剂平衡
使用前，将试剂从冷藏中取出，常温放置20min以上，平衡至室温后使用。
1.3磁微粒试剂重新悬浮
第一次装机前，需要混合磁微粒试剂，使运输过程中沉淀下来的磁微粒重新悬浮。首次装载磁微粒试剂后，无需进一步混合。
1.4溶液配制
洗液(1×洗液)：将本试剂盒配备的25×浓缩洗液用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。
1.5仪器准备
阅读仪器说明书，按已经确定的条件设置好仪器参数，放置相关试剂、样本、所需耗材，开始检测(具体设置方式参考仪器说明书)。
2.对照血清测试
检测阴性及阳性对照血清，检测值必须在参考范围内，方可继续样品检测，阴性对照血清发光度小于100000、阳性对照血清发光度在500000～700000范围内时，实验成立。如下情况需检测对照血清：
a.每次试剂盒批号改变；
b.至少24小时内需检测1次。
3.样品检测
a.取10μl待检样品，加入25μl磁性微粒工作液、55μl酶标抗体工作液，37℃孵育10分钟；
b.清洗4次，加入酶标抗体工作液100μl，37℃孵育10分钟；
c.清洗4次，加入100μl化学发光底物，孵育3分钟；读取发光值。
4.结果
①判定依据：S/N≥2.5为阳性，S/N＜2.5为阴性，其中S为待测血清发光度，N为阴性对照血清发光度。
②判定：检测完成后，查看样品猪德尔塔冠状病毒发光度，判断样品猪德尔塔冠状病毒抗体阴阳性。
实施例3
猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)不同检测抗原检测血清抗体的灵敏度和特异性
取背景清楚的40份阳性血清和40份阴性血清，分别用PDCoVN(SEQ ID NO:1，MAAPVVPTTDASWFQVLKAQNKKATHPQFRGNGVPLNSAIKPVE NHGYWLRYTRQKPGGTPIPPSYAFYYTGTGPRGNLKYGELPPNDTPATTRVTWVKGSGADTSIKPHVAKRNPNNPKHQLLPLRFPTGDGPAQGFRVDPFNARGRPQERGSGPRSQSVNSRGTGNQPRKRDQSAPAAVRRKTQHQAPKRTLPKGKTISQVFGNRSRTGANVGSADTEKTGMADPRIMALARHVPGVQEMLFAGHLESNFQAGAITLTFSYSITVKEGSPDYERLKDALNTVVNQTYEPPTKPTKDKKPDKQDQSAKPKQQKKPKKVTLPADKQDWEWDDAFEIKQESAA)、S(SEQ ID NO:2，MQRALLIMTLLCLVRAKFADDLLDLLTFPGAHR LLHKPTGNSSTLYSRANNNFDVGVLPGYPTKNVNLFSPLTNSTLPINGLHRSYQPLMLNCLTKITNHTLSMYLLPSEIQTYSCGGAMVKYQSHDAVRIILDLTATDHISVEVVGQHGENYVFVCSEQFNYTTALHNSTFFSLNSELYCFTNNTYLGILPPDLTDFTVYRTGQYYANGYLLGTLPITVNYVRLYRGHLSANSAHFALANLTDTLITLTNTTISQITYCDKSVVDSIACQRSSHEVEDGFYSDPKSAVRARQRTIVTLPKLPELEVVQLNISAHMDFGEARLDSVTINGNTSYCVTKPYFRLETNFMCTGCTMNLRTDTCSFDLSAVNNGMSFSQFCLSTESGACEMKIIVTYVWNYLLRQRLYVTAVEGQTHTGTTSVHATDTSSVITDVCTDYTIYGVSGTGIIKPSDLLLHNGIAFTSPTGELYAFKNITTGKTLQVLPCKTPSQLIVINNTVVGAITSSNSTENNRFTTTIVTPTFFYSTNATTFNCTKPVLSYGPISVCSDGAIAGTSTLQNTRPSIVSLYDGEVEIPSAFSLSVQTEYLQVQAEQVIVDCPQYVCNGNSRCLQLLAQYTSACSNIEAALHSSAQLDSREIINMFQTSTQSLQLANITNFKGDYNFSSILTTRLGGRSAIEDLLFNKVVTSGLGTVDQDYKACSRDMAIADLVCSQYYNGIMVLPGVVDAEKMAMYTGSLTGAMVFGGLTAAAAIPFATAVQARLNYVALQTNVLQENQKILAESFNQAVGNISLALSSVNDAIQQTSEALNIVAIAIKKIQTVVNQQGEALSHLTAQLSNNFQAISTSIQDIYNRLEEVEANQQVDRLITGRLAALNAYVTQLLNQMSQIRQSRLLAQQKINECVKSQSPRYGFCGNGTHIFSLTQTAPNGIFFMHAVLVPNKFTRVNAFAGICVDNTRGYSLQPQLILYQFNNSWRVTPRNMYEPRLPRQADFIQLTDCSVTFYNTTAANLPNIIPDVIDVNQTVSDIIDNLPTATPPQWDVGIYNNTILNLTVEINDLQERSKNLSQIADRLQNYIDNLNNTLVDLEWLNKVETYLKWPWYIWLAIALALIAFVTILITIFLCTGCCGGCFGCCGGCFGLFSKKKRYTDDLPTPSFKFKEW)、M(SEQ ID NO:3，MSDAEEWQIIVFIAIIWALGVILQGGYATR NRVIYVIKLILLWLLQPFTLVVTIWTAVDRSSKKDAVFIVSIIFAVLTFISWAKYWYDSIRLLIKTRSAWALSPESRLLAGIMDPMGTWRCIPIDHMAPILTPVVKHGKLKLHGQELANGISVRNPPQDMVIVSPSDTFHYTFKKPVESNNDPEFAVLIYQGDRASNAGLHTITTSKAGDARLYKYM)作为检测抗原按照实施例2的方法进行检测。其中PDCoV S、M蛋白按照实施例1记载的方法制备对应的重组表达蛋白。
结果见表1。以N蛋白作为检测抗原的灵敏性(97.5％)和特异性(97.5％)均最高。
表1PDCoV不同抗原检测结果比较
实施例4
一种检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式化学发光试剂盒的特性
1.试剂盒的敏感性
1.1猪德尔塔冠状病毒攻毒、免疫样本及阴性样本的制备方法
阴性样本：选取背景清楚的1月龄猪(无PDCoV感染，且未经过疫苗免疫)，进行荧光定量检测和血清学检测确定为PDCoV阴性，采集血清为阴性样本；
攻毒血清样本制备：上述方法筛选的PDCoV阴性猪12头口服5ml PDCoV攻毒，并在21天采血，测定抗体效价；
免疫血清样本制备：选取上述PDCoV阴性猪，肌肉注射1ml灭活的PDCoV，并在第21天加强免疫一次，然后在强免后14天采集血清为免疫样本。
1.2检测方法
选取上述制备的猪德尔塔冠状病毒攻毒、免疫样本及阴性样本进行测试。
结果如表2所示。测试攻毒样本12份，免疫样本8份，阴性样本14份，与血清背景符合率为100％。阳性样本共计20份，检出率为100％，试剂盒敏感性高。
表2攻毒、免疫、阴性样本检测结果
2.试剂盒的特异性
分别选取不同病原抗体阳性血清，包括口蹄疫O型、A型免疫猪血清、猪德尔塔冠状病毒、塞尼卡谷病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、非洲猪德尔塔冠状病毒6种相关病原抗体阳性样本，使用本试剂盒进行检测。
结果如图2所示，检测对照血清样本抗体含量最高，其余6种样本均为阴性，故本试剂盒特异性好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，包括偶联猪德尔塔冠状病毒N蛋白的磁微粒悬浊液和酶标抗体溶液。
2.根据权利要求1所述检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述偶联猪德尔塔冠状病毒N蛋白的磁微粒悬浊液中，磁微粒和猪德尔塔冠状病毒N蛋白的质量比为1000：(1～10)。
3.根据权利要求1所述检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述猪德尔塔冠状病毒N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1所述检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体溶液中酶为碱性磷酸酶；
所述抗体为抗猪IgG。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下任意一种或几种：稀释液、样本稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、浓缩洗涤液和发光底物。
6.根据权利要求5所述检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述稀释液为pH值7的0.1M的MOPS缓冲液；
所述MOPS缓冲液为含有质量百分含量为0.1％～2％的BSA、0.01％～0.5％的Tween-20、0.01％～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl2、0.01～0.5M的NaCl、0.05％～3％的水解乳蛋白和0.1％～1％的PEG 6000的水溶液。
7.根据权利要求5所述检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含有体积浓度0.1％～0.5％的Tween-20的pH值7的PBS缓冲液或者含有体积浓度0.1％～0.5％的Tween-20的pH值8的0.05M的Tris缓冲液；
所述样本稀释液为含质量百分含量0.1～2％的BSA、质量百分含量0.1～1％的PEG6000、质量百分含量0.5～5％的Prionex、质量百分含量0.1～0.5％的明胶和体积百分含量0.01～0.5％的ProClin300的PBS缓冲液。
8.根据权利要求5所述检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述阳性对照血清为猪德尔塔冠状病毒N蛋白高免血清8倍稀释后的抗血清。
9.权利要求1～8中任意一项所述检测猪德尔塔冠状病毒抗体管式磁微粒化学发光试剂盒在非诊断目的的检测猪德尔塔冠状病毒抗体中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述应用中检测样本包括德尔塔冠状病毒的自然感染血清样本或人工免疫血清样本。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication |