CN115541877A - 一种管式化学发光免疫分析技术检测口蹄疫病毒非结构蛋白3abc抗体的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于管式化学发光免疫分析技术检测口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的试剂盒及其应用，属于体外检测技术领域。本发明提供的试剂盒包括磁微粒偶联3ABC融合蛋白、酶标3A抗体、标准品、稀释液、浓缩洗涤液和发光底物。本发明所述试剂盒能检测猪、牛、羊血清中3ABC的特异性抗体，并且实现定量、自动化、高敏感性、高重复性检测，与ELISA检测试剂盒相比具有明显的优势。

Description

一种管式化学发光免疫分析技术检测口蹄疫病毒非结构蛋白 3ABC抗体的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种管式化学发光免疫分析技术检测口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的试剂盒。
背景技术
口蹄疫(Food-and-Mouth Disease，FMD)是一种由口蹄疫病毒(Food-and-MouthDisease Virus，FMDV)引起的偶蹄动物共患烈性传染病，患病群体包括重要经济畜种猪、牛、羊、鹿、骆驼和20多个科70多个种的野生动物。FMDV可通过动物直接接触或间接接触污染物及空气等进行传播，感染后发病率100％，是一种全球性的传染性疫病，被世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)列法定报告病之一，因其传染特征和防控难度，自1514年人类首次报道口蹄疫至今，世界范围内仍然有很多地区流行。FMDV有A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3(South Africa type,SAT)7种不同血清型，根据近几年的相关报道，全球范围内除C型未见报到外，其他6种都有流行，防控形势依然严峻。
目前，检测FMDV的技术包括病毒分离鉴定、病毒中和实验、实时荧光PCR、酶联免疫吸附(ELISA)等，病毒分离鉴定和中和实验都需要进行活毒操作，实验条件苛刻，安全防护级别要求较高，临床应用较少；实时荧光定量PCR对样本和实验室要求较高，且容易污染出现假阳性。
大多数国家以免疫灭活疫苗为主要防控措施，因为灭活疫苗中不含有或含有少量非结构蛋白(Non-structural protein，NSP)，故可以通过检测NSP抗体来鉴别FMD感染或免疫情况，其中3ABC抗体则被普遍认为是检测FMD感染的金标准，目前报道的ELISA检测试剂盒操作相对简单、样本要求不高，故使用最为广泛，但其缺点在于耗时较长、不能准确定量检测、自动化困难。
化学发光免疫分析(CLIA)技术是将化学发光体系和免疫学方法结合起来的一种诊断技术，通过将免疫信号放大转化为化学发光信号，检测发光强度从而检测相应物质的含量。第一代的CLIA技术是在发光板上进行反应，除底物变为化学发光体系外，其余步骤和ELISA基本相同，故也存在大量检测费事费力、自动化难度高等问题。第二代CLIA技术使用纳米材料作为固相反应载体，使得反应在反应管中以更接近液相的体系进行，即管式化学发光法，其减少空间位阻的影响，使得抗原抗体反应更为充分，从而实现自动化、高敏感性检测。虽然此方法已经用于人医乙肝三项、肿瘤标志物等的检测，兽医上也开始使用此方法检测口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体等，但是由于检测物的不同，其检测体系并不能通用，该技术在口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的检测中还未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于管式化学发光免疫分析技术检测口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的试剂盒及其应用，能够准确定量检测动物血清中3ABC的特异性抗体，并且实现自动化、高敏感性、高重复性检测目的。
本发明提供了一种基于管式化学发光免疫分析技术检测口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的试剂盒，包括磁微粒偶联3ABC融合蛋白、酶标抗体、稀释液、标准品、标准品稀释液、浓缩洗涤液和发光底物；
所述酶标抗体中抗体为3A单克隆抗体。
优选的，所述3A单克隆抗体是由杂交瘤细胞株3A24分泌得到。
优选的，所述标准品为标准抗血清。
优选的，所述稀释液为0.1M pH7的MOPS缓冲液；
所述MOPS缓冲液含有质量浓度0.1～2％的BSA、体积浓度0.01～0.5％的Tween-20、体积浓度0.01～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl2、0.01～0.5M的NaCl、质量浓度0.05～3％的水解乳蛋白和质量浓度0.1～1％的PEG 6000。
优选的，所述标准品稀释液为0.1M pH值7的PBS缓冲液；
所述PBS缓冲液含有质量浓度0.1％～2％的BSA、质量浓度0.1～1％的PEG、质量浓度0.5～5％的海藻糖、质量浓度0.1～0.5％的明胶和体积浓度0.01～0.5％的ProClin300。
优选的，所述浓缩洗涤液为含体积浓度0.1％～0.5％Tween-20的pH值7的PBS缓冲液或含体积浓度0.1％～0.5％的Tween-20的0.05M pH值8的Tris缓冲液。
优选的，酶标抗体的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；
所述发光底物与酶标抗体中的酶对应。
本发明提供了所述试剂盒在鉴别口蹄疫病毒自然感染动物与疫苗免疫动物中的应用。
优选的，所述鉴别灭活疫苗免疫动物和自然感染动物的方法，包括以下步骤：
将待测样本血清与磁微粒偶联3ABC融合蛋白工作液、酶标抗体工作液混合孵育，磁分离，洗涤固相后与发光底物孵育，读取发光值，将发光值带入标准曲线中，计算3ABC抗体含量，根据判断3ABC抗体含量待测样本是灭活疫苗免疫动物还是自然感染动物：抗体含量≥200U，为非结构蛋白抗体阳性，判为口蹄疫病毒感染样本；抗体含量＜200U，为非结构蛋白抗体阴性，判为灭活疫苗免疫样本或未免疫样本。
本发明提供了一种基于管式化学发光免疫分析技术检测口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的试剂盒，包括磁微粒偶联3ABC融合蛋白、酶标抗体、稀释液、标准品、标准品稀释液、浓缩洗涤液和发光底物；所述酶标抗体中抗体为3A单克隆抗体。本发明以磁微粒偶联3ABC融合蛋白，使反应在更接近液相环境中进行，减少空间位阻的影响，抗原抗体反应更为充分，实现比板式化学发光更高的敏感性；同时免疫反应在试管中进行，配套自动化化学发光免疫分析仪、标准曲线，可实现精准定量、全自动化检测；酶标记3A单克隆抗体能够与待检血清中3ABC抗体竞争性结合偶联在磁微粒的3ABC融合蛋白，检测速度快，23min即可完成检测；同时所述试剂盒通过配制的标准品、标准品稀释液、稀释液，使得试剂盒在试用期内各个组分保持稳定，保证检测重复性好。
同时本发明提供的试剂盒可通过全自动化学发光免疫分析仪定量检测口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体，和目前使用的检测方法和试剂盒相比，能实现自动化、高敏感性、高重复性检测，其检测步骤少、使用方便、操作简单，适于口蹄疫病毒感染动物与免疫动物的鉴别诊断。
本发明提供了所述试剂盒在鉴别灭活疫苗免疫动物和自然感染动物中的应用。基于本发明所述试剂盒检测3ABC抗体，具有高敏感性、高重复性检测特点，同时基于灭活疫苗中非结构蛋白3ABC不含或含量极低的特点，检测得到阴性样品可准确判断为灭活疫苗免疫样品，而自然感染的FMDV含有大量非结构蛋白3ABC，血清中含有大量对应的抗体，因此，检测样本为阳性时判断为自然感染样本。可见，本发明提供的应用具有检测方便、操作简单、检测快速的特点，能够用于临床鉴别诊断口蹄疫病毒自然感染动物与疫苗免疫动物。
附图说明
图1为口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC管式化学发光抗体检测试剂盒标准曲线；
图2为不同病原抗体阳性血清使用本试剂盒检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种基于管式化学发光免疫分析技术检测口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的试剂盒，包括磁微粒偶联3ABC融合蛋白、酶标抗体、稀释液、标准品、标准品稀释液、浓缩洗涤液和发光底物；所述酶标抗体中抗体为3A单克隆抗体。
在本发明中，所述试剂盒包括磁微粒偶联3ABC融合蛋白。所述磁微粒偶联3ABC融合蛋白中磁微粒的粒径优选为0.1～5μm，更优选为0.5～4μm，更优选为3μm。所述磁微粒以Fe3O4为核心，表面官能团为羟基、羧基、氨基、环氧基或磺酰基。在本发明中，所述磁微粒的获取途径购自JSR公司。所述3ABC融合蛋白的重组表达优选参见现有技术制备得到(曹轶梅,刘在新,卢曾军,等.口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的高效表达[J].畜牧兽医学报,2004,35(1):115-118；曹轶梅,卢曾军,刘在新,等.大肠埃希氏菌表达FMDV3ABC非结构蛋白的纯化复性与活性检测[J].中国兽医科技,2003,33(8):22-25.)。所述3ABC融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述磁微粒偶联3ABC融合蛋白的制备方法，优选包括以下步骤(一种口蹄疫O、A、AsiaI型抗体多重管式化学发光检测试剂盒，专利号：ZL201910646270.2)。本发明实施例结果表明，分别以3ABC融合蛋白和3AB为抗原与磁微粒偶联对3ABC抗体进行检测，结果表明3ABC融合蛋白作为抗原具有更高的检测敏感性。
在本发明中，所述试剂盒包括酶标抗体。所述酶标抗体中抗体为3A单克隆抗体。所述3A单克隆抗体优选是由杂交瘤细胞株3A24分泌得到。所述杂交瘤细胞株3A24为申请人在前报道的一种已知杂交瘤细胞株，具体参见现有技术(FuY,LiP,CaoY,WangN,SunP,ShiQ,etal.Development of a Blocking ELISA Using a Monoclonal Antibody to a DominantEpitope in Non-Structural Protein 3A of Foot-and-Mouth Disease Virus,as aMatching Test for a Negative-Marker Vaccine.PLoSONE.2017:12(1):0170560.)。所述酶标抗体的酶为本领域公知的酶种类即可，例如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)。本发明对酶标抗体的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶标方法即可。本发明实施例中验证，采用3A单克隆抗体作为检测抗体，比3B单克隆抗体具有更高的检测灵敏度。
在本发明中，所述试剂盒包括稀释液。所述稀释液用于稀释磁微粒偶联3ABC融合蛋白和酶标抗体至各自的工作浓度，形成工作液。所述稀释液优选为0.05～0.2M pH值7的MOPS缓冲液；所述MOPS缓冲液优选含有质量浓度0.1％～2％的BSA、体积浓度0.01～0.5％的Tween-20、体积浓度0.01～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl2、0.01～0.5M的NaCl、质量浓度0.05％～3％的水解乳蛋白和质量浓度0.1～1％的PEG 6000，更优选为含有质量浓度1％的BSA、体积浓度0.1％的Tween-20、体积浓度0.1％的ProClin300、0.2M的MgCl2、0.2M的NaCl、质量浓度0.1％的水解乳蛋白和质量浓度0.5％的PEG。
在本发明中，所述标准品优选为口蹄疫病毒感染动物血清。所述口蹄疫病毒感染动物血清为采自口蹄疫病毒感染后1～3个月的牛，经检测，非结构蛋白抗体与结构蛋白抗体均为阳性，经分离纯化、无菌处理后加保存剂制备。所述分离纯化的方法优选为血清经过8000r/min离心30min,用亲和层析柱纯化。所述标准品的制备方法，优选为将标准阳性血清用口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC阻断ELISA试剂盒标定10个梯度抗体含量的标准品，根据其抑制率大小定义其抗体含量分别为:0U、2.5U、5U、10U、20U、40U、80U、160U、320U、640U。其中抗体的含量单位为U，1U是通过口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC阻断ELISA抗体检测试剂盒(购自兰州兽研生物科技有限公司)检测临界点血清的方法定义。
在本发明中，所述试剂盒包括标准品稀释液。所述标准品稀释液为0.05～0.2M pH值7的PBS缓冲液；所述PBS缓冲液含有质量浓度0.1％～2％的BSA、质量浓度0.1～1％的PEG、质量浓度0.5～5％的海藻糖、质量浓度0.1～0.5％的明胶和体积浓度0.01～0.5％的ProClin300，更优选为含有质量浓度0.1％的BSA、质量浓度0.5％的PEG、质量浓度2％的海藻糖、质量浓度0.2％的明胶和体积浓度0.1％的ProClin300。
在本发明中，所述试剂盒包括浓缩洗涤液。所述浓缩洗涤液为含体积浓度0.1％～0.5％Tween-20的pH值7的PBS缓冲液或者含体积浓度0.1％～0.5％的Tween-20的0.05M pH值8的Tris缓冲液，更优选为含体积浓度0.2％～0.4％Tween-20的pH值7的PBS缓冲液或者含体积浓度0.2％～0.4％的Tween-20的0.05M pH值8的Tris缓冲液，更优选为含体积浓度0.3％Tween-20的pH值7的PBS缓冲液或者含体积浓度0.3％的Tween-20的0.05M pH值8的Tris缓冲液。所述浓缩洗涤液在使用时，优选稀释10～30倍，更优选为15～25倍，最优选为25倍。
在本发明中，所述试剂盒包括发光底物。所述发光底物与酶标抗体中辣根过氧化物酶、磷酸酯酶或碱性磷酸酶相对应即可。
在本发明中，所述试剂盒中磁微粒偶联3ABC融合蛋白工作液的浓度优选为0.2～0.5mg/ml，更优选为0.3～0.4mg/ml，最优选为0.35mg/ml。酶标抗体工作液的浓度优选为1:500～1:5000，更优选为1:2000～1:3000，最优选为1:2500。洗涤液的工作浓度为稀释25倍。
在本发明中，所述试剂盒通过用偶联口蹄疫3ABC融合蛋白的磁性微粒取代96孔板，使得反应在移动的反应管中进行，可实现检测的全自动化，同时实现精准定量、高敏感性、高重复性检测。所述试剂盒的检测特异性较高。
本发明提供了所述试剂盒在鉴别口蹄疫病毒自然感染动物与灭活疫苗免疫动物中的应用。
在本发明中，所述鉴别灭活疫苗免疫动物和自然感染动物的方法，优选包括以下步骤：
将待测样本血清与磁微粒偶联3ABC融合蛋白工作液、酶标抗体工作液混合孵育，磁分离，洗涤固相后与发光底物孵育，读取发光值，将发光值带入标准曲线中，计算3ABC抗体含量，根据判断3ABC抗体含量待测样本是灭活疫苗免疫还是自然感染：抗体含量≥200U，为非结构蛋白抗体阳性，判为口蹄疫病毒感染样本；抗体含量＜200U，为非结构蛋白抗体阴性，判为灭活疫苗免疫样本或未免疫样本。
在本发明中，所述标准曲线优选如公式I所示：
y＝14102.97+(1360648.205-14102.97)/(1+(x/0.9373)1.0821) 公式I
其中x为抗体含量，y为相对发光强度，可以通过代入检测样本的发光强度，计算出待检样本的抗体含量。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于管式化学发光免疫分析技术检测口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种基于管式化学发光免疫分析技术检测口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的试剂盒的制备方法
1.参考以下文献进行非结构蛋白3ABC融合蛋白的表达、纯化及复性。
曹轶梅,刘在新,卢曾军,等.口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的表达[J].畜牧兽医学报,2004,35(1):115-118。
曹轶梅,卢曾军,刘在新,等.大肠埃希氏菌表达FMDV 3ABC非结构蛋白的纯化复性与活性检测[J].中国兽医科技,2003,33(8):22-25。
1.1非结构蛋白3ABC蛋白鉴定结果
3ABC融合蛋白通过包涵体纯化、亲合层析等纯化过程后，经过SDS-PAGE电泳分析，目的蛋白的纯度达到了90％以上，电泳显示3ABC融合蛋白分子量大小为49kDa，与预期大小一致。
2.3A单克隆抗体的制备及鉴定，参考以下文献：
FuY,LiP,CaoY,WangN,SunP,ShiQ,et al.Development of a Blocking ELISAUsing a Monoclonal Antibody to a Dominant Epitope in Non-Structural Protein3A of Foot-and-Mouth Disease Virus,as a Matching Test for a Negative-MarkerVaccine.PLoSONE.2017:12(1):0170560.
3A单克隆抗体的纯度与含量鉴定结果
纯化单抗通过SDS-PAGE电泳检测纯度可达95％以上，3A单抗含量为1.951mg/ml，共制备50mg，分装为1ml/管，保存于-70℃超低温冰箱中备用。
3.磁微粒偶联3ABC融合蛋白工作液的制备方法
取1mg磁珠，分别用0.1M 2-吗啉乙磺酸(MES)(pH 5.0)稀释至10mg/ml，用磁铁充分吸附磁珠，弃去上清液，再加入100μL 0.1M MES(pH值5.0)，混匀磁珠，重复清洗操作1次。
从-20℃取出1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，恢复至室温。称取EDC、NHS。分别用0.1M MES(pH5.0)溶解，配制成10mg/ml。
分别向磁珠中加入NHS溶液10μl，再加入EDC溶液10ul,常温混匀反应30min。清洗磁珠：用磁铁充分吸附磁珠，弃去上清液，再加入100μL 0.1M MES(pH值5.0)，混匀磁珠。
分别在上述活化磁珠中加入待包被口蹄疫3ABC蛋白30ug，混匀磁珠。室温震荡包被3h。封闭加入10ul 10％BSA溶液，室温震荡封闭3h。用清洗液(1×洗液)清洗3次，用4ml保存液分散为磁微粒工作液，4℃储存。
4.酶标抗体工作液的制备方法
4.1 AP酶活化：配制高碘酸钠(NaIO4)15mg/ml，AP 10mg/ml，以m:m为1.5:1反应，震荡混匀，37℃，反应30min；加入和混合液等体积的乙二醇(1％)，4℃，45min，AP活化完成，备用。
4.2 AP标记单克隆抗体
用pH值9.6 0.5M碳酸盐缓冲液将3ABC蛋白透析过夜，加入到上述的活化AP混合液中，AP:Ab为2:1(m:m)，将混合液置于pH9.6 0.5M碳酸盐缓冲液中透析，4℃过夜。
在上述混合液中分别加入NaBH4 80μl/mgAP(2mg/ml)，4℃，2h，使用超滤管5000r/min,离心10min，换液浓缩标记物，用含甘油50％的PBS溶解，-20℃保存，使用时用酶标抗体稀释液1：50000稀释为酶标抗体工作液，4℃备用。
5.标准品、质控品的制备方法
5.1 3ABC抗体高浓度血清的制备方法
采自口蹄疫病毒感染后1个月的牛，经检测，非结构蛋白抗体与结构蛋白抗体均为阳性，经无菌处理后加保存剂制备，并–20℃以下保存备用。
5.2 3ABC抗体高浓度标准血清的纯化方法
纯水冲洗AKTA蛋白纯化仪管道3次，接入蛋白纯化Protein A柱，纯水平衡直至仪器各项参数稳定，换0.02M磷酸盐缓冲液(PB)仪器各项参数稳定，进样1ml/5ml，用0.02M磷酸盐缓冲液(PB)洗脱杂质，后用0.1M柠檬酸缓冲液(SSC)洗脱样本，在UV在200以上接样，调pH值至7.0，用紫外分光光度计检测在260nm和280nm的吸光度，计算抗体浓度，备用。
5.3标准品的制备与标定
使用标准品稀释液梯度稀释5.2制备的抗体，使用口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC阻断ELISA抗体检测试剂盒(购自兰州兽研生物科技有限公司)进行检测，检测结果如表1所示，在1：64时，阻断ELISA检测结果变为阴性，故1：32和1：64的标准品作为ELISA检测的临界血清。管式化学发光检测结果如表2所示，在检测1：64以及1：128、1：256的血清时，和前一稀释倍数血清的检测结果比值分别是11.27、7.85、3.66，敏感性很好。阻断ELISA的判定标准为“血清样本PI值不低于50％，判为非结构蛋白抗体阳性，小于50％判为非结构蛋白抗体阴性”，介于CLIA方法敏感性较高，故我们定义1：64稀释的血清(即ELISA检测结果PI为44％的血清)抗体含量为10个活性单位即10U，则标准品1～标准品10的抗体含量如表2所示，分别为0U、2.5U、5U、10U、20U、40U、80U、160U、320U、640U，其中0U、2.5U、10U、40U、160U、640U作为校准品1～标准品6。
表1标准品3ABC抗体结果1(阻断ELISA)
Figure BDA0003851617740000091
Figure BDA0003851617740000101
表2标准品3ABC抗体结果1(CLIA)
Figure BDA0003851617740000102
6.标准曲线的制备
口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体标准品抗体含量分别是0U、2.5U、5U、10U、20U、40U、80U、160U、320U、640U，分别取上述不同浓度的标准品不小于300ul于1.5ml尖底离心管，置于专用样品架，放入全自动化学发光仪样品仓中，按要求设置全自动化学发光仪各项参数，开始检测检测反应步骤如下(为仪器全自动)：
(1)取50μl待检样品、标准品、阴阳性血清，加入反应杯中；
(2)加入15μl磁性微粒工作液、50μl酶标抗体工作液，37℃孵育20分钟；
(3)清洗4次，加入100μl化学发光底物，孵育3分钟；
(4)读取发光值。
(5)标准曲线制作：用化学发光仪检测化学发光值，以抗体浓度为横坐标，发光值(RLU)为纵坐标，绘制四参数标准曲线y＝a+(b-a)/(1+(x/c)d)，标准曲线如图1所示。
7.一种口蹄疫非结构蛋白3ABC管式化学发光抗体检测试剂盒成分及组装
取上述制备的磁性微粒工作液，浓度为0.35mg/ml。
酶标抗体溶液，浓度为1:2500。
按不同规格分别分装至试剂船磁珠瓶和酶标抗体瓶，装入试剂船架上，组成“口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体检测的化学发光反应体系”；
配制浓缩液为25×PBST；
发光底物(武汉瀚海新酶生物科技有限公司，HH3605)分装100ml/瓶；
分装阴性血清和抗体含量为20U的标准品5作为质控品1、质控品2。
按相应规格需求组装口蹄疫非结构蛋白3ABC管式化学发光抗体检测试剂盒
实施例2
一种基于管式化学发光免疫分析技术检测口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的试剂盒的检测步骤
1检测前准备
1.1样本要求
采集血清后制备血清用于检测，离心前，必须保证血清样本完全凝固。分离血清后，置于无菌血清管中，若在一周内检测，可置2℃～8℃条件下保存，若超过一周检测，应置于-15℃以下冷冻保存。
1.2磁微粒试剂重新悬浮
第一次装机前，需要混合磁微粒试剂，使运输过程中沉淀下来的磁微粒重新悬浮。首次装载磁微粒试剂后，无需进一步混合。
1.3溶液配制
洗液(1×洗液)：将本试剂盒配备的25×浓缩洗液用无离子水或蒸馏水做1:25稀释；
1.4仪器准备
阅读仪器说明书，按已经确定的条件设置好仪器参数，放置相关试剂、样本、所需耗材，开始检测。(具体设置方式参考仪器说明书)。
2.标准曲线校准
取口校准品1～校准品6，抗体含量分别为0U、2.5U、10U、40U、160U、640U，按仪器说明书对标准曲线进行校准，校准后标准曲线R2≥0.99时，可进行质控品检测。
1.7质控
需要时检测质控品，检测值必须在参考范围内，方可继续样品检测，如下情况需检测质控品：
a.每次试剂盒批号改变或校准后；
b.至少24小时内需检测1次。
2样品检测
a.取50μl待检样品、标准品、阴阳性血清，加入反应杯中；
b.加入15μl磁性微粒工作液、50μl酶标抗体工作液，37℃孵育20分钟；
c.清洗4次，加入100μl化学发光底物，孵育3分钟；
d.读取发光值，计算浓度。
3结果
检测完成后，按仪器说明查样品口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体含量，判断样品口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体阴阳性。
4结果判定依据
抗体活性含量≥200判为口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体阳性，抗体活性含量＜200判为口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体阴性。
实施例3
一种基于管式化学发光免疫分析技术检测口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的试剂盒的检测特性
试剂盒的敏感性与灵敏度
1.1对阳性血清进行梯度稀释，分别用管式CLIA和ELISA进行检测，检测结果如表3所示，ELISA检测显示：OD(阴性样本)/OD(原倍P++)为10.85倍，OD(阴性样本)/OD(1：256)为1.18倍；而CLIA检测结果分别为210.61倍、3.66倍，相对于ELISA，CLIA检测结果阴阳性检测结果差值更大，敏感性更好。
表3敏感性检测结果
Figure BDA0003851617740000131
1.2分别用本试剂盒和阻断ELISA对背景为阳性的34份血清进行检测，检测结果如表4所示，本试剂盒检测35份血清结果均为阳性，和背景符合率100％；ELISA检测35血清中有3份阴性，其和背景符合率为91.4％；但三份血清的PI值分别为42.29％、43.30％、49.67％，接近“PI≥50％判为口蹄疫非结构蛋白3ABC阳性，小于50％判为口蹄疫非结构蛋白3ABC阴性”的临界值，可以看出，本试剂盒敏感性较高。
表4 35份阳性血清检测结果
Figure BDA0003851617740000132
Figure BDA0003851617740000141
Figure BDA0003851617740000151
2.试剂盒的特异性
2.1口蹄疫疫苗免疫前后检测结果
本试剂盒目的是检测口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体，从而区分口蹄疫病毒感染动物和疫苗免疫动物，故我们对50头猪口蹄疫抗体阴性的牛进行免疫，疫苗为“口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(O/MYA98/BY/2010株+Re-A/WH/09株)”，购自“中农威特科技有限公司”。50头猪分别免疫了三次，采集免疫前和3免后的血清，使用本试剂盒进行检测。检测结果如表5所示，可以看到，本试剂盒检测3免后的血清抗体含量比免疫前稍高，但是和表4中的3ABC抗体阳性比较，则抗体含量很低，按本试剂盒的判定标准，免疫前和3免后的血清检测结果均判为阴性。本试剂盒具有较高特异性。
表5口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗免疫50头猪免疫前后检测结果
Figure BDA0003851617740000152
Figure BDA0003851617740000161
Figure BDA0003851617740000171
2.2其他病原检测结果
分别选取不同病原血清，包括口蹄疫感染样本、牛结节皮肤病病毒、猪瘟病毒、羊痘病毒、塞内卡病毒、猪瘟呼吸与繁殖综合征病毒、口蹄疫O型免疫、口蹄疫A型免疫、非洲猪瘟病毒9种相关病原抗体阳性样本，使用本试剂盒进行检测，结果如图1所示，检测对照血清样本，3ABC抗体含量最高，其余8种样本检测3ABC抗体含量很低，均为阴性。故本试剂盒特异性很好。
3.检测重复性
选取3份样品(1份强阳，1份可疑，1份阴性)，分两批试剂盒检测，每一批次分别检测5次，检测结果如表6所示，样本1、样本2、样本3的CV(％)值分别是1.35％、3.42％、8.57％，在检测阴性样本时，由于数值整体较低，检测CV偏高，但整体来看，本试剂盒重复性较好。
表6重复性试验检测结果
Figure BDA0003851617740000172
Figure BDA0003851617740000181
本发明所述试剂盒通过用偶联口蹄疫3ABC融合蛋白的磁性微粒取代96孔板，使得反应在移动的反应管中进行，可实现检测的全自动化，同时实现精准定量、高敏感性、高重复性检测，且结果以活性单位(U)表示，计算结果及判定方法适用于实际使用，符合实际要求，有利于各个诊断方法检测结果之间的统一与比较。
实施例4
3A、3B单克隆抗体作为检测抗体实验结果比较
在建立方法初期，对3A、3B单克隆抗体(李永亮,田美娜,卢曾军,等.口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体的制备和鉴定[J].江苏农业学报,2009,25(2):296-300.)进行碱性磷酸酶标记，分别和不同抗原配对，筛选最优抗原、抗体。在以3ABC蛋白为抗原偶联磁微粒时，3A、3B单克隆抗体分别标记碱性磷酸酶作为检测抗体，建立竞争法检测口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体，试验及结果如下。
1.实验方法：
建立竞争法，3ABC蛋白偶联磁珠、碱性磷酸酶标记3A、3B单克隆抗体同专利实施例1所述。
试验过程：①样本25μl，磁微粒25μl，酶标抗体150μl，37℃孵育20min
②洗涤液清洗4次，加100μl化学发光底物，37℃孵育3min，检测发光强度。
试验结果
2.1检测阴阳性血清
检测标准阴阳性血清，结果如表7所示，因为建立的竞争法，检测结果和样本抗体含量呈负相关，故N/P越大，检测效果越好。当以3B单克隆抗体为检测抗体时，非特异性反应强，N/P值比3A单克隆抗体为检测抗体时低。
表7 3A、3B单克隆抗体为检测抗体检测阴阳性对照结果
Figure BDA0003851617740000191
2.2检测临床样本结果
检测田间样本17份，其中阴性6份，阳性1份，检测结果如表2所示，其中阴性样本中N5号样本，两种方法检测结果都最低，故计算N5/P值，比较两种方法检测田间样本效果。检测结果如表8所示，以3A-AP为酶标抗体时，检测田间样本N5/P均比3A-AP为酶标抗体检测结果高。
表8 3A、3B单克隆抗体为检测抗体检测临床样本结果
Figure BDA0003851617740000192
Figure BDA0003851617740000201
综上，在初步筛选试验中，3A-AP为酶标抗体检测阴阳性对照、临床样本结果较好，故选择3A单克隆抗体为检测抗体，进行后续方法建立和优化。
实施例5
3AB、3ABC蛋白的比较
使用3AB、3ABC蛋白分别和3A-AP为酶标抗体配对，建立竞争法，分别计算N1/P，比较使用两种蛋白检测结果。
表9 3AB、3ABC分别作为抗原检测阴阳性对照检测结果
Figure BDA0003851617740000202
表10 3AB、3ABC分别作为抗原检测临床样本结果
Figure BDA0003851617740000203
Figure BDA0003851617740000211
如表9所示，检测阴阳性对照血清时，两种方法N1检测结果比N2低，使用3ABC为抗原检测阳性对照时N1/P为3.72和11.06，比3AB为抗原检测结果高。如表10所示，检测临床样本时，3ABC为抗原时计算V2/P，最高位34.53；3AB为抗原时，计算V1/P，最高为6.47，3ABC为抗原检测结果较好。
综上所述，3ABC蛋白为抗原检测时，检测阴阳性对照和临床样本结果较好，故选择3ABC蛋白为抗原进行后续方法建立及优化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于管式化学发光免疫分析技术检测口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的试剂盒，其特征在于，包括磁微粒偶联3ABC融合蛋白、酶标抗体、稀释液、标准品、标准品稀释液、浓缩洗涤液和发光底物；
所述酶标抗体中抗体为3A单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述3A单克隆抗体是由杂交瘤细胞株3A24分泌得到。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述标准品为标准抗血清。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述稀释液为0.05～0.2M pH 7的MOPS缓冲液；
所述MOPS缓冲液含有质量浓度0.1～2％的BSA、体积浓度0.01～0.5％的Tween-20、体积浓度0.01～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl2、0.01～0.5M的NaCl、质量浓度0.05～3％的水解乳蛋白和质量浓度0.1～1％的PEG 6000。
5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述标准品稀释液为0.05～0.2M、pH值7的PBS缓冲液；
所述PBS缓冲液含有质量浓度0.1％～2％的BSA、质量浓度0.1％～1％的PEG、质量浓度0.5％～5％的海藻糖、质量浓度0.1％～0.5％的明胶和体积浓度0.01％～0.5％的ProClin300。
6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含体积浓度0.1％～0.5％Tween-20的pH值7的PBS缓冲液或含体积浓度0.1％～0.5％的Tween-20的0.05MpH值8的Tris缓冲液。
7.根据权利要求1～6任意一项所述试剂盒，其特征在于，酶标抗体的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；
所述发光底物与酶标抗体中的酶对应。
8.权利要求1～7任意一项所述试剂盒在鉴别口蹄疫病毒自然感染动物与疫苗免疫动物中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述鉴别灭活疫苗免疫动物和自然感染动物的方法，包括以下步骤：
将待测样本血清与磁微粒偶联3ABC融合蛋白工作液、酶标抗体工作液混合孵育，磁分离，洗涤固相后与发光底物孵育，读取发光值，将发光值带入标准曲线中，计算3ABC抗体含量，根据判断3ABC抗体含量待测样本是灭活疫苗免疫还是自然感染：抗体含量≥200U，判为口蹄疫病毒感染样本，抗体含量＜200U，判为灭活疫苗免疫样本。
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