CN110297091B - 一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒 - Google Patents

一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒，属于抗体检测技术领域。本发明所述试剂盒包括口蹄疫O型抗体的化学发光反应体系和血清标准品，口蹄疫A型抗体化学发光反应体系和血清标准品，口蹄疫AsiaⅠ型抗体化学发光反应体系和血清标准品，以及浓缩洗涤液，发光底物。本发明所述试剂盒能够同时检测口蹄疫O、A、AsiaⅠ型的抗体，并且实现高通量、自动化、高敏感性、高特异性、高重复性、宽检测限检测。

Description

一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒
技术领域
本发明涉及抗体检测技术领域，具体涉及一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒。
背景技术
口蹄疫简介
口蹄疫(Food-and-Mouth Disease,FMD)是一种由口蹄疫病毒(Food-and-MouthDisease Virus,FMDV)引起的偶蹄动物共患烈性传染病，患病群体包括重要经济畜种猪、牛、羊、鹿、骆驼和20多个科70多个种的野生动物。FMDV可通过动物直间接触或间接接触污染物及空气等进行传播，感染后发病率100％，动物发病后表现各不相同，多数动物(如牛、猪等)发病后全身多处出现水泡、溃疡等，致使动物精神萎靡甚至幼崽的死亡，直接导致严重的经济损失，部分动物病症不明显，则成为病毒的长期携带者。FMD是一种全球性的传染性疫病，被世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)列法定报告病之一，因其传染特征和防控难度，自1514年人类首次报道口蹄疫至今，世界范围内仍然有很多地区流行，所以口蹄疫疫病的消灭和防控依然是世界各国共同面对的世界性问题。
FMDV属于小核糖核酸病毒科，有7种不同血清型，不同血清型之间无交叉保护。目前在我国流行的有O型、A型和Asial1型，其中O型、A型流行情况不容乐观，防控形势依然严峻。
化学发光免疫分析技术简介和优点
化学发光免疫分析(CLIA)技术是将化学发光体系和免疫学方法结合起来的一种诊断技术，通过将免疫信号放大转化为化学发光信号，检测发光值从而检测相应物质的含量。第一代的CLIA技术是在发光板上进行反应，除底物变为化学发光体系外，其余步骤和ELISA基本相同，故也存在大量检测费事费力、自动化难度高等问题；第二代CLIA技术使得反应在反应管中进行，即管式化学发光法，可实现准确定量、高敏感性、高通量检测、宽检测限、自动化检测、直接计算结果等优点。
现有诊断方法及试剂盒简介
现有检测FMDV的技术和试剂盒以免疫学诊断和分子生物学诊断为主，免疫学诊断技术以病毒中和试验、酶联免疫(ELISA)、免疫胶体金层析技术(GICA)为主流，其中ELISA方法和其他方法相比较有优势，故使用最为广泛，但其缺点在于不能准确定量检测、敏感度不够高、自动化困难，O、A、Asial1型同时大批量检测时任务量大、费事费力。口蹄疫病毒O型、A型和Asial1型在我国流行时间比较长，国内防控体系主要以免疫口蹄疫疫苗对动物进行防疫，需要定量检测血清中的抗体效价，以监测免疫的保护作用，所以建立一种能同时准确定量、高敏感性、高通量、全自动化、快速检测O型、A型和Asial1的方法很有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒。本发明所述试剂盒能够同时检测口蹄疫O、A、AsiaⅠ型的抗体，并且实现高通量、自动化、高敏感性、宽检测限检测。
本发明提供了一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包括口蹄疫O型抗体的化学发光反应体系和血清标准品，口蹄疫A型抗体化学发光反应体系和血清标准品，口蹄疫AsiaⅠ型抗体化学发光反应体系和血清标准品，浓缩洗涤液，发光底物；
所述口蹄疫O型抗体的化学发光反应体系包括磁性微粒包被的口蹄疫O型捕获抗体溶液，灭活的口蹄疫O型病毒抗原溶液和口蹄疫O型酶标检测抗体溶液；
所述口蹄疫A型抗体的化学发光反应体系包括磁性微粒包被的口蹄疫A型捕获抗体溶液，灭活的口蹄疫A型病毒抗原溶液和口蹄疫A型酶标检测抗体溶液；
所述口蹄疫AsiaⅠ型抗体的化学发光反应体系包括磁性微粒包被的口蹄疫AsiaⅠ型捕获抗体溶液，灭活的口蹄疫AsiaⅠ型病毒抗原溶液和口蹄疫AsiaⅠ型酶标检测抗体溶液。
优选的是，所述捕获抗体和酶标检测抗体分别独立的包括多克隆抗体或单克隆抗体。
优选的是，所述磁性微粒包括以Fe3O4为核心，表面官能团为羟基、羧基、氨基、环氧基或磺酰基的磁性微粒。
优选的是，灭活的口蹄疫O/A/Asial型病毒抗原为细胞培养的全病毒抗原。
优选的是，所述试剂盒检测及计算方法是：所述试剂盒检测结果以效价形式定量，具体计算方法是：通过以效价为横坐标，发光度(RLU)为纵坐标分别制作O/A/AsiaⅠ型标准曲线，然后分别代入加入待检血清后体系的RLU值，分别计算出待检血清中口蹄疫O/A/AsiaⅠ型抗体效价。
优选的是，所述灭活的口蹄疫O/A/Asial型病毒抗原溶液的制备方法分别包括以下步骤：细胞培养后，灭活、纯化、去脂，用稀释液稀释；所述稀释液为0.1M pH7的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液含有质量百分含量为0.1～2％的BSA、0.1～1％的PEG、0.5～5％的蔗糖、0.01～0.5％的Tween-20和0.01～0.5％的ProClin300。
优选的是，所述磁性微粒包被的口蹄疫O/A/Asial型捕获抗体溶液和口蹄疫O/A/Asial型酶标检测抗体溶液所用稀释液为0.1M pH7的MOPS缓冲液，所述MOPS缓冲液含有质量百分含量为0.1～2％的BSA、0.01～0.5％的Tween-20、0.01～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl2、0.01～0.5M的NaCl、0.05～3％的水解乳蛋白和0.1～1％的PEG。
优选的是，所述口蹄疫O/A/AsiaⅠ型血清标准品分别分为低效价标准品和高效价标准品，所述低效价标准品的低效价范围是1:8～1:256；所述高效价标准品的高效价范围是：1:512～1:2048，标准血清效价通过病毒中和试验和ELISA共同标定。
优选的是，所述酶标检测抗体使用的发光标记物包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标检测抗体的标记方法包括高碘酸钠法或戊二醛法；所述发光底物与发光标记物对应。
优选的是，所述浓缩洗涤液为pH7的PBS缓冲液或者0.05M pH8的Tris缓冲液，所述浓缩洗涤液还含有0.1～0.5％的Tween-20。
本发明提供了一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒。本发明所述试剂盒能够采用化学发光法(CLIA)，通过全自动化学发光仪定量检测样本中口蹄疫O、A、AsiaⅠA型病毒抗体效价。和目前使用的检测方法和试剂盒相比，利用本发明提供的试剂盒能同时检测口蹄疫O、A、AsiaⅠ型的抗体，并且实现高通量、自动化、高敏感性、高特异性、高重复性、宽检测限检测，检测步骤少、使用方便、操作简单，检测结束自动化发光仪自动计算血清抗体效价并判定阴阳性，在检测结果中显示。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的“一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒”口蹄疫O型抗体检测标准曲线；
图2本发明实施例1提供的“一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒”口蹄疫A型抗体检测标准曲线；
图3本发明实施例1提供的“一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒”口蹄疫AsiaⅠ型抗体检测标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包括口蹄疫O型抗体的化学发光反应体系和血清标准品，口蹄疫A型抗体化学发光反应体系和血清标准品，口蹄疫AsiaⅠ型抗体化学发光反应体系和血清标准品，浓缩洗涤液，发光底物；
所述口蹄疫O型抗体的化学发光反应体系包括磁性微粒包被的口蹄疫O型捕获抗体溶液，灭活的口蹄疫O型病毒抗原溶液和口蹄疫O型酶标检测抗体溶液；
所述口蹄疫A型抗体的化学发光反应体系包括磁性微粒包被的口蹄疫A型捕获抗体溶液，灭活的口蹄疫A型病毒抗原溶液和口蹄疫A型酶标检测抗体溶液；
所述口蹄疫AsiaⅠ型抗体的化学发光反应体系包括磁性微粒包被的口蹄疫AsiaⅠ型捕获抗体溶液，灭活的口蹄疫AsiaⅠ型病毒抗原溶液和口蹄疫AsiaⅠ型酶标检测抗体溶液。
在本发明中，所述捕获抗体和酶标检测抗体分别独立的包括多克隆抗体或单克隆抗体。
在本发明中，所述磁性微粒独立的包括以Fe3O4为核心，表面官能团为羟基、羧基、氨基、环氧基或磺酰基的磁性微粒。优选的，购自Thermofisher公司的羧基磁珠可用于本试剂盒。
在本发明中，灭活的口蹄疫O/A/Asial型病毒抗原为细胞培养的全病毒抗原，具有完整的抗原决定簇和非线性空间结构。在本发明中，所述口蹄疫O型病毒优选为O/MYA98/BY/2010，2010年采集自广东省广州市白云区，经国家口蹄疫参考实验室鉴定为O型，命名为O/MYA98/BY/2010；所述口蹄疫A型病毒优选为AF/72/1972，1972年采集自山东省肥城市，经国家口蹄疫参考实验室鉴定为A型，命名为AF/72/1972。；所述口蹄疫AsiaⅠ型病毒优选为AsiaⅠ/JLS/06，2006年采集自河南省周口，经国家口蹄疫参考实验室鉴定为AsiaⅠ型，命名为AsiaⅠ/JLS/06。所述灭活的口蹄疫O/A/Asial型病毒抗原均为细胞培养的全病毒抗原。
在本发明中，所述灭活的口蹄疫O/A/Asial型病毒抗原溶液的制备方法分别包括以下步骤：细胞培养后，灭活、纯化、去脂，用稀释液稀释；所述稀释液为0.1M pH7的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液含有质量百分含量为0.1～2％的BSA、0.1～1％的PEG、0.5～5％的蔗糖、0.01～0.5％的Tween-20和0.01～0.5％的ProClin300。本发明对所述灭活、纯化、去脂方法没有特殊限定，采用常规操作即可。
在本发明中，所述试剂盒检测及计算方法是：通过全自动化化学发光仪检测分别加入口蹄疫O/A/AsiaⅠ型标准品后体系的发光值(RLU值)、分别加入待检血清后体系的RLU值，根据标准品效价和RLU分别制作口蹄疫O/A/AsiaⅠ型标准曲线，然后在标准曲线中分别代入加入待检血清后体系的RLU值，分别计算出待检血清中口蹄疫O/A/AsiaⅠ型抗体效价。
在本发明中，所述酶标检测抗体使用的发光标记物包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标检测抗体的标记方法包括高碘酸钠法或戊二醛法；所述发光底物与发光标记物对应。
在本发明中，所述磁性微粒包被的口蹄疫O/A/AsiaⅠ型捕获抗体溶液和口蹄疫O/A/AsiaⅠ型酶标检测抗体溶液所用稀释液为0.1M pH7的MOPS缓冲液，所述MOPS缓冲液含有质量百分含量为0.1～2％的BSA、0.01～0.5％的Tween-20、0.01～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl2、0.01～0.5M的NaCl、0.05～3％的水解乳蛋白和0.1～1％的PEG。
在本发明中，所述口蹄疫O/A/AsiaⅠ型血清标准品分别分为低效价标准品和高效价标准品，所述低效价标准品的低效价范围是1:8-1:256；所述高效价标准品的高效价范围是：1:512-1:2048，标准血清效价通过病毒中和试验和ELISA共同标定。
在本发明中，所述浓缩洗涤液为pH7的PBS缓冲液或者0.05MpH8的Tris缓冲液，所述浓缩洗涤液还含有0.1～0.5％的Tween-20。
在本发明中，所述试剂盒检测的样品包括猪、牛、羊等偶蹄动物血清。
本发明通过待检血清中的口蹄疫O、A、AsiaⅠ型病毒抗体特异性结合灭活的口蹄疫O、A、AsiaⅠ型病毒抗原，阻断酶标记物与病毒抗原的结合，定量检测样本中口蹄疫O、A、AsiaⅠ型病毒抗体效价。本发明所述试剂盒通过全自动化化学发光仪检测加入标准品后体系的发光值(RLU值)、加入待检血清后体系的RLU值，根据标准品效价和RLU值做标准曲线，然后在标准曲线中代入加入待检血清后体系的RLU值，计算待检血清中口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ抗体效价。
本发明所述试剂盒采用磁性微粒包被捕获抗体，使得反应在反应管的全液相环境中进行，配套相应的全自动化学发光仪，通过加入化学发光底物，以检测到的发光信号强弱判定检测结果。本发明所述3个反应体系配套试剂盒其他组分及全自动化学发光仪，可同时分型、快速、高通量检测口蹄疫O、A、AsiaⅠ抗体3种口蹄疫抗体。
在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选包括以下步骤：(1)在反应管中分别加入口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体标准品或被检血清样品10～50ul，然后分别对应地加入磁性微粒包被的口蹄疫O、A、AsiaⅠ型捕获抗体溶液20～50ul、加入灭活的口蹄疫O、A、AsiaⅠ型病毒抗原溶液20～200ul；
(2)35～39℃下孵育10～20min；
(3)分别用磁铁于反应管壁一侧吸附5～20s，吸去上清液，加入洗涤液200～500ul，弃去上清液，重复操作2～3次。
(4)分别加入发光标记物标记的口蹄疫O、A、AsiaⅠ型酶标检测抗体溶液50～200ul；
(5)重复(2)、(3)操作步骤；
(6)加入发光底物50～150ul，35～39℃下反应0.5～10min；
(7)计算：用化学发光仪检测化学发光值，绘制四参数标准曲线Y＝(a-d)/[1+(x/c)*b]+d，根据标准曲线计算待检血清中抗体效价。
(8)判定：根据(7)计算得出的待检血清中抗体效价判定待检血清抗体阴阳性。
表1抗体阴阳性判定标准
抗体阴阳性 检测计算得效价
阳性 ≥100
阴性 ≤45
可疑 45＜效价＜100
下面结合具体实施例对本发明所述的一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒的制备
1.口蹄疫O、A、AsiaⅠ型病毒抗原的灭活、纯化、去脂
口蹄疫O、A、AsiaⅠ型病毒灭活：将制备好的二乙烯亚胺(BEI)分别加入除菌的口蹄疫O、A、AsiaⅠ型病毒液(使其最终浓度为0.002mol/L)，搅拌混匀，置30℃温箱，灭活28小时(期间每3-4小时搅拌一次，每次搅拌10-15min)。灭活结束，分别加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液(终浓度为2％)，充分搅拌均匀，待温度降至2-8℃，取样进行灭活检验，检验合格置于-20℃保存备用。
口蹄疫O、A、AsiaⅠ型病毒纯化：取上述灭活的O、A、AsiaⅠ型溶液，分别加入质量分数为4％的NaCl和质量分数为6％的PEG6000，4℃搅拌6h后静置过夜，8000r/min离心45min，取沉淀分别溶解于50mLpH 7.0的PBS溶液中。
口蹄疫O、A、AsiaⅠ型病毒去脂：取纯化的上述病毒溶液分别加入100mL三氯乙烯摇晃2min，8000r/mL离心20min，分别取上层水相为最终使用的O、A、AsiaⅠ型病毒抗原溶液，-20℃保存备用。
2.磁珠偶联口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型兔抗
2.1口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型兔抗纯化
分别纯化口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型兔抗，用纯水冲洗AKTA蛋白纯化仪管道3次，接入蛋白纯化ProteinA柱，纯水平衡直至仪器各项参数稳定，换0.02M磷酸盐缓冲液(PB)仪器各项参数稳定，进样1ml/5ml，用0.02M磷酸盐缓冲液(PB)洗脱杂质，后用0.1M柠檬酸缓冲液(SSC)洗脱样本，在UV在200以上接样，调PH至7.0，用紫外分光光度计检测在260nm和280nm的吸光度，计算抗体浓度，备用。
2.2磁珠偶联口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型兔抗
取1mg磁珠3份，分别用0.1M 2-吗啉乙磺酸(MES)(PH 5.0)稀释至10mg/ml，用磁铁充分吸附磁珠，弃去上清液，再加入100uL 0.1M MES(pH5.0)，混匀磁珠，重复清洗操作1次。
从-20℃取出1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，恢复至室温。称取EDC、NHS。分别用0.1M MES(pH5.0)溶解，配制成10mg/ml。
分别向磁珠中加入NHS溶液10ul,再加入EDC溶液10ul,常温混匀反应30min。清洗磁珠：用磁铁充分吸附磁珠，弃去上清液，再加入100uL 0.1M MES(pH5.0)，混匀磁珠。
分别在上述活化磁珠中加入待包被口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型兔抗10ug，混匀磁珠。室温震荡包被3h。封闭加入10ul 10％BSA溶液，室温震荡封闭3h。用清洗液清洗3次，用2ml保存液分散，4℃储存。
3.AP酶标记口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型豚抗
3.1口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型豚抗纯化
用纯水冲洗AKTA蛋白纯化仪管道3次，接入蛋白纯化Protein A柱，纯水平衡直至仪器各项参数稳定，换0.02M磷酸盐缓冲液(PB)仪器各项参数稳定，进样1ml/5ml，用0.02M磷酸盐缓冲液(PB)洗脱杂质，后用0.1M柠檬酸缓冲液(SSC)洗脱样本，在UV在200以上接样，调PH至7.0，用紫外分光光度计检测在260nm和280nm的吸光度，计算抗体浓度，备用。
3.2AP酶标记口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型豚抗
AP酶活化：配制高碘酸钠(NaIO4)15mg/ml，AP10mg/ml，以m:m为1.5:1反应，震荡混匀，4℃，反应1h；加入和混合液等体积的乙二醇(1％)，4℃，45min，AP活化完成，备用。
分别把口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型豚抗于pH9.6 0.5M碳酸盐缓冲液(CB)中透析，4℃过夜。然后将活化AP混合液分别加入透析的抗体中，AP:Ab为2:1(m:m)，将混合液置于pH9.60.5M碳酸盐缓冲液中透析，4℃过夜。
在上述混合液中分别加入NaBH480ul/mgAP(2mg/ml)，4℃，2h，加入等体积饱和硫酸铵4℃，2h，8000r/min,离心30min，弃上清，用含甘油50％的PBS溶解，-20℃保存，使用时用酶标记物保存液稀释。
4.一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒成分及组装
取上述制备的口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型捕获抗体包被的磁性微粒溶液，灭活的口蹄疫病毒抗原溶液和口蹄疫酶标检测抗体溶液，按所需浓度稀释后，按不同规格分别定量装入试剂船相应位置，组装成“口蹄疫O型抗体的化学发光反应体系”、“口蹄疫A型抗体的化学发光反应体系”、“口蹄疫AsiaⅠ型抗体的化学发光反应体系”；按照现有技术配制浓缩液和洗针液、化学发光底物等；口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型血清校准品效价为中国农业科学院兰州兽医研究所提供，效价分别为：口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型血清标准品效价分别为1:512、1:64。
按相应规格需求组装口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒，试剂盒包括：口蹄疫O型抗体的化学发光反应体系和血清标准品，口蹄疫A型抗体化学发光反应体系和血清标准品，口蹄疫AsiaⅠ型抗体化学发光反应体系和血清标准品，浓缩洗涤液，洗针液，化学发光底物。
5.一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒检测样本中口蹄疫、A、AsiaⅠ型抗体
5.1标准曲线的建立
口蹄疫O、A、AsiaⅠ型血清标准品(中国农业科学院兰州兽医研究所提供)，效价分别为：1:2048、1:1024、1:512、1:256、1:128、1:64、1:32、1:16、1:8、0，分别取上述标准品不小于300ul于1.5ml尖底离心管，置于专用样品架，放入全自动化学发光仪样品仓中，按要求设置全自动化学发光仪各项参数，开始检测检测反应步骤如下(为仪器全自动)：
(1)在反应管杯中分别加入10ul，然后对应加入磁性微粒包被的口蹄疫O、A、AsiaⅠ型捕获抗体溶液25ul、加入灭活的口蹄疫O、A、AsiaⅠ型病毒抗原溶液100ul；
(2)35～39℃下孵育10～20min；
(3)分别用磁铁于反应管壁一侧吸附5～20s，吸去上清液，加入洗涤液300ul，弃去上清液，重复操作3次。
(4)分别加入发光标记物标记的口蹄疫O、A、AsiaⅠ型酶标检测抗体溶液100ul；
(5)重复(2)、(3)操作步骤；
(6)加入发光底物100ul，35～39℃下反应0.5～10min；
(7)标准曲线制作：用化学发光仪检测化学发光值，以浓度(标准品效价)横坐标，发光值(RLU)为纵坐标，绘制四参数标准曲线Y＝(a-d)/[1+(x/c)*b]+d，标准曲线如图1、图2、图3所示。
5.2样本中口蹄疫、A、AsiaⅠ型抗体的检测
检测：取待检样本不小于300μL于1.5mL尖底离心管中，专用样品架，放入全自动化学发光仪样品仓中，按要求设置全自动化学发光仪各项参数，开始检测检测反应步骤及结果计算同5.1中的反应步骤(仪器全自动)。
结果：点击“结果”页面，查看相应样本的检测结果。
反应步骤及结果计算同5.1中的反应步骤(仪器全自动)：
(1)取待检样本各10ul分别加入反应管中，然后对应加入磁性微粒包被的口蹄疫O、A、AsiaⅠ型捕获抗体溶液25ul、加入灭活的口蹄疫O、A、AsiaⅠ型病毒抗原溶液100ul；
(2)35～39℃下孵育10～20min；
(3)分别用磁铁于反应管壁一侧吸附5～20s，吸去上清液，加入洗涤液300ul，弃去上清液，重复操作3次。
(4)分别加入发光标记物标记的口蹄疫O、A、AsiaⅠ型酶标检测抗体溶液100ul；
(5)重复(2)、(3)操作步骤；
(6)加入发光底物100ul，35～39℃下反应0.5～10min；
(7)结果及计算：用化学发光仪检测化学发光值，代入标准曲线，结算样本口蹄疫O、A、AsiaⅠ型中和抗体效价。
实施例2
试剂盒的特性
1.试剂盒的特异性试验
用本试剂盒和市售ELISA试剂盒检测多种相关病毒抗体的阳性血清86份，包括口蹄疫O型病毒抗体血清20份，口蹄疫A型病毒抗体血清20份，口蹄疫AsiaⅠ型病毒抗体血清20份，牛流行热病毒(BEFV)抗体血清3份，塞内卡病毒(SVV)抗体血清3份，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)抗体血清3份，猪圆环病毒2型(PCV2)抗体血清3份，羊痘病毒(QRFV)抗体血清3份，小反刍病毒(PPRV)抗体血清3份，健康猪血清抗体血清3份，健康牛血清抗体血清3份、健康羊血清抗体血清2份、
结果如表2所示，检测86份血清中，口蹄疫O型病毒抗体血清20份，口蹄疫A型病毒抗体血清20份，口蹄疫AsiaⅠ型病毒抗体血清20份血清共60份，检出率为98.3％，其中1份FMDA血清被检测为口蹄疫O型病毒抗体可疑，其余样本均100％检出；剩余56份血清检测结果均为阴性，特异性符合率100％，和市售ELISA试剂盒(兰州兽医研究所提供)相比，本试剂盒特异性较好。
表2 FMD不同来源血清检测结果
Figure BDA0002133528520000111
Figure BDA0002133528520000121
2.试剂盒的灵敏性
选取背景清楚的口蹄疫O型病毒抗体血清5份，口蹄疫A型病毒抗体血清5份，口蹄疫AsiaⅠ型病毒抗体血清5份，用1×PBST梯度稀释，用本试剂盒和市售ELISA试剂盒检测。
检测结果如表3所示：从本试剂盒检测结果可以看出，在上述15份样本稀释到1024倍的时候，本试剂盒的检出率是93.3％，ELISA试剂盒的检出率是80％，在稀释度为2048倍的时候，本试剂盒的检出率是80％，ELISA试剂盒的检出率是66.6％，故本试剂盒灵敏度较ELISA试剂盒稍好。
表3敏感性试验检测结果
Figure BDA0002133528520000122
3.试剂盒符合率试验
选取田间血清200份，用本试剂盒和市售ELISA试剂盒检测，检测结果如表4所示，本试剂盒检测阳性血清有124份，符合率是99.2％，检测出阴性血清是60份，符合率是96.77％，可疑血清是12份，总的符合率是98％，故本试剂盒符合率较高。
表4符合率实验结果统计
Figure BDA0002133528520000131
4.试剂盒重复性试验
选取3份样品，其中两份样本为口蹄疫病毒O型免疫血清，3份均为口蹄疫A型、AsiaⅠ型阴性，分两批试剂盒检测，每一批次分别检测5次，检测结果如表5所示(结果为口蹄疫病毒O型抗体检测结果)，样本1、样本2、样本3的CV(％)值分别是1.287％、4.360％、4.588％，故本试剂盒敏感性高。
表5重复性试验检测结果
Figure BDA0002133528520000132
本发明所述试剂盒通过用偶联口蹄疫A型兔抗的磁性微粒取代96孔板，使得反应在移动的反应管中进行，可实现检测的全自动化，同时实现高敏感性、宽检测限、重复性好以及高通量检测，且结果以效价形式表示，计算结果及判定方法适用于实际使用，符合行业实际要求，有利于各个诊断方法检测结果之间的统一与比较。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种口蹄疫O、A、Asia I型抗体多重管式化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括口蹄疫O型抗体的化学发光反应体系和血清标准品，口蹄疫A型抗体化学发光反应体系和血清标准品，口蹄疫Asia I型抗体化学发光反应体系和血清标准品，浓缩洗涤液，发光底物；
所述口蹄疫O型抗体的化学发光反应体系包括磁性微粒包被的口蹄疫O型捕获抗体溶液，灭活的口蹄疫O型病毒抗原溶液和口蹄疫O型酶标检测抗体溶液；
所述口蹄疫A型抗体的化学发光反应体系包括磁性微粒包被的口蹄疫A型捕获抗体溶液，灭活的口蹄疫A型病毒抗原溶液和口蹄疫A型酶标检测抗体溶液；
所述口蹄疫Asia I型抗体的化学发光反应体系包括磁性微粒包被的口蹄疫Asia I型捕获抗体溶液，灭活的口蹄疫Asia I型病毒抗原溶液和口蹄疫Asia I型酶标检测抗体溶液；
所述磁性微粒包括以Fe3O4为核心，表面官能团为羟基、羧基、氨基、环氧基或磺酰基的磁性微粒；
所述磁性微粒包被的口蹄疫O/A/Asial型捕获抗体溶液和口蹄疫O/A/Asial型酶标检测抗体溶液所用稀释液为0.1M pH7的MOPS缓冲液，所述MOPS缓冲液含有质量百分含量为0.1～2％的BSA、0.01～0.5％的Tween-20、0.01～0.5％的ProClin300、0.01～0.5M的MgCl2、0.01～0.5M的NaCl、0.05～3％的水解乳蛋白和0.1～1％的PEG；
所述灭活的口蹄疫O/A/Asial型病毒抗原溶液的制备方法分别包括以下步骤：细胞培养后，灭活、纯化、去脂，用稀释液稀释；所述稀释液为0.1M pH7的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液含有质量百分含量为0.1～2％的BSA、0.1～1％的PEG、0.5～5％的蔗糖、0.01～0.5％的Tween-20和0.01～0.5％的ProClin300。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体和酶标检测抗体分别独立的包括多克隆抗体或单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，灭活的口蹄疫O/A/Asial型病毒抗原为细胞培养的全病毒抗原。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测结果以效价形式定量，具体计算方法是：通过以效价为横坐标，发光度(RLU)为纵坐标分别制作O/A/Asia I型标准曲线，然后分别代入加入待检血清后体系的RLU值，分别计算出待检血清中口蹄疫O/A/AsiaI型抗体效价。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述口蹄疫O/A/Asia I型血清标准品分别分为低效价标准品和高效价标准品，所述低效价标准品的低效价范围是1∶8～1∶256；所述高效价标准品的高效价范围是：1∶512～1∶2048，标准血清效价通过病毒中和试验和ELISA共同标定。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标检测抗体使用的发光标记物包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标检测抗体的标记方法包括高碘酸钠法或戊二醛法；所述发光底物与发光标记物对应。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为pH7的PBS缓冲液或者0.05M pH8的Tris缓冲液，所述浓缩洗涤液还含有0.1～0.5％的Tween-20。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111856032A (zh) * 2020-07-21 2020-10-30 成都华西海圻医药科技有限公司 一种快速检测抗pd-l1单克隆抗体浓度的方法
CN114705857B (zh) * 2022-05-16 2023-03-21 北京亿森宝生物科技有限公司 猪口蹄疫病毒o型和a型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用
CN116068175A (zh) * 2022-09-07 2023-05-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于e2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1900115A (zh) * 2006-07-11 2007-01-24 中国农业科学院兰州兽医研究所 抗o型口蹄疫病毒的单克隆抗体制备方法及抗体和用途
CN101324579A (zh) * 2007-06-13 2008-12-17 清华大学 一种检测糖类抗原的磁性微粒子化学发光酶免疫分析试剂盒及其使用方法
CN101592664A (zh) * 2008-05-30 2009-12-02 北京科美东雅生物技术有限公司 乙肝e抗体磁微粒化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法
CN108333352A (zh) * 2018-01-29 2018-07-27 江苏拜明生物技术有限公司 一种o型口蹄疫抗体的高通量检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1900115A (zh) * 2006-07-11 2007-01-24 中国农业科学院兰州兽医研究所 抗o型口蹄疫病毒的单克隆抗体制备方法及抗体和用途
CN101324579A (zh) * 2007-06-13 2008-12-17 清华大学 一种检测糖类抗原的磁性微粒子化学发光酶免疫分析试剂盒及其使用方法
CN101592664A (zh) * 2008-05-30 2009-12-02 北京科美东雅生物技术有限公司 乙肝e抗体磁微粒化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法
CN108333352A (zh) * 2018-01-29 2018-07-27 江苏拜明生物技术有限公司 一种o型口蹄疫抗体的高通量检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法的建立;林密，等;《中国预防兽医学报》;20080831;第30卷(第8期);全文 *
PCV2 ELISA诊断试剂盒稳定剂的筛选与应用;董林，等;《中国兽医学报》;20120131;第32卷(第1期);全文 *

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