CN114544934A - 一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条及其应用，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条采用双抗体夹心荧光免疫层析法检测样品中的曲霉半乳甘露聚糖的含量。本发明提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条克服了ELISA方法的不足，具有即时检验产品的诸多优势，包括检测成本低、样本随到随检、操作简单、对人员的专业要求不高以及检测时间短，仅需简单样本处理、加样和读数三个步骤即可完成整个检测过程，具有检测快速、高灵敏度、高准确度的特点。

Description

一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条及其应用。
背景技术
侵袭性真菌病(invasive fungal disease，IFD)是指真菌侵入人体，在组织、器官或血液中生长、繁殖，并导致炎症反应及组织损伤的感染性疾病。国内外流行病学研究显示侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis，IA)的发病率逐年升高。长期中性粒细胞缺乏的患者、造血干细胞移植的患者、实体器官移植的患者、接受糖皮质激素治疗的患者、接受免疫抑制剂治疗的患者和进展期艾滋病的患者均为IA的高危人群。
在实体器官移植的患者人群中，IA导致的死亡率高达67％～82％，造成高死亡率的主要原因是不能早期诊断、及时治疗，因此早期诊断具有重要的意义。侵袭性曲霉病临床表现常无特异性，病情容易被原发病掩盖，造成漏诊、误诊而延误治疗时机，因此，在病情发展的早期建立快速且特异的IA诊断学方法是临床上迫切需要解决的问题。
曲霉特异性抗原(Galactomannan，GM)是曲霉细胞壁的主要成分，是曲霉感染后最早释放进入血液的标志性抗原，其释放量与感染程度相关，GM检测试验是主要的IA早期诊断方法。IA诊断方法主要包括镜检(组织病理学或细胞病理学)、培养、影像学、血清学(G试验或GM试验)和分子生物学检测。
目前国际市场上，主要使用法国伯乐的曲霉菌抗原检测试剂盒(酶联免疫法)来进行侵袭性曲霉感染的早期诊断。其敏感性达到1ng/mL，是目前国际公认的侵袭性曲霉病的诊断方法，并且纳入了最新的IFI(侵袭性真菌病)诊断标准中。目前国内已上市试剂盒产品均使用ELISA的检测方法，所述ELISA检测方法的操作步骤繁琐、检测耗时长、对操作者要求高，且无法实现即时检测，限制了用户使用场景。
因此，开发一种能克服ELISA方法不足，能够即时检测、低成本、操作简单且检测时间短的曲霉菌半乳甘露聚糖检测方法对IA早期诊断具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条及其应用，本发明提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条克服了ELISA方法的不足，具有即时检验产品的诸多优势，包括检测成本低、样本随到随检、操作简单、对人员的专业要求不高、检测时间短，能够在40min内出结果，仅需简单样本处理、加样和读数三个步骤即可完成整个检测过程。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条包括底板，所述底板上沿液体流动方向依次设置有样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
所述荧光垫上包埋有有荧光微球标记的抗体，包括荧光微球标记的曲霉半乳甘露聚糖抗体和荧光微球标记的鸡IgY抗体；
所述荧光微球标记的曲霉半乳甘露聚糖抗体为亲和素标记的荧光微球和生物素标记的抗体通过亲和素-生物素连接得到；
所述荧光微球标记的鸡IgY抗体为亲和素标记的荧光微球和生物素标记的鸡IgY抗体通过亲和素-生物素连接得到；
所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线；
所述检测线为含有曲霉半乳甘露聚糖抗体的检测线；
所述质控线为含有羊抗鸡IgY抗体的质控线。
本发明中，所述试纸条采用双抗体夹心荧光免疫层析法检测样品中的曲霉半乳甘露聚糖，试纸条在荧光垫上包埋荧光微球标记的曲霉半乳甘露聚糖抗体，在检测线包被曲霉半乳甘露聚糖抗体。若检测样本为阳性，其中的曲霉半乳甘露聚糖与荧光微球标记的曲霉半乳甘露聚糖抗体结合形成复合物，在层析作用下复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的曲霉半乳甘露聚糖抗体反应，形成免疫复合物而呈现荧光条带。曲霉半乳甘露聚糖是曲霉菌释放的由重复单元组成的多聚体抗原，其中含有多个重复的抗体结合位点，在荧光垫上曲霉半乳甘露聚糖与荧光微球标记的曲霉半乳甘露聚糖抗体结合形成的复合物，在经过检测线时，曲霉半乳甘露聚糖的其他位点与检测线上的曲霉半乳甘露聚糖抗体反应，形成双抗体夹心复合物。若检测样本为阴性，不会形成免疫复合物，在检测线处不会出现条带。使用荧光免疫分析仪扫描检测区得到荧光信号，结合导入标准曲线计算样品中对应的曲霉半乳甘露聚糖的含量。
优选地，所述荧光微球包括时间分辨荧光微球、cy5荧光微球、cy7荧光微球、FITC荧光微球或APC荧光微球等中的任意一种。
优选地，所述荧光微球表面带有官能团包括羧基、氨基或磺酸基等中的任意一种，优选为羧基时间分辨荧光微球。
优选地，所述荧光微球的粒径为50～200nm，例如可以是50nm、100nm、120nm、140nm、160nm、180nm或200nm等。
优选地，曲霉半乳甘露聚糖抗体为兔源抗体。
优选地，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条能检测烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和黑曲霉来源的样本。
本发明中，所述曲霉半乳甘露聚糖抗体为兔源单抗，与鼠源抗曲霉抗体相比较具有更高的亲和力和特异性，所述曲霉半乳甘露聚糖抗体可识别更多新型表位，易于识别小分子或半抗原。所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条能够识别四种曲霉菌，包括烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和黑曲霉；曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条检测四种不同来源的曲霉菌菌株提取的曲霉半乳甘露聚糖抗原反应的灵敏度一致。
本发明中，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的阳性检出率在95％以上，例如可以是95％、96％、97％、98％或99％等；所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的阴性检出率达到100％。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法包括如下步骤：
(1)处理样品垫；
(2)制备亲和素标记的荧光微球和生物素标记的抗体；
(3)将所述亲和素标记的荧光微球和生物素标记的抗体混合后，并包埋在荧光垫上；
(4)在硝酸纤维素膜上包被检测线和质控线；
(5)组装试纸条。
优选地，步骤(1)包括：
用样品垫处理液对样品垫进行处理，将处理后的样品垫烘干。
优选地，所述样品垫处理液中包括缓冲盐、缓释剂、助溶剂和封闭剂。
优选地，所述缓冲盐包括Tris，所述Tris在所述样品垫处理液中的浓度为100～120mmol/L，例如可以是110mmol/L、113mmol/L、115mmol/L、117mmol/L或120mmol/L等。
优选地，所述缓释剂包括PVP-K30，所述PVP-K30在所述样品垫处理液中的浓度为0.3wt％～0.8wt％，例如可以是0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％或0.8wt％等。
优选地，所述助溶剂包括Tween-20，所述Tween-20在所述样品垫处理液中的浓度为0.01wt％～1wt％，例如可以是0.01wt％、0.05wt％、0.1wt％、0.5wt％或1wt％等。
优选地，所述封闭剂包括BSA，所述BSA在所述样品垫处理液中的浓度为1wt％～3wt％，例如可以是1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％或3wt％等。
优选地，所述烘干的参数为湿度低于30％，温度30～40℃，时间1～24h。
在本发明中，使用样品垫处理液对样品垫处理均匀后放入30～40℃(例如可以是30℃、33℃、37℃或40℃等)，低湿度(≤30％，例如10％、15％、20％、25％或30％等)烘干1～24h(例如可以是1h、5h、10h、15h、20h或24h等)。
优选地，步骤(2)包括以下步骤：
a.将荧光微球溶液和MES缓冲液混合，得到荧光微球混合液，向荧光微球混合液中加入EDC溶液和NHS溶液混合，震荡反应活化荧光微球，离心收集沉淀，得到活化后的荧光微球；
b.稀释步骤a所得活化后的荧光微球，与亲和素混合，震荡反应，得到亲和素标记的荧光微球；
c.使用封闭液处理，离心收集沉淀，得到亲和素-荧光微球复合物；
d.N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的生物素与标记抗体混合，震荡，去除未结合生物素，得到生物素-抗体复合物。
优选地，步骤a中，所述MES缓冲液的浓度为10～100mmol/L，例如可以是10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/L或100mmol/L等。
优选地，步骤a中，所述荧光微球混合液中荧光微球的浓度为0.1wt％～1wt％，例如可以是0.1wt％、0.2wt％、0.4wt％、0.6wt％、0.8wt％或1wt％等。
优选地，步骤a中，所述EDC溶液的浓度为5～50mg/mL，例如可以是5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL或50mg/mL等。
优选地，步骤a中，所述NHS溶液的浓度为5～50mg/mL，例如可以是5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL或50mg/mL等。
优选地，步骤a中，荧光微球混合液、EDC溶液和NHS溶液混合的体积比为(20～100):1:1，例如可以是20:1:1、30:1:1、40:1:1、50:1:1、60:1:1、70:1:1、80:1:1、90:1:1或100:1:1等。
在本发明中，用EDC活化荧光微球上的羧基，与NHS联用能够增加荧光微球偶联的效率。EDC溶液的添加量过低会延长荧光微球的活化时间，降低活化效果；EDC溶液的添加量过高，残留的EDC会与抗体交联影响荧光微球与抗体的偶联反应。
优选地，步骤a中，所述震荡反应的温度为2～30℃，例如可以是2℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃等，时间为10～120min，例如可以是10min、30min、60min、90min或120min等。
优选地，步骤a中所述离心的转速为10000～20000g，例如可以是10000g、15000g、18000g或10000g等，离心的时间为10～30min，例如可以是10min、15min、20min、25min或30min等。
优选地，步骤b中，所述稀释液为HEPES溶液，所述HEPES溶液缓冲液的浓度为10～100mmol/L，例如可以是10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/L或100mmol/L等。
在本发明中，加入了大量的EDC溶液和NHS溶液，能够充分活化荧光微球，活化后，使用HEPES溶液对得到的微球进行洗涤，去除多余的EDC溶液和NHS溶液，能够防止残留的EDC与曲霉半乳甘露聚糖抗体发生交联，有利于后续抗体与荧光微球的偶联。
优选地，步骤b中，所述亲和素包括卵白亲和素或者链霉亲和素。
优选地，步骤b中，所述活化后的荧光微球与亲和素混合的质量比为(5～50):1，例如可以是5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1或50:1等。
优选地，步骤b中，所述震荡反应的温度为2～30℃，例如可以是2℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃等，时间为0.5～18h，例如可以是0.5h、1h、2h、5h、10h、15h或18h等。
在本发明中，所述封闭液为含氨基的氨基酸、多肽或者无关蛋白的溶液，加入封闭液，可以防止曲霉半乳甘露聚糖抗体的非特异性吸附，提高所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条检测的灵敏度。
优选地，步骤c中，所述封闭液包括甘氨酸、多聚赖氨酸、BSA、酪蛋白、脱脂奶粉、明胶、鱼精蛋白、卵清蛋白中任意一种或至少两种的组合，所述封闭液的浓度为0.1wt％～3wt％，例如可以是0.1wt％、0.5wt％、1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％或3wt％等。
优选地，步骤d中，所述标记抗体为曲霉半乳甘露聚糖抗体或鸡IgY抗体，所述标记抗体的浓度为1～10mg/mL，例如可以是1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL或10mg/mL等。
优选地，步骤d中，所述标记抗体和N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的生物素的摩尔数量比为(5～50):1，例如可以是5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1或50:1等，优选为(15～25):1。
优选地，步骤d中，所述震荡的温度为2～30℃，例如可以是2℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃等，时间为0.5～18h，例如可以是0.5h、1h、2h、5h、10h、15h或18h等。
优选地，步骤d中，所述去除未结合生物素的方法包括脱盐柱脱盐、透析或超滤。
优选地，步骤(3)包括：将步骤(2)所得的亲和素-荧光微球复合物和生物素-抗体复合物混合，并喷涂到荧光垫上，烘干荧光垫。
所述混合中亲和素-荧光微球复合物和生物素-抗体复合物的质量比为(2～20):1，例如可以是2:1、5:1、10:1、15:1或20:1等，优选为(5～10):1。
优选地，所述喷涂的使用量为2～20μL/cm，例如可以是2μL/cm、4μL/cm、6μL/cm、8μL/cm、10μL/cm、12μL/cm、14μL/cm、16μL/cm、18μL/cm或20μL/cm等，间距为4～10mm，例如可以是4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm等。
优选地，所述烘干的参数为湿度低于30％，温度30～40℃，时间1～4h。
在本发明中，所述烘干的温度为30～40℃(例如可以是30℃、33℃、37℃或40℃等)，低湿度(≤30％，例如10％、15％、20％、25％或30％等)烘干1～4h(例如可以是1h、2h、3h或4h等)。
优选地，步骤(4)包括：
使用曲霉半乳甘露聚糖抗体和羊抗鸡IgY抗体分别在硝酸纤维素膜上划线，并烘干。
优选地，所述曲霉半乳甘露聚糖抗体和羊抗鸡IgY抗体的包被量各自独立为0.5～2μL/cm，例如可以是0.5μL/cm、0.75μL/cm、1μL/cm、1.2μL/cm、1.4μL/cm、1.6μL/cm、1.8μL/cm或2μL/cm等。
优选地，所述烘干的参数为湿度低于30％，温度30～40℃，时间1～24h。
在本发明中，步骤(4)中所述烘干的温度为30～40℃(例如可以是30℃、33℃、37℃或40℃等)，低湿度(≤30％，例如10％、15％、20％、25％或30％等)烘干1～18h(例如可以是1h、5h、10h、15h或18h等)。
优选地，步骤(5)包括：
在PVC底板上依次粘贴组装硝酸纤维素膜、吸水垫、荧光垫和样品垫，组装后切割，得到所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
在本发明中，所述吸水垫和荧光垫各自独立地覆盖硝酸纤维素膜1～2mm，例如可以是1mm、1.5mm或2mm等，所述样品垫覆盖荧光垫1～2mm，例如可以是1mm、1.5mm或2mm等。
作为本发明的优选技术方案，所述的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法包括：
(1)处理样品垫
使用样品垫处理液对样品垫进行处理，所述样品垫处理液的配方为100～120mmol/L Tris、0.3wt％～0.8wt％PVP-K30、0.01wt％～1wt％Tween-20和1wt％～3wt％BSA，将处理后的样品垫在30～40℃、湿度不大于30％的条件下烘干1～24h。
(2)制备亲和素标记的荧光微球和生物素标记的抗体
a.将荧光微球溶液和10～100mmol/L的MES缓冲液混合，得到荧光微球浓度为0.1wt％～1wt％的荧光微球混合液，向荧光微球混合液中加入5～50mg/mL的EDC溶液和5～50mg/mL的NHS溶液混合，其中荧光微球混合液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为(20～100):1:1，在2～30℃震荡反应10～120min活化荧光微球，在10000～20000g离心10～30min收集沉淀，得到活化后的荧光微球；
b.用10～100mM HEPES溶液稀释步骤a所得活化后的荧光微球，再加入亲和素混合，其中活化后荧光微球与亲和素混合的质量比为(5～50):1，在2～30℃震荡反应0.5～18h，得到亲和素标记的荧光微球；
c.使用浓度为0.1wt％～3wt％的封闭液处理亲和素标记的荧光微球，离心收集沉淀，得到亲和素-荧光微球复合物；
d.N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的生物素与标记抗体按摩尔数量比为(5～50):1混合，2～30℃震荡0.5～18，去除未结合生物素，得到生物素-抗体复合物。
(3)将步骤(2)所得亲和素-荧光微球复合物和生物素-抗体复合物按质量比为(2～20):1混合，并按2～20μL/cm的使用量、间距为4～10mm喷涂到荧光垫上，并在30～40℃、湿度不大于30％的条件下烘干1～4h。
(4)使用曲霉半乳甘露聚糖抗体和羊抗鸡IgY抗体分别在硝酸纤维素膜上划线，曲霉半乳甘露聚糖抗体的包被量为0.5～2μL/cm，羊抗鸡IgY抗体的包被量为0.5～2μL/cm，并在30～40℃、湿度不大于30％的条件下烘干1～18h。
(5)在PVC底板上依次粘贴硝酸纤维素膜、吸水垫、荧光垫和样品垫，所述吸水垫和荧光垫各自独立地覆盖硝酸纤维素膜1～2mm，所述样品垫覆盖荧光垫1～2mm，组装后切割，得到所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
第三方面，本发明提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒包括第一方面所述的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
第四方面，本发明提供一种第三方面所述的曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒的使用方法，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒的使用方法包括：
(1)制备待测样品；
(2)使用所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条对待测样品进行检测；
(3)检测后对结果进行判读。
优选地，步骤(3)中，所述检测后对结果进行判读包括：
导入试纸条标准曲线，使用荧光免疫分析仪扫描检测区的荧光信号，判定样本的阴阳性。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条克服了ELISA方法的不足，具有即时检验产品的诸多优势，包括检测成本低、样本随到随检、操作简单、对人员的专业要求不高和检测时间短等，能够在40min内出结果，仅需简单样本处理、加样和读数三个步骤即可完成整个检测过程。
(2)本发明提供的微球标记方法使用亲和素-生物素标记系统，与微球直接标记抗体，本发明标记方法能够增加微球有效抗体的标记量，从而提高待测抗原的灵敏度。具体地，一方面能够提高微球表面抗体标记数量，另一方面标记抗体与小分子生物素结合能够减少标记过程对抗体活性损伤。
(3)使用本发明所提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒检测待测样本时，使用荧光免疫分析仪扫描检测区得到荧光信号，结合导入标准曲线计算样品中对应的曲霉半乳甘露聚糖的含量，能够实现快速、高灵敏度、高准确度的检测。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明中所使用的曲霉半乳甘露聚糖抗体的制备方法参照专利CN110894236A中的制备方法。所述曲霉半乳甘露聚糖抗体的制备方法包括如下步骤：
(1)构建曲霉半乳甘露聚糖抗体的表达载体
利用同源重组引物分别在抗体重链可变区基因的两端和轻链可变区基因的两端加入同源重组臂(抗体重链可变区基因和轻链可变区基因序列见专利CN110894236A)，使用双酶分别将含有兔抗体重链IgG1恒定区基因序列的表达质粒和含有兔轻链IgG1恒定区基因序列的表达质粒线性化，产生同源重组臂；将加入同源重组臂的可变区基因片段和线性化的质粒通过同源重组的方式连接起来，构成完整的表达质粒，得到曲霉半乳甘露聚糖抗体重链的表达质粒和曲霉半乳甘露聚糖抗体轻链的表达质粒，将表达质粒转化进TOP10大肠杆菌感受态中，扩增表达质粒。
(2)曲霉半乳甘露聚糖抗体的表达与纯化
将得到的曲霉半乳甘露聚糖抗体重链的表达质粒和曲霉半乳甘露聚糖抗体轻链的表达质粒按照1:1的比例加入到Opti-Mem转染培养基中，充分混合后加入4倍DNA质量的转染试剂PEI，混合后，室温避光放置30min，随后加入到293T细胞中。孵育6h后去除转染体系，加入FreeStyleTM293表达培养基进行培养，使用AKTA蛋白纯化系统，采用亲和纯化(Protein A)的方法纯化培养基上清，得到曲霉半乳甘露聚糖抗体，具体步骤为：
(a)将培养基上清以2500g室温离心10min，去除沉淀物；
(b)将装有Protein A的亲和纯化柱用10倍体积的结合缓冲液(Binding Buffer)充分流洗；
(c)将培养基上清以5mL/min的流速通过纯化柱；
(d)使用20倍纯化柱体积的结合缓冲液(Binding Buffer)充分洗涤纯化柱；
(e)用0.1M pH3.2的柠檬酸缓冲液洗脱纯化柱，直至洗脱峰降至平衡状态，用1MpH9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH为7.0；
(f)使用浓缩离心柱浓缩纯化后的曲霉半乳甘露聚糖抗体，用PBS缓冲液作为曲霉半乳甘露聚糖抗体保存的缓冲液，最后用BSA蛋白浓度检测方法测定浓缩后的曲霉半乳甘露聚糖抗体的浓度。
以下实施例和对比例中所用各组分来源如表1所示：
表1
Figure BDA0003512439980000101
Figure BDA0003512439980000111
实施例1
本实施例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法包括：
(1)处理样品垫：
使用样品垫处理液对样品垫进行处理，所述样品垫处理液的配方为100mmol/LTris、0.5wt％PVP-K30、0.5wt％Tween-20和1wt％BSA，将处理后的样品垫在37℃、湿度为25％的条件下烘干4h。
(2)制备荧光微球标记的抗体：
a.将荧光微球溶液和50mmol/L的MES缓冲液混合，得到荧光微球浓度为0.1wt％的荧光微球混合液，向荧光微球混合液中加10mg/mL的EDC溶液和10mg/mL的NHS溶液混合，其中荧光微球混合液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为100:1:1，在25℃震荡反应120min活化荧光微球，在10000g离心30min收集沉淀，得到活化后的荧光微球；
b.用25mmol/L HEPES溶液稀释步骤a所得活化后的荧光微球，再加入亲和素混合，其中活化后荧光微球与亲和素混合的质量比为20:1，在25℃震荡反应10h，得到亲和素标记的荧光微球；
c.使用浓度为1wt％的封闭液处理亲和素标记的荧光微球，离心收集沉淀，得到亲和素-荧光微球复合物；
d.N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的生物素与曲霉半乳甘露聚糖抗体按摩尔数量比为20:1混合，25℃震荡10h，去除未结合的生物素，得到生物素-曲霉半乳甘露聚糖抗体复合物；将N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的生物素与鸡IgY抗体按摩尔数量比为20:1混合，25℃震荡10h，去除未结合的生物素，得到生物素-鸡IgY抗体复合物；
(3)将所述亲和素标记的荧光微球和生物素标记的抗体混合后，并包埋在荧光垫上：
将步骤(2)所得荧光微球标记的亲和素和抗体标记的生物素按质量比10:1混合，亲和素-荧光微球复合物与生物素-曲霉半乳甘露聚糖抗体复合物的质量比为10:1，亲和素-荧光微球复合物与生物素-鸡IgY抗体复合物的质量比为10:1，按5μL/cm的使用量、间距为6mm喷涂到荧光垫上，并在37℃、湿度25％的条件下烘干2h。
(4)在硝酸纤维素膜上包被检测线和质控线：
使用曲霉半乳甘露聚糖抗体和羊抗鸡IgY抗体分别在硝酸纤维素膜上划线，曲霉半乳甘露聚糖抗体的包被量为1μL/cm，羊抗鸡IgY抗体的包被量为1μL/cm，并在37℃、湿度为25％的条件下烘干10h。
(5)组装试纸条：
在PVC底板上依次粘贴硝酸纤维素膜、吸水垫、荧光垫和样品垫，所述吸水垫和荧光垫各自独立地覆盖硝酸纤维素膜2mm，所述样品垫覆盖荧光垫2mm，组装后切割，得到所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
实施例2
本实施例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法与实施例1的区别仅在于，步骤(2)制备荧光微球标记的抗体的过程中，步骤a中荧光微球混合液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为20:1:1。
实施例3
本实施例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法与实施例1的区别仅在于，步骤(2)制备荧光微球标记的抗体的过程中，步骤a中荧光微球混合液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为10:1:1。
实施例4
本实施例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法与实施例1的区别仅在于，步骤(2)制备荧光微球标记的抗体的过程中，步骤a中荧光微球混合液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为200:1:1。
实施例5
本实施例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法与实施例1的区别仅在于，步骤(2)制备荧光微球标记的抗体的过程中，步骤d中N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的生物素与所述曲霉半乳甘露聚糖抗体混合的质量比为2:1。
实施例6
本实施例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法与实施例1的区别仅在于，步骤(2)制备荧光微球标记的抗体的过程中，步骤d中N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的生物素与所述曲霉半乳甘露聚糖抗体混合的质量比为55:1。
实施例7
本实施例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法与实施例1的区别仅在于，步骤(2)制备荧光微球标记的抗体的过程中，步骤d中N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的生物素与所述曲霉半乳甘露聚糖抗体混合的质量比为5:1。
实施例8
本实施例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法与实施例1的区别仅在于，步骤(3)制备荧光微球标记的抗体的过程中，亲和素-荧光微球复合物与生物素-曲霉半乳甘露聚糖抗体复合物的质量比为1:1，亲和素-荧光微球复合物与生物素-鸡IgY抗体复合物的质量比为1:1。
对比例1
本实施例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法包括如下步骤：
(1)处理样品垫：
使用样品垫处理液对样品垫进行处理，所述样品垫处理液的配方为100mmol/LTris、0.5wt％PVP-K30、0.5wt％Tween-20和1wt％BSA，将处理后的样品垫在37℃、湿度为25％的条件下烘干4h。
(2)制备荧光微球标记的抗体：
a.将荧光微球溶液和50mmol/L的MES缓冲液混合，得到荧光微球浓度为0.1wt％的荧光微球混合液，向荧光微球混合液中加10mg/mL的EDC溶液和10mg/mL的NHS溶液混合，其中荧光微球混合液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为100:1:1，在25℃震荡反应120min活化荧光微球，在10000g离心30min收集沉淀，得到活化后的荧光微球；
b.用25mmol/L HEPES溶液稀释步骤a所得活化后的荧光微球，再加入曲霉半乳甘露聚糖抗体混合，在25℃震荡反应10h，得到荧光微球标记的曲霉半乳甘露聚糖抗体，所述荧光微球与曲霉半乳甘露聚糖抗体混合的质量比为20:1；
用25mmol/L HEPES溶液稀释步骤a所得活化后的荧光微球，再加入鸡IgY混合，在25℃震荡反应10h，得到荧光微球标记的鸡IgY，所述荧光微球与鸡IgY混合的质量比为20:1。
(3)封闭所述荧光微球标记的抗体，并包埋在荧光垫上：
使用BSA溶液处理荧光微球标记的曲霉半乳甘露聚糖抗体，在25℃震荡反应10h，得到抗体封闭混合液，所述抗体封闭混合液中BSA的浓度为1wt％，所述抗体封闭混合液中荧光微球标记的曲霉半乳甘露聚糖抗体的浓度为0.1wt％，10000g离心10min收集沉淀微球，得到封闭后的荧光微球标记的曲霉半乳甘露聚糖抗体；
使用BSA溶液处理荧光微球标记的鸡IgY，在25℃震荡反应10h，得到抗体封闭混合液，所述抗体封闭混合液中BSA的浓度为1wt％，所述抗体封闭混合液中荧光微球标记的鸡IgY的浓度为0.1wt％，10000g离心10min收集沉淀微球，得到封闭后的荧光微球标记的鸡IgY；
将所得封闭后的荧光微球标记的曲霉半乳甘露聚糖抗体和荧光微球标记的鸡IgY分别配制成0.5mg/mL的稀释液，将稀释液按5μL/cm的使用量、间距为6mm喷涂到荧光垫上，并在37℃、湿度25％的条件下烘干2h。
(4)在硝酸纤维素膜上包被检测线和质控线：
使用曲霉半乳甘露聚糖抗体和羊抗鸡IgY抗体分别在硝酸纤维素膜上划线，曲霉半乳甘露聚糖抗体的包被量为1μL/cm，羊抗鸡IgY抗体的包被量为1μL/cm，并在37℃、湿度为25％的条件下烘干10h。
(5)组装试纸条：
在PVC底板上依次粘贴硝酸纤维素膜、吸水垫、荧光垫和样品垫，所述吸水垫和荧光垫各自独立地覆盖硝酸纤维素膜2mm，所述样品垫覆盖荧光垫2mm，组装后切割，得到所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
应用例1
本应用例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒包括实施例1所提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
应用例2
本应用例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒包括实施例2所提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
应用例3
本应用例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒包括实施例3所提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
应用例4
本应用例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒包括实施例4所提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
应用例5
本应用例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒包括实施例5所提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
应用例6
本应用例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒包括实施例6所提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
应用例7
本应用例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒包括实施例7所提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
应用例8
本应用例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒包括实施例7所提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
对比应用例1
本对比应用例提供一种曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒包括对比例1所提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
试验例1
使用应用例1～8和对比应用例1所得的曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒对标准品溶液进行准确度测定，统计检测结果如表2所示。
表2
样品 标准品溶液浓度 检测值 回收率
应用例1 5.0ng/mL 5.1ng/mL 102％
应用例2 5.0ng/mL 4.9ng/mL 96％
应用例3 5.0ng/mL 3.9ng/mL 78％
应用例4 5.0ng/mL 4.2ng/mL 84％
应用例5 5.0ng/mL 3.5ng/mL 70％
应用例6 5.0ng/mL 2.3ng/mL 46％
应用例7 5.0ng/mL 4.6ng/mL 92％
应用例8 5.0ng/mL 3.7ng/mL 74％
对比应用例1 5.0ng/mL 4.6ng/mL 92％
试验例2
诊断灵敏度和诊断特异性评估，使用应用例1所提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒和Bio-Rad生产的曲霉菌抗原检测试剂盒(对照)对两种类型临床样本(肺泡灌洗液和血清)进行检测，统计阳性符合率、阴性符合率和总符合率。肺泡灌洗液样本检测结果如表3所示。
表3
Figure BDA0003512439980000161
阳性符合率＝A/(A+C)×100％＝92.4％
阴性符合率＝D/(B+D)×100％＝95.5％
总符合率＝(A+D)/(A+B+C+D)×100％＝94.0％
血清样本检测结果如表4所示。
表4
Figure BDA0003512439980000162
阳性符合率＝A/(A+C)×100％＝90.4％
阴性符合率＝D/(B+D)×100％＝97.7％
总符合率＝(A+D)/(A+B+C+D)×100％＝94.6％
诊断灵敏度和诊断特异性评估结果：两种试剂盒对肺泡灌洗液样本的阳性符合率为92.4％，阴性符合率为95.5％，总符合率为94.0％；两种试剂盒对血清样本的阳性符合率为90.4％，阴性符合率为97.7％，总符合率为94.6％。
对应用例1所提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒和市售试剂盒的进行比较，本发明的试剂盒与市售试剂盒的对比内容如表5所示。
表5
Figure BDA0003512439980000171
结果表明所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒菌能够达到市售试剂盒的检测标准，同时本发明提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒克服了ELISA方法的不足，具有即时检验产品的诸多优势，检测成本低、检测时间短、样本随到随检、操作简单、对人员的专业要求不高，仅需简单样本处理、加样和读数三个步骤即可完成整个检测过程。本发明的试剂盒的综合性能优于市场上现有的曲霉检测试剂盒。
试验例3
精密度评估：
取4例临床血清样本(1例阴性样本、1例临界阳性样本、1例中阳性样本、1例强阳性样本)和4例临床肺泡灌洗液样本(1例阴性样本、1例临界阳性样本、1例中阳性样本、1例强阳性样本)，用3种机型分别检测，每种机型2个操作人员，共6个操作人员，每种机型分别使用3个批次的试剂盒，所述试剂盒参照实施例1制备得到，检测5天，每天每个样本做5个重复(3种机型×3个试剂盒批次×5天×5个重复/天＝225个结果/样本)。三款机型分别为机型1(广州蓝勃生物科技有限公司的干式荧光免疫分析仪，型号AFS-1000)，机型2(广州蓝勃生物科技有限公司的干式荧光免疫分析仪，型号AFS2000A)，机型3(苏州和迈精密仪器有限公司的干式荧光免疫分析仪，型号FIC-Q100N)。
血清样本精密度评估结果：
(中或强)阳性血清样本数据分析结果如表6所示。
表6
Figure BDA0003512439980000181
临界阳性血清样本数据分析结果如表7所示。
表7
仪器 检测总均值 I值≥0.5的结果数 I值＜0.5的结果数 阳性检出率
AFS-1000 0.60 73 2 97.3％
AFS2000A 0.60 74 1 98.7％
FIC-Q100N 0.61 74 1 98.7％
阴性血清样本数据分析结果如表8所示。
表8
仪器 检测总均值 I值≥0.5的结果数 I值＜0.5的结果数 阴性检出率
AFS-1000 0.18 0 75 100％
AFS2000A 0.18 0 75 100％
FIC-Q100N 0.18 0 75 100％
从上表数据分析结果可知，3种机型检测中阳性血清样本和强阳性血清样本的重复性、室内精密度和批间精密度的CV均小于15％，符合要求(重复性CV≤15％，批间CV≤20％)；临界阳性血清样本的阳性检出率≥95％，符合要求；阴性血清样本的阴性检出率均为100％，符合要求。
肺泡灌洗液样本精密度评估结果：
(中或强)阳性肺泡灌洗液样本数据分析结果如表9所示。
表9
Figure BDA0003512439980000191
临界阳性肺泡灌洗液样本数据分析结果如表10所示。
表10
仪器 检测总均值 I值≥0.5的结果数 I值＜0.5的结果数 阳性检出率
AFS-1000 0.60 74 1 98.67％
AFS2000A 0.59 73 2 97.33％
FIC-Q100N 0.59 73 2 97.33％
阴性肺泡灌洗液样本数据分析结果如表11所示。
表11
仪器 检测总均值 I值≥0.5的结果数 I值＜0.5的结果数 阴性检出率
AFS-1000 0.21 0 75 100％
AFS2000A 0.20 0 75 100％
FIC-Q100N 0.21 0 75 100％
从上表数据分析结果可知，3种机型检测中阳性肺泡灌洗液样本和强阳性肺泡灌洗液样本的重复性、室内精密度和批间精密度的CV均小于15％，符合要求(重复性CV≤15％，批间CV≤20％)；临界阳性肺泡灌洗液样本的阳性检出率≥95％，符合要求；阴性肺泡灌洗液样本的阴性检出率均为100％，符合要求。
本试验例使用应用例1中所述的曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒检测四种不同来源的曲霉菌菌株提取的曲霉半乳甘露聚糖抗原，所述抗原包括从烟曲霉Aspergillusfumigatus(ATCC:16903)、黄曲霉Aspergillus flavus(ATCC:24133)、土曲霉Aspergillusterreus(ATCC:1012)和黑曲霉Aspergillus niger(ATCC:16888)中提取的抗原。
所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒与四种不同来源的曲霉菌菌株提取的曲霉半乳甘露聚糖抗原反应的灵敏度结果统计如表12所示。
表12
抗原浓度(ng/ml) 烟曲霉抗原 黄曲霉抗原 土曲霉抗原 黑曲霉抗原
1000 24.50 20.96 21.71 21.48
500 16.53 16.33 15.19 16.30
100 9.33 7.76 8.06 8.62
50 7.17 6.46 6.73 6.52
10 2.55 3.22 2.64 2.83
5 2.06 1.85 1.74 1.71
1 0.52 0.47 0.51 0.52
0.5 0.35 0.28 0.33 0.32
0 0.14 0.13 0.12 0.12
从上述结果可知，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒与四种不同来源的曲霉菌菌株提取的曲霉半乳甘露聚糖抗原反应的灵敏度一致，所述曲霉半乳甘露聚糖抗体能够识别四种不同的曲霉半乳甘露聚糖抗原。
综上，本发明提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒克服了ELISA方法不足，具有即时检测产品的诸多优势。本发明提供的曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒能够实现快速、高灵敏度、高准确度的检测。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条，其特征在于，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条包括底板，所述底板上沿液体流动方向依次设置有样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
所述荧光垫上包埋有荧光微球标记的抗体，包括荧光微球标记的曲霉半乳甘露聚糖抗体和荧光微球标记的鸡IgY抗体；
所述荧光微球标记的曲霉半乳甘露聚糖抗体为亲和素标记的荧光微球和生物素标记的抗体通过亲和素-生物素连接得到；
所述荧光微球标记的鸡IgY抗体为亲和素标记的荧光微球和生物素标记的鸡IgY抗体通过亲和素-生物素连接得到；
所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线；
所述检测线为含有曲霉半乳甘露聚糖抗体的检测线；
所述质控线为含有羊抗鸡IgY抗体的质控线。
2.根据权利要求1所述的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条，其特征在于，所述荧光微球包括时间分辨荧光微球、cy5荧光微球、cy7荧光微球、FITC荧光微球或APC荧光微球等中的任意一种；
优选地，所述荧光微球表面带有官能团包括羧基、氨基或磺酸基等中的任意一种；
优选地，所述荧光微球的粒径为50～200nm；
优选地，曲霉半乳甘露聚糖抗体为兔源抗体；
优选地，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条能检测烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和黑曲霉来源的样本。
3.一种权利要求1或2所述的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法包括如下步骤：
(1)处理样品垫；
(2)制备亲和素标记的荧光微球和生物素标记的抗体；
(3)将所述亲和素标记的荧光微球和生物素标记的抗体混合后，并包埋在荧光垫上；
(4)在硝酸纤维素膜上包被检测线和质控线；
(5)组装试纸条。
4.根据权利要求3所述的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括：用样品垫处理液对样品垫进行处理，将处理后的样品垫烘干；
优选地，所述样品垫处理液中包括缓冲盐、缓释剂、助溶剂和封闭剂；
优选地，所述缓冲盐包括Tris，所述Tris在所述样品垫处理液中的浓度为100～120mmol/L；
优选地，所述缓释剂包括PVP-K30，所述PVP-K30在所述样品垫处理液中的浓度为0.3wt％～0.8wt％；
优选地，所述助溶剂包括Tween-20，所述Tween-20在所述样品垫处理液中的浓度为0.01wt％～1wt％；
优选地，所述封闭剂包括BSA，所述BSA在所述样品垫处理液中的浓度为1wt％～3wt％；
优选地，所述烘干的参数为湿度低于30％，温度30～40℃，时间1～24h。
5.根据权利要求3或4所述的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括以下步骤：
a.将荧光微球溶液和MES缓冲液混合，得到荧光微球混合液，向荧光微球混合液中加入EDC溶液和NHS溶液混合，震荡，离心收集沉淀，得到活化后的荧光微球；
b.用稀释液稀释步骤a所得活化后的荧光微球，与亲和素混合，震荡，得到亲和素标记的荧光微球；
c.使用封闭液处理，离心收集沉淀，得到亲和素-荧光微球复合物；
d.N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的生物素与标记抗体混合，震荡，去除未结合的生物素，得到生物素-抗体复合物；
优选地，步骤a中，所述MES缓冲液的浓度为10～100mmol/L；
优选地，步骤a中，所述荧光微球混合液中荧光微球的浓度为0.1wt％～1wt％；
优选地，步骤a中，所述EDC溶液的浓度为5～50mg/mL；
优选地，步骤a中，所述NHS溶液的浓度为5～50mg/mL；
优选地，步骤a中，荧光微球混合液、EDC溶液和NHS溶液混合的体积比为(20～100):1:1；
优选地，步骤a中，所述震荡的温度为2～30℃，时间为10～120min；
优选地，步骤b中，所述稀释液为HEPES溶液，所述HEPES溶液的浓度为10～100mmol/L；
优选地，步骤b中，所述亲和素包括卵白亲和素或链霉亲和素；
优选地，步骤b中，所述活化后的荧光微球与亲和素混合的质量比为(5～50):1；
优选地，步骤b中，所述震荡的温度为2～30℃，时间为0.5～18h；
优选地，步骤c中，所述封闭液包括甘氨酸、多聚赖氨酸、BSA、酪蛋白、脱脂奶粉、明胶、鱼精蛋白或卵清蛋白中任意一种或至少两种的组合，所述封闭液的浓度为0.1wt％～3wt％；
优选地，步骤d中，所述标记抗体为曲霉半乳甘露聚糖抗体或鸡IgY抗体，所述标记抗体的浓度为1～10mg/mL；
优选地，步骤d中，所述混合中标记抗体和N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的生物素的摩尔数量比为(5～50):1；
优选地，步骤d中，所述震荡的温度为2～30℃，时间为0.5～18h；
优选地，步骤d中，所述去除未结合生物素的方法包括脱盐柱脱盐、透析或超滤。
6.根据权利要求3～5中任一项所述的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(3)包括：
将步骤(2)所得亲和素-荧光微球复合物和生物素-抗体复合物混合，并喷涂到荧光垫上，烘干荧光垫；
优选地，所述混合中亲和素-荧光微球复合物和生物素-抗体复合物的质量比为(2～20):1；
优选地，所述喷涂的使用量为2～20μL/cm，间距为4～10mm；
优选地，所述烘干的参数为湿度低于30％，温度30～40℃，时间1～4h。
7.根据权利要求3～6中任一项所述的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(4)包括：
使用曲霉半乳甘露聚糖抗体和羊抗鸡IgY抗体分别在硝酸纤维素膜上划线；
优选地，所述曲霉半乳甘露聚糖抗体和羊抗鸡IgY抗体的包被量各自独立为0.5～2μL/cm；
优选地，所述烘干的参数为湿度低于30％，温度30～40℃，时间1～24h。
8.根据权利要求3～7中任一项所述的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(5)包括：
在PVC底板上依次粘贴组装硝酸纤维素膜、吸水垫、荧光垫和样品垫，组装后切割，得到所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
9.一种曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒，其特征在于，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒包括权利要求1或2所述的曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条。
10.一种权利要求9所述的曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒的使用方法包括：
(1)制备待测样品；
(2)使用所述曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条对待测样品进行检测；
(3)检测后对结果进行判读；
优选地，步骤(3)中，所述检测后对结果进行判读包括：
导入试纸条标准曲线，使用荧光免疫分析仪扫描检测区的荧光信号，判定样本的阴阳性。
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