CN115420892B - 联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法 - Google Patents

联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法。本发明采用第一缓冲液处理第一玻璃纤维膜制得样本垫，采用第二缓冲液处理心磷脂抗原‑荧光微球偶联物和DNP‑BSA‑荧光微球偶联物，然后将处理后的心磷脂抗原‑荧光微球偶联物和处理后的DNP‑BSA‑荧光微球偶联物分别结合到第二玻璃纤维膜上制得结合垫，将样本垫、结合垫与硝酸纤维素膜、吸水纸以及底板组装得到荧光免疫层析试纸条。通过本发明的方法制备的荧光免疫层析试纸条能够一次性同时检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体，且灵敏度和准确度高，重复性和稳定性好。

Description

联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免 疫层析试纸条的制备方法
技术领域
本发明属于免疫荧光检测技术领域，具体涉及联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法。
背景技术
抗心磷脂抗体（anti-phospholipid antibody，APA）是一类自身免疫性抗体，与多种自身免疫性疾病有关，也是抗磷脂抗体综合征（anti-phospholipid antibody syn-drome，APS）的标志性抗体。抗心磷脂抗体的靶抗原主要是带负电荷的心磷脂，主要是血小板和内皮细胞膜中的心磷脂。抗心磷脂抗体包括IgG型和IgM型。研究表明IgG型抗心磷脂抗体与血小板减少症密切相关，还与中晚期流产相关，IgM型抗心磷脂抗体和溶血性贫血密切相关，持续中高梯度的IgG/IgM型抗心磷脂抗体与血栓密切相关。
目前临床及实验室的抗心磷脂抗体测定方法多为酶联免疫法和化学发光法。酶联免疫法精密度和灵敏度线性均较差，且有操作步骤较多，检测耗时长等问题。化学发光法虽然灵敏度和精确性更好，但是目前相关化学发光法检测试剂盒一次只能检测一种抗心磷脂抗体的分型，且该技术依赖昂贵的检测设备，不能进行实时床旁检测，局限性较多。荧光免疫层析可以实现一次同时检测IgG和IgM两种抗体分型且操作简单方便，但是针对不同抗原抗体，需要不断调整试纸条制备方法，以同时保证灵敏度、准确度、稳定性等，因此荧光免疫层析试纸的开发难度较高。目前未见同时检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的相关报道及产品上市。
发明内容
本发明的目的是提供一种联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法。
本发明另外还提供采用上述制备方法制备的用于联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条。
本发明另外还提供IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的联合定量检测系统。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法，所述制备方法包括：采用第一缓冲液处理第一玻璃纤维膜制得样本垫；分别采用第二缓冲液处理心磷脂抗原-荧光微球偶联物和DNP-BSA-荧光微球偶联物，然后将处理后的心磷脂抗原-荧光微球偶联物和处理后的DNP-BSA-荧光微球偶联物分别结合到第二玻璃纤维膜上制得结合垫；将所述样本垫、所述结合垫与硝酸纤维素膜、吸水纸以及底板组装得到所述荧光免疫层析试纸条，其中，所述第一缓冲液含有0.5wt%~1.5wt%的吐温-20，0.5wt%~1.5wt%的PEG20000，3wt%~8wt%的海藻糖和0.1wt%~0.6wt%的酪蛋白，所述第一缓冲液的pH值为8.0~9.0，所述第二缓冲液含有100mmol/L~200mmol/L的氯化钠，8wt%~12wt%的海藻糖，0.4wt%~0.6wt%的吐温-20和0.4wt%~0.6wt%的酪蛋白，所述第二缓冲液的pH值为8.0~9.0，所述硝酸纤维素膜上设有IgG检测线、IgM检测线和质控线。
优选地，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液分别独立地选自磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液或柠檬酸缓冲液。
进一步优选地，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液分别独立地为Tris缓冲液。
再进一步优选地，所述Tris缓冲液的浓度为25mmol/L~70mmol/L，例如25mmol/L，30mmol/L，35mmol/L，40mmol/L，45mmol/L，50mmol/L，55mmol/L，60mmol/L，65mmol/L，70mmol/L。
优选地，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液的pH值分别独立地为8.5~9.0，例如8.5，8.6，8.7，8.8，8.9，9.0。
进一步优选地，所述第一缓冲液为pH值为8.0~9.0，浓度为45mmol/L~55mmol/L的Tris缓冲液，其含有0.5wt%~1.5wt%的吐温-20，0.5wt%~1.5wt%的PEG20000，3wt%~8wt%的海藻糖和0.1wt%~0.6wt%的酪蛋白。
再进一步优选地，所述第一缓冲液为pH值为8.4~8.6，浓度为45mmol/L~55mmol/L的Tris缓冲液，其含有0.8wt%~1.2wt%的吐温-20，0.8wt%~1.2wt%的PEG20000，4wt%~6wt%的海藻糖和0.4wt%~0.6wt%的酪蛋白。
进一步优选地，所述第二缓冲液的pH值为8.0~9.0，浓度为45mmol/L~55mmol/L的Tris缓冲液，其含有100mmol/L~200mmol/L的氯化钠，8wt%~12wt%的海藻糖，0.4wt%~0.6wt%的吐温-20和0.4wt%~0.6wt%的酪蛋白。
再进一步优选地，所述第二缓冲液的pH值为8.4~8.6，浓度为45mmol/L~55mmol/L的Tris缓冲液，其含有140mmol/L~160mmol/L的氯化钠，8wt%~12wt%的海藻糖，0.4wt%~0.6wt%的吐温-20和0.4wt%~0.6wt%的酪蛋白。
优选地，采用第一缓冲液浸润第一玻璃纤维膜1min~3min，然后在30℃~60℃下烘干，制得所述样本垫。
进一步优选地，所述烘干的温度为30℃~40℃。
进一步优选地，所述烘干在湿度小于30%、温度为18℃~28℃的环境下进行。
优选地，将所述心磷脂抗原-荧光微球偶联物与所述第二缓冲液混合得到微球含量为0.05wt%~0.5wt%的心磷脂抗原-荧光微球偶联物溶液，将所述DNP-BSA-荧光微球偶联物与所述第二缓冲液混合得到微球含量为0.05wt%~0.5wt%的DNP-BSA-荧光微球偶联物溶液，然后将所述心磷脂抗原-荧光微球偶联物溶液和所述DNP-BSA-荧光微球偶联物溶液按照体积比为（15~18）:1混合后喷涂到所述第二玻璃纤维膜上，在30℃~60℃下烘干，制得所述结合垫。
进一步优选地，所述心磷脂抗原-荧光微球偶联物溶液中微球含量为0.05wt%~0.5wt%。
进一步优选地，所述DNP-BSA-荧光微球偶联物溶液中微球含量为0.05wt%~0.5wt%。
进一步优选地，所述烘干在湿度小于30%、温度为18℃~28℃的环境下进行。
所述心磷脂抗原-荧光微球偶联物和所述DNP-BSA-荧光微球偶联物的制备方法没有特别的限制，可选择本领域常规方法。
优选所述心磷脂抗原-荧光微球偶联物和所述DNP-BSA-荧光微球偶联物制备方法分别为：
1）微球的活化及偶联：将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和荧光微球加入偶联缓冲液中，室温摇床孵育10min~20min。将心磷脂抗原或二硝基苯酚偶联牛血清白蛋白（DNP-BSA）与活化的微球混合得到偶联体系，室温摇床孵育1.5h~2.5h，控制偶联体系中EDC的用量为10~15μg/mL、荧光微球的体积为偶联体系总体积的8%~12%、心磷脂抗原或DNP-BSA的浓度为0.05mg/mL~0.5mg/mL。偶联缓冲液优选为pH值为5.5~6.5的浓度为0.05mol/L~0.5mol/L的MES缓冲液。
2）微球的封闭：室温孵育结束后，向偶联体系中加入体积为偶联总体积的8%~12%的封闭缓冲液，室温摇床孵育0.5h~1.5h。封闭缓冲液优选为浓度5wt%~15wt%的BSA缓冲液。
3）微球的清洗：封闭结束后，离心去上清，使用体积为偶联总体积的150%~250%的偶联缓冲液复溶，超声，离心弃上清，即可获得心磷脂抗原-荧光微球偶联物或DNP-BSA-荧光微球偶联物。
优选地，将鼠抗人IgG抗体与第三缓冲液混合得到第一包被液，使用所述第一包被液在所述硝酸纤维素膜上划线，在30℃~60℃下烘干，形成所述IgG检测线。进一步优选以30℃~40℃烘干。进一步优选在湿度小于30%、温度为18℃~28℃的环境下进行所述烘干。
优选地，将鼠抗人IgM抗体与第三缓冲液混合得到第二包被液，使用所述第二包被液在所述硝酸纤维素膜上划线，在湿度小于30%、温度为18~28℃的环境下，以30~60℃烘干，形成所述IgM检测线。进一步优选以30℃~40℃烘干。
优选地，将DNP单克隆抗体与第三缓冲液混合得到第三包被液，使用所述第三包被液在所述硝酸纤维素膜上划线，在30~60℃下烘干，形成所述质控线。进一步优选以30℃~40℃烘干。进一步优选在湿度小于30%、温度为18℃~28℃的环境下进行所述烘干。
优选地，所述第一包被液、所述第二包被液、所述第三包被液中抗体的浓度分别独立地为1mg/mL~5mg/mL，例如1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL。
优选地，所述第三缓冲液的pH值为7.0~7.5，例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5。
优选地，所述第三缓冲液为浓度为5mmol/L~20mmol/L的PBS缓冲液，其包含2wt%~8wt%的海藻糖、2wt%~8wt%的甲醇。
进一步优选地，所述第三缓冲液为浓度为8mmol/L~12mmol/L的PBS缓冲液，其包含4wt%~6wt%的海藻糖、4wt%~6wt%的甲醇。
优选地，所述底板为PVC材质。
优选地，所述荧光微球为铕螯合荧光微球。
优选地，所述荧光微球的表面带有修饰基团，所述修饰基团为氨基和/或羧基。
优选地，所述荧光微球为经N-羟基琥珀酰亚胺酯和/或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺活化的荧光微球。
优选地，所述荧光微球的直径为0.1μm~0.3μm。
优选地，所述荧光微球的激发波长为320nm~350nm，所述荧光微球的发射波长为600nm~620nm。
优选地，所述心磷脂抗原-荧光微球偶联物的心磷脂抗原为人工合成抗原。
优选地，所述IgG检测线上包被鼠抗人IgG抗体，所述IgM检测线上包被鼠抗人IgM抗体，所述质控线上包被DNP单克隆抗体。
本发明还提供采用所述的制备方法制备的用于联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条。
本发明还提供用于联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的试剂盒，其包括上述荧光免疫层析试纸条和样本稀释液。
优选地，所述样本稀释液为pH值为7.0~8.0，浓度为8mmol/L~12mmol/L的PBS缓冲液，其含有0.4wt%~0.6wt%的吐温-20。
本发明还提供一种IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的联合定量检测系统，所述联合定量检测系统包括荧光免疫分析仪、上述荧光免疫层析试纸条和样本稀释液，所述荧光免疫层析试纸条上设有ID卡，所述ID卡中存储有标定数据和/或标准曲线，所述联合定量检测系统的检测方法包括以下步骤：
（1）将所述荧光免疫层析试纸条插入所述荧光免疫分析仪，读取所述ID卡上的标定数据和/或标准曲线，读取完毕后拔下所述荧光免疫层析试纸条；
（2）可选择性地采用样本稀释液稀释待测样本，将未稀释或稀释后的待测样本滴加到所述荧光免疫层析试纸条上，静置反应5min~15min，未稀释或稀释后的待测样本依次经过所述样本垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜到达所述吸水纸上；
（3）将静置反应后的荧光免疫层析试纸条再次插入所述荧光免疫分析仪，读取所述IgG检测线、所述IgM检测线和所述质控线的荧光强度，根据所述标定数据和/或标准曲线计算并输出待测样本的IgG型抗心磷脂抗体浓度、IgM型抗心磷脂抗体浓度以及IgG/IgM值。
所述IgG/IgM值是指IgG型抗心磷脂抗体浓度和IgM型抗心磷脂抗体浓度的比值。
本发明中，所述荧光免疫层析试纸条和所述联合定量检测系统检测的检测样本为血清样本。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
采用本发明的制备方法制备的荧光免疫层析试纸条在极少临床样本用量和仅需一台荧光免疫分析仪的前提下，一次检测即可同时对IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体进行定量，且具有灵敏度高、准确度高、稳定性好、重复性好、简单易操作等优点，应用前景广。
附图说明
图1为本发明的IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体联合检测试纸条的结构示意图，
其中，1、底板；2、样本垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、吸水纸；6、IgM检测线；7、IgG检测线；8、质控线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
目前国内实验室及临床上，主要采用化学发光法和酶联免疫法检测抗心磷脂抗体，也有部分厂家采用胶体金法检测抗心磷脂抗体，灵敏度和准确度不佳，很难满足临床定量检测要求。荧光免疫层析可以实现一次同时检测IgG和IgM两种抗体分型且操作简单方便，但是开发难度高，尚无在荧光免疫层析平台制备检测抗心磷脂抗体的试纸条的先例，而本发明针对心磷脂抗原进行了大量的研究和实验验证，开发了一种联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法。
具体地，本发明的制备方法为：采用第一缓冲液处理第一玻璃纤维膜制得样本垫；分别采用第二缓冲液处理心磷脂抗原-荧光微球偶联物和DNP-BSA-荧光微球偶联物，然后将处理后的心磷脂抗原-荧光微球偶联物和处理后的DNP-BSA-荧光微球偶联物分别结合到第二玻璃纤维膜上制得结合垫；将所述样本垫、所述结合垫与硝酸纤维素膜、吸水纸以及底板组装得到所述荧光免疫层析试纸条，其中，所述第一缓冲液含有0.5wt%~1.5wt%的吐温-20，0.5wt%~1.5wt%的PEG20000，3wt%~8wt%的海藻糖和0.1wt%~0.6wt%的酪蛋白，所述第一缓冲液的pH值为8.0~9.0，所述第二缓冲液含有100mmol/L~200mmol/L的氯化钠，8wt%~12wt%的海藻糖，0.4wt%~0.6wt%的吐温-20和0.4wt%~0.6wt%的酪蛋白，所述第二缓冲液的pH值为8.0~9.0，所述硝酸纤维素膜上设有IgG检测线、IgM检测线和质控线。
本发明通过第一缓冲液对第一玻璃纤维膜进行处理，通过第二缓冲液对心磷脂抗原-荧光微球偶联物和DNP-BSA-荧光微球偶联物进行处理，保证了试纸条的灵敏度、准确性、稳定性、重复性。此外，IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体联合检测试纸条的结构简单，生产周期短，设备要求不高，易于实现量产化，IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体联合检测试纸条还具有检测时间短、操作简单、使用便捷、应用场景广等优势。
下面结合具体实施例和对比例进一步阐述本发明的技术方案。
以下实施例和对比例中，若无特殊说明，所使用的原料、试剂等均为常规市售产品。
以下实施例和对比例中，使用的心磷脂抗原为上海费玛生物科技有限公司生产的人工合成心磷脂抗原；二硝基苯酚偶联牛血清白蛋白（DNP-BSA）和DNP单克隆抗体均自南京拂晓生物科技有限公司；鼠抗人IgM抗体和鼠抗人IgG抗体均购自北京博尔西科技有限公司；荧光微球为铕螯合荧光微球，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司（Thermo），表面带有修饰基团为羧基，荧光微球的粒径约为0.2μm，激发波长为333nm，发射波长为613nm；IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的质控品和校准品均购自上海费玛生物科技有限公司。
以下实施例和对比例中，配套使用的荧光免疫分析仪为迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司生产的干式荧光免疫分析仪DL300。
“ACA-IgG”为IgG型抗心磷脂抗体的缩写；“ACA-IgM”为IgM型抗心磷脂抗体的缩写。
实施例1
本实施例提供一种用于联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条，其结构如图1所示，包括底板1和依次搭接在底板1上的样本垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4以及吸水纸5，其中硝酸纤维素膜4上设置有IgM检测线6、IgG检测线7和质控线8。其中，底板的材质为PVC，样本垫2和结合垫3的材质均为玻璃纤维素膜。联合检测IgG型抗心磷脂抗体/IgM的荧光免疫层析试纸条上设置有加样孔（图中未显示），荧光免疫层析试纸条的结构设置包括加样孔的设置都是本领域的常规技术手段，此处不赘述。
本实施例的IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体联合检测试纸条的制备方法为：
1. 制备样本垫2：
1.1 配制第一缓冲液，第一缓冲液为pH值为8.5、浓度为50mmol/L的Tris缓冲液，其含有1wt%的吐温-20、1wt%的PEG20000、5wt%的海藻糖和0.5wt%的酪蛋白。
1.2 将玻璃纤维素膜浸没到第一缓冲液中1min，取出后置于湿度小于30%、温度为18℃~28℃的环境下，以37℃烘干24小时，裁切得到所需规格后备用。
2. 制备结合垫3：
2.1 配制第二缓冲液，第二缓冲液为pH值为8.5、浓度为50mmol/L的Tris缓冲液，其含有150mmol/L的NaCl、10wt%的海藻糖、0.5wt%的吐温-20和0.5wt%的酪蛋白。
2.2 制备心磷脂抗原-荧光微球偶联物溶液和DNP-BSA-荧光微球偶联物溶液。
1）微球的活化及偶联：将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和荧光微球加入偶联缓冲液中，置于摇床，25℃，250r/min，孵育15min，随后16000rpm，10℃，离心15min并去除上清，使用偶联缓冲液复溶，加入心磷脂抗原得到偶联体系，置于摇床，25℃，250r/min，孵育2h。偶联缓冲液为pH值为6、浓度为0.1mol/L的MES缓冲液。在偶联体系中，EDC的用量为12.5μg/mL，荧光微球的体积为偶联总体积的10%，心磷脂抗原的终浓度为0.1mg/mL。
2）微球的封闭：摇床孵育结束后，向偶联体系中加入体积为偶联总体积的10%的封闭缓冲液，置于摇床，25℃，250r/min，孵育1h。封闭缓冲液为浓度为10wt%的BSA缓冲液。
3）微球的清洗：封闭结束后，离心去上清，使用体积为偶联总体积200%的偶联缓冲液复溶，超声，离心弃上清，即可获得心磷脂抗原-荧光微球偶联物。
4）将心磷脂抗原-荧光微球偶联物与第二缓冲液混合得到浓度为0.1wt%的心磷脂抗原-荧光微球偶联物溶液。
DNP-BSA-荧光微球偶联物溶液的制备步骤与心磷脂抗原-荧光微球偶联物溶液基本相同，只是将原本加入的终浓度为0.1mg/mL的心磷脂抗原替换为终浓度为0.1mg/mL的DNP-BSA。
2.3 将玻璃纤维素膜裁切得到所需规格。将心磷脂抗原-荧光微球偶联物溶液与DNP-BSA-荧光微球偶联物溶液按照体积比为16：1混合配制喷金液。用喷金仪将配制好的喷金液均匀喷涂到玻璃纤维素膜上，并置于湿度小于30%、温度为18℃~28℃的环境下，以37℃烘干2小时。
3. 制备硝酸纤维素膜4：
3.1 配制第三缓冲液，第三缓冲液为pH值为7.4、浓度为10mmol/L的PBS缓冲液，其含有5wt%的海藻糖和5wt%的甲醇。
3.2 取适量的第三缓冲液，加入鼠抗人IgM抗体混合得到第一包被液，鼠抗人IgM抗体在第一包被液中的浓度为2mg/mL。
取适量的第三缓冲液，加入鼠抗人IgG抗体混合得到第二包被液，鼠抗人IgG抗体在第二包被液中的浓度为2mg/mL。
取适量的第三缓冲液，加入DNP单克隆抗体混合得到第三包被液，DNP单克隆抗体在第三包被液中的浓度为2mg/mL。
3.3 用划膜仪将上述第一包被液以1μL/cm的包被速度均匀的包被在IgM检测线6的位置上，将上述第二包被液以1μL/cm的包被速度均匀的包被在IgG检测线7的位置上，将上述第三包被液以1μL/cm的包被速度均匀的包被在质控线8的位置上，置于湿度小于30%、温度为18℃~28℃的环境下，以37℃烘干24小时。
4. 荧光免疫层析试纸条组装：在底板1上的特定位置依次搭接样本垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4以及吸水纸5，组装好后以3.9mm的固定宽度裁切，得到用于联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条。
5. 本实施例中使用到的样本稀释液为pH为7.4、浓度为10mmol/L的PBS缓冲液，其含有0.5wt%的吐温-20。
6. ID卡制备：
6.1 IgG型抗心磷脂抗体标准曲线：
选择IgG型抗心磷脂抗体的6个浓度的校准品，其浓度分别为0GPLU/mL、5GPLU/mL、15GPLU/mL、30GPLU/mL、60GPLU/mL、120GPLU/mL，每个浓度校准品重复测试6次，测试方法为：使用样本稀释液将校准品稀释20倍后，取80μL加入上述荧光免疫检测试纸条的加样孔中，等待15min后，将该荧光免疫检测试纸条插入荧光免疫分析仪，读取IgG检测线6的荧光强度T值和质控线8的荧光强度C值，以IgG型抗心磷脂抗体浓度和T/C值拟合标准曲线：y=（A-D）/[1+（x/C^B）]+D，其中，A=6.01068，B=-3.68071，C=48.49502，D=0.04121，式中y表示T/C值，x表示IgG型抗心磷脂抗体的浓度值，r2=0.99985。
6.2 IgM型抗心磷脂抗体标准曲线：
选择IgM型抗心磷脂抗体的6个浓度的校准品，其浓度分别为0MPLU/mL、5MPLU/mL、15MPLU/mL、30MPLU/mL、60MPLU/mL、120MPLU/mL，测试方法为：使用样本稀释液将校准品稀释20倍后，取80μL加入上述荧光免疫检测试纸条的加样孔中，等待15min后，将该荧光免疫检测试纸条插入荧光免疫分析仪，读取IgM检测线7的荧光强度T值和质控线8的荧光强度C值，以IgM型抗心磷脂抗体浓度和T/C值拟合标准曲线：y=（A-D）/[1+（x/C^B）]+D，其中，A=3.98452，B=-3.67364，C=48.44762，D=0.02777，式中y表示T/C值，x表示IgM型抗心磷脂抗体的浓度值，r2=0.99985。
将IgG型抗心磷脂抗体标准曲线和IgM型抗心磷脂抗体标准曲线分别写入ID卡，将ID卡装入用于联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条中，荧光免疫分析仪的处理器能够读取ID卡的内容并处理样本检测结果。
对比例1
本对比例提供一种用于联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条，其结构同实施例1，其制备方法基本同实施例1，区别在于第一缓冲液中不含PEG-20000，第二缓冲液中海藻糖的用量为15wt%。
对比例2
本对比例提供一种用于联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条，其结构同实施例1，其制备方法基本同实施例1，区别在于第一缓冲液中PEG-20000的含量为0.2wt%，第二缓冲液中海藻糖的含量为5wt%。
对比例3
本对比例提供一种用于联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条，其结构同实施例1，其制备方法基本同实施例1，区别在于第一缓冲液和第二缓冲液中的酪蛋白分别换成牛血清白蛋白。
对比例4
本对比例提供一种用于联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条，其结构同实施例1，其制备方法基本同实施例1，区别在于第一缓冲液pH值为7.5，第二缓冲液pH值为9。
对比例5
本对比例提供一种用于联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条，其结构同实施例1，其制备方法基本同实施例1，区别在于第一缓冲液的配方为：pH值为8.5、浓度为5mmol/L的Tris缓冲液，其中包含5wt%的吐温-20、5wt%的PEG20000、10wt%的海藻糖和1wt%的酪蛋白。
对比例6
本对比例提供一种用于联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条，其结构同实施例1，其制备方法基本同实施例1，区别在于第二缓冲液的配方为：pH值为8.5，浓度为5mmol/L的Tris缓冲液，其包含250mmol/L的氯化钠，5wt%的海藻糖，1wt%的吐温-20和1wt%的酪蛋白。
对比例7
本对比例提供一种用于联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条，其结构同实施例1，其制备方法基本同实施例1，区别在于第一缓冲液中还添加1wt%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。
性能测试
1. 灵敏度测试
取6个浓度的IgG型抗心磷脂抗体校准品和IgM型抗心磷脂抗体校准品，分别使用实施例1、对比例1~7的IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体联合检测试纸条进行信号强度验证。IgG型抗心磷脂抗体校准品浓度为0GPLU/mL、5GPLU/mL、15GPLU/mL、30GPLU/mL、60GPLU/mL、120GPLU/mL；IgM型抗心磷脂抗体校准品浓度为0MPLU/mL、5MPLU/mL、15MPLU/mL、30MPLU/mL、60MPLU/mL、120MPLU/mL。每个浓度重复检测2次，记录信号强度均值，检测方法参见上文实施例1中标准曲线的步骤，具体测试结果见表1。
Figure 654537DEST_PATH_IMAGE001
注：表1中T2值表示IgM型抗心磷脂抗体的荧光强度，T1值表示IgG型抗心磷脂抗体的荧光强度，C值表示质控线荧光强度。
2 重复性测试
分别采用实施例1和对比例1~7的试纸条对两个浓度的质控品各重复检测10次，对比例1~对比例7的检测值代入各自的标准曲线中计算所得，计算检测结果平均值（M）、标准差（SD）和变异系数CV（%），用于IgG型抗心磷脂抗体重复性测试的质控品浓度为20GPLU/mL和60GPLU/mL，用于IgM型抗心磷脂抗体重复性测试的质控品浓度为20MPLU/mL和60MPLU/mL，结果见表2。
Figure 102836DEST_PATH_IMAGE003
3 稳定性测试
分别将实施例1和对比例1~7的试纸条置于37℃烘箱中进行加速热稳定性验证。按烘烤时间依次取出4天、7天、10天和14天的试纸条，准备好所有检测所需的试纸条后，分别用于检测质控品浓度，每个处理设置10个平行，浓度计算采用未烘烤的试纸条的标准曲线，统计烘烤4天、7天、10天和14天的试纸条相对未烘烤的试纸条的平均值偏差，以确定实施例1和对比例1~7的试纸条的稳定性。其中用于IgG型抗心磷脂抗体重复性测试的质控品浓度为20GPLU/mL和60GPLU/mL，用于IgM型抗心磷脂抗体重复性测试的质控品浓度为20MPLU/mL和60MPLU/mL，结果见表3，表3中第0天代表未进行烘烤。
Figure 23519DEST_PATH_IMAGE004
4 阴阳性符合率测试：
使用实施例1的荧光免疫层析试纸条和行业认可的欧蒙医学诊断(中国)有限公司的抗心磷脂抗体IgM检测试剂盒(酶联免疫吸附法)、抗心磷脂抗体IgG检测试剂盒(酶联免疫吸附法)分别进行血清样本检测，
实施例1的荧光免疫层析试纸条进行血清样本检测的步骤为：
（1）将荧光免疫层析试纸条插入荧光免疫分析仪，荧光免疫分析仪读取ID卡中的标准曲线，然后拔出荧光免疫层析试纸条。
（2）使用样本稀释液将血清样本稀释20倍后，取80μL加入荧光免疫层析试纸条的加样孔，静置15min。
（3）再次插入荧光免疫分析仪测试IgG检测线荧光强度（T1值）、IgM检测线荧光强度（T2值）和质控线荧光强度（C值），荧光免疫分析仪可通过ID卡内的定标曲线信息，自动将T1/C值和T2/C值换算为相对应的IgG型抗心磷脂抗体浓度和IgM型抗心磷脂抗体浓度。
欧蒙医学诊断(中国)有限公司的抗心磷脂抗体IgA/G/M检测试剂盒(酶联免疫吸附法)的检测方法参考其说明书。
分析实施例1的荧光免疫层析试纸条和抗心磷脂抗体IgM检测试剂盒、抗心磷脂抗体IgG检测试剂盒的测试结果的阴阳性符合率，测试结果见表4，阴阳性符合率见表5。
Figure 684307DEST_PATH_IMAGE005
Figure 764259DEST_PATH_IMAGE006
灵敏度测试结果显示在检测相同浓度的校准品时，实施例1的信号强度最高，表明实施例1的灵敏度最高。
重复性测试结果显示实施例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例6的重复性性能基本一致，而对比例1、对比例5和对比例7的重复性相对其他组表现较差。
稳定性测试结果显示实施例1、对比例1、对比例3、对比例4和对比例5的稳定性性能基本一致，而对比例2、对比例6和对比例7的稳定性相对其他组表现较差。
综上，实施例1的荧光免疫层析试纸条的综合性能最好，且阴阳性符合率测试显示实施例1的荧光免疫层析试纸条与金标准方法的阴阳性符合率较高，满足接受标准。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
采用第一缓冲液处理第一玻璃纤维膜制得样本垫；
分别采用第二缓冲液处理心磷脂抗原-荧光微球偶联物和DNP-BSA-荧光微球偶联物，然后将处理后的心磷脂抗原-荧光微球偶联物和处理后的DNP-BSA-荧光微球偶联物分别结合到第二玻璃纤维膜上制得结合垫；
将所述样本垫、所述结合垫与硝酸纤维素膜、吸水纸以及底板组装得到所述荧光免疫层析试纸条，
其中，所述第一缓冲液含有0.5wt%~1.5wt%的吐温-20，0.5wt%~1.5wt%的PEG20000，3wt%~8wt%的海藻糖和0.1wt%~0.6wt%的酪蛋白，所述第一缓冲液的pH值为8.0~9.0，
所述第二缓冲液含有100mmol/L~200mmol/L的氯化钠，8wt%~12wt%的海藻糖，0.4wt%~0.6wt%的吐温-20和0.4wt%~0.6wt%的酪蛋白，所述第二缓冲液的pH值为8.0~9.0，
所述硝酸纤维素膜上设有IgG检测线、IgM检测线和质控线，
将鼠抗人IgG抗体与第三缓冲液混合得到第一包被液，使用所述第一包被液在所述硝酸纤维素膜上划线，在30℃~60℃下烘干，形成所述IgG检测线；
将鼠抗人IgM抗体与第三缓冲液混合得到第二包被液，使用所述第二包被液在所述硝酸纤维素膜上划线，在30℃~60℃下烘干，形成所述IgM检测线；
将DNP单克隆抗体与第三缓冲液混合得到第三包被液，使用所述第三包被液在所述硝酸纤维素膜上划线，在30℃~60℃下烘干，形成所述质控线，
其中，所述第一包被液、所述第二包被液、所述第三包被液中抗体的浓度分别独立地为1mg/mL~5mg/mL，所述第三缓冲液的pH值为7.0~7.5，所述第三缓冲液为浓度为5mmol/L~20mmol/L的PBS缓冲液，其含有2wt%~8wt%的海藻糖和2wt%~8wt%的甲醇。
2.根据权利要求1所述的联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液分别独立地选自磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液或柠檬酸缓冲液。
3.根据权利要求2所述的联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液分别独立地为25mmol/L~70mmol/L的Tris缓冲液。
4.根据权利要求1所述的联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液的pH值分别独立地为8.5~9.0。
5.根据权利要求1所述的联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，采用第一缓冲液浸润第一玻璃纤维膜1min~3min，然后在30℃~60℃下烘干，制得所述样本垫。
6.根据权利要求1所述的联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，将所述心磷脂抗原-荧光微球偶联物与所述第二缓冲液混合得到微球含量为0.05wt%~0.5wt%的心磷脂抗原-荧光微球偶联物溶液，将所述DNP-BSA-荧光微球偶联物与所述第二缓冲液混合得到微球含量为0.05wt%~0.5wt%的DNP-BSA-荧光微球偶联物溶液，然后将所述心磷脂抗原-荧光微球偶联物溶液和所述DNP-BSA-荧光微球偶联物溶液按照体积比为（15~18）:1混合后喷涂到所述第二玻璃纤维膜上，在30℃~60℃下烘干，制得所述结合垫。
7.根据权利要求1所述的联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述心磷脂抗原-荧光微球偶联物和DNP-BSA-荧光微球偶联物中使用的荧光微球分别为铕螯合荧光微球，表面分别带有修饰基团，所述修饰基团为氨基和/或羧基，所述荧光微球分别为经N-羟基琥珀酰亚胺酯和/或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺活化的荧光微球，所述荧光微球的直径为0.1μm~0.3μm，激发波长为320nm~350nm，发射波长为600nm~620nm；
和/或，所述心磷脂抗原-荧光微球偶联物中使用的心磷脂抗原为人工合成抗原；
和/或，所述样本垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜以及所述吸水纸依次搭载在所述底板上。
8.一种用于联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条，其特征在于：由权利要求1至7中任一项所述的制备方法制备得到所述荧光免疫层析试纸条。
9.一种IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的联合定量检测系统，其特征在于：所述联合定量检测系统包括荧光免疫分析仪、权利要求8所述的荧光免疫层析试纸条和样本稀释液，所述荧光免疫层析试纸条上设有ID卡，所述ID卡中存储有标定数据和/或标准曲线，
所述联合定量检测系统的检测方法包括以下步骤：
（1）将所述荧光免疫层析试纸条插入所述荧光免疫分析仪，读取所述ID卡上的标定数据和/或标准曲线，读取完毕后拔下所述荧光免疫层析试纸条；
（2）可选择性地采用样本稀释液稀释待测样本，将未稀释或稀释后的待测样本滴加到所述荧光免疫层析试纸条上，静置反应5min~15min，未稀释或稀释后的待测样本依次经过所述样本垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜到达所述吸水纸上；
（3）将静置反应后的荧光免疫层析试纸条再次插入所述荧光免疫分析仪，读取所述IgG检测线、所述IgM检测线和所述质控线的荧光强度，根据所述标定数据和/或标准曲线计算并输出待测样本的IgG型抗心磷脂抗体浓度、IgM型抗心磷脂抗体浓度以及IgG/IgM值。
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