CN110618266A - 一种检测奶牛乳腺炎的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种荧光免疫层析测定试剂盒及其使用方法，属于体外诊断动物疫病产品技术领域。该试剂盒其包括塑料卡壳、检测试剂卡、样本稀释液，所述卡壳包括底壳和上盖，所述底壳内有试纸条卡槽，所述上盖设有扫描窗和样本加样孔；其中，所述检测试剂卡由在底板上依次粘贴的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；所述扫描窗的位置与硝酸纤维素膜的位置相配合，所述样本加样孔的位置与样品垫的位置相配合。本发明试剂盒通过检测牛奶中血清淀粉样蛋白A的含量，判断奶牛是否患乳腺炎或其患乳腺炎的严重程度，具有快速、准确、成本低廉的特点。

Description

一种检测奶牛乳腺炎的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及一种荧光免疫层析测定试剂盒及其使用方法，尤其涉及一种检测奶牛乳腺炎的荧光免疫层析测定试剂盒及其使用方法，属于体外诊断动物疫病产品技术领域。
背景技术
乳腺炎是奶牛饲养过程中的常见疾病，奶牛一旦发病将严重影响牛奶的品质，如不能准确、及时的检测出奶牛是否患有乳腺炎，将会给奶站和乳制品企业造成巨大的经济损失。目前乳腺炎主要使用体细胞计数(SCC)法进行筛查，但SCC的灵敏度及准确度有限，且易受其他因素的影响，不能准确反映炎症状态。目前国内针对奶牛乳腺炎的诊断研究较少，研制奶牛乳腺炎相关检测产品，提高检测水平，为人们提供优质安全的乳制品成为目前较为迫切的需求。
急性期反应蛋白(APP)是一类公认的炎症、外伤以及其他病理学状态的指示蛋白，包括结合珠蛋白、血清淀粉样蛋白A、C-反应蛋白等。其中，牛血清淀粉样蛋白A在急性炎症或组织损伤的刺激下，含量可迅速升高。在炎症过程中牛血清淀粉样蛋白A的主要功能是清除损伤组织、引起巨噬细胞和淋巴细胞的粘附和趋化，增强他们的杀菌和吞噬功能。机体的炎症程度减轻后，牛血清淀粉样蛋白A的分泌逐步降低至正常水平。有报道表明，牛奶中血清淀粉样蛋白A的含量与奶牛乳腺炎的病发程度呈正相关性。有文献表明牛血清淀粉样蛋白A比SCC的检测结果灵敏度更高，且不易受干扰，因此牛血清淀粉样蛋白A定量检测是奶牛乳腺炎更有价值及发展前景的诊断方法。
免疫层析是一种以硝酸纤维素膜为固相载体的快速免疫分析技术，待测样本通过毛细管作用在硝酸纤维素膜上流动，待测样本若含有目标抗原(或抗体)，则会与标记有抗体(或抗原)的示踪物结合形成复合物，该复合物被硝酸纤维素膜上特定区域的抗体(或抗原)捕获，根据检测该特定区域上的示踪物，可得到带测样本中目标抗原(或抗体)的含量。
时间分辨荧光免疫分析是以镧系元素作为标记物的非放射性标记免疫分析技术，镧系元素具有荧光半衰期长、stokes位移大、激发光谱宽而发射光谱窄的优点，因而具有较高的检测灵敏度。
应用时间分辨荧光微球的荧光免疫层析技术具有操作安全、快速、适合单个测试、可实现定量检测、灵敏度高、特异性好、成本低廉等优势。
现有牛奶血清淀粉样蛋白A的检测产品仅有ELISA法检测试剂盒，该方法检测时间较长、不适合单个样本检测。
发明内容
为了克服现有检测技术中的不足，本发明提供一种基于荧光免疫层析技术测定牛奶血清淀粉样蛋白A的免疫层析定量试剂盒，通过检测牛奶中血清淀粉样蛋白A的含量，判断奶牛是否患乳腺炎或其患乳腺炎的严重程度，具有快速、准确、成本低廉的特点。
本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。
一种检测奶牛乳腺炎的荧光免疫层析测定试剂盒，其包括塑料卡壳、检测试剂卡、样本稀释液，所述卡壳包括底壳和上盖，所述底壳内有试纸条卡槽，所述上盖设有扫描窗和样本加样孔；其中，所述检测试剂卡由在底板上依次粘贴的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；所述扫描窗的位置与硝酸纤维素膜的位置相配合，所述样本加样孔的位置与样品垫的位置相配合。
上述检测奶牛乳腺炎的荧光免疫层析测定试剂盒，所述样品垫和结合垫均为玻璃纤维素膜，底板为聚氯乙烯(PVC)底板。
上述检测奶牛乳腺炎的荧光免疫层析测定试剂盒，所述样品垫使用样品垫预处理缓冲液预处理，所述样品垫预处理缓冲液由样品垫缓冲剂、样品垫蛋白保护剂、样品垫表面活性剂溶于水制成；其中，所述样品垫缓冲剂选自磷酸盐(PBS)缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的任意一种，其浓度为5～100mM；所述样品垫蛋白保护剂选自BSA、鱼皮明胶、酪蛋白、酪蛋白钠盐、牛血清中的任意一种或几种的组合，其用量g与样品垫预处理缓冲液总体积L的比为0.5～20g：1；所述样品垫表面活性剂选自Tween-20、Tween-80、TritonX-100、TritonX-305中的任意一种，其用量g与样品垫预处理缓冲液总体积L的比为2～20g：1；所述样品垫预处理缓冲液使用本领域的常用pH调节剂进行pH值调节，pH值的范围是7.0～8.0。
上述检测奶牛乳腺炎的荧光免疫层析测定试剂盒，所述结合垫，其上含有荧光微球标记鸡IgY及荧光微球标记抗牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的复合物。所述结合垫使用结合垫预处理缓冲液进行预处理，所述结合垫预处理缓冲液由结合垫蛋白保护剂、结合垫反应增强剂、结合垫表面活性剂溶于水制成；其中，所述结合垫蛋白保护剂选自牛血清白蛋白(BSA)、鱼皮明胶、酪蛋白、酪蛋白钠盐、牛血清、蔗糖、海藻糖中的任意一种或几种，其用量g与结合垫预处理缓冲液总体积L的比为0.5～50：1；所述结合垫反应增强剂选自PEG6000、PEG8000、PEG20000、PVP K30、PVP K40中的任意一种，其用量g与结合垫预处理缓冲液总体积L的比为0.1～10：1；所述结合垫表面活性剂选自Tween-20、Tween-80、TritonX-100、TritonX-305中的任意一种，其用量g与结合垫预处理缓冲液总体积L的比为0.5～10：1。
上述检测奶牛乳腺炎的荧光免疫层析测定试剂盒，所述硝酸纤维素膜，其上包被有抗牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的检测线及包被有兔抗鸡IgY抗体的质控线，其中检测线靠近结合垫、质控线靠近吸水纸。
上述检测奶牛乳腺炎的荧光免疫层析测定试剂盒，所述结合垫和样品垫的预处理步骤为：将结合垫或样品垫分别在结合垫预处理缓冲液或样品垫预处理缓冲液中浸泡0.5～2h，取出放于36～38℃晾干。
上述检测奶牛乳腺炎的荧光免疫层析测定试剂盒，其检测原理为，采用双抗体夹心法定量检测牛奶样本血清淀粉样蛋白A的含量。
检测时，把样本滴入样本加样孔，样本通过层析作用流入结合垫，若样本含有牛血清淀粉样蛋白A，则会与结合垫上的荧光标记牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体结合形成免疫复合物，该复合物及荧光标记鸡IgY继续移动至硝酸纤维素膜上，该复合物与T线包被的牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体特异性结合，最终形成双抗体夹心复合物，荧光标记鸡IgY与C线包被的兔抗鸡IgY抗体结合；通过荧光定量分析仪对T线和C线的荧光值进行测量分析。根据试剂盒测出的T/C的荧光比值与校准品浓度关系绘制的定标曲线，将测得样本的T/C的荧光比值带入定标曲线，计算得到样本中牛血清淀粉样蛋白A的含量。
上述检测奶牛乳腺炎的荧光免疫层析测定试剂盒，其使用方法为，样本为牛奶，样本采集后，立即放入装有样本稀释液(0.01M磷酸盐缓冲液)的离心管内，牛奶与样本稀释液的体积比为1:5，震荡使其充分混匀；检测时，取100μL稀释样本滴入样品加样孔，在室温条件下，水平静置反应5min；反应结束后，将检测试剂卡插入荧光定量分析仪，读取C、T线的荧光信号值，并计算相应的T/C值，将得到的样本T/C值代入定标曲线，计算得到样本中牛血清淀粉样蛋白A的浓度。
本发明研制的奶牛乳腺炎检测试剂盒首次将牛奶的血清淀粉样蛋白A通过荧光免疫层析技术进行检测，具有快速、简便、准确、成本低廉等优点。
附图说明
图1为本发明牛血清淀粉样蛋白A荧光免疫层析试剂盒的剖面结构示意图。
图2为本发明牛血清淀粉样蛋白A荧光免疫层析试纸条的剖面结构示意图。
图3为本发明牛血清淀粉样蛋白A荧光免疫层析试剂盒的定标曲线。
具体实施方式
实施例1：制备牛血清淀粉样蛋白A荧光免疫层析检测试剂盒
1)包被：
在底板的中部粘贴硝酸纤维素膜，将牛血清淀粉样蛋白A单抗(购自芬兰Medix
Biochemica公司)使用0.01M PB缓冲液稀释到2mg/ml，作为T线包被液，将兔抗鸡IgY抗体(购自南京瀚睿柏柯生物科技有限公司)使用0.01M PB缓冲液稀释到2mg/ml，作为C线包被液。通过三维喷金划线仪，将T线及C线包被液包被到硝酸纤维素膜上。膜划好后，放于45℃鼓风干燥箱干燥1小时。
2)制备荧光微球标记牛血清淀粉样蛋白A单抗：
a)取荧光微球1mg，用50mM MES缓冲液pH 6.0稀释至1mL；
b)分别取Sulfo-NHS及EDC各约2mg，使用50mM MES缓冲液pH 6.0稀释Sulfo-NHS至10mg/ml，取0.5mg加入稀释的荧光微球中，混匀；使用50mM MES缓冲液pH 6.0稀释EDC至10mg/ml，取0.5mg加入稀释的荧光微球中，混匀，室温混匀反应30min；
c)12000rpm，4℃，离心，20min，去掉上清液，用1mL 50mM硼酸缓冲液pH 8.0复悬；
d)取牛血清淀粉样蛋白A单抗(购自芬兰Medix Biochemica公司)100μg，加入荧光微球，混匀，室温混匀反应1h；
e)加入5％BSA封闭液50ul，室温混匀反应30min；
f)12000rpm，4℃，离心20min，去掉上清液，加1mL微球保存液(含0.5％BSA，20％蔗糖)复悬；
3)制备荧光微球标记鸡IgY：
a)取荧光微球1mg，用50mM MES缓冲液pH 6.0稀释至1mL；
b)分别取Sulfo-NHS及EDC各约2mg，使用50mM MES缓冲液pH 6.0稀释Sulfo-NHS至10mg/ml，取0.25mg加入稀释的荧光微球中，混匀；使用50mM MES缓冲液pH 6.0稀释EDC至10mg/ml，取0.25mg加入稀释的荧光微球中，混匀，室温混匀反应30min；
c)12000rpm，4℃，离心，20min，去掉上清液，加1mL 50mM硼酸缓冲液pH 8.0复悬；
d)取鸡IgY(购自南京瀚睿柏柯生物科技有限公司)15μg，加入荧光微球，混匀，室温混匀反应1h；
e)加入5％BSA封闭液50ul，室温混匀反应30min；
f)12000rpm，4℃，离心20min，去掉上清液，加1mL微球保存液(含0.5％BSA，20％蔗糖)复悬；
4)制备结合垫
a)按照T线荧光微球标记抗体：C线荧光微球标记抗体：荧光微球标记抗体保存液5:1:6配制喷球工作液；
b)将预处理的结合垫裁切为10mm宽的长条，使用三维喷金划线仪，将喷球工作液按8μl/cm喷在结合垫上；
c)膜喷好后，放于45℃鼓风干燥箱干燥1小时。
5)裁切样品垫：将预处理的样品垫裁切为22mm宽的长条。
6)裁切吸水纸：将吸水纸裁切为31mm宽的长条。
7)组装检测试纸卡：硝酸纤维素膜的靠近C线一端搭接粘贴吸水纸，硝酸纤维素膜的靠近T线一端搭接粘贴结合垫，最后将样品垫搭接粘贴在结合垫旁边。将贴好的试纸板切成80mm长、4mm宽的试纸条。
8)装卡壳：将检测试纸卡装入配套塑料卡壳，压紧上下盖。
9)样本稀释液配制：样本稀释液成分为pH 7.4的0.01M PBS，含有0.5％Tween-20，0.1％酪蛋白。
实施例2：绘制牛血清淀粉样蛋白A荧光免疫层析检测试剂盒的定标曲线
使用经上海蓝基生物科技有限公司的牛血清淀粉样蛋白ELISA试剂盒定值的250mg/L样本作为高值参考品，将该样本使用本发明所述试剂盒中的样本稀释液分别稀释得到0mg/L、0.4mg/L、2mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L的校准品浓度点。使用本发明所述试剂盒中的试纸卡对每个校准品浓度点进行10个重复测试，用校准品各点测出的T/C均值与理论浓度值进行四参数拟合，绘制出定标曲线(图3)，其中X轴为校准品浓度点，Y轴为T/C均值。
实施例3：牛血清淀粉样蛋白A荧光免疫层析检测试剂盒的空白限测试
根据相关文献报道，采用测试空白限的方法评价试剂盒的灵敏度。
使用本发明所述试剂盒中的试纸卡测试20次0mg/L校准品浓度点，计算该点的T/C平均值和标准差，将该(平均值+2倍标准差)的数值代入定标曲线方程，计算得到空白限为0.052mg/L。表明本发明试剂盒测试牛奶血清淀粉样蛋白A含量>0.052mg/L的样品，检测结果将>0mg/L。
有文献报道，牛奶样本中的血清淀粉样蛋白A含量参考值范围为<0.55mg/L，该数值表示健康奶牛的牛奶样本中血清淀粉样蛋白A的含量通常<0.55mg/L，而样本中血清淀粉样蛋白A的含量≥0.55mg/L的奶牛可能患有乳腺炎等疾病。
若使用本发明研制的试剂盒测试浓度≥0.55mg/L的样本，将能够得到>0mg/L的结果，并根据定标曲线，可计算得到血清淀粉样蛋白A的含量，进而辅助判断奶牛的健康状况。因此本方法研制的试剂盒灵敏度能够满足检测需求。
表1空白限数据
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种检测奶牛乳腺炎的试剂盒，其包括塑料卡壳、检测试剂卡、样本稀释液，所述卡壳包括底壳和上盖，所述底壳内有试纸条卡槽，所述上盖设有扫描窗和样本加样孔；其特征在于，所述检测试剂卡由在底板上依次粘贴的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；所述扫描窗的位置与硝酸纤维素膜的位置相配合，所述样本加样孔的位置与样品垫的位置相配合。
2.根据权利要求1所述的检测奶牛乳腺炎的试剂盒，其特征在于，所述样品垫和结合垫均为玻璃纤维素膜，底板为聚氯乙烯(PVC)底板。
3.根据权利要求2所述的检测奶牛乳腺炎的试剂盒，其特征在于，所述样品垫使用样品垫预处理缓冲液预处理，所述样品垫预处理缓冲液由样品垫缓冲剂、样品垫蛋白保护剂、样品垫表面活性剂溶于水制成；其中，所述样品垫缓冲剂选自磷酸盐(PBS)缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的任意一种，其浓度为5～100mM；所述样品垫蛋白保护剂选自BSA、鱼皮明胶、酪蛋白、酪蛋白钠盐、牛血清中的任意一种或几种的组合，其为0.5～20g/L；所述样品垫表面活性剂选自Tween-20、Tween-80、TritonX-100、TritonX-305中的任意一种，其浓度为2～20g/L；所述样品垫预处理缓冲液使用本领域的常用pH调节剂进行pH值调节，pH值的范围是7.0～8.0。
4.根据权利要求2所述的检测奶牛乳腺炎的试剂盒，其特征在于，所述结合垫，其上含有荧光微球标记鸡IgY及荧光微球标记抗牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的复合物。所述结合垫使用结合垫预处理缓冲液进行预处理，所述结合垫预处理缓冲液由结合垫蛋白保护剂、结合垫反应增强剂、结合垫表面活性剂溶于水制成；其中，所述结合垫蛋白保护剂选自牛血清白蛋白(BSA)、鱼皮明胶、酪蛋白、酪蛋白钠盐、牛血清、蔗糖、海藻糖中的任意一种或几种，其浓度为0.5～50g/L；所述结合垫反应增强剂选自PEG6000、PEG8000、PEG20000、PVPK30、PVP K40中的任意一种，其浓度为0.1～10g/L；所述结合垫表面活性剂选自Tween-20、Tween-80、TritonX-100、TritonX-305中的任意一种，其浓度为0.5～10g/L。
5.根据权利要求2所述的检测奶牛乳腺炎的试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜，其上包被有抗牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的检测线及包被有兔抗鸡IgY抗体的质控线，其中检测线靠近结合垫、质控线靠近吸水纸。
6.根据权利要求3或4所述的检测奶牛乳腺炎的试剂盒，其特征在于，所述结合垫和样品垫的预处理步骤为：将结合垫或样品垫分别在结合垫预处理缓冲液或样品垫预处理缓冲液中浸泡0.5～2h，取出放于36～38℃晾干。
7.权利要求1所述检测奶牛乳腺炎的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
把样本滴入样本加样孔，样本通过层析作用流入结合垫，若样本含有牛血清淀粉样蛋白A，则会与结合垫上的荧光标记牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体结合形成免疫复合物，该复合物及荧光标记鸡IgY继续移动至硝酸纤维素膜上，该复合物与T线包被的牛血清淀粉样蛋白A单克隆抗体特异性结合，最终形成双抗体夹心复合物，荧光标记鸡IgY与C线包被的山羊抗鸡IgY抗体结合；通过荧光定量分析仪对T线和C线的荧光值进行测量分析。根据试剂盒测出的T/C的荧光比值与校准品浓度关系绘制的定标曲线，将测得样本的T/C的荧光比值带入定标曲线，计算得到样本中牛血清淀粉样蛋白A的含量。
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