CN112462069B - 检测犬胰腺炎的荧光免疫层析试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测犬胰腺炎的荧光免疫层析试剂盒及其制备方法，包括免疫层析试纸条和样本稀释液。本发明的荧光免疫层析试剂盒利用荧光免疫层析技术以犬胰脂肪酶单克隆抗体定量检测犬胰腺炎，借助免疫分析仪检测荧光信号，通过光电磁信号放大系统使检测灵敏度得到大大的提高，有效排除背景色的干扰，减少了人为因素对结果的误判，操作安全、简单、快速(15min)、灵敏度高。而且本发明针对犬胰腺炎的检测将样本稀释液进行了改进，加入0.1wt％～1.0wt％月桂基磷酸单酯钾盐(MAPK)和0.01wt％～1.0wt％脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵(AESA)，能够提高检测的准确度。

Description

检测犬胰腺炎的荧光免疫层析试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫层析技术领域，特别是涉及一种检测犬胰腺炎的荧光免疫层析试剂盒及其制备方法。
背景技术
胰腺炎是一种胰腺的炎症疾病，它与不同种类的炎症细胞相关，也可以被定义为胰腺的自消化性炎症。胰腺炎通常开始于消化酶的提前激活。而消化酶的提前激活可以由创伤、药物感染甚至饮食引起。胰腺炎可分为急性胰腺炎和慢性胰腺炎。犬急性胰腺炎在临床上更为常见，程度从轻微到致命都有可能，这令其很难与其他胃肠道疾病区分开来。急性胰腺炎发病急，病程短，所以及时诊治对其格外重要。
目前检测犬胰腺炎的免疫学方法主要有酶联免疫法、金标免疫渗滤法(金标法)、化学发光法、分子诊断法(PCR)等。但是金标免疫渗滤法(金标法)灵敏度不高，重复性和准确性均有欠缺，抗干扰能力不足，检测时间长，致使临床价值受到很大的限制。化学发光法需要大型仪器，而且对实验人员的要求较高，在宠物医院难以普及。
发明内容
基于此，有必要提供一种准确度较高的检测犬胰腺炎的荧光免疫层析试剂盒。
一种检测犬胰腺炎的荧光免疫层析试剂盒，包括免疫层析试纸条和样本稀释液；
所述样本稀释液为含有0.5wt％～2wt％吐温20、0.5wt％～2wt％聚乙烯吡咯烷酮40、0.001M～0.005M乙二胺四乙酸二钠或乙二胺四乙酸二钾、0.001wt％～0.005wt％防腐剂P300、0.2M～0.5M氯化钠、0.1wt％～1.0wt％月桂基磷酸单酯钾盐和0.01wt％～1.0wt％脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵的缓冲液；
所述免疫层析试纸条包括底板和设于所述底板上的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，所述结合垫的两端分别与所述样品垫及所述反应膜搭接，所述反应膜远离所述结合垫的一端与所述吸水垫搭接，所述反应膜上设有相互间隔的检测线及质控线，所述检测线较所述质控线更靠近所述结合垫，所述结合垫上含有分别用荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体和第一质控抗体，所述检测线上包被有犬胰脂肪酶单克隆捕获抗体，所述质控线包被有能够与所述第一质控抗体特异性结合的第二质控抗体。
在其中一个实施例中，所述样品垫上含有鼠IgG、伊文斯兰、阻断剂R-001、吐温20和BSA。
在其中一个实施例中，所述结合垫上还含有吐温20、BSA和蔗糖。
在其中一个实施例中，所述第一质控抗体为羊抗兔IgG抗体，所述第二质控抗体为兔IgG抗体。
在其中一个实施例中，所述荧光微球为荧光胶乳微球。
在其中一个实施例中，所述荧光微球的直径为200mm～500nm，所述荧光微球在300nm～400nm的激发光光源作用下，发射出500nm～600nm的荧光。
本发明还提供了一种上述荧光免疫层析试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
将所述吐温20、聚乙烯吡咯烷酮40、乙二胺四乙酸二钠、防腐剂P300、氯化钠、月桂基磷酸单酯钾盐、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵和Tris盐酸缓冲液混合得到所述样本稀释液；
将分别用荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体和第一质控抗体包被在结合垫上；
将犬胰脂肪酶单克隆捕获抗体包被在反应膜上形成所述检测线；
将第二质控抗体包被在所述反应膜上形成与所述检测线相间隔的所述质控线；
将所述样品垫、所述吸水垫、所述结合垫及所述反应膜设于所述底板上，得到所述免疫层析试纸条。
在其中一个实施例中，所述样品垫的制备方法包括以下步骤：制备含有0.5mg/mL～2mg/mL鼠IgG、0.5wt％～1wt％伊文斯兰、0.1mg/mL～2mg/mL阻断剂R-001、0.5wt％～3wt％吐温20和2wt％～5wt％BSA的样品垫稀释液，并以2μL/cm～8μL/cm的喷涂量喷在玻璃纤维垫上。
在其中一个实施例中，所述荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体的制备方法包括以下步骤：将荧光微球与活化缓冲液混合进行活化，然后离心弃上清并加入终止液终止活化，收集活化后的荧光微球与犬胰脂肪酶单克隆检测抗体混合孵育60min～120min，然后加入封闭液孵育30min～60min，离心弃上清后加入微球稀释液。
在其中一个实施例中，所述活化缓冲液为含有5mg/mL～10mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺和5mg/mL～10mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的Tris缓冲液；所述终止液为含有0.1wt％～0.5wt％甲醇的MES缓冲液；所述封闭液为含有0.5wt％～2wt％BSA的Tris缓冲液；所述微球稀释液为含有0.5wt％～3wt％吐温20、2wt％～5wt％BSA和3wt％～10wt％蔗糖的PBS缓冲液。
本发明的荧光免疫层析试剂盒利用荧光免疫层析技术以犬胰脂肪酶单克隆抗体定量检测犬胰腺炎，借助免疫分析仪检测荧光信号，通过光电磁信号放大系统使检测灵敏度得到大大的提高，有效排除背景色的干扰，减少了人为因素对结果的误判，操作安全、简单、快速(15min)、灵敏度高。脂肪酶主要来源于胰腺，是胰腺分泌的消化酶之一。在急性胰腺炎时，脂肪酶与淀粉酶呈平行性改变，但脂肪酶的升高在血清中出现较晚，持续时间长，所以采用犬胰脂肪酶单克隆抗体诊断胰腺炎的特异性更高。而且本发明针对犬胰腺炎的检测将样本稀释液进行了改进，加入0.1wt％～1.0wt％月桂基磷酸单酯钾盐(MAPK)和0.01wt％～1.0wt％脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵(AESA)，能够提高检测的准确度。本发明的荧光免疫层析试剂盒的基本原理为双抗体夹心法，即样本中的待测物与分散在结合垫的荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体结合形成复合物。在层析作用下，复合物沿着反应膜向前扩散，复合物被固定在反应膜检测线上对应的犬胰脂肪酶单克隆捕获抗体所捕获。样本中待测物越多，反应形成的复合物也越多，检测线上积聚的复合物则越多，显色就更加明显，荧光信号的强度反应了被捕获的待测物的数量。荧光微球标记的第一质控抗体则层析至质控线，与第二质控抗体结合显色。
附图说明
图1为本发明试剂盒的线性拟合方程图；
图2为本发明试剂盒在常温保存6个月、12个月、18个月、24个月后的检测数据图；
图3为本发明试剂盒与韩国安捷Vcheck试剂的相关性图；
图4为不同样本稀释液的检测结果差异图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例的检测犬胰腺炎的荧光免疫层析试剂盒，包括免疫层析试纸条和样本稀释液。
样本稀释液为含有0.5wt％～2wt％吐温20、0.5wt％～2wt％聚乙烯吡咯烷酮40、0.001M～0.005M乙二胺四乙酸二钠或乙二胺四乙酸二钾、0.001wt％～0.005wt％防腐剂P300、0.2M～0.5M氯化钠、0.1wt％～1.0wt％月桂基磷酸单酯钾盐和0.01wt％～1.0wt％脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵的缓冲液。
免疫层析试纸条包括底板和设于底板上的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，结合垫的两端分别与样品垫及反应膜搭接，反应膜远离结合垫的一端与吸水垫搭接，反应膜上设有相互间隔的检测线及质控线，检测线较质控线更靠近结合垫，结合垫上含有分别用荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体和第一质控抗体，检测线上包被有犬胰脂肪酶单克隆捕获抗体，质控线包被有能够与第一质控抗体特异性结合的第二质控抗体。
本发明的荧光免疫层析试剂盒利用荧光免疫层析技术以犬胰脂肪酶单克隆抗体定量检测犬胰腺炎，借助免疫分析仪检测荧光信号，通过光电磁信号放大系统使检测灵敏度得到大大的提高，有效排除背景色的干扰，减少了人为因素对结果的误判，操作安全、简单、快速(15min)、灵敏度高。脂肪酶主要来源于胰腺，是胰腺分泌的消化酶之一。在急性胰腺炎时，脂肪酶与淀粉酶呈平行性改变，但脂肪酶的升高在血清中出现较晚，持续时间长，所以采用犬胰脂肪酶单克隆抗体诊断胰腺炎的特异性更高。而且本发明针对犬胰腺炎的检测将样本稀释液进行了改进，加入0.1wt％～1.0wt％月桂基磷酸单酯钾盐(MAPK)和0.01wt％～1.0wt％脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵(AESA)，能够提高检测的准确度。本发明的荧光免疫层析试剂盒的基本原理为双抗体夹心法，即样本中的待测物与分散在结合垫的荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体结合形成复合物。在层析作用下，复合物沿着反应膜向前扩散，复合物被固定在反应膜检测线上对应的犬胰脂肪酶单克隆捕获抗体所捕获。样本中待测物越多，反应形成的复合物也越多，检测线上积聚的复合物则越多，显色就更加明显，荧光信号的强度反应了被捕获的待测物的数量。荧光微球标记的第一质控抗体则层析至质控线，与第二质控抗体结合显色。
在一个具体示例中，样品垫上含有鼠IgG、伊文斯兰、阻断剂R-001、吐温20和BSA。如此，可以提高免疫层析检测的抗干扰能力，提高检测准确性。
在一个具体示例中，结合垫上还含有吐温20、BSA和蔗糖，有助于进一步提高抗干扰能力。
在一个具体示例中，第一质控抗体为羊抗兔IgG抗体，第二质控抗体为兔IgG抗体。可以理解，第一质控抗体和第二质控抗体的选择不限于此，根据需要选择能够特异性结合的抗体即可。
可选地，荧光微球为荧光胶乳微球、胶体金颗粒或磁珠微粒，底板为PVC板，结合垫和样品垫均为玻璃纤维垫，反应膜为硝酸纤维素膜。
在一个具体示例中，荧光微球的直径为200mm～500nm，荧光微球在300nm～400nm的激发光光源作用下，发射出500nm～600nm的荧光。
在一个具体示例中，荧光免疫层析试剂盒还包括卡壳，免疫层析试纸条设于该卡壳内，卡壳上设有加样孔，以便较好地保护试纸条免受污染，也便于测试。
可以理解，犬胰脂肪酶单克隆检测抗体和犬胰脂肪酶单克隆捕获抗体为纯化后的单克隆抗体，来源于针对犬胰腺炎的抗原决定簇的单克隆抗体细胞株。
本发明一实施方式的荧光免疫层析试剂盒的制备方法，包括以下步骤S1～S5：
S1、将吐温20、聚乙烯吡咯烷酮40、乙二胺四乙酸二钠、防腐剂P300、氯化钠、月桂基磷酸单酯钾盐、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵和Tris盐酸缓冲液按照上述浓度比例混合得到样本稀释液。
S2、将分别用荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体和第一质控抗体包被在结合垫上。
S3、将犬胰脂肪酶单克隆捕获抗体包被在反应膜上形成检测线。
S4、将第二质控抗体包被在反应膜上形成与检测线相间隔的质控线。
S5、将样品垫、吸水垫、结合垫及反应膜设于底板上，得到免疫层析试纸条。
在一个具体示例中，样品垫的制备方法包括以下步骤：制备含有0.5mg/mL～2mg/mL鼠IgG、0.5wt％～1wt％伊文斯兰、0.1mg/mL～2mg/mL阻断剂R-001、0.5wt％～3wt％吐温20和2wt％～5wt％BSA的样品垫稀释液，并以2μL/cm～8μL/cm的喷涂量喷在玻璃纤维垫上。
在一个具体示例中，结合垫的制备方法包括以下步骤：制备含有5wt％～15wt％荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体和5wt％～15wt％荧光微球标记的第一质控抗体的微球稀释液，并以2μL/cm～8μL/cm的喷涂量喷在玻璃纤维垫上。
在一个具体示例中，将犬胰脂肪酶单克隆捕获抗体包被在反应膜上形成检测线的方法包括以下步骤：用含2wt％～5wt％蔗糖的PBS缓冲液将犬胰脂肪酶单克隆捕获抗体稀释到0.5mg/mL～1mg/mL作为检测线(T线)工作液，以检测线工作液在反应膜上划线，然后进行烘干。优选地，划线的浓度为0.5μL/cm～2μL/cm，烘干温度为40℃～60℃，烘干时间为48～72小时。
在一个具体示例中，将第二质控抗体包被在反应膜上形成质控线的方法包括以下步骤：用含2wt％～5wt％蔗糖的PBS缓冲液将第二质控抗体稀释到0.5mg/mL～1mg/mL作为质控线(C线)工作液，以质控线工作液在反应膜上划线，然后进行烘干。优选地，划线的浓度为0.5μL/cm～2μL/cm，烘干温度为40℃～60℃，烘干时间为48～72小时。
在一个具体示例中，荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体的制备方法包括以下步骤：将荧光微球与活化缓冲液混合进行活化，然后离心弃上清并加入终止液终止活化，收集活化后的荧光微球与犬胰脂肪酶单克隆检测抗体混合孵育60min～120min，然后加入封闭液孵育30min～60min，离心弃上清后加入微球稀释液。
在一个具体示例中，活化缓冲液为含有5mg/mL～10mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺和5mg/mL～10mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的Tris缓冲液。优选地，终止液为含有0.1wt％～0.5wt％甲醇的MES缓冲液。优选地，封闭液为含有0.5wt％～2wt％BSA的Tris缓冲液。优选地，微球稀释液为含有0.5wt％～3wt％吐温20、2wt％～5wt％BSA和3wt％～10wt％蔗糖的PBS缓冲液。
本发明的荧光免疫层析试剂盒操作简单，检测时间短，只需要采集75μl的犬血清(全血、血浆均可测试)，加入样本稀释液混匀后，滴入加样孔，只需15min即可出定量检测结果，大大减少检测时间，能快速判断病情，缩短治愈时间，真正实现即时检测。定量检测犬胰腺炎的浓度只需要使用小型仪器(干式免疫荧光检测仪)，灵敏度高，线性范围广，准确度高，与韩国安捷试剂的临床样本相关性R2在0.95，适合在中小型宠物医院普及。本发明的检测犬胰腺炎的荧光免疫层析试剂盒，保存温度是4℃～30℃，可常温保存，大大降低了运输成本，使用方便。本发明的检测犬胰腺炎的荧光免疫层析试剂盒，通过对样本稀释液和样品垫的优化，可减少非特异性干扰，样本类型可支持全血、血浆、血清，为用户提供多种选择。
以下为具体实施例。
实施例1试剂盒的制备
制备样本稀释液：将各组分混合得到含有1wt％吐温20、1wt％聚乙烯吡咯烷酮40、0.003M乙二胺四乙酸二钠、0.003wt％防腐剂P300、0.3M氯化钠、0.5wt％月桂基磷酸单酯钾盐和0.5wt％脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵的0.01M Tris缓冲液(pH8.0)。
制备样品垫：制备含有1mg/mL鼠IgG、0.5wt％伊文斯兰、1mg/mL阻断剂R-001、2wt％吐温20和3wt％BSA的样品垫稀释液，并以6μL/cm的喷涂量喷在玻璃纤维垫上。
制备具有检测线和质控线的反应膜：用含3wt％蔗糖的0.01M PBS缓冲液(pH＝7.4)将犬胰脂肪酶单克隆捕获抗体稀释到0.8mg/mL作为检测线(T线)工作液，用含3wt％蔗糖的0.01M PBS缓冲液(pH＝7.4)将兔IgG抗体稀释到0.8mg/mL作为质控线(C线)工作液。将反应膜贴在PVC板上，分别以检测线工作液和质控线工作液在反应膜上划线，划线浓度为1μL/cm，然后置于50℃烘干48小时。
制备荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体和羊抗兔IgG抗体：用移液枪吸取1mL微球，12000～15000rpm离心10～15min，弃上清，加入1mL清洗缓冲液，超声混匀。加入1mL活化缓冲液，在旋转混匀仪上混匀20min。12000～15000rpm离心10～15min，弃上清，加入1mL终止液，超声混匀。分别加入0.5mg的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体和羊抗兔IgG，在旋转混匀仪上混匀60min。加入1mL封闭液，超声混匀，在旋转混匀仪上混匀30min。12000～15000rpm离心10～15min，弃上清，加入1mL微球稀释液，超声混匀。其中，清洗缓冲液为0.01M Tris缓冲液；活化缓冲液是含8mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺和8mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的0.01M Tris缓冲液；终止液是含0.3wt％甲醇的0.1M MES缓冲液；封闭液是含1wt％BSA的0.01M Tris缓冲液；微球稀释液含有2wt％吐温20、3wt％BSA和5wt％蔗糖的0.02M PBS缓冲液。所用单克隆抗体为小鼠抗犬胰脂肪酶单抗隆抗体，购自珠海博美生物科技有限公司。
制备结合垫：获得含有10wt％荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体和10wt％荧光微球标记的羊抗兔IgG抗体的微球稀释液，并以6μL/cm的喷涂量喷在玻璃纤维垫上。
将样品垫、吸水垫、结合垫及反应膜设于PVC底板上，得到免疫层析试纸条。
实施例2拟合线性方程
采用上述试剂盒对不同浓度的犬胰腺炎校准品进行测定，犬胰腺炎校准品的浓度以及对应的检测限信号值和质控线信号值如表1所示，其中，检测限信号值和质控线信号值分别用T和C表示。
表1犬胰腺炎校准品不同浓度对应的检测限信号值和质控线信号值
Figure BDA0002767418340000111
结论：如图1所示，线性拟合方程与重复性测试结果显示，试剂盒在检测范围0～200μg/L cPL线性拟合相关系数R大于0.99。
实施例3精密度
取215μg/L、900μg/L两个水平的的校准品，每个浓度测试10张试剂卡。犬胰腺炎校准品的浓度以及对应的检测限信号值和质控线信号值如表2所示，其中，检测限信号值和质控线信号值分别用T和C表示。
表2
Figure BDA0002767418340000121
Figure BDA0002767418340000131
结果显示：本试剂盒的批内精密度较好，检测两个浓度的参考品的批内精密度变异系数(CV)小于10％。
实施例4准确度
对浓度为71μg/L、240μg/L、680μg/L的犬胰腺炎校准品进行测定，每个浓度各检测3次计算样本测定结果均值和相对偏差(表3)。用本试剂盒与配套仪器(干式荧光免疫试剂盒)进行样本测试，并与韩国安捷Vcheck试剂进行比较(表4)。
表3
Figure BDA0002767418340000132
表4
Figure BDA0002767418340000133
Figure BDA0002767418340000141
结果显示：本试剂盒的准确度较好，检测3个浓度的参考品的相对偏差Bias％在±15％内。
实施例5试剂盒常温保存时间检测
将试剂盒常温保存6个月、12个月、18个月、24个月，分别检测校准品71μg/L、240μg/L、680μg/L，稳定性检测结果如下表5所示。
表5
Figure BDA0002767418340000142
结论：本试剂盒常温保存24个月后，相对偏差Bias％在±15％内，试剂盒可以常温保存2年。
实施例6
用本试剂盒与配套仪器(干式荧光免疫试剂盒)进行样本测试，并与韩国安捷Vcheck试剂进行相关性比较，如表6所示。
表6
Figure BDA0002767418340000143
Figure BDA0002767418340000151
Figure BDA0002767418340000161
结论：本试剂盒测定结果与韩国安捷Vcheck仪器及配套试剂盒测定的结果，相关系数为R2＝0.953，相关性较好，可用于临床诊断。
实施例7样本稀释液中添加与不添加MAPK、AESA的结果差异
用本试剂盒与配套仪器(干式荧光免疫试剂盒)对浓度为123μg/L、215μg/L、320μg/L、432μg/L的犬胰腺炎校准品进行测定，每个浓度各检测3次，结果如表7所示。其中，检测信号值用T/C表示，不加的组分以吐温20进行补充代替。
表7
Figure BDA0002767418340000171
结论：根据结果显示，样本稀释液加入MAPK和AESA比不加MAPK和AESA的准确度更高，优选同时加入表面活性剂MAPK和AESA。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种检测犬胰腺炎的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，包括免疫层析试纸条和样本稀释液；
所述样本稀释液为含有0.5wt％～2wt％吐温20、0.5wt％～2wt％聚乙烯吡咯烷酮40、0.001M～0.005M乙二胺四乙酸二钠或乙二胺四乙酸二钾、0.001wt％～0.005wt％防腐剂P300、0.2M～0.5M氯化钠、0.1wt％～1.0wt％月桂基磷酸单酯钾盐和0.01wt％～1.0wt％脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵的缓冲液；
所述免疫层析试纸条包括底板和设于所述底板上的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，所述结合垫的两端分别与所述样品垫及所述反应膜搭接，所述反应膜远离所述结合垫的一端与所述吸水垫搭接，所述反应膜上设有相互间隔的检测线及质控线，所述检测线较所述质控线更靠近所述结合垫，所述结合垫上含有分别用荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体和第一质控抗体，所述检测线上包被有犬胰脂肪酶单克隆捕获抗体，所述质控线包被有能够与所述第一质控抗体特异性结合的第二质控抗体；所述样品垫上含有鼠IgG、伊文斯兰、阻断剂R-001、吐温20和BSA。
2.根据权利要求1所述的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述结合垫上还含有吐温20、BSA和蔗糖。
3.根据权利要求1所述的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述第一质控抗体为羊抗兔IgG抗体，所述第二质控抗体为兔IgG抗体。
4.根据权利要求1所述的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述荧光微球为荧光胶乳微球。
5.根据权利要求4所述的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述荧光微球的直径为200mm～500nm，所述荧光微球在300nm～400nm的激发光光源作用下，发射出500nm～600nm的荧光。
6.一种权利要求1～5任一项所述的荧光免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述吐温20、聚乙烯吡咯烷酮40、乙二胺四乙酸二钠、防腐剂P300、氯化钠、月桂基磷酸单酯钾盐、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵和Tris盐酸缓冲液混合得到所述样本稀释液；
将分别用荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体和第一质控抗体包被在结合垫上；
将犬胰脂肪酶单克隆捕获抗体包被在反应膜上形成所述检测线；
将第二质控抗体包被在所述反应膜上形成与所述检测线相间隔的所述质控线；
将所述样品垫、所述吸水垫、所述结合垫及所述反应膜设于所述底板上，得到所述免疫层析试纸条。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述样品垫的制备方法包括以下步骤：制备含有0.5mg/mL～2mg/mL鼠IgG、0.5wt％～1wt％伊文斯兰、0.1mg/mL～2mg/mL阻断剂R-001、0.5wt％～3wt％吐温20和2wt％～5wt％BSA的样品垫稀释液，并以2μL/cm～8μL/cm的喷涂量喷在玻璃纤维垫上。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述荧光微球标记的犬胰脂肪酶单克隆检测抗体的制备方法包括以下步骤：将荧光微球与活化缓冲液混合进行活化，然后离心弃上清并加入终止液终止活化，收集活化后的荧光微球与犬胰脂肪酶单克隆检测抗体混合孵育60min～120min，然后加入封闭液孵育30min～60min，离心弃上清后加入微球稀释液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述活化缓冲液为含有5mg/mL～10mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺和5mg/mL～10mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的Tris缓冲液；所述终止液为含有0.1wt％～0.5wt％甲醇的MES缓冲液；所述封闭液为含有0.5wt％～2wt％BSA的Tris缓冲液；所述微球稀释液为含有0.5wt％～3wt％吐温20、2wt％～5wt％BSA和3wt％～10wt％蔗糖的PBS缓冲液。
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Denomination of invention: Fluorescence immunoassay kit for detecting canine pancreatitis and its preparation method

Granted publication date: 20221118

Pledgee: China Construction Bank Corporation Guangzhou Development Zone Branch

Pledgor: HEALVET (GUANGZHOU) MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980031790