CN116539886A - 检测超敏心肌肌钙蛋白i含量的检测卡、试剂盒及检测方法 - Google Patents
检测超敏心肌肌钙蛋白i含量的检测卡、试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测超敏心肌肌钙蛋白I含量的检测卡、试剂盒及检测方法；其中，检测卡中的试纸条包括底板，在底板上依次设有样品垫、第一结合垫、第二结合垫、反应膜以及吸收垫；反应膜两端分别与第二结合垫一端及吸收垫一端形成交叠压，第二结合垫另一端与第一结合垫一端形成交叠压，第一结合垫另一端与所述样品垫一端形成交叠压；反应膜上设有相互平行的检测线和质控线，且检测线靠近第二结合垫。该检测卡，基于时间分辨荧光免疫层析法，在试纸条的第一结合垫上包被有生物素标记的第一抗体、第二结合垫上包被有荧光微球标记第二抗体，可以提高检测的灵敏度；该检测卡操作流程简单、检测时间短、检测成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其涉及一种检测超敏心肌肌钙蛋白I含量的检测卡、试剂盒及检测方法。
背景技术
心肌肌钙蛋白I(cTnI：cardiac troponin I)是一个分子量为22.5KD的心肌蛋白，它与肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白C(TnC)一起形成一个超敏心肌肌钙蛋白复合物，共同完成细胞内肌动蛋白间相互作用的钙信号传递的基本功能。
目前cTnI已成为心梗的临床诊断，治疗，监测必不可少的标志物。超敏心肌肌钙蛋白在正常人微量存在，但在心肌梗死发生时，心肌细胞毁损造成cTnI释放入血，无论ST段是否抬高，cTnI都会急剧升高，在24小时左右达到高峰，7－10天后下降至正常水平。cTnI升高的幅度与心肌细胞坏死程度有一定程度的关联。如果病人血中cTnI在下降过程中再次升高，意味着心肌再次损伤/坏死。cTnI浓度的变化与急性心肌梗死危险程度、治疗决策和预后明确相关。随着cTnI的广泛应用，医生们逐渐认识到一个问题，那就是当患者的cTnI结果为阳性时，就已经是较严重心肌损伤了。cTnI灵敏度的增加可以提高早期AMI检测的检出率，通过系列cTnI检测来判断随着时间变化的ΔcTnI可以有效鉴别急性心肌梗死和结构性心脏病患者。用高敏感方法测定hs－cTnI，能够有效区分健康人和发生微小心肌损伤的患者，早期诊断心肌梗死，有效降低心梗患者死亡率。市面上也不断地涌入大量的POCT产品，而这些产品的性能普遍又达不到高敏的要求，比如检出率低、不能监测病情的发展趋势、灵敏度特异性不够等。因此，发明一种能够提高检出率，且能够随时监测心肌梗塞患者血液中hs－cTnI含量的检测方法和试剂盒，对基层医院或者病房尤其重要。
目前，超敏心肌肌钙蛋白I常用的检测方法有免疫比浊法、化学发光法，这些方法都是基于抗原抗体特异性结合反应进行的检测。
(1)免疫比浊法。其原理是抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过量时，形成的复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物的含量。免疫浊度测定法按照仪器设计的不同可以分为两种，即比浊仪测定和散射比浊仪测定。比浊仪测定是测量由于反射、吸收或散射引起的入射光衰减，其读数以吸光度A表示。A反映了入射光与透射光的比率。散射比浊仪测定是测量入射光遇到质点(复合物)后呈一定角度散射的光量，该散射光经放大后以散射值表示。但缺点是需特殊仪器如生化仪或者特定蛋白检测仪等。
(2)化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析。是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析仪器。化学发光免疫分析仪包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原(化学发光免疫分析)或抗体(免疫化学发光分析)上，或酶作用于发光底物。化学发光免疫分析仪器中核心探测器件为光电倍增管，由单光子检测并传输至放大器，并加高压电流放大，放大器将模拟电流转化为数字电流，数字电流将发光信号由R232数据线传输给电脑并加以计算，得出临床结果。化学发光免疫分析技术的优势在于灵敏度高、较宽的线性动力学范围、结果稳定、误差小；缺点是需要配对专业的化学发光仪器，且多为封闭式系统，不同厂家之间试剂和仪器不能通用，成本较高。
发明内容
基于上述问题，本发明所要解决的问题之一在于提供一种操作简单、检测时间快、检测灵敏度高，且制作成本低的超敏心肌肌钙蛋白I含量的检测卡。
本发明所要解决的问题之二在于提供一种检测超敏心肌肌钙蛋白I含量的试剂盒。
本发明所要解决的问题之三在于提供一种超敏心肌肌钙蛋白I含量的检测方法。
本发明的技术方案一如下：
一种检测超敏心肌肌钙蛋白I含量的检测卡，所述检测卡包括试纸条以及适配纳置所述试纸条的卡壳；其中：
所述试纸条包括长条状的底板，在所述底板上沿其长度方向依次设有样品垫、第一结合垫、第二结合垫、反应膜以及吸收垫；所述反应膜的两端分别与第二结合垫的一端及吸收垫的一端形成交叠压搭接，所述第二结合垫的另一端与第一结合垫的一端形成交叠压搭接，所述第一结合垫的另一端与所述样品垫的一端形成交叠压搭接；所述反应膜上设有相互平行的检测线和质控线，且检测线靠近所述第二结合垫；
所述卡壳包括纳置腔、加样孔和观察窗；所述加样孔和观察窗分别与所述纳置腔贯通；当所述试纸条置于所述卡壳的纳置腔中时，所述样品垫通过加样孔外露、所述反应膜通过所述观察窗外露。
其中，所述检测卡，在所述第一结合垫上设有生物素标记的cTnI第一抗体。
其中，所述检测卡，在所述第二结合垫上设有荧光微球标记的识别不同表位的cTnI第二抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY单克隆抗体。
其中，所述检测卡，所述检测线包被链霉亲和素。
其中，所述检测卡，所述质控线包被鸡IgY单克隆抗体。
其中，所述检测卡，所述样品垫、所述第一结合垫和第二结合垫均为玻璃纤维素膜制得。
其中，所述检测卡，所述反应膜为硝酸纤维素膜制得。
本发明还提供一种检测超敏心肌肌钙蛋白I含量的试剂盒，该试剂盒包括上述任一所述的检测卡、样本稀释液和芯片；所述芯片中存储有试剂标准曲线数据信息；所述样本稀释液用于稀释待检测血清、血浆和/或全血样本。
本发明还提供一种使用上述试剂盒进行血清、血浆和/或全血液中心肌肌钙蛋白I含量的检测方法，包括如下步骤：
首先，将血清、血浆和/或全血液样本加入到样本稀释液中混合均匀，得到混合样本；
其次，将混合样本再加入到检测卡的加样孔中，10～15分钟内，由检测卡的观察窗显示检测结果；
最后，将试剂盒中的检测卡插入配套的免疫荧光分析仪后，检测出血清、血浆和/或全血液样本中超敏心肌肌钙蛋白I的浓度。
本发明提供的一种检测超敏心肌肌钙蛋白I含量的检测卡，基于时间分辨荧光免疫层析法，在试纸条的第一结合垫上包被有生物素标记的超敏心肌肌钙蛋白I第一抗体、第二结合垫上包被有荧光微球标记的识别不同表位的超敏心肌肌钙蛋白I第二抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY单克隆抗体，通过利用“生物素－链霉亲和素放大系统”和将针对不同抗原表位的抗体分别包被于不同的结合垫上，可以提高检测的灵敏度；该检测卡操作流程简单、检测时间短、检测成本较低。另外，含该检测卡的试剂盒制备方法简单，可以实现批量生产，有利于大规模推广应用，具备广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明检测卡中试纸条的侧面结构示意图；
图2为本发明检测卡中试纸条的正面结构示意图；
图3为本发明检测卡中试纸条的卡壳结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
如图1和2所示，本发明提供的检测超敏心肌肌钙蛋白I(hs－cTnI) 含量的检测卡，包括试纸条10以及适配纳置试纸条10的卡壳20；其中：
如图1所示，试纸条10包括长条状PVC材质制得的底板6，在底板6 的一个表面上沿其长度方向依次设有样品垫1、第一结合垫2、第二结合垫 3、反应膜4以及吸收垫5；反应膜5的两端分别与第二结合垫3的一端及吸收垫4的一端形成交叠压搭接，第二结合垫3的另一端与第一结合垫2 的一端形成交叠压搭接，第一结合垫2的另一端与样品垫1的一端形成交叠压搭接；也即是，样品垫1、第一结合垫2、第二结合垫3、反应膜4由左向右依次形成首尾交叠压搭接方式粘连在一起，样品垫1与吸收垫4分别设置在底板6的两端。在反应膜上设有相互平行的检测线(T线)7和质控线(C线)8，且检测线7靠近第二结合垫3。
如图2所示，卡壳20包括纳置腔23、加样孔22和观察窗21；加样孔 22和观察窗21分别与纳置腔23贯通；当试纸条10置于卡壳20的纳置腔 23中时，样品垫1通过加样孔22外露，即样品垫1与加样孔22位置对应设置，反应膜4通过观察窗21外露，也就是说反应膜4与观察窗21的位置对应设置。
上述试纸条10上，在第一结合垫2上设有生物素标记的cTnI第一抗体；在第二结合垫3上设有荧光微球标记的识别不同表位的cTnI第二抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY单克隆抗体。
上述试纸条10上，检测线7包被链霉亲和素；其质控线8包被鸡IgY 单克隆抗体。
上述试纸条10上，样品垫1、第一结合垫2和第二结合垫3均为玻璃纤维素膜制得；反应膜4为硝酸纤维素膜制得。
本发明提供的检测超敏心肌肌钙蛋白I含量的试剂盒，包括检测卡、样本稀释液和芯片；芯片中存储有试剂标准曲线数据信息；样本稀释液用于稀释待检测血清、血浆和/或全血样本。
本发明提供的使用上述试剂盒进行人体血清、血浆和/或全血液中心肌肌钙蛋白I含量的检测方法，按照表1所示的反应参数进行，包括如下步骤：
首先，将人血清、血浆和/或全血液样本加入到样本稀释液中混合均匀，得到混合样本；
其次，将混合样本再加入到检测卡的加样孔中，10～15分钟内，由检测卡的观察窗显示检测结果；
最后，将试剂盒中的检测卡插入配套的免疫荧光分析仪后，检测出血清、血浆和/或全血液样本中超敏心肌肌钙蛋白I的浓度。
表1反应参数
| 样本类型 | 样本量 | 加样量 | 反应时间 | 反应温度 |
| 血清、血浆和全血 | 100μL | 100μL | 15min | 18～30℃ |
检测实现原理如下：
检测时，首先，将血样样本加入到试剂条的样品垫上，通过毛细管作用下的层析作用下，在第一结合垫上，血样样本中cTnI抗原和生物素标记的心肌肌钙蛋白I第一抗体发生特异性结合，形成cTnI抗原－生物素标记的cTnI第一抗体复合物；在第二结合垫上，cTnI抗原－生物素标记的cTnI 第一抗体复合物与荧光微球标记的识别不同表位的cTnI第二抗体发生特异性结合，形成抗体－抗原－抗体夹心复合物；该抗体－抗原－抗体夹心复合物被反应膜(即硝酸纤维素膜)检测线上包被的链霉亲和素所捕获。因此，当血样样本中的cTnI抗原越多，检测线上的夹心复合物积聚的也多。荧光信号的强度反映了被捕获的cTnI抗原数量，血样样本中的cTnI抗原与复合物荧光强度成正比，根据设定的标准曲线，免疫荧光检测仪将荧光信号值转换成样本中cTnI抗原的浓度。
下面通过几个实施例详细说明
实施例1超敏心肌肌钙蛋白I免疫层析检测试剂盒的组成成分、包装及数量(50反应/盒)，如表2所示。
表2试剂盒的组成成分、包装及数量
实施例2检测卡的制作过程
(一)试纸条的制作
1)样品垫的制备
样品垫为玻璃纤维膜，对样品垫进行预处理，使用含有0.5％BSA、1％ PEG20000、0.2％Tween－20的pH8.0及0.1M的硼酸－硼砂组成的缓冲液浸泡处理，置于温度为50℃鼓风干燥箱烘干10小时，密封保存；
2)结合垫的制备
a)结合垫的预处理：将玻璃纤维素膜放入结合垫处理液(含有1％BSA、 0.05％Tween－20的0.1M及pH8.0的硼酸－硼砂缓冲液)中浸泡处理后，于50℃鼓风干燥箱中烘干10小时。
b)生物素标记抗体溶液的制备：将心肌肌钙蛋白I第一抗体以0.01M， pH7.4的磷酸盐缓冲液4℃透析过夜，调整浓度为4mg/mL。准确称取300mg 生物素溶解于5mL的二甲亚砜(DMSO)中，室温条件下加入200mg的N－羟基琥珀酰亚胺(NHS)，280mg的N－(3－二甲基氨基丙基)－N＇－乙基碳二亚胺(EDC)，将反应混合物在室温下搅拌2小时。滤液浓缩后通过硅胶柱色谱纯化，在异丙醇中重结晶得到的白色固体即为预活化的生物素。用二甲亚砜(DMSO)溶解预活化的生物素，使其终浓度为0.05M，并加入到透析过的心肌肌钙蛋白 I第一抗体中，使得心肌肌钙蛋白I第一抗体与生物素的摩尔比为1∶10，室温反应2小时，以0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液4℃透析过夜，制得生物素标记抗体溶液。
c)荧光微球标记抗体溶液的制备：将2mL 0.05M PH6.0MES缓冲液加入到1mL荧光微球溶液，室温条件下加入100mg的N－羟基琥珀酰亚胺(NHS)， 100mg的N－(3－二甲基氨基丙基)－N＇－乙基碳二亚胺(EDC)，将反应混合物在室温下搅拌0.5小时。滤液浓缩后加入1mg超敏心肌肌钙蛋白I第二抗体 /0.5mg羊抗鸡IgY抗体，室温反应2小时，离心去上清后加入1mL 10％BSA溶液封闭1小时，离心去上清后加入含有1％BSA和0.1％Tween－20的0.05M，pH8.0的Tris－HCl缓冲液进行复溶，制得荧光微球标记抗体溶液。
d)第一结合垫的制备：将上述步骤b)制备获得的生物素标记抗体使用定量喷膜仪以4μL/cm均匀喷涂于上述步骤a)中预处理过的玻璃纤维素膜上，于50℃鼓风干燥箱中烘干10小时，制得包被生物素标记的cTnI第一抗体的第一结合垫，加入干燥剂封存备用。
e)第二结合垫的制备：将上述步骤c)制备获得的荧光微球标记cTnI抗体和荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体以1：1比例充分混匀后使用定量喷膜仪以6μL/cm均匀喷涂于上述步骤a)中预处理过的玻璃纤维素膜上，于50℃鼓风干燥箱中烘干10小时制得荧光微球标记的识别不同表位的cTnI第二抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY单克隆抗体包被的第二结合垫，加入干燥剂封存备用。
3)反应膜制备
a)检测线的制备：使用包被液(含有2％海藻糖的0.01M，pH7.4的 Tris－HCl缓冲液)将链霉亲和素稀释到2mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以 1.2μL/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于50℃鼓风干燥箱中烘干10小时，制得含检测线的反应膜。
b)质控线的制备：使用包被液(含有2％海藻糖的0.01M，pH7.4的 Tris－HCl缓冲液)将鸡IgY抗体稀释到1mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以 1.0μL/cm均匀喷涂于含检测线的反应膜，于50℃鼓风干燥箱中烘干10小时，制得含检测线和质控线的反应膜。
4)试纸条的组装
a)在湿度小于35％，温度20～30℃条件下进行试纸条的组装。在底板粘贴面的方向顺次连接且相邻部位部分重叠的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、包被膜及吸收垫；
b)在反应膜粘覆底板时，检测线的位置靠近结合垫，质控线的位置靠近吸收垫，组装好后切割成宽度为4.0mm的试纸条。
c)在底板上正确安装试纸条，吸收垫应装在底板的终端，置于压壳设备上压牢，得到试纸条，备用。
(二)检测卡的组装
1)制备卡壳：将塑料薄片，按照试纸条的规格尺寸，冲压出相应的卡壳平面包装片，并在其中一表面分别冲压出加样孔和观察窗，折叠粘结后，制得含纳置腔的卡壳；
2)组装检测卡：首先，将试纸条适配装入卡壳的纳置腔中，且试纸条的样品垫对应位于加样孔出，第一结合垫和第二结合垫则位于观察窗位置处；粘封好卡壳的装入口；随后，将检测卡和干燥剂一同装入一铝箔袋中，密封备用。
实施例3：ID芯片数据存储
取已进行中间产品检测合格的试纸条和hs－cTnI校准品，每个校准品至少有5个浓度，每个浓度至少测试5次，将各个浓度校准品测试值(T/C 值)的平均值与浓度做标准曲线，得到线性方程；
将方程式的数值导入专用软件中，将空白的原始芯片连接至电脑，通过专用软件即可将数值代码导入芯片，贴好芯片标签。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种检测超敏心肌肌钙蛋白I含量的检测卡，其特征在于，所述检测卡包括试纸条以及适配纳置所述试纸条的卡壳；其中：
所述试纸条包括长条状的底板，在所述底板上沿其长度方向依次设有样品垫、第一结合垫、第二结合垫、反应膜以及吸收垫；所述反应膜的两端分别与第二结合垫的一端及吸收垫的一端形成交叠压搭接，所述第二结合垫的另一端与第一结合垫的一端形成交叠压搭接，所述第一结合垫的另一端与所述样品垫的一端形成交叠压搭接；所述反应膜上设有相互平行的检测线和质控线，且检测线靠近所述第二结合垫；
所述卡壳包括纳置腔、加样孔和观察窗；所述加样孔和观察窗分别与所述纳置腔贯通；当所述试纸条置于所述卡壳的纳置腔中时，所述样品垫通过加样孔外露、所述反应膜通过所述观察窗外露。
2.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，在所述第一结合垫上设有生物素标记的cTnI第一抗体。
3.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，在所述第二结合垫上设有荧光微球标记的识别不同表位的cTnI第二抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述检测线包被链霉亲和素。
5.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述质控线包被鸡IgY单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述样品垫玻璃纤维素膜制得。
7.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述第一结合垫和第二结合垫均为玻璃纤维素膜制得。
8.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述反应膜为硝酸纤维素膜制得。
9.一种检测超敏心肌肌钙蛋白I含量的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1至8任一所述的检测卡、样本稀释液和芯片；所述芯片中存储有试剂标准曲线数据信息；所述样本稀释液用于稀释待检测血清、血浆和/或全血样本。
10.一种血清、血浆和/或全血液中心肌肌钙蛋白I含量的检测方法，其特征在于，该检测方法使用权利要求9所述试剂盒，该检测方法包括如下步骤：
首先，将血清、血浆和/或全血液样本加入到样本稀释液中混合均匀，得到混合样本；
其次，将混合样本再加入到检测卡的加样孔中，10～15分钟内，由检测卡的观察窗显示检测结果；
最后，将试剂盒中的检测卡插入配套的免疫荧光分析仪后，检测出血清、血浆和/或全血液样本中超敏心肌肌钙蛋白I的浓度。
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