JP3356785B2 - グリコヘモグロビン（％）の定量 - Google Patents

グリコヘモグロビン（％）の定量

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、血液サンプル中のグリコヘモグロビン（GH
b）の検出法、または定量法、特にグリコヘモグロビン
の割合評価のために改善された、精度の高い１回読み取
り法、即ち総ヘモグロビン（THb）測定の必要がない方
法に関する。
発明の背景 グリコヘモグロビン（GHb）は、ヘモグロビン分子に
様々な糖類（最も一般的にはグルコース）が結合して生
成する一連の少量のヘモグロビン成分を意味する。ヒト
赤血球は、グルコースを自由に浸透させる。各赤血球内
で、GHbは周囲のグルコース濃度に正比例した速度で生
成する。グルコースとヘモグロビンとの反応は、非酵素
的で不可逆的、かつゆっくりと進むため、赤血球の寿命
（120日）の間に総ヘモグロビンの一部分しか糖化しな
い。その結果、GHbを測定することにより、長期血糖値
のモニタリングに用いることができる、血糖値の重みつ
き「移動」平均が得られ、過去２〜３ヶ月間の平均血糖
値の正確な指標となる。糖尿病患者における血糖管理の
評価が、この最も重要な臨床応用である。
ヘモグロビンA1c（HbA1c）はある特有の型のグリコヘ
モグロビンで、糖尿病に関する最も重要なヘモグロビン
種である。HbA1cの総ヘモグロビン量は、非糖尿病患者
では約３〜６％で、管理をあまり行っていない糖尿病患
者では20％以上である（Goldstein DEら、Clin Chem 3
2:B64−B70（1986））。HbA1cでは、グルコースがヘモ
グロビンＡの一方または両方のβ鎖のアミノ末端バリン
残基に結合している。HbA1c（ならびに他のグリコヘモ
グロビンA1種）は、電荷の差で分子を分離する方法によ
り、非糖化ヘモグロビンから分離することができる。ヘ
モグロビンの糖化はヘモグロビン分子の他の部位でも起
こるが、これらの種は非糖化ヘモグロビンから電荷の差
により分離することはできないため、これらのヘモグロ
ビン種はすべてHbA0と呼ばれる。グリコヘモグロビンの
すべての型を測定する方法は、総GHbを測定することで
あると言われている。ある部位の糖化は、他のいかなる
部位の糖化とも比例していると考えられるため、GHbとH
bA1cとの間には直線的相関がある。糖尿病管理および合
併症試験研究班（Diabetes Control and Complications
Trial（DCCT）Research Group）は、GHbにおける１％
の変化（％HbA1c）が過去120日間の血糖値における300m
g/Lの平均変化を表していると報告した。
尿および血糖値を含む、糖尿病の血糖管理を評価する
従来法は変動する可能性があり、糖濃度の経時情報を示
さず、また、食事により劇的な影響を受けるため限られ
た価値しかない。しかしGHbの測定は、対象者の過去２
〜３ヶ月間の平均血糖値の正確な指標となり、糖尿病患
者は血糖値管理に対する長期的目標達成のあらましを把
握できる。GHb値は患者の経時的血糖管理のモニタリン
グに用いることができるため、高度の長期アッセイ精度
および異なる方法間の標準化が必須である。これらの臨
床的な要求に応えて、米国臨床化学協会（American Ass
ociation of Clinical Chemistry）（AACC）は、1993年
にGHb標準化に関する小委員会を結成した。GHb標準化小
委員会（GHb Standardization Subcommittee）は、検査
室内におけるすべてのGHbアッセイに対し、測定間のCV
を５％以下に維持すべきで、新しいサンプルについての
標準化は、DCCTへの相関に基づいて行うべきと勧告し
た。作成されたアッセイ法はすべて、認可を受けるため
にはこれらの要求に合致しなければならない。
臨床アッセイ法は、電荷の差または構造上の特徴のい
ずれかに基づいてGHbを総ヘモグロビンから分離する。
電荷の差に基づく方法には、陽イオン交換クロマトグラ
フィーおよび電気泳動が含まれ、HbA0から、HbA1または
HbA1cをそれらの電荷の差に基づいて分離する。イオン
交換クロマトグラフィーは、大型カラム、小型カラム、
もしくは超小型カラムで、または高圧液体クロマトグラ
フィー（HPLC）により、実施することができる。大型カ
ラムによる方法は臨床検査室における常用には非実用的
であるが、単純化された小型または超小型カラムが利用
可能である。しかし、これらの方法は再現性が低く、温
度、pH、およびイオン強度の変動に非常に敏感である。
電気泳動は、温度、pHまたはイオン強度にそれほど敏感
ではないが、イオン交換法にも見られる他の欠点、すな
わち不安定なGHb中間体による干渉があり、この中間体
はGHb検査前に除去しておかなければならず、また、血
色素病がある場合の諸問題、サンプルの保存状態に対す
る感受性、ならびにアスピリン治療、エタノール濃度、
および尿毒症などの外来性臨床因子からの干渉がある。
また、HPLCおよび電気泳動には特別な装置が必要であ
る。
構造上の特徴に基づく方法には、アフィニティー結合
またはクロマトグラフィー、およびイムノアッセイが含
まれる。これらの方法は、温度、pH、またはイオン強度
の小さな変動に対する感受性がより低く、一般に前述の
不安定なGHb中間体、血色素病、もしくはサンプルの保
存状態、または外来性臨床因子による影響を受けない。
しかし、これらの方法は、非糖化成分からのGHbの分離
を含むか、または％GHbを計算するために別々の２回の
定量−１回は総ヘモグロビンの定量、２回目はGHbまた
はHbA1cの定量−が必要である。ボロネートはGHbに対す
る親和性があるため、固相基質に結合させたボロネート
配位子をアフィニティー結合アッセイに用いることがで
きる。次いで結合（糖化）ヘモグロビンの、非結合（非
糖化）ヘモグロビンに対する比を定量することができ
る。イムノアッセイは、HbA1c特異抗体を用いてHbA1cを
測定するが、％GHbを計算するために別々の２回の定
量、すなわち１回は総ヘモグロビン、もう１回はHbA1c
の定量が必要である。または、イムノアッセイは受動的
吸着により全ヘモグロビン種を結合し、次いで特異的抗
体抱合体によりHbA1cを検出することもできる。しか
し、この方法はヘモグロビンの変種により不都合な影響
を受けることがある。
従って、当技術分野で必要とされるのは、総ヘモグロ
ビン含有量をも定量する必要がない、改善された精度の
高い、血液サンプル中のグリコヘモグロビンの検出法ま
たは定量法である。
発明の概要 本明細書に記載の、独特で新規なアプローチは、全血
サンプル中の％GHbを測定し、わずか１回の測定後に％G
Hbの結果を示すものである。本法は、％GHbを例えばGHb
/THb×100の比として計算するために、総ヘモグロビン
およびGHbの別々の測定を必要とする、前述の当技術分
野で現在利用可能な方法とは異なっている。本明細書に
記載のGHbアッセイは、全血サンプル中のDCCT標準化％G
Hb定量のための単純な方法を用いている。まず、全血溶
解サンプルを、ボロン酸（boronic）、フェニルボロン
酸（phenylboronic）もしくはホウ酸、または関係する
ボロネート（boronate）化合物が、当技術分野では周知
の共有結合化学により結合している固相と共にインキュ
ベートする。この固相は、サンプル中の％GHbに正比例
してGHbを特異的に捕獲するため、新規である。次に、
ヒトヘモグロビンを認識する標識成分を加えると、得ら
れるシグナルはサンプル中の％GHbに正比例する。１回
の定量を用いて％GHbを測定する利点には、精密度が高
いこと（CV約５％未満）、およびアッセイが容易に自動
化できるため処理量が高いこと（100〜200検査／時）が
挙げられる。自動化により、本アッセイは１台の分析器
上で他の検査と統合することもできる。
図面の簡単な説明 図１は、本発明の一つの態様による、CMA/Merquatコ
ートした粒子およびポリアニオン試薬（Polyanion Reag
ent）とあらかじめ混合したサンプルを用いて、％GHb値
を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフであ
る。
図２は、本発明の一つの態様による、CMA/Merquatコ
ートした粒子をポリアニオン試薬と共に用いて、％GHb
値を測定する全血サンプル検査の結果を示すグラフであ
る。
図３は、本発明の一つの態様による、CMA−APBAコー
トした粒子を用いて、％GHb値を測定する全血サンプル
検査の結果を示すグラフである。
図４は、本発明の一つの態様による、CMC−APBAコー
トした粒子を用いて％GHb値を測定する全血サンプル検
査の結果を示すグラフである。
図５は、本発明の一つの態様による、PAA−APBAコー
トした粒子を用いて％GHb値を測定する全血サンプル検
査の結果を示すグラフである。
図６は、本発明の一つの態様による、TREN−CMA−APB
Aコートした粒子を用いて％GHb値を測定する全血サンプ
ル検査の結果を示すグラフである。
図７は、本発明の一つの態様による、TREN−CMC−APB
Aコートした粒子を用いて％GHb値を測定する全血サンプ
ル検査の結果を示すグラフである。
図８は、本発明の一つの態様による、APBAコートした
粒子を用いて％GHb値を測定する全血サンプル検査の結
果を示すグラフである。
図8Aは、本発明の一つの態様による、EDA−CMA−APBA
コートした粒子を用いて％GHb値を測定する全血サンプ
ル検査の結果を示すグラフである。
図９は、Biorad Diamat HPLCおよび本発明の好ましい
態様を用いて測定した％GHb値間の相関を示すグラフで
ある。
図10は、Abbott IMx（登録商標）GHbアッセイおよび
本発明の好ましい態様を用いて測定した％GHb値間の相
関を示すグラフである。
図11は、本発明の好ましい態様を用いて％GHb値を測
定した場合の、測定間の相関を示すグラフである。
図12は、本発明の一つの態様による、１ステップ（同
時）フォーマットを用いて％GHb値を測定する全血サン
プル検査の結果を示すグラフである。
図13は、本発明の一つの態様による、アクリジニウム
標識したCortexポリクローナルヤギ抗ヒトヘモグロビン
を用いて％GHb値を測定する全血サンプル検査の結果を
示すグラフである。
図14は、本発明の一つの態様による、アクリジニウム
標識したBiosPacificモノクローナル抗ヒトヘモグロビ
ンを用いて％GHb値を測定する全血サンプル検査の結果
を示すグラフである。
図15は、本発明の一つの態様による、アクリジニウム
標識したBiosPacificポリクローナルヤギ抗ヒトヘモグ
ロビンを用いて％GHb値を測定する全血サンプル検査の
結果を示すグラフである。
図16は、本発明の一つの態様による、アクリジニウム
標識したDakoポリクローナルウサギ抗ヒトヘモグロビン
を用いて％GHb値を測定する全血サンプル検査の結果を
示すグラフである。
好ましい態様の詳細な説明 ヘモグロビンを遊離させるために全血中の赤血球を溶
血し、その後サンプルを希釈して、グリコヘモグロビン
が結合するボロネート反応基を有する固相とインキュベ
ートする。このインキュベートを行っている間に、固相
にはサンプル中の％GHbに直接比例したGHbが特異的に捕
獲される。固相に捕獲されたGHを測定するために、サン
プル混合液と標識した抗ヘモグロビン抗体（Ab）と反応
させる。得られるシグナルを検出すると、このシグナル
はサンプル中の％GHbに正比例する。従って、本発明の
様々な態様による方法を用いることにより、２回測定す
ること、すなわち１回はGHb、およびもう１回は総ヘモ
グロビンを測定して、その比で％GHbを求める必要がな
くなる。
一つの特定の理論に制限されることなく、グリコヘモ
グロビンは固相に結合されたボロネート親和性複合体に
結合すると考えられる。固相への結合に際し、総ヘモグ
ロビンがグリコヘモグロビンと直接競合し、それにより
１回の測定でグリコヘモグロビンの割合が正確に求めら
れると考えられる。
全血サンプルを水中で希釈するか、またはより好まし
くはTRITON（登録商標）Ｘ−100のような非イオン性界
面活性剤などの物質を用いるかのいずれかによる、様々
な方法で全血を溶血することができる。溶血により、分
析に用いるヘモグロビンおよびその誘導体が赤血球から
遊離する。
本発明に係るGHbアッセイは、ボロン酸、フェニルボ
ロン酸、ホウ酸、およびボロネートなど（以下「ボロネ
ート」とする）の化合物またはその一部分の、グリコヘ
モグロビンに対する親和性に基づく。ボロネートは、ヘ
モグロビンに結合しているグルコースのシス−ジオール
部分を介してサンプル中のGHbと反応し、５員環構造を
形成する。ボロネート基は、共有結合、様々な化学的結
合、または静電気的結合により固相に結合させることが
でき、その方法は、例えば米国特許第5,459,080号など
当技術分野において記載されており、この開示は本明細
書中で参照として組み込まれる。
固相自体は、表面官能基を有するようさらに誘導体化
することのできるポリスチレン、ポリアクリルアミド、
アガロース、デキストラン、ラテックス、シリカ、ガラ
スなどで作られたビーズ、微粒子、磁気微粒子、微量定
量プレート、チューブなどを含む様々な物質から選ぶこ
とができるが、このような物質に制限されない。これら
の表面官能基には、当業者には周知の標準的結合法に従
ってボロネートまたはボロネート支持体に共有結合する
ことが可能な、アルデヒド、脂肪族アミン、芳香族アミ
ン、アミド、カルボン酸、スルフヒドリル、クロロメチ
ル、エポキシ、ヒドラジド、ヒドロキシルなどが含まれ
るが、これらに制限されることはない。好ましい固相に
は、アミノ官能基を有する磁気ラテックス粒子が含ま
れ、特に好ましくは、ジアミンおよび標準的結合法を用
いてアミノ粒子に誘導したカルボキシル化磁気ラテック
ス粒子が含まれる。ジアミンには、エチレンジアミン、
1,6−ヘキサンジアミン、1,4−トランス−シクロヘキサ
ンジアミンが含まれ、エチレンジアミンが好ましいが、
これらに制限されることはない。
ボロネート化合物を結合するための好ましい表面官能
基部分は、カルボキシメチルアミロース、カルボキシメ
チルセルロース、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン
酸、ポリリジン、ポリアクリル酸、タンパク、アルブミ
ン、抗体などを含む様々な物質から選ぶことができる
が、このような物質に制限されることはなく、周知の方
法により固相に結合することができる。好ましい表面官
能基部分はカルボキシメチルセルロースで、カルボキシ
メチルアミロースが特に好ましい。
本発明の方法に用いるためのボロネート化合物には、
ギャロップ（Gallop）の米国特許第4,496,722号に記載
の化合物が含まれ、この開示は本明細書中で参照として
組み込まれる。好ましい化合物には、４−カルボキシフ
ェニルボロン酸、３−ニトロ−５−カルボキシフェニル
ボロン酸およびｍ−アミノフェニルボロン酸（APBA）が
含まれる。特に好ましいのは、ｍ−アミノフェニルボロ
ン酸（APBA）である。
ボロネート結合基により固相に結合されたGHbは、次
いでヘモグロビン分子の一部を認識する抗体を用いて検
出することができ、このような抗体は、検出可能な部分
に結合または抱合されている。標識成分は抗体でもよ
く、望ましくはモノクローナルもしくはポリクローナル
抗体（Ab）、または抗原結合部位を含むAb断片、あるい
は、Ｆ（ab'）２もしくはFab断片などの相補性決定領域
（CDR）でもよい。検出可能部分または標識は、放射
性、蛍光もしくは化学発光物質、または酵素でもよい。
または、第一のAbの種特異的Fc断片を認識する、標識し
た第二のAbも用いることができる。また、標識成分とし
て単純に標識を有することも可能である。いずれの場合
にもシグナルが生じ、用いた標識物質の型に応じて検出
することになる。
別法として、標識を付加する代わりに、結合したヘモ
グロビン自体がそのペルオキシダーゼ様の性質により検
出可能なシグナルを発することも可能である。これは別
の基質（例えばイソルミノール）の添加の有無に関わら
ず、過酸化水素の添加により達成される。
好ましくは、当技術分野で周知の方法を用いて全血サ
ンプルを溶解し、希釈する。血球を、技術者が入手でき
る薬剤を用いて溶解する。これらのうち、界面活性剤、
特に非イオン性界面活性剤が好ましい。例えば0.5％TRI
TON（登録商標）Ｘ−100非イオン性界面活性剤を用い
る、1:80の希釈が標準的である。アゾ吉草酸を加えられ
たカルボキシル化磁気微粒子（azo−valeric initiate
d,carboxylated magnetic microparticles）を、アミ
ン、好ましくはエチレンジアミン（EDA）でコートし、
このアミンにポリマー、好ましくはアニオン重合体、特
にカルボン酸のアニオン重合体およびボロネート化合物
を結合させる。特に好ましいのは、表面官能基部分とし
て１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩（EDAC）を用いた、カルボキシメチ
ルアミロース（CMA）およびｍ−アミノフェニルボロン
酸（APBA）である。誘導体化した微粒子を、次いで溶解
したサンプルと共にインキュベートする。洗浄後、アク
リジニウム標識したモノクローナル抗ヘモグロビンAbを
添加する。インキュベーションおよび洗浄に続き、トリ
ガー試薬（Trigger Reagent）を加え、得られる化学発
光シグナルを相対光単位（Relative Light Units）（RL
U）として測定する。標識成分により生じたシグナルを
読み取る、別の方法も本発明の範囲内である。アッセイ
と同時に測定する較正物質または標準物質により、測定
した化学発光シグナルを用いてサンプル中の％GHbを求
める較正（または標準）曲線を作成する。測定した化学
発光シグナルは、サンプル中の％GHbに正比例する。
実施例 以下の実施例は、本発明の様々な態様を提示するため
のものである。これらは例示のために示したにすぎず、
本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
簡単に言うと、ヘモグロビンを遊離させるために全血
中の赤血球を溶血し、その後サンプルを希釈して、グリ
コヘモグロビンが結合するボロネート反応基を有する固
相とインキュベートした後、％GHbを測定した。次いで
または同時に、サンプル混合液を標識した抗ヘモグロビ
ンAbと反応させた。洗浄後、得られるシグナルを検出し
たところ、このシグナルはサンプル中の％GHbに正比例
した。
以下の実施例により、溶血および希釈の異なる方法、
ボロネート基を磁気微粒子に結合するための異なる手
段、ならびに異なる抗ヘモグロビン抗体の使用を示す。
すべての方法は、本明細書中に参照として組み入れられ
る米国特許第5,468,646および米国特許第5,543,524に記
載のとおり、Abを化学発光標識するために、スルホプロ
ピルアクリジニウムエステル（10−（３−スルホプロピ
ル）−Ｎ−トシル−Ｎ−（２−カルボキシプロピル）−
９−アクリジニウムカルボキサミド）を用い、検出され
たAbの定量、従って％GHbを求めるために、相対光単位
（RLU）の検出を用いた。
実施例１−−磁気微粒子へのボロネートの結合 A. CMA/MERQUAT（登録商標）コートしたアミノ微粒
子 固体含量５％のアミノ磁気微粒子（＃AM 40−500、
Spherotech、Libertyville、IL）2mlを、50mM 2−（Ｎ
−モルホリノ）エタンスルホン酸、pH6.2（MESバッファ
ー）10mlで３回洗浄した。洗浄した微粒子を、次いで24
0mgのカルボキシメチルアミロース（CMA;＃C4947、Sigm
a、St.Louis、MO）および96mgの１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ED
AC）を含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回
転装置上でインキュベートした。インキュベーション
後、微粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0で３回洗
浄し、２％ Merquat溶液10ml中に再懸濁した。
以下の実施例4.A.および4.B.に記載のとおり、CMA/Me
rquatコートした微粒子をIMx（登録商標） GHb Polyan
ion Reagent（Abbott Laboratories、Abbott Park、I
L）と共に用いた。このポリアニオン試薬は、ポリアク
リル酸に結合したフェニルボロン酸で構成されている。
B. CMA−APBAコートしたアミノ微粒子 固体含量５
％のアミノ磁気微粒子（＃AM 40−500、Spherotech、Li
bertyville、IL）2mlを、MESバッファー10mlで３回洗浄
した。洗浄した微粒子を、次いで240mgのCMAおよび96mg
のEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、
回転装置上でインキュベートした。インキュベーション
後、微粒子を磁石に引きつけ、上清を廃棄した。微粒子
をMESバッファー10mlで１回洗浄し、次いで46.5mgのｍ
−アミノフェニルボロン酸（半硫酸塩）（APBA）および
96mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分
間、回転装置上でインキュベートした。インキュベーシ
ョン後、微粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0で３
回洗浄し、同じバッファー10ml中に再懸濁した。
C. CMC−APBAコートしたアミノ微粒子 固体含量５
％のアミノ磁気微粒子（＃AM 40−500、Spherotech、Li
bertyville、IL）2mlを、MESバッファー10mlで３回洗浄
した。洗浄した微粒子を、次いで240mgのカルボキシメ
チルセルロース（CMC）（分子量250,000;＃41931−１、
Aldrich、Milwaukee、WI）および96mgのEDACを含むMES
バッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でイン
キュベートした。インキュベーション後、微粒子を磁石
に引きつけ、上清を廃棄した。微粒子をMESバッファー1
0mlで１回洗浄し、次いで46.5mgのAPBAおよび96mgのEDA
Cを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回転装
置上でインキュベートした。インキュベーション後、微
粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0で３回洗浄し、
同じバッファー10ml中に再懸濁した。
D. PAA−APBAコートしたアミノ微粒子 固体含量５
％のアミノ磁気微粒子（＃AM 40−500、Spherotech、Li
bertyville、IL）2mlを、MESバッファー10mlで３回洗浄
した。洗浄した微粒子を次いで、209mgの35％ポリアク
リル酸（PAA）（分子量250,000;＃41600−２、Aldric
h、Milwaukee、WI）および96mgのEDACを含むMESバッフ
ァー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベ
ートした。インキュベーション後、微粒子を磁石に引き
つけ、上清を廃棄した。微粒子をMESバッファー10mlで
１回洗浄し、次いで46.5mgのAPBAおよび96mgのEDACを含
むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上
でインキュベートした。インキュベーション後、微粒子
を100mMタウリンバッファー、pH9.0で３回洗浄し、同じ
バッファー10ml中に再懸濁した。
E. TREN−CMA−APBAコートしたカルボキシル微粒子
固体含量５％のカルボキシル磁気微粒子（SP1267、Po
lymer Labs、Shropshire、UK）2mlを、MESバッファー10
mlで３回洗浄した。洗浄した微粒子を、次いで73mgのト
リス（２−アミノエチル）アミン（TREN）および96mgの
EDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回
転装置上でインキュベートした。インキュベーション
後、微粒子を磁石に引きつけ、上清を廃棄した。微粒子
をMESバッファー10mlで３回洗浄し、次いで120mgのCMA
および48mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温
で60分間、回転装置上でインキュベートした。２回目の
インキュベーション後、微粒子をMESバッファー10mlで
１回洗浄し、次いで46.5mgのAPBAおよび96mgのEDACを含
むMESバッファー10ml中で、室温でさらに60分間、回転
装置上でインキュベートした。この最後のインキュベー
ション後、微粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0で
３回洗浄し、同じバッファー10ml中に再懸濁した。
F. TREN−CMC−APBAコートしたカルボキシル微粒子
固体含量５％のカルボキシル磁気微粒子（SP1267、Po
lymer Labs、Shropshire、UK）2mlを、MESバッファー10
mlで３回洗浄した。洗浄した微粒子を、次いで73mgのト
リス（２−アミノエチル）アミン（TREN）および96mgの
EDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分間、回
転装置上でインキュベートした。インキュベーション
後、微粒子を磁石に引きつけ、上清を廃棄した。微粒子
をMESバッファー10mlで３回洗浄し、次いで120mgのCMC
（分子量700,000;＃41933−８、Aldrich、Milwaukee、W
I）および48mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室
温で60分間、回転装置上でインキュベートした。２回目
のインキュベーション後、微粒子をMESバッファー10ml
で１回洗浄し、次いで46.5mgのAPBAおよび96mgのEDACを
含むMESバッファー10ml中で、室温でさらに60分間、回
転装置上でインキュベートした。この最後のインキュベ
ーション後、微粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0
で３回洗浄し、同じバッファー10ml中に再懸濁した。
G. APBAコートしたカルボキシル微粒子 固体含量５
％のカルボキシル磁気微粒子（SP1340、Polymer Labs、
Shropshire、UK）2mlを、MESバッファー10mlで３回洗浄
した。洗浄した微粒子を、次いで43.2mgのAPBAおよび96
mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室温で60分
間、回転装置上でインキュベートした。インキュベーシ
ョン後、微粒子を50mMタウリンバッファー、pH9.0、10m
lで２回洗浄し、同じバッファー10ml中に再懸濁した。
H. EDA−CMA−APBAコートしたカルボキシル微粒子
固体含量５％の、アゾ吉草酸を加えられたカルボキシル
化磁気微粒子（azo−valeric initiated carboxylated
magnetic microparticles）（AB007C、Polymer Labs、S
hropshire、UK）2mlを、MESバッファー10mlで３回洗浄
した。洗浄した微粒子を、次いで15μｌのエチレンジア
ミン（EDA）および10mgのEDACを含むMESバッファー10ml
中で、室温で60分間、回転装置上でインキュベートし
た。インキュベーション後、微粒子を磁石に引きつけ、
上清を廃棄した。微粒子をMESバッファー10mlで３回洗
浄し、次いで120mgのCMAおよび19.6mgのEDACを含むMES
バッファー10ml中で、室温で60分間、回転装置上でイン
キュベートした。２回目のインキュベーション後、微粒
子をMESバッファー10mlで１回洗浄し、次いで46.5mgのA
PBAおよび96mgのEDACを含むMESバッファー10ml中で、室
温でさらに60分間、回転装置上でインキュベートした。
この最後のインキュベーション後、微粒子を50mMタウリ
ンバッファー、pH9.0で３回洗浄し、同じバッファー10m
l中に再懸濁した。
実施例２−−抗体のアクリジニウムとの抱合 抱合させ
る抗体を、まずリン酸緩衝食塩水（PBS）を３回変え
て、１回の透析交換に４〜６時間かけて透析した。次い
で抗体を1mg/mlの濃度に希釈した。1mg/mlの抗体溶液を
混合しながら、10％３−［（３−コラミドプロピル）−
ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸塩（CH
APS）および５μg/mlのスルホプロピルアクリジニウム
エステルを加えた。これを室温で10分間混和し、次いで
吸着床面積120ml（1.6×60cm）のファルマシアセファク
リル（Pharmacia Sephacryl）Ｓ−200カラムにのせた。
カラムに用いたバッファーは2.28mM一塩基リン酸ナトリ
ウム、7.68mM二塩基リン酸ナトリウム、145mM NaCl、0.
1％CHAPS、pH6.3であった。1mlを一分画として採取し、
280nmの吸光度が0.1以上の分画を集めた。アクリジニウ
ム標識した抗体を、抱合希釈液（Conjugate Diluent）
（２％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.5％TRITON
（登録商標）Ｘ−100を含む10mM MES、150mM NaCl、pH
6.3）中で、最終濃度40ng/mlに希釈した。
実施例３−−GHbアッセイのプロトコル 微粒子を、100
mMタウリンバッファー、pH9.0で洗浄し、別に記載のな
い場合は、同じバッファー中に固体含量0.1％で再懸濁
した。全血サンプルを溶解および希釈し、次いで50μｌ
のサンプルを50μｌの微粒子と混合し、37℃で18分間イ
ンキュベートした。次いで粒子を磁石に引きつけ、コモ
ンバッファー（Common Buffer）（0.05％Brijおよび0.1
％NaN3を含む4mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.
5）1mlで４回洗浄した。
実施例２に記載のとおりに調製した、ヒトヘモグロビ
ンに対するアクリジニウム標識した抗体50μｌを、洗浄
した微粒子に加えた。標識抗体を微粒子と共に37℃で４
分間インキュベートし、次いで粒子を磁石に引きつけ
て、コモンバッファー1mlで４回洗浄した。
0.053％HNO3、1.2％H2O2および0.9％ジエチレントリ
アミンペンタ酢酸（DPTA）のトリガー試薬と、続いて0.
35N NaOHおよび２％TRITON（登録商標）Ｘ−100とを加
えることにより、化学発光シグナルが生じた。化学発光
シグナルを相対光単位（RLU）で測定した。
実施例４−−GHbアッセイにおけるボロネート磁気微粒
子の使用 IMx（登録商標）GHbアッセイ（Abbott Laboratorie
s、Abbott Park、IL）における％GHb値に基づき、％GHb
値の臨床範囲をカバーする６から８個の全血サンプル
を、検査のために選択した。
A. CMA/Merquatコートした粒子：サンプル＋ポリア
ニオン試薬 全血サンプルを、蒸留水中で1:5に希釈す
ることにより溶解した。次いで溶血物をPBS中の0.5％TE
TRONIC（登録商標）1307（BASF ＃550193、Mount Oliv
e、NJ）中で1:16にさらに希釈した。実施例1.A.で調製
した微粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0で洗浄
し、次いで同じタウリンバッファー中に固体含量0.1％
で再懸濁した。希釈した全血サンプルを、同量のIMx
（登録商標）GHb Polyanion Reagent（Abbott Laborato
ries、Abbott Park、IL）と混合し、37℃で７分間イン
キュベートしてサンプル中のGHbをポリアニオン試薬の
ボロネート基に結合させた。インキュベーション後、こ
の混合物50μｌを微粒子50μｌと混合し、実施例３に記
載のとおりにインキュベートおよび洗浄した。
実施例２に記載のとおりにアクリジニウムで標識しDE
AE精製した、ヒトヘモグロビンに対するマウスモノクロ
ーナル抗体（IgG1）（クローンMIH9505、Medix Biotec
h,Inc.、San Carlos、CA）を、洗浄した微粒子に加え、
実施例３に記載のとおりに実験を完了した。図１によ
り、化学発光シグナル（RLU）がサンプル中の％GHbに正
比例（Ｒ＝0.956）していたことが明らかである。
B. CMA/Merquatコートした粒子＋ポリアニオン試薬 実施例1.A.から得た、CMA/Merquatコートした微粒子
を、100mMタウリンバッファー、pH9.0で洗浄し、ポリア
ニオン試薬に固体含量0.1％で再懸濁することにより、I
Mx（登録商標）GHb Polyanion Reagent（Abbott Labora
tories、Abbott Park、IL）で上塗りコートした。次い
で微粒子を100mMタウリンバッファー、pH9.0で洗浄し
て、過剰のポリアニオン試薬を除去し、タウリンバッフ
ァー中に固体含量0.1％で再懸濁した。
実施例4.A.に記載のとおりに調製したサンプル溶血物
50μｌを、次いで微粒子50μｌと混合し、実施例4.A.と
同じ抗体を用いて実施例３に記載のとおりにGHbアッセ
イを実施した。図２により、化学発光シグナル（RLU）
がサンプル中の％GHbに正比例（Ｒ＝0.984）していたこ
とが明らかである。
C. CMA−APBAコートした粒子 全血サンプルを実施
例4.A.に記載のとおりに選択し、蒸留水中の0.5％TRITO
N（登録商標）Ｘ−100中に1:80に希釈することにより溶
血した。次いでGHbアッセイを、実施例1.B.から得た微
粒子および実施例4.A.と同じ抗体を用いて、実施例３に
記載のとおりに実施した。図３により、化学発光シグナ
ル（RLU）がサンプル中の％GHbに正比例（Ｒ＝0.981）
していたことが明らかである。
D. CMC−APBAコートした粒子 GHbアッセイを、実施
例4.C.に記載のとおりに調製したサンプル、実施例1.C.
から得た微粒子、および実施例4.A.と同じ抗体を用い
て、実施例３に記載のとおりに実施した。図４により、
化学発光シグナル（RLU）がサンプル中の％GHbに正比例
（Ｒ＝0.961）していたことが明らかである。
E. PAA−APBAコートした粒子 GHbアッセイを、実施
例4.C.に記載のとおりに調製したサンプル、実施例1.D.
から得た微粒子、および実施例4.A.と同じ抗体を用い
て、実施例３に記載のとおりに実施した。図５により、
化学発光シグナル（RLU）がサンプル中の％GHbに正比例
（Ｒ＝0.928）していたことが明らかである。
F. TREN−CMA−APBAコートした粒子 GHbアッセイ
を、実施例4.C.に記載のとおりに調製したサンプル、実
施例1.E.から得た微粒子、および実施例4.A.と同じ抗体
を用いて、実施例３に記載のとおりに実施した。図６に
より、化学発光シグナル（RLU）がサンプル中の％GHbに
正比例（Ｒ＝0.978）していたことが明らかである。
G. TREN−CMC−APBAコートした粒子 GHbアッセイ
を、実施例4.C.に記載のとおりに調製したサンプル、実
施例1.F.から得た微粒子、および実施例4.A.と同じ抗体
を用いて、実施例３に記載のとおりに実施した。図７に
より、化学発光シグナル（RLU）がサンプル中の％GHbに
正比例（Ｒ＝0.994）していたことが明らかである。
H. APBAコートした粒子 GHbアッセイを、実施例4.
C.に記載のとおりに調製したサンプル、実施例1.G.から
得た微粒子、および実施例4.A.と同じ抗体を用いて、実
施例３に記載のとおりに実施した。図８により、化学発
光シグナル（RLU）がサンプル中の％GHbに正比例（Ｒ＝
0.991）していたことが明らかである。
I. EDA−CMA−APBAコートした粒子 GHbアッセイ
を、実施例4.C.に記載のとおりに調製したサンプル、実
施例1.H.から得た微粒子、および実施例4.A.と同じ抗体
を用いて、実施例３に記載のとおりに実施した。（本フ
ォーマット中の手順は、IPLS GHbアッセイと呼ばれ
る。）図8Aにより、化学発光シグナル（RLU）がサンプ
ル中の％GHbに正比例（Ｒ＝0.985）していたことが明ら
かである。
実施例５−−IPLS GHbアッセイとBiorad Diamat HPLCお
よびAbbott IMx（登録商標）GHbとの相関 以前に％HbA
1c値を求めるためにBiorad Diamat HPLC法を用いてGHb
についての検査を行っている病院検査室から、110の全
血サンプルを得た。ここで記述しているアッセイで用い
るようなボロネートアフィニティー結合法は、HbA1cを
含むすべてのGHb種を検出する。GHbとHbA1cとの間には
直接的相関があるため、GHbおよびHbA1c測定検査間の比
較をすることができる。
IPLS GHbアッセイを、実施例4.C.に記載のとおりに調
製した110のサンプルを用い、実施例4.I.に記載のとお
りに実施した。結果はBiorad Diamat HPLC（Brea、CA）
およびIMx（登録商標）GHb（Abbott Laboratories、Abb
ott Park、IL）アッセイと相関していた（それぞれ図９
および10）。
IPLS GHbおよびBiorad Diamat HPLCアッセイ間の相関
（図９）は91％であった。IPLS GHbおよびIMx（登録商
標）GHbアッセイ間の相関（図10）は93％であった。
さらに、同じ110のサンプルについてIPLS GHbアッセ
イを用いて２回測定を行い、測定間の相関を調べた。図
11に示している結果より、２回の測定（測定１および測
定２）間には良好な一致（98％）が認められた。
実施例６−−１ステップフォーマット 溶血サンプル
を、実施例4.C.に記載のとおりに調製した。実施例1.H.
で調製した微粒子を50mMタウリンバッファー、pH9.0で
洗浄し、同じバッファー中に固体含量0.1％で再懸濁し
た。標識した抗体は、実施例4.A.に記載の抗体と同じで
あった。溶血産物50μｌ、微粒子50μｌおよびアクリジ
ニウム標識した抗体50μｌを37℃で25分間インキュベー
トすることにより、アッセイを実施した。次いで粒子を
磁石に引きつけて、コモンバッファー1mlで４回洗浄し
た。トリガー試薬を加えることにより、化学発光シグナ
ルを生じさせた。図12により、化学発光シグナル（RL
U）がサンプル中の％GHbに正比例（Ｒ＝0.973）してい
たことが明らかである。従って、本アッセイにより１ス
テップおよび２ステップのフォーマットで％GHbが正確
に検出される。
実施例７−−異なる抗体の使用 前述の実施例はすべて
Medix Biotech製の、DEAE精製した、ヒトヘモグロビン
に対するマウスモノクローナル抗体（IgG1）を用いてい
る。異なる種由来のポリクローナル抗体、およびモノク
ローナル抗体を含む他の抗体も用いることができる。
GHbアッセイを、実施例4.A.に記載のとおりに調製し
たサンプル、実施例1.A.から得た微粒子、および実施例
２に記載のとおりにアクリジニウムで標識したヒトヘモ
グロビンに対する下記の抗体を用いて、インキュベーシ
ョンをいずれも37℃で10分間行った以外は実施例３に記
載のとおりに実施した。前記抗体はすなわち、（１）ポ
リクローナルヤギ抗ヒトヘモグロビン（＃CR8000 GAP、
Cortex Biochem、San Leandro、CA）、（２）モノクロ
ーナル抗ヒトヘモグロビン（＃A36380、BiosPacific、E
meryville、CA）、（３）ポリクローナルヤギ抗ヒトヘ
モグロビン（＃G32100、BiosPacific、Emeryville、C
A）、および（４）ポリクローナルウサギ抗ヒトヘモグ
ロビン（＃A118、Dako Corp.、Carpinteria、CA）であ
る。図13から16に示した結果から、化学発光シグナル
（RLU）がサンプル中の％GHbに正比例していたことが明
らかである。各Abを用いたアッセイに対する相関係数
（Ｒ値）はそれぞれ0.982、0.975、0.946および0.869で
あった。従って、ヒトヘモグロビンに対するポリクロー
ナルまたはモノクローナル抗体は、本アッセイフォーマ
ットにおける正確な％GHb検出にとって有用である。
本発明は、その様々な態様のそれぞれにおいて記載さ
れているが、本明細書および付随の請求の範囲に示され
ている、本発明の真の意図および範囲から逸脱すること
なく、当業者によりそれらに一定の改変が加えられるこ
とが予想される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヤオ ハイオウ エイチ. アメリカ合衆国 イリノイ州 リバティ ービル ダブリュー．ゴルフ ロード 233 (72)発明者 アダムクズィク ジャニナ アメリカ合衆国 イリノイ州 ガーニー カイル ヘイブン コート 174 (72)発明者 クリステンセン メリッサ エイ. アメリカ合衆国 イリノイ州 パラティ ン グリッソム ドライブ 1023 (56)参考文献 特開 平５−87809（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−508690（ＪＰ，Ａ) 米国特許4269605（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/72 G01N 33/53

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）グリコヘモグロビン（GHb）を遊離さ
    せるために血液サンプルを溶解する段階、 ｂ）該溶解血液サンプルを、ボロネート部分が結合して
    いる固相であって前記血液サンプル中のグリコヘモグロ
    ビンの割合に正比例したグリコヘモグロビンを特異的に
    捕獲する固相とインキュベートする段階、 ｃ）該サンプルにヘモグロビン特異的な標識成分を加え
    る段階、 ｄ）得られるシグナルを測定する段階、および ｅ）得られた該シグナルに基づきサンプル中のグリコヘ
    モグロビンの割合を求める段階を含み、全ヘモグロビン
    値の測定を要することなく、血液サンプル中のグリコヘ
    モグロビンの割合を求める１回読み取り法。
  2. 【請求項２】固相が、ビーズ、微粒子、磁気微粒子、微
    量定量プレート、およびチューブからなる群より選択さ
    れる、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】ボロネート部分が、ホウ酸、ボロネート化
    合物、およびフェニルボロン酸からなる群より選択され
    る、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】フェニルボロン酸が、４−カルボキシフェ
    ニルボロン酸、３−ニトロ−５−カルボキシフェニルボ
    ロン酸、およびｍ−アミノフェニルボロン酸（APBA）か
    らなる群より選択される、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】標識成分が、標識されたモノクローナルお
    よびポリクローナル抗体、ならびにヘモグロビンに親和
    性を有するその他の標識分子からなる群より選択され
    る、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】標識成分が、標識されたモノクローナル抗
    体からなる群より選択される、請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】標識成分が標識である、請求項１記載の方
    法。
  8. 【請求項８】標識成分の標識が、放射性、蛍光もしくは
    化学発光物質、または酵素からなる群より選択される、
    請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】総ヘモグロビンを測定しないという条件が
    付いた、請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】ａ）溶解血液サンプルを、ボロネート部
    分が結合している固相とインキュベートする段階、 ｂ）該サンプルに、ヘモグロビン特異的な標識成分を加
    える段階、 ｃ）該標識成分から得られるシグナルを測定する段階、
    および ｄ）該サンプル中のグリコヘモグロビン（GHb）の割合
    を求める段階を含み、全ヘモグロビン値の測定を要する
    ことなく、血液サンプル中のグリコヘモグロビンの割合
    を求める１回読み取り法。
  11. 【請求項１１】ａ）グリコヘモグロビン（GHb）を遊離
    させるために血液サンプルを溶解する段階、 ｂ）該溶解血液サンプルを、ボロネート部分が結合して
    いる固相とインキュベートする段階、 ｃ）得られるシグナルを測定する段階、および ｄ）得られた該シグナルに基づきサンプル中のグリコヘ
    モグロビンの割合を求める段階を含む、全ヘモグロビン
    値の測定を要することなく、血液サンプル中のグリコヘ
    モグロビンの割合を求める１回読み取り法。
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