CN111879930A - 肌酸激酶同工酶mb检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

肌酸激酶同工酶mb检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种肌酸激酶同工酶MB检测试剂盒及其制备方法。具体地，所述试剂盒包括肌酸激酶同工酶MB检测试剂卡，所述试剂卡包括：预加样部件和测试条；其中，所述预加样部件包括加样容器和预加在所述加样容器内的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体‑荧光微球偶联物；所述测试条包括：测试条底板，以及设置在所述测试条底板上的上样部件、检测部件和吸液部件；和所述检测部件包括层析基质和分别设置的检测带和质控带，其中，所述检测带包被有肌酸激酶同工酶CK‑MB多克隆抗体，且所述质控带包被有IgG多克隆抗体。本发明的试剂盒操作简单、成本低且重复性好、准确度高。

Description

肌酸激酶同工酶MB检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及荧光免疫层析检测领域，更具体地涉及使用荧光免疫层析法，定量检测临床样本中CK-MB的试剂盒。
背景技术
急性心肌梗死(AMI)已经成为威胁人类生命的主要疾病之一，目前全球每年有1700万人死于心血管疾病，其中有一半以上死于急性心肌梗死，AMI过程中心肌细胞中的酶，如肌酸激酶(CK)在血清中活性增高，可广泛应用于AMI的诊断。
肌酸激酶(CK)是由脑型亚单位B和肌型亚单位M组成的二聚体，每个亚单位的分子量都约为43kDa，M亚基与B亚基在一级结构上的同源性达80％，在高级结构上会形成3中二聚体，有CK-MM、CK-BB、CK-MB三种同工酶。人体很多组织中都含有肌酸激酶，但是每一种同工酶的分布都不一样，骨骼肌中富含有CK-MM型同工酶，脑、胃、小肠、膀胱及肺主要含有CK-BB同工酶，而CK-MB型同工酶仅存在于心肌组织中。CK-MB同工酶诊断透壁型心肌梗死的敏感性及特异性均极高，CK-MB在正常条件下其表达水平较低，在发病后4-8小时CK-MB从受损细胞排出并迅速开始在血液中增加，在12-24小时后达到最高水平，并在24-48小时内恢复正常。若CK-MB同工酶在急性心肌梗死(AMI)后仍保持高水平，表明心肌坏死还在进行；若恢复正常后再次升高，表明原梗死部位扩展或者新的梗死部位出现。因此，定量检测血液中CK-MB型同工酶水平，对心肌梗死的诊断及心肌手术后的效果监测有着极高的医学价值。目前，CK-MB同工酶的定量诊断主要是基于化学发光的大型仪器，这些方法成本高、操作复杂，检测时间较长，且多是依赖于国外进口，昂贵的成本导致医院检测价格居高不下。
所以，本领域急需提供操作简单、成本低、重复性好、准确度高的CK-MB检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、成本低、重复性好、准确度高的CK-MB检测试剂盒。
本发明第一方面，提供了一种肌酸激酶同工酶MB检测试剂卡，所述试剂卡
包括：
预加样部件和测试条；
其中，所述预加样部件包括加样容器和预加在所述加样容器内的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物；
所述测试条包括：测试条底板，以及设置在所述测试条底板上的上样部件、检测部件和吸液部件；和
所述检测部件包括层析基质和分别设置的检测带和质控带，其中，所述检测带包被有肌酸激酶同工酶CK-MB多克隆抗体，且所述质控带包被有IgG多克隆抗体。
在另一优选例中，预加的所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物为通过将溶液A滴加在所述加样容器内干燥后形成的固相混合物，所述溶液A包括：
(a)缓冲液，所述缓冲液包括：PB 10-50mM、甘油0.5-5wt％、海藻糖或蔗糖0.5-5wt％、防腐剂0.01-0.4wt％，且pH为6.0-9.5；和
(b)经封闭的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物。
在另一优选例中，所述防腐剂选自下组：Proclin、NaN3，或其组合。
在另一优选例中，所述缓冲液的pH为7.0-9.0，较佳地8.0-9.0。
在另一优选例中，所述缓冲液包括：PB 10-50mM、甘油0.5-5wt％、海藻糖或蔗糖0.5-5wt％、Tween 20或Tween 80 0.5-5wt％、PEG 0.1-0.5wt％、防腐剂0.01-0.4wt％，且pH为6.0-9.5。
在另一优选例中，所述缓冲液的溶剂为水或水性溶液。
在另一优选例中，所述缓冲液包括：
PB 10-20mM，
海藻糖 2-3wt％，
甘油 2-3wt％，
防腐剂 0.01-0.3wt％，
且pH为7-9，其中，百分比以缓冲液总重量计。
在另一优选例中，所述缓冲液还包括：
Tween 20或Tween 80 0.5-2wt％，和/或
PEG 0.1-0.2wt％。
在另一优选例中，pH通过盐酸或氢氧化钠调节。
在另一优选例中，溶液A中，所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物浓度0.3mg/mL-1mg/mL，较佳地为0.4mg/mL-0.7mg/mL，更佳地为0.5-0.6mg/mL。
在另一优选例中，所述加样区中，所述溶液A的滴加量≥2μL，如2-50μL较佳地，4-20μL，更佳地，5-10μL。
在另一优选例中，所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体选自下组：鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体、兔源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体、羊源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体或人源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体；优选为鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体。
在另一优选例中，所述IgG多克隆抗体为羊抗鼠IgG多克隆抗体。
在另一优选例中，所述检测带设置在靠近上样部件一侧；而所述质控带设置在靠近吸液部件一侧。
在另一优选例中，所述检测带和质控带平行设置。
在另一优选例中，所述检测带和质控带的宽度各自独立的为0.1-5mm，较佳地，0.5-3mm，更佳地，0.8-2mm。
在另一优选例中，所述检测带和质控带的宽度基本相等。
在另一优选例中，所述检测带和质控带之间的距离为2-5cm，较佳地，3-4cm。
在另一实施例中，所述质控线和检测带彼此平行设置在检测部件上。
在另一优选例中，所述上样部件、检测部件(硝酸纤维素膜)和吸液部件依次连续设置。
在另一优选例中，所述层析基质为硝酸纤维素膜。
在另一实施例中，所述检测部件两端上表面以部分重叠方式粘连上样部件和吸液部件。
在另一实施例中，所述的上样部件、检测部件和吸液部件通过粘连贴合在所述测试条底板一侧。
在另一优选例中，所述预加样部件与所述测试条设置在同一基板上。
在另一实施例中，所述基板是硬质基片。
在另一优选例中，所述加样容器为上方开口的小室(如加样杯)。
在另一优选例中，所述加样容器的容积为0.01-2cm3，较佳地，0.05-1cm3，更佳地，0.1-0.8cm3。
在另一优选例中，所述加样容器的内表面不或基本上不与加入其中的检测试剂和样本产生物理吸附和化学反应。
在另一优选例中，所述加样容器为塑料材质。
在另一实施例中，所述试剂卡还包括卡盒，所述卡盒由下盖和上盖组成，所述加样部件和测试条完全设置于下盖中，上盖设有加样窗口、上样窗口和读卡窗口，所述加样窗口、上样窗口和读卡窗口分别对应于所述预加样部件、上样部件和检测部件。
在另一优选例中，所述卡盒的上盖上设有产品编号区和指示条形码区。
在另一优选例中，所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物中，所述荧光微球选自下组：100nm-500nm乳胶微球，200-400nm乳胶微球，300-400nm乳胶微球。
本发明第二方面，提供了一种肌酸激酶同工酶MB检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)如本发明第一方面所述的试剂卡；以及
(b)任选地样品管、吸液管和/或说明书。
本发明第三方面，提供了一种检测肌酸激酶同工酶MB的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供如本发明第一方面所述的试剂卡或如本发明第二方面所述的试剂盒；
(b)将样本加入所述加样容器，使样本与加样容器中预加的所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物接触并反应，形成待测混合液；和
(c)将所述待测混合液上样至所述上样部件并层析，荧光检测获得检测区的显色情况。
在另一优选例中，所述检测为定量检测或定性检测。
在另一优选例中，所述显色情况为检测线与检测线加上质控线的和之比。
在另一优选例中，步骤(a)中，所述样本体积为10μL-50μL，最佳为25-30μL。
在另一优选例中，步骤(b)中，所述反应的时间为8min-12min，最佳为10min。
在另一优选例中，所述样本选自下组：血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、组织标本、细胞培养上清液。
本发明第四方面，提供了一种肌酸激酶同工酶CK-MB检测试剂卡或试剂盒的制备方法，所述方法包括制备加样部件，其中包括步骤：
(i)将含有肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的溶液滴加至加样容器上，干燥所述溶液，从而形成所述加样部件。
在另一优选例中，所述含有肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的溶液为溶液A，所述溶液A包括：
(a)缓冲液，所述缓冲液包括：PB 10-50mM、甘油0.5-5wt％、海藻糖或蔗糖0.5-5wt％、防腐剂0.01-0.4wt％，且pH为6.0-9.5；
(b)经封闭的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物。
在另一优选例中，所述干燥为减压干燥，较佳地，真空干燥。
在另一优选例中，所述干燥的温度为20℃---30℃，最佳为25℃。
在另一优选例中，在步骤(i)之前，所述方法还包括步骤：
(i-1)将肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体和活化的荧光微球反应，得到肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物；
(i-2)用封闭液封闭所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物，得到经封闭的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物；和
(i-3)将所述经封闭的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物溶于缓冲液中，得到所述含有肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的溶液。
在另一优选例中，步骤(i-1)中，所述荧光微球通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。
在另一优选例中，步骤(i-2)中，所述封闭液包括：PB 10-50mM、甘油0.5-5wt％、海藻糖或蔗糖0.5-5wt％、防腐剂0.01-0.4wt％，溶剂为水，且pH为6.0-9.5。
在另一优选例中，所述封闭液包括：PB 10-50mM、甘油0.5-5wt％、海藻糖或蔗糖0.5-5wt％、Tween 20或Tween 80 0.5-5wt％、PEG 0.1-0.5wt％、防腐剂0.01-0.4wt％，且pH为6.0-9.5。
在另一优选例中，所述封闭液的溶剂为水或水性溶液。
在另一优选例中，所述封闭液包括：
PB 10-20mM，
海藻糖 2-3wt％，
甘油 2-3wt％，
防腐剂 0.01-0.3wt％，
且pH为7-9，其中，百分比以封闭液总重量计。
在另一优选例中，所述封闭液还包括：
Tween 20或Tween 80 0.5-2wt％，和/或
PEG 0.1-0.2wt％。
在另一优选例中，所述缓冲液与封闭液相同。
在另一优选例中，在步骤(i)之后，所述方法还包括步骤：
(ii).分别用包被缓冲液包被肌酸激酶同工酶CK-MB多克隆抗体和IgG多克隆抗体，将包被后的两种抗体均匀地喷于检测部件的层析基质上，所述肌酸激酶同工酶CK-MB多克隆抗体渗入层析基质后形成检测带，IgG多克隆抗体形成质控带；
(iii)在测试条底板上分别依次粘贴上样部件、形成有检测带和质控带的检测部件、和吸液部件；和
(iv)按照要求切割成适当宽度后与所述预加样部件装入卡盒中，从而形成试剂卡。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为一个实施例的试剂卡结构示意图；1.预加样部件；2.预加的鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物；3.测试条底板；4.上样部件；5.层析基质；6.检测带；7.质控带；8.吸液部件；9.基板。
图2为本发明的试剂卡与结合垫式试剂卡检测临床样本相关性对比。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种肌酸激酶同工酶CK-MB检测试剂卡。与本领域常用的将与待测物反应的免疫检测试剂负载在结合垫上的形式相比，本发明的检测试剂卡将肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物滴加在加样区并干燥，使用时，将样本滴加在加样区并溶解所述偶联物，两者可以最大程度的接触并反应，从而显著提高了检测的重复性、灵敏度和准确性。在此基础上完成了本发明。
本发明人还发现，当使用本发明优选的缓冲液溶解肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物时，在所述加样区预加并干燥后，得到的含有肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的固相混合物，所述固相混合物中含有缓冲液基质，所述缓冲液基质的存在能够使所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物在样品中迅速溶解并充分反应，从而使试剂卡的检测时间缩短且检测效果进一步提高。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“室温”是指温度为4-40℃，较佳地，25±5℃。
在本发明中，术语“荧光微球”与“荧光乳胶微球”可互换使用。
CK-MB免疫检测试剂卡
免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的膜检测技术，对于大分子(如蛋白质)物质而言，通常采用双抗体夹心法。
通常，通过双抗体夹心法原理进行免疫层析的试剂盒包括：上样部件、检测部件和吸液部件。以检测CK-MB为例，上样部件(结合垫)中固定有待测物的CK-MB单克隆抗体-标记物偶联物、检测部件上设置有检测带和质控带，所述检测带上固定有待测物的CK-MB多克隆抗体B。将样本从加样窗滴到至上样部件后，如果样本中存在CK-MB，则其与单克隆抗体A-标记物偶联物反应生成CK-MB-单克隆抗体A-标记物偶联物，通过毛细管效应，分析物到达检测带，并形成多克隆抗体B-CK-MB-单克隆抗体A-标记物偶联物(可显色)；未与CK-MB结合的单克隆抗体A-标记物偶联物继续前进到达质控带，与检测带中包被的多克隆抗体C反应形成多克隆抗体C-单克隆抗体A-标记物偶联物(可显色)。
目前，用于免疫分析的标记物主要包括胶金、荧光素(荧光微球)、量子点、上转换纳米粒子等。
本发明人发现，上述试剂盒存在如下缺点：a.因结合垫中标记抗体释放不均造成检测重复性差；b.被检测物通过结合垫时，与标记抗体反应不充分，造成检测灵敏度低。
经过大量的筛选测试，本发明提供了一种肌酸激酶同工酶MB检测试剂卡，所述试剂卡包括：测试条和加样部件，其中所述预加样部件包括加样容器和预加在所述加样容器内的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物。
通常，所述测试条包括上样部件、检测部件和吸液部件。
本发明中，与现有技术相比，不同之处在于，所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物没有固定于上样部件上，而是预加于预加样部件上。
本发明中，对所述上样部件没有特别要求，可采用本领域常用的上样部件。优选地，所述上样部件有利于样本的层析(如玻纤材质)。
本发明中，对所述检测部件没有特别要求，可采用本领域常用的检测部件。优选地，所述检测部件有利于样本的层析和抗体的包被，如所述检测部件为硝酸纤维素膜。
本发明中，对所述吸液部件没有特别要求，可采用本领域常用的吸液部件。优选地，所述吸液部件有利于吸收液体。
本发明中，对所述质控线中包被的抗体没有特别要求，可以用本领域常用的方法选择合适的抗体，其中，所述抗体能与所用的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物结合，如IgG多克隆抗体。优选地，当所述CK-MB单克隆抗体为鼠源时，所述质控线采用羊抗鼠IgG多克隆抗体。
通常，上样部件、检测部件、吸液部件依次设置。优选地，设置在同一底板上。
本发明中，加样部件与所述测试条可以设置在固定的相对位置，或分开设置。优选地，所述加样部件设置在加样部件之前。或与测试条不处于同一基板上，在此情况下，加样部件可以方便的设置在任何有利于加入样本和转移样本的位置。优选地，所述加样部件和测试条设置在同一卡盒中。
在本发明中，对所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体没有特别要求，可以使用本领域常用的合格的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体。例如(但并不限于)，鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体、兔源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体、羊源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体或人源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体。
在本发明中，对所述肌酸激酶同工酶MB多克隆抗体没有特别要求，可以使用本领域常用的合格的肌酸激酶同工酶MB多克隆抗体。通常，所述多克隆抗体具有至少一个与所述单克隆抗体与CK-MB的结合位点不同的CK-MB结合位点。
特别优选地，预加的所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物为通过将溶液A滴加在所述加样容器内干燥后形成的，所述溶液A包括：
(a)缓冲液，所述缓冲液包括：PB 10-50mM、甘油0.5-5wt％、海藻糖或蔗糖0.5-5wt％、防腐剂0.01-0.4wt％，且pH为6.0-9.5；和
(b)经封闭的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物。
通常，本发明的试剂盒的检测原理：采用免疫荧光双抗体夹心法定量检测人血浆中肌酸激酶同工酶CK-MB的浓度。具体地，将待测样本加到含有肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的于加样杯中，反应一定时间后，吸取一定量的混合液，从测试孔滴到加样部件上，在层析作用下，样本从加样部件到达检测部件。样本中若存在肌酸激酶同工酶CK-MB，则其会与肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物形成复合体，再与检测线上的肌酸激酶同工酶CK-MB多克隆抗体结合，在检测线上形成荧光免疫复合物，样本中肌酸激酶同工酶CK-MB的浓度与上述荧光信号成正比，同时以质控线荧光信号强度校正检测线的荧光信号强度及信号，从而实现肌酸激酶同工酶CK-MB的定量检测。
一种具体的本发明的检测试剂盒的制备方法，包括步骤：
a.将鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物与缓冲液A混合，其中荧光微球质量浓度为0.1-0.5mg/mL；
b.将上述混合液定量精确分装在六三孔加样杯中，分装量在每预制杯2.5-10μL，并置于真空干燥罐中真空干燥0.5-3h，干燥后将六三孔加样杯板冲切成独立的含有鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的加样杯；
c.将样品垫、包被有鼠源肌酸激酶同工酶CK-MB多克隆抗体、羊抗鼠IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜，吸液垫组装在PVC底板上，并切割成固定宽度的试剂卡；和
d.将含有鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的加样杯，固定宽度的试剂卡，塑料件按照组装操作手册，组装成可用于检测肌酸激酶同工酶CK-MB的试剂盒。
本发明的主要优点包括：
1.本发明中加样部件的存在，使得样本中的肌酸激酶同工酶CK-MB可与肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物充分反应并结合，同时，可降低结合垫型结构的固相结合物复溶不均的现象造成检测重复性较差的问题。
2.所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物在本发明优化的缓冲液中形成的溶液在加样容器中干燥后形成的固相混合物可以快速、充分的复溶，可节省检测时间，并进一步提高检测的重复性和准确度。
3.本发明制备的肌酸激酶同工酶CK-MB免疫荧光层析试剂盒反应时间短，重复性好、灵敏度高、准确度高的优点，且操作简单和经济实用。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
试剂
羧基荧光乳胶微球：可购自苏州为度，固含量1％，直径100-400nm，绿色荧光，激发波长为488nm，发射波长为520nm；
鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体：市售，外观澄清溶液，无不溶物或冻干干粉；浓度≥1.0mg/mL；蛋白电泳检测纯度大于90％。
实施例1
鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的制备过程中的溶液配制：
a.封闭液的制备：称取0.0992g磷酸氢二钠、0.0358g磷酸二氢钠溶解于80mL水中，振荡混匀，待磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶解完全后，加入2.5g海藻糖、2.5g甘油和0.1g叠氮钠，震荡混匀，用盐酸和氢氧化钠将pH调节至8.5，最后室温定容至100mL。
b.配置缓冲液B，缓冲液B的配方：PB(磷酸盐缓冲液)的摩尔浓度为10mM，海藻糖的质量浓度为2.5％，甘油的质量浓度为2.5％，叠氮钠的质量分数为0.1％，pH调节至8.5。
实施例2
肌酸激酶同工酶CK-MB免疫荧光层析试剂卡的制备方法
1.通过离心、洗涤将荧光微球(羧基荧光乳胶微球)溶液置换成pH＝5.5～7.0的标记缓冲液；
2.加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化荧光乳胶微球，反应完成后，离心去除上清液，再洗涤一次；
3.加入鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体和活化的荧光乳胶微球反应，反应完成后，离心去除上清液，再洗涤一次，得到鼠源肌酸激酶同工酶单克隆抗体-荧光微球偶联物；
4.用上述封闭液封闭所得得鼠源肌酸激酶同工酶单克隆抗体-荧光微球偶联物，室温封闭1小时后，离心去除上清液；
5.将经封闭的鼠源肌酸激酶同工酶单克隆抗体-荧光微球偶联物保存在荧光保存液中，保存浓度为0.5mg/ml；
6.将经封闭的鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物加入所述缓冲液B中，振荡混匀，每个预加样杯中滴加5微升混合液，真空干燥；
7.将1mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗体和1.5mg/ml鼠源肌酸激酶同工酶CK-MB多克隆抗体分别用包被液包被，用喷金划膜仪以1.0mm条带状分别固定于硝酸纤维素膜上；
8.在PVC底板上先后贴上硝酸纤维素膜、吸液垫和样本垫，之后切割成3.2mm宽，装入卡盒中，同时将预加有有鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的预加样杯放入到卡盒中，之后将试剂卡卡盒合上压片，命名为杯孔式试剂卡a。
一种本发明的试剂卡的结构如图1所示。
对照试剂卡b：结合垫式试剂卡，所用抗体和荧光微球与上述试剂卡相同，不同之处在于试剂卡中放置鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的装置的物理结构不同。前者是杯孔式试剂卡，鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物预先干燥在加样杯中，再放入到卡盒中组装成成品试剂卡，测试时，样本经稀释后和鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物在杯孔中充分混匀，再滴样至试剂卡加样窗；而对照试剂卡b是本领域常用的结合垫式试剂卡，其中，经封闭的鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物加入所述缓冲液B中后，固定于上样部件(结合垫)上，测试时，样本稀释后直接加样至试剂卡加样窗。
实施例3
不同试剂卡检测数据对比
将本发明的试剂卡a和对照试剂卡b进行检测效果对照。
试剂卡a检测方法：将临床样本置于I-Reader S仪器的探针下，探针没入样本液面，按下吸样键，5s后，移走临床样本。探针自动移入稀释液中，吸取稀释液后，稀释样本，得样本稀释液，将样本稀释液注入加样杯中，吹打混匀后，探针自动吸取60μL加样杯中的混合液，并自动注入试剂卡加样窗，10min后，仪器自动读取荧光信号，并计算样本中待测物浓度。
其中，复合物中的荧光乳胶微球在外界488nm波长的激发光照射下，发射出520nm波长的荧光。
对照试剂卡b检测方法，样本稀释后，直接将本稀释液加样至试剂卡加样窗。
检测结果如表1所示，每浓度重复10次测试。
表1
Figure BDA0002617407750000131
从表1中可以看出，本发明的将肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物预加样于加样容器中，与现有技术中将检测试剂固定于结合垫中的方案相比，由于本发明采用的加样容器不会与所述偶联物结合，在加入液体样本后可以最大程度的复溶，更加可控，结果显示，本发明试剂卡的其检测结果的变异系数＜5％，与对照组相比，降低5-8％，说明本发明的试剂卡具有显著提高的重复性(精密度高)。
同时，两组的信号值相比，本发明的试剂卡的结果也明显高于对照试剂卡的信号(约高出20％左右)，说明本发明的试剂卡的检测灵敏度也明显高于对照试剂卡。
实施例4
进一步比较本发明的试剂卡a和对照试剂卡的检测灵敏度。
结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002617407750000141
Figure BDA0002617407750000151
从表2可以看出，0.3ng/mL的检测信号值与不含肌酸激酶同工酶CK-MB的样本(空白，0ng/ml)检测信号值的差值，本发明的试剂卡要明显高于对照试剂卡，本发明试剂卡的信号差值比对照试剂卡信号差值高2.5倍以上，这说明本发明的试剂卡的检测灵敏度明显优于对照试剂卡。
实施例5
本发明的试剂卡a和对照试剂卡对临床样本(血浆样本)进行测试，参考值来自为化学发光试剂平台(Beckman ACCESS 2测试系统，其检测范围为0.1ng/mL-300ng/mL。
结果如图2所示。本发明的试剂卡与对照试剂卡测试临床样本后，测试值与参考值进行相关性比对，本发明的试剂卡与参考值的相关性＞0.97，明显优于对照试剂卡的0.88，说明本发明的试剂卡具有优异的准确性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种肌酸激酶同工酶MB检测试剂卡，其特征在于，所述试剂卡包括：
预加样部件和测试条；
其中，所述预加样部件包括加样容器和预加在所述加样容器内的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物；
所述测试条包括：测试条底板，以及设置在所述测试条底板上的上样部件、检测部件和吸液部件；和
所述检测部件包括层析基质和分别设置的检测带和质控带，其中，所述检测带包被有肌酸激酶同工酶CK-MB多克隆抗体，且所述质控带包被有IgG多克隆抗体。
2.如权利要求1所述的试剂卡，其特征在于，预加的所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物为通过将溶液A滴加在所述加样容器内干燥后形成的固相混合物，所述溶液A包括：
(a)缓冲液，所述缓冲液包括：PB 10-50mM、甘油0.5-5wt％、海藻糖或蔗糖0.5-5wt％、防腐剂0.01-0.4wt％，且pH为6.0-9.5；和
(b)经封闭的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物。
3.如权利要求2所述的试剂卡，其特征在于，所述缓冲液包括：PB10-50mM、甘油0.5-5wt％、海藻糖或蔗糖0.5-5wt％、Tween 20或Tween 800.5-5wt％、PEG 0.1-0.5wt％、防腐剂0.01-0.4wt％，且pH为6.0-9.5。
4.如权利要求2所述的试剂卡，其特征在于，溶液A中，所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物浓度0.3mg/mL-1mg/mL，较佳地为0.4mg/mL-0.7mg/mL，更佳地为0.5-0.6mg/mL。
5.如权利要求1所述的试剂卡，其特征在于，所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体选自下组：鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体、兔源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体、羊源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体或人源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体，或其组合；优选为鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体。
6.如权利要求1所述的试剂卡，其特征在于，所述预加样部件与所述测试条设置在同一基板上。
7.一种肌酸激酶同工酶MB检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(a)如权利要求1所述的试剂卡；以及
(b)任选地样品管、吸液管和/或说明书。
8.一种检测肌酸激酶同工酶MB的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)提供如权利要求1所述的试剂卡或如权利要求2所述的试剂盒；
(b)将样本加入所述加样容器，使样本与加样容器中预加的所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物接触并反应，形成待测混合液；和
(c)将所述待测混合液上样至所述上样部件并层析，荧光检测获得检测区的显色情况。
9.如权利要求1所述的试剂卡，其特征在于，所述样本选自下组：血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、组织标本、细胞培养上清液。
10.一种肌酸激酶同工酶CK-MB检测试剂卡或试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括制备加样部件，其中包括步骤：
(i)将含有肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的溶液滴加至加样容器上，干燥所述溶液，从而形成所述加样部件。
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