DK157328B - Testmateriale til bestemmelse af en ligand i en vaeskeproeve ved hjaelp af homogen immunanalyse, fremgangsmaade til fremstilling af materialet samt ved anvendelse deraf udfoert analytisk fremgengsmaade - Google Patents

Description

DK 157328 B

Opfindelsen angâr et testmateriale til bestemmelse af en ligand i en væskepr0ve ved hjælp af homogen immunana-lyse, en fremgangsmâde til fremstilling af materialet samt en ved anvendelse deraf udf0rt analytisk fremgangsmâde.

5 Testmaterialer i form af teststrimler og lignende analyseelementer i fast tilstand er blevet almindelige ved analysen af forskellige typer pr0ver, især flydende prever, sâsom biologiske væsker og industrielle væsker, pâ grund af den bekvemmelighed og den hastighed, hvormed deres anvendelse 10 er forbundet. Teststrimler beregnet til pâvisning af forskellige klinisk signifikante stoffer i biologiske væsker, f.eks. sérum og urin, har især vist sig at være meget fordelagtige til hjælp ved diagnose og behandling af sygdomstilstande hos mennesker og dyr.

15 Konventionelle testmaterialer af test- eller pr0ve- strimmeltypen omfatter almindeligvis et bærermateriale, sâsom en absorberende eller væskeopsugende matrix, f.eks. papir, hvori der er inkorporeret reagenser, som reagerer med bestanddelen eller -delene af en flydende pr0ve, der 20 befinder sig under bestemmelse, til tilvejebringelse af et detekterbart respons, sædvanligvis et elektromagnetisk strâ-lingssignal, sâsom en farveændring. Pr0ven, der skal under-s0ges, bringes i kontakt med det med reagens inkorporerede bærermateriale, f.eks. ved momentan neddypning af materialet 25 i pr0ven eller ved pâf0ring af en aliquot af pr0ven pâ materialet, og det fremkomne respons iagttages eller mâles efter en fastlagt reaktionstidsperiode. Den store fordel ved sâ-danne testmaterialer er deres bekvemme, rutinemæssige anvendelse, idet der ikke kræves en teknikers tid eller kvalifi-30 kationer til reagenstilsætninger til preven og tilvejebringelse af et let iagttageligt eller pâ et instrument aflæse-ligt signal. Endvidere tilvejebringes der hurtigt et let observerbart eller pâ et instrument aflæseligt signal.

0

DK 157328 B

2

Teststrimler af forskellig type har været kendt og anvendt i mange âr pâ en lang række forskellige omrâ-der, lige fra de mest kendte pH-test-papirmaterialer til in vitro-diagnostikmidler til detektering af forskellige 5 urin- og blodbestanddele sâsom glucose, protein, okkult blod etc., f.eks. som beskrevet i US-patentskrifterne nr. 3.164.534, 3.485.587 og 3.012.976. De reagenssammen-sætninger, der findes i sâdanne konventionelle teststrimler, reagerer med den eller de bestanddele, der skal be-10 stemmes, ved direkte kemisk reaktion og har af denne og andre grunde begrænset sensitivitet, idet de anvendes til detektering af stoffer, der er til stede i flydende pr0ver i koncentrationer i det millimolære omrâde eller derover.

Pâ den anden side har udviklingen af specifikke 15 bindingsbestemmelsesmetoder vist sig at tilvejebringe yderst nyttige analysemetoder til bestemmelse af forskellige organiske stoffer af diagnostisk, medicinsk, milj0-mæssig og industriel betydning, der foreligger i flydende medier i meget lave koncentrationer. Specifikke bindings-20 bestemmelser er baseret pâ den specifikke reaktion mellem liganden, dvs. den analyt under bestemmelse, som er i stand til at bindes, og en bindingspartner derfor. Nâr liganden eller dens bindingspartner er et antistof, og den anden er en tilsvarende hapten eller et tilsvarende 25 antigen, kendes bestemmelsen som en immunobestemmelse eller immunanalyse.

Ved konventionelle specifikke bindingsbestemmelsesmetoder kombineres en pr0ve af det flydende madium, der skal bestemmes, med reagenser af forskellige sammen-30 sætninger. Sâdanne sammensætninger omfatter et mærket konjugat omfattende en bindingsbestanddel inkorporeret med et mærkningsstof. Bindingsbestanddelen i det mærkede konjugat deltager sammen med éventuelle andre bestanddele af reagensmaterialet og liganden i mediet, der skal be-35 stemmes, til dannelse af et bindingsreaktionssystem, der frembringer to arter eller former af det mærkede konjugat, en bunden form og en fri form. I den bundne form er bindingsbestanddelen, f.eks. en hapten eller et antigen, i 0 3

DK 157328 B

i det mærkede konjugat bundet til en tilsvarende bin-dingspartner, f.eks. et antistof, medens bindingsbestand-delen ikke er sâledes bunden i den frie art eller form.

Den relative mængde eller andel af det mærkede konjugat/ 5 der findes i den bundne form, sammenlignet med den frie form, er en funktion af nærværelsen (eller mængden) af den ligand, der skal detekteres i testpr0ven.

Nâr det mærkede konjugat i den bundne form er i det væsentlige ikke-skelnelig fra det mærkede konjugat 10 i den frie form ved de metoder, der anvendes til at spore mærkningsstoffet, ma den bundne form og den frie form adskilles fysisk til fuldstændigg0relse af bestem-melsen. Denne type bestemmelse betegnes i fagsproget soin "heterogen". Nâr de bundne og de frie artsformer af det 15 mærkede konjugat kan skelnes i hverandres nærværelse, kan adskillelsestrinnet undgâs, og bestemmelsen betegnes som "homogen".

Den f0rst opdagede type h0jsensitiv, specifik bindingsbestemmelse var radioimmunobestemmelsen, ved 20 hvilken der anvendes en radioaktiv isotop som mærkningsstof. En sâdan bestemmelse mâ n0dvendigvis f01ge det heterogene princip, eftersom mærkningsstoffets efterspor-bare karakter er kvalitativt uændret i de frie og de bundne former. Pâ grund af den ubekvemme og vanskelige hândtering 25 af radioaktive materialer og n0dvendigheden af et adskil-lelsestrin er der udviklet homogène bestemmelsessystemer, hvor der anvendes andet end radioisotoper som mærknings-bestanddel, herunder enzymer, bakteriofager, metaller og organometalliske komplekser, coenzymer, enzymsubstrater, 30 enzymaktivatorer og -inhibitorer, cycliseringsreaktanter, organiske og uorganiske katalysatorer, prosthetiske grup-per, kemoluminiscerende reaktanter og fluorescerende mole-kyler. Sâdanne homogène specifikke bindingsbestemmelses-systemer tilvejebringer et detekterbart respons, f.eks.

35 et elektromagnetisk strâlingssignal sàsom kemoluminiscens, fluoroscensemission eller farveændring, der stâr i rela- ' tion til nærværelsen eller mængden af den ligand, der skal bestemmes i den flydende pr0ve.

0 4

DK 157328 B

Kommercielt tilgængelige testmaterialer til udf0relse af specifikke bindingsbestemmelser er sæd-vanligvis i form af test-sæt, der omfatter en pakket kombination af beholdere indeholdende opl0sninger eller 5 . rehydratiserbare kompositioner af de reagenser, der er n0dvendige til gennemf0relse af bestemmelsen. Til udf0-relse af den egentlige bestemmelsesmetode skal aliquoter af sâdanne opl0sninger manuelt eller ved hjælp af instrumenter sættes til en reaktionsbeholder indeholdende pr0-10 ven. Hvis der tilsættes manuelt, kræver bestemmelsen sâ-ledes en teknikers tid og kvalifikationer, og hvis der tilsættes ved hjælp af et instrument, kræver bestemmelsen sâledes udgifter og vedligeholdelse af tilsætningsappa-raturet.

15 Testmaterialer i fast fase er blevet anvendt til heterogene specifikke bindingsbestemmelser i fors0g pâ at overvinde det ubekvemme og ulemperne ved det n0d-vendige adskillelsestrin. Et almindeligt anvendt fastfase--materiale af denne type har en ikke-por0s over-20 flade, f.eks. den indre overflade af et reagensglas eller en anden beholder, hvortil antistof fastg0res eller pâ-f0res som overtræk ved adsorption eller covalent kobling. USA-patentskrifterne nr. 3.826.619, 4.001.583, 4.017.597 og 4.105.410 angâr anvendelsen af med antistof overtrukne 25 reagensglas ved radioimmunobestemmelser. Fastfase-testma-terialer er ogsâ blevet anvendt ved heterogene enzymimmu-nobestemmelser, jfr. USA-patentskrifterne nr. 4.016.043 og 4.147.752, og ved heterogene fluorescerende immuno-bes'temmelser, jfr. USA-patentskrifterne nr. 4.025.310 og 30 4.056.724 samt britisk patentskrift nr. 1.552.374.

Anvendelsen af sâdanne heterogene specifikke bindingsbestemmelses-testmaterialer kan eksemplificeres ved fremgangsmâden if0lge USA-patentskrift nr. 4.135.884, der angâr en sâkaldt "gamma-stick". Testmaterialet in-35 korporeres med antistof-reagenset og bringes i kontakt med den flydende pr0ve og med de resterende reagenser i reaktionssystemet, f0rst og fremmest det mærkede konju-gat. Efter en inkubationsperiode fjernes fastfase-materi- 0 5

DK 157328 B

alet fysisk ira reaktionsopl0sningen, og mærkningsstoffet mâles enten i opl0sningen eller pâ testmaterialet.

Lignende materialer, hvor antistof-reagenset er indesluttet i en matrix, f.eks. en gel eller et papirma-5 teriale, er beskrevet i USA-patentskrifterne nr. 3.925.017, 3.970.429, 4.138.474, 3.966.897, 3.981.981 og 3.888.629 og i DE-offentligg0relsesskrift nr. 2.241,646. Der kendes ligeledes materialer til anvendelse ved heterogene specifikke bindingsbe-stemmelser, hvor antistof-reagenset er fikseret til en matrix, 10 der holdes i en gennemstr0mningskolonne, jfr. USA-patentskrif-terne nr. 4.036.947, 4.039.652, 4.059.684, 4.153.675 og 4.166.102. Som ved aile heterogene specifikke bindingsbe-stemmelses^materialer er testmaterialet almindeligvis in-korporeret med mindre end aile de n0dvendige reagenser til 15 udf0relse af bestemmelsen og er blot et middel til at g0re det n0dvendige adskillelsestrin mere bekvemt.

Der er ogsâ blevet beskrevet specifikke bin-dingsbestemmelses-testmaterialer, hvori de fleste eller aile de n0dvendige reagenser er inkorporeret i det sam-20 me bærerelement, og hvori reagens-pr0ve-kontakterne og adskillelsen af de frie og bundne faser opnâs ved kapil-lare migrationer eller vandringer langs bærerelementet, jfr. USA-patentskrifterne nr. 3.641.235, 4.094.647 og 4.168.146. De materialer, der er beskrevet i disse patent-25 skrifter, betragtes almindeligvis som vanskelige at frem-stille og som værende udsatte for ikke-reproducerbarhed pâ grund af den komplekse natur af de mange kemiske og fysiske indbyrdes reaktioner, der finder sted langs bærerelementet under udf0relsen af en bestemmelse, samt de 30 lave koncentrationer af ligand eller analyt, som det er hensigten at bestemme ved hjælp af sâdanne materialer.

Anvendelsen af homogène specifikke bindingsbe-stemmelses-reagenssystemer i forbindelse med fast-fase-testmaterialer ville give store fordele for den rutine-35 mæssige bruger af sâdanne bestemmelsessystemer. Bestemmelsen af ligander, der forekommer i meget lave koncentrationer i flydende pr0ver, ville blive forenklet til kon-

DK 157328 B

6 takten mellem materialet og proven samt mâling af det resul-terende signal, enten ved visuel iagttagelse eller ved hjælp af et mâleinstrument. Reagenserne ville blive anvendt i fast form og uden nodvendigheden af at opbevare, tilsætte 5 eller blande flydende reagenser sâledes, som det kræves ved anvendelse af de kendte test-sæt. Fastfase-materialer ville ogsâ være meget lettere at tilpasse til automatisering end de kendte flydende systemer.

I den kendte teknik findes der ingen angivelse af, 10 hvorledes man kan tilpasse homogène specifikke bindingsbe-stemmelses-reagenssystemer til anvendelse i forbindelse med fastfase-testmaterialer. I det britiske patentskrift nr. 1.552.607 er der beskrevet homogène specifikke bindingsbe-stemmelsessystemer, i hvilke der anvendes forskellige nye 15 mærkningsstoffer, herunder kemoluminiscerende mærkningsstof-fer, enzymsubstrat-mærkningsstoffer og coenzymmærkningsstof-fer. Pâ side 23, linie 12 ff. i patentskriftet findes der er forslag om at inkorporere bestemmelsesreagenserne med forskellige bærere omfattende væskeholdige beholdere eller 20 uoploselige, pordse og fortrinsvis absorberende matrixmate-rialer sâsom væskesugende papir, polymère film, membraner, fiberflor eller blokke, geler og lignende, men der er ikke anfort forslag til inkorporering af sâdanne reagenser i materialet under opretholdelse af det mærkede konjugat og 25 antistofreagenserne i det væsentlige ubundne med hinanden..

I DE-offentliggorelsesskrift nr. 2.537.275 er der beskrevet et homogent specifikt bindingsbestemmelses-rea-genssystem, og der omtales muligheden af at anvende bând eller strimler inkorporeret med antistof ved udforelsen af 30 bestemmelsen. Ved anvendelse af dette forslag ville det mærkede konkugat f0rst blive blandet med pr0ven, hvorpâ det med antistoffet inkorporerede testmateriale ville blive bragt i kontakt med reaktionsblandingen. Efter en passende inkubationstid foreslâs testmaterialet skyllet med puffer 35 og t0rret, hvorefter signalet (fluorescens) mâles. Det nævnte skrift indeholder sâledes forslag til et testmateriale og

DK 157328 B

7 en bestemmelsesmetode, der er meget lig de materialer og metoder, hvor testmaterialet neddyppes i den flydende reak-tionsblanding, inkuberes, derpâ fjernes, vaskes og til slut anvendes til aflæsning. Desuden inkorporerer man ved det 5 foreslâede testmateriale ikke aile bindingsbestemmelses-reagenserne med bærerelementet. Specielt foreslâs det, at kun antistoffet inkorporeres med bærerelementet, idet det mærkede konjugat sættes særskilt til pr0ven, der skal bestem-mes, inden kontakt med det foreslâede testmateriale.

10 I EP offentliggorelsesskrift nr. 13.156 er der be- skrevet en partikelformig struktur til brug som bærermatrix i reagensstrimler. Denne struktur skal tilvejebringe en bærermatrix, der har et forholdsvis stort hulrumsvolumen og derfor tillader transport af hdjmolekylære materialer, f.eks.

15 rede blodlegemer og makroreagenser sâsom antistoffer. De immunanalyse-udf0relsesformer, der er beskrevet under anven-delse af en sâdan bærermatrix, er af multilagstypen, hvor adskillelse af de bundne og de frie dele af det mærkede konjugat udfdres, medens væsken str0mmer gennem materialet.

20 Sâdanne multilags-immunanalyse-materialer er vanskelige at udforme og at fremstille. Anvendelsen af homogène immunana-lyse-systemer i forbindelse med reagensstrimler foreslâs ikke i det nævnte skrift.

I DE offentliggorelsesskrift nr. 2.733.380 beskrives 25 der en væske-immunanalysemetode, ved hvilken der anvendes et overfladebundet antistof og et opldseligt mærket konjugat.

Der er ingen omtale af eller forslag om en reagensstrim-mel-form, hvori der er inkorporeret bâde antistoffet og det mærkede konjugat.

30 I GB offentliggorelsesskrift nr. 2.023.607 er der beskrevet et homogent immunanalysesystem, som er et foretruk-ket System til inkorporering i et reagensstrimmelmateriale ifolge den foreliggende opfindelse. Dette skrift tilveje-bringer imidlertid ingen antydning om, hvoriedes en sâdan 35 reagensstrimmel skal udformes, og ej heller nogen antydning om, ved hjælp af hvilke midler man kan inkorporere antistof-

DK 157328 B

8 fet og mærkede konjugatreagenser i et materiale af den nævnte art.

I US patentskrift nr. 3.641.235 beskrives der et immunologisk testmateriale til detektering af et antigen.

5 Materialet er en papirstrimmel inkorporeret med partikler, der bâde er overtrukket med en farvet indikator og har anti-stof mod antigenet bundet dertil. Nâr antigenet reagerer med antistof-partikel-reagenset, frigores indikatoren, og den diffunderer bort fra partiklerne og kan detekteres til 10 indikering af tilstedeværelsen af antigenet.

I US patentskrift nr. 4.094.647 beskrives der et kapillarstromnings-immunanalyse-testmateriale. Materialet fungerer ved adskillelse af det antigen-bundne, mærkede reagens fra det ubundne, mærkede reagens pâ en kapillarstrim-15 mel. Ved anvendelse af materialet anvendes der sâledes ikke et homogent immunanalyseprincip.

I US patentskrift nr. 4.160.008 beskrives der en udformning af en multilags-reagensstrimmel, med hvilken man overvinder problemet med krydsforurening mellem tilst0dende 20 testarealer pâ en strimmel. Sâdanne materialer anvendes f.eks. ved detektering af urin- og serumanalytter, f.eks. ved bestemmelse af glucose. Der gives i skriftet ingen en-keltheder vedrorende immunanalyse-materialer.

Formâlet med opfindelsen er at tilvejebringe et test-25 materiale til bestemmelse af en ligand i en væskeprove ved hjælp af immunanalyse, hvilket testmateriale er sâledes sammensat, at der ved dets anvendelse opnâs en forenkling af bestemmelsen ved meget lave koncentrationer i de flydende prdver. Dette formâl opnâs med testmaterialet if0lge opfin-30 delsen, der er sammensat som angivet i det f0lgende.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der sâledes et homogent, specifikt bindingsbestemmelses-testmate-riale, en fremgangsmàde til fremstilling deraf samt en frem-gangsmâde til anvendelse deraf til bestemmelse af en ligand 35 i eller ligandbindingskapaciteten af en flydende pr0ve.

Testmaterialet omfatter (a) reagenser til et homogent, spe-

DK 157328 B

9 cifikt bindingsbesteiwnelsessystem, der giver et detekterbart respons, som er en funktion af tilstedeværelsen, i kvalitativ eller kvantitativ forstand, af liganden i eller ligandbin-dingskapaciteten af den flydende pr0ve, der bestemmes, og 5 (b) et fast bærermateriale inkorporeret med sâdanne reagen- ser. I én udf0relsesform er bærermaterialet praktisk taget ensartet inkorporeret med bestemmelsesreagenserne. Bærermaterialet er fortrinsvis en matrix, som er absorberende i forhold til den flydende prove, f.eks. en vævmatrix over-10 vejende sammensat af naturlige eller syntetiske polymerfibre, f.eks. papir, eller en polymerfilm eller -gel. I en anden udf0relsesform omfatter bærermaterialet et stort antal zoner, f.eks. fysisk adskilte lag, hvor hver af zonerne er inkorporeret med et forskelligt reagens eller med en reagenskom-15 bination af bestemmelsesreagenserne.

Det her omhandlede testmateriale omfatter (1) en fast bærerbestanddel, som udg0r en absorbent for væskepr0ven, og (2) et reagensmateriale, som er inkorporeret i bærerbe-standdelen og indeholder (i) et antistof eller andet natur-20 ligt forekommende bindingsprotein for liganden og (ii) et ligandkonjugat eller en analog deraf, som antistoffet eller bindingsproteinet ogsâ formâr at binde, covalent bundet til et mærkningsstof, som kan detekteres ved hjælp af et elek-tromagnetisk signal, som er forskelligt, nâr det mærkede 25 konjugat er bundet til antistoffet eller andet bindingsprotein, og nâr det ikke er sâledes bundet, hvorhos signalet er en funktion af ligandmængden i proven, og dette testmateriale er if0lge opfindelsen ejendommeligt ved, at antistoffet eller andet bindingsprotein og det mærkede konjugat 30 er inkorporeret i den faste bærerbestanddel i det væsentlige ubundne til hverandre, og at materialet er fremstillet véd i en forste væske at inkorporere et af reagenserne, hvilke reagenser er konjugatet og antistoffet eller bindingsprotein i bæreren, hvorpâ der torres, hvorefter man (A) enten i 35 bæreren inkorporerer det andet af de nævnte reagenser, som ikke indeholder vand, hvorpâ bæreren torres, eller man (B)

DK 157328 B

10 f0rst dybfryser bæreren, inkorporerer det andet af reagen-serne, hvilke regaenser er konjugatet og antistoffet eller bindingsproteinet, i en anden væske, i bæreren, udsætter denne for en temperatur, ved hvilken den anden væske fryser, 5 og lyofiliserer bæreren.

Den her omhandlede fremgangsmâde til bestemmelse af en ligand i en væskeprove, der skal analyseres, hvilken fremgangsmâde omfatter f0lgende trin: a) pr0ven bringes i kontakt med et analyse- eller 10 testmateriale, som omfatter (1) en fast bærerbestanddel, der udger en absorbent for væskeproven, og (2) et reagens-materiale, der er inkorporeret i bærerbestanddelen og in-deholder (i) et antistof eller et andet naturligt forekom-mende bindingsprotein for liganden og (ii) et ligandkonjugat 15 eller en analog deraf, som antistoffet eller det andet bindingsprotein ogsâ er i stand til at binde, covalent bundet til et mærkningsstof, der kan detekteres ved hjælp af et elektromagnetisk signal, som er forskelligt, nâr det mærkede konjugat er bundet til antistoffet eller andet bindingspro-20 tein, og nâr det ikke er sâledes bundet, hvorhos signalet er en funktion af ligandmængden i proven, og b) det frembragte elektromagnetiske signal mâles pâ bærerbestanddelen uden fysisk adskillelse af det mærkede konjugat, som er bundet til antistoffet eller bindingspro- 25 teinet fra konjugatet, som ikke bindes, er if0lge opfindelsen ejendommelig ved, at antistoffet eller andet bindingsprotein og det mærkede konjugat inkorporeres i den faste bærerbestanddel i det væsentlige ubundne til hinanden, og at mate-rialet er fremstillet ved i en forste væske at inkorporere 30 et af reagenserne, hvilke reagenser er konjugatet og antistoffet eller bindingsproteinet, i bæreren, hvorpâ denne torres, hvorefter man enten (A) ved at inkorporere i bæreren det andet af de nævnte reagenser i en væske, som ikke in-deholder vand, hvorpâ bæreren torres, eller (B) ved forst 35 at dybfryse bæreren, inkorporerer det andet af reagenserne, hvilke reagenser er det nævnte konjugat og antistof eller

DK 157328 B

11 bindingsprotein, i en anden væske, i bæreren, udsætter denne for en temperatur, ved hvilken den anden væske fryser, og lyofiliserer bæreren.

Den her omhandlede fremgangsmâde til fremstilling af 5 et testmateriale til bestemmelse af en ligand i en væskepr0ve ved flere ganges inkorporering af reagens i en fast bærer-bestanddel, hvilket testmateriale omfatter (1) en fast bæ-rerbestanddel, der udg0r en absorbent for væskepr0ven, og (2) et reagensmateriale, som er inkorporeret i bærerbes-10 tanddelen og indeholder (i) et antistof eller andet naturligt forekommende bindingsprotein for liganden og (ii) et ligand-konjugat eller en analog deraf, som antistoffet eller bin-dingsproteinet ogsâ er i stand til at binde, kovalent bundet til et mærkningsstof, som kan detekteres ved hjælp af et 15 elektromagnetisk signal, som er forskelligt, nâr det mærkede konjugat er bundet til antistoffet eller andet bindingsprotein, og nâr det ikke er sâledes bundet, hvorhos signalet er en funktion af ligandmængden i pr0ven, er if0lge opfin-delsen ejendommelig ved, at man 20 a) inkorporerer et af reagenserne, som er det mærkede konjugat og bindingspartneren, i bæreren i en f0rste væske, og derefter b) inkorporerer det andet af reagenserne, som er mærket konjugat og bindingspartner i bæreren, i en væske, 25 som ikke indeholder vand, hvorpâ bæreren torres, hvorhos det mærkede konkugat og bindingspartneren ikke samtidig indfores i samme miljo, hvorved bindingsreaktionen mellem dem i det væsentlige forhindres, og antistoffet eller andet bindingsprotein og det nævnte mærkede konjugat er inkor-30 poreret i bæreren i det væsentlige ubundne til hinanden.

Den omhandlede lyofiliseringsfremgangsmâde til fremstilling af et testmateriale til bestemmelse af en ligand i en væskepreve, hvilket testmateriale omfatter (1) en fast bærerbestanddel, som udg0r en absorbent for væskeproven, og 35 (2) et reagensmateriale, som er inkorporeret i bærerbestand- delen og indeholder (i) et antistof eller andet naturligt

DK 157328 B

12 forekommende bindingsprotein for liganden og (ii) et ligand-konjugat eller en analog deraf, som antistoffet eller bin-dingsproteinet ogsâ er i stand til at binde, kovalent bundet til et mærkningsstof, som kan detekteres ved hjælp af et 5 elektromagnetisk signal, som er forskelligt, nâr det mærkede konjugat er bundet til antistoffet eller andet bindingsprotein, og nâr det ikke er sâledes bundet, hvorhos signalet er en funktion af ligandmaengden i pr0ven, er if0lge opfin-delsen ejendommelig ved, at fremgangsmâden omfatter f0lgende 10 trin: a) enten det nævnte mærkede konjugat eller den nævnte bindingspartner inkorporeres i bæreren i en forste væske, b) bæreren t0rres, c) bæreren dybfryses, og et andet af de nævnte rea- 15 genser eller mærket konjugat eller bindingspartner inkor poreres deri i en anden væske, d) bæreren udsættes for en temperatur, ved hvilken den anden væske fryser, og e) bæreren lyofiliseres, hvorhos det mærkede konkugat 20 og bindingspartneren ikke samtidig indfores i samme milj0 i noget væsentligt tidsrum, hvorved bindingsreaktionen mellem dem i det væsentlige forhindres, og det nævnte antistof eller andet bindingsprotein og det nævnte mærkede konjugat sâledes inkorporeres i bærerbestanddelen i det væsentlige 25 ubundne til hinanden.

Ved anvendelsen bringes testmaterialet i kontakt med den flydende pr0ve, f.eks. en biologisk væske, sâsom sérum eller urin, f.eks. ved momentan neddypning af det med reagens inkorporerede bærermateriale i proven, eller ved anbringelse 30 af en aliquot af proven pâ en overflade af bærermaterialet.

Det detekterbare respons mâles derpâ, almindeligvis efter en forudbestemt inkubations- eller reaktionsperiode, enten visuel-t af den tekniker, der udforer bestemmelsen, eller ved hjælp af et instrument. Det detekterbare respons er i 35 de fleste tilfælde et elektromagnetisk strâlingssignal, f.eks. fluorescens, kemoluminiscens, en farveændring eller et spektrofotometrisk respons.

DK 157328B

13 Ο

Foretrukne homogène, specifikke bindingsbestmmel-sessystemer er de kendte systemer, der indbefatter et mærkningsstof, som deltager i en enzymatisk reaktion. Et sâdant foretrukkent bestemmelsessystem er det, hvori 5 mærkningsstoffet er en enzym-prosthetisk gruppe, og hvori det omfang, i hvilket et apoenzym er i stand til at danne en kombination med et sâdant mærkningsstof i form af en prosthetisk gruppe til dannelse af et aktivt holoenzym, afhænger af tilstedeværelsen af liganden eller bindings-10 kapaciteten derfor. Holoenzymet kan mâles ved hjælp af dets enzymatiske aktivitet i overensstemmelse med et stort antal metoder, herunder kolorimetriske metoder. Et andet foretrukkent bestemmelsessystem er det, hvori mærkningsstoffet er et enzymsubstrat, og hvor det omfang, i hvil-15 ket et enzym kan indvirke pâ et sâdant substrat-mærk-ningsstof til frembringelse af et detekterbart produkt, afhænger af nærværelsen af liganden eller bindingskapaci-teten derfor. I et sâdant homogent specifikt bindings-bestemmelsessystem er det detekterbare produkt fortrins-20 vis fluorescerende, og det detekterbare respons fra test-materialet kan mâles med et fluorometer. Ogsâ anvendeligt som det homogène, specifikke bindingsbestemmelsessystem er det, hvori mærkningsstoffet er et enzym, og hvor akti-viteten af dette enzym-mærkningsstof afhænger af nærvæ-25 relsen af liganden eller bindingskapaciteten derfor. Ogsâ i dette tilfælde kan enzymaktiviteten mâles pâ et stort antal mâder.

Pâ tegningen viser figur 1-16 grafiske fremstil-linger af de data, der er opnâet ved de fors0g, der er 30 beskrevet i de efterstâende eksempler.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebrin-ges der et testmateriale til anvendelse ved udf0relse af homogène, ikke-radioisotopiske, specifikke immunanaly-se-bindingsbestemmelser, og dette materiale har aile 35 de bekvemmelighedstræk, der forefindes ved de kon-

DK 157328 B

0 14 ventionelle analyseteststrimler og andre testelementer med lignende udformning. Ligesom ved sâdanne konventio-nelle materialer tilvejebringes der if0lge opfindelsen en fast bærer, almindeligvis en matrix af en eller anden 5 art, inkorporeret med aile de reagenser, der er n0dven-dige til gennemf0relsen af en given bestemmelse sâledes, at brugeren blot har til opgave at bringe testmaterialet i kontakt med den pr0ve, der skal unders0ges, og at mâle det fremkomne respons. Nâr hele processen er automatise-10 ret, kan et instrument til ud£0relse af de samme manipu-lationer hâve en meget enklere udformning end et instrument, der skal anvendes i forbindelse med konventionelle flydende kemiske systemer, der nu anvendes til udf0relse af homogène, specifikke bindingsbestemmelser.

15 Reagenser til ethvert homogent, specifikt bin- dingsbestemmelsessystem kan inkorporeres i det her om-handlede testmateriale. I almindelighed er homogène, specifikke bindingsbestemmelsesmetoder baseret pâ en særlig indbyrdes reaktion mellem (1) et konjugat af en bindings-20 komponent og et mærkningsstof og (2) en bindingspartner til bindingskomponenten i konjugatet, idet et karakteri-stikum ved mærkningsstoffet er forskelligt, nâr det mær-kede konjugat er bundet med bindingspartneren, sammenlig-net med det tilfælde, hvor et sâdant konjugat ikke er sâ-25 ledes bundet. Det pâvirkede karakteristikum ved mærkningsstoffet kan være af enhver mâlelig natur, f.eks. en ke-misk eller fysisk egenskab ved mærkningsstoffet. I nogle tilfælde er det pâvirkede eller ændrede karakteristikum en kemisk reaktivitet ved en forudbestemt reaktion, der 30 involverer dannelse eller spaltning af kemiske bindinger, der kan være covalente eller ikke-covalente. I andre tilfælde er det pâvirkede karakteristikum en fysisk egenskab ved mærkningsstoffet, der kan mâles uden kemisk reaktion.

35 15

DK 157328 B

0 I det her omhandlede testmateriale er der inkorporeret homogène, specifikke bindingsbestemmel-sesreagenser, soin reagerer med liganden eller dens bindingskapacitet i pr0ven pâ en immunokemisk mâde.

5 Dette betyder, at der vil være et antigen-antistof-eller hapten-antistof-forhold mellem reagenserne og/eller ligandén:.~.eller dens bindingskapacitet i pr0ven. Sâdanne bestemmelser betegnes derfor som immunobestemmelser, og den specielle indbyrdes reaktion 10 mellem det mærkede konjugat og dets bindingspartner er en immunokemisk binding. I sâdanne tilfælde er bindings-komponenten i det mærkede konjugat sâledes et antigen, hapten eller antistof (eller et fragment deraf), og bin-dingspartneren er dens korresponderende immunokemiske 15 bindingspartner.

Nâr pr0ven unders0ges til bestemmelse af nærvæ-relsen eller mængden af en bestemt ligand deri, omfatter reagenserne til den homogène, specifikke bindingsbestem-melsesmetode sædvanligvis (1) et mærket konjugat sammen-20 sat af liganden, eller en bindingsanalog dertil, kemisk koblet til mærkningsstoffet, (2) en bindingspartner for liganden, f.eks. et antistof eller et fragment deraf, et naturligt receptor-protein og lignende, og (3) et vil-kârligt hjælpereagens, der er n0dvendigt til mâling af 25 det mærkede stof i det mærkede konjugat. En begrænsende mængde af bindingsstoffet indf0res, sâledes at enhver ligand i pr0ven vil konkurrere med det mærkede konjugat med hensyn til binding til bindingspartneren. Fordelingen af mærkningsstoffet mellem den bundne form og den frie 30 form vil derfor bestemme st0rrelsen af det detekterbare respons fra mærkningsstoffet,som igen vil være en funktiôn af tilstedeværelsen af liganden. En anden metode til bestemmelse af en ligand indebærer, at det mærkede konjiugat 35 ] 16

DK 157328 B

0 er sammensat af en mærket bindingspartner for liganden, og ved binding til liganden pâvirkes mærkningsstoffet med hensyn til dets detekterbare respons. Nâr man be-stemmer pr0vens ligandbindingskapacitet, vil det mær-5 kede konjugat være sammensat af liganden, eller en bin-dingsanalog dertil, kemisk koblet til mærkningsstoffet, hvorved pr0vens kapacitet til at binde det mærkede konjugat, f.eks. pâ grund af nærværelsen af en bindingspartner til liganden i pr0ven, bestemmer den effekt, der ud-10 0ves pâ det detekterbare signal fra mærkningsstoffet.

Der kendes adskillige homogène, specifikke bin-dingsbestemmelsessystemer, og de f01gende er eksempler pâ nogle sâdanne systemer, der kan anvendes i forbindelse med det her omhandlede testmateriale. De f01gende syste-15 mer er anf0rt svarende til natüren af det anvendte mærk-ningsstof.

1. Mærkningsstoffer i form af enzym-prosthetiske grupper.

20 I dette system er mærkningsstoffet en prosthetisk gruppe af et enzym, og et katalytisk inaktivt apoenzyms evne til kombination med den prosthetiske gruppemærkning til dannelse af et aktivt enzym (holoenzym) pâvirkes af bindingen mellem det mærkede konjugat og dets bindings-25 partner. Resulterende holoenzymaktivitet kan mâles ved hjælp af konventionelle detekteringssystemer til frem-bringelse af et endeligt detekterbart signal.

Bestemmelsessystemer af denne type er beskrevet i det britiske offfentligg0relsesskrift nr. 2.023.607.

30 En særlig foretrukken bestemmelsesmetode under anvendelse af mærkning med en prosthetisk gruppe benytter sig af flavin-adenin-dinucleotid (FAD) som mærkningsstof og apo--glucoseoxidase som apoenzymet. Resulterende glycoseoxi- 35 0 17

DK 157328 B

dase-aktivitet kan mâles ved et kolorimetrisk detekte-ringssystem omfattende glucose, peroxidase og et indi-katorsystem, der frembringer en farveændring som respons pâ hydrogenperoxid.

5 Ved en sâdan foretrukken bestemmelsesmetode har det FAD-mærkede konjugat fortrinsvis formlen

NH-R-L

<pü

Ribof lavin-(Phos-)-^—Ribose i hvilken Riboflavin-fPhos^-Ribose betegner riboflavin--pyrophosphat-ribose-resten i FAD, R er en forbindende 15 gruppe, og L er bindingskomponenten, f.eks. liganden eller en dermed analog.

2. Enzymsubstrat-mærkningsstoffer.

20 I dette System er mærkningsstoffet valgt sâledes, at det mærkede konjugat er et substrat for et enzym, og enzymets evne til at virke pâ det substrat-mærkede konjugat pâvirkes enten i positiv eller negativ forstand ved binding af det mærkede konjugat med dets bindingspartner.

25 Indvirkning af enzymet pâ det substrat-mærkede konjugat frembringer et produkt, der kan skelnes ved hjælp af et eller andet træk, almindeligvis et kemisk eller fysisk kendetegn sâsom kemisk reaktivitet ved en indikatorreak-tion eller sâsom et fotometrisk kendetegn, f.eks. fluor-30 escens eller lysabsorption (farve). Bestemmelsessystemer af denne type er beskrevet i .DE-OS 2.618.511 samt i Anal. Chem., 48: 1933 (1976), Anal. Biochem., 77:55 (1977) og Clin. Chem., 23:1402 (1977). Ved en.særlig foretrukken bestemmeîsêsmetode med substrat-mærkning anvendes der et 35 0 18

DK 157328 B

mærket konjugat med strukturformlen ch2ho

^ ocC

hvori R er en forbindende gruppe, og L er bindingskomponen-tenf f.eks. liganden eller en dermed analog, idet evnen for enzymet 0-galactosidase til at spalte konjugatet, hvorved 10 der fâs et produkt, der kan skelnes ved dets fluorescens, inhiberes ved binding af konjugatet med dets bindingspart-ner.

3. Coenzym-mærkningsstoffer.

15

Det mærkede konjugat i dette System er i dets mærkningsdel sammensat af en coenzym-aktiv funktion, og evnen for en sâdan coenzym-mærkning til at deltage i en enzymatisk reaktion pâvirkes af bindingen af det mærkede 20 konjugat med dets bindingspartner. Omfanget af den resul-terende enzymatiske reaktion kan mâles ved konventionelle detekteringssystemer til opnâelse af et endeligt detekter-bart signal. Bestemmelsessystemer af denne type er beskre-vet i DE-OS 2.618.511 og i Anal. Biochem., 72:271 (1976), 25 Anal. Biochem., 72:283 (1976) og Anal. Biochem., 76:95 (1976).

4. Enzymmodulator-mærkningsstoffer.

30

Det mærkede konjugat i dette System er i dets mærkningsdel sammensat af en enzymmodulerende funktion, sâsom en enzyminhibitor eller -stimulator, og evnen for et sâdant modulatormærkningsstof til at modulere aktivi-35 teten af et enzym pâvirkes af bindingen af det mærkede konjugat med dets bindingspartner. Graden eller hastig- 0 19

DK 157328 B

heden af den resulterende enzymatiske reaktion kan mâles ved hjælp af konventionelle detekteringssystemer til op-nâelse af et endeligt detekterbart signal. Bestemmelses-systemer af denne type er beskrevet i USA-patentskrift 5 nr. 4.134.792.

5. Enzym-mærkningsstoffer.

I dette System er mærkningsstoffet et enzym, og 10 enzymmærkningsstoffets aktivitet pâvirkes af bindingen af det mærkede konjugat med dets bindingspartner. Den resulterende enzymaktivitet kan mâles med konventionelle detekteringssystemer til opnâelse af et endeligt detekterbart signal. Bestemmelsessystemer af denne type er beskrevet 15 i USA-patentskrifterne nr. 3.817.837 og 4.043.872.

6. Un’dertrykkeligt fluorescerende mærkningsstoffer.

Det mærkede konjugat i dette System er i mærknings-20 delen sammensat af et fluorescerende stof, hvis fluores-cens undertrykkes i mâleligt omfang, nâr det mærkede konjugat bindes af dets bindingspartner, sædvanligvis et pro-teinstof sâsom et antistof. Det fluorescrende mærknings-stof mâles direkte, idet dets fluorescens er det detek-25 terbare signal. Bestemmelsessystemer af denne type er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.160.016 og i J.Clin.Path., 30:526 (1977) .

7. Fluorescens-polarisations-mærkningsstoffer.

30 Mærkningsstoffet i dette System er ogsâ et fluorescerende stof, men det pâvirkede karakteristikum er en polarisation af fluorescensen pâ grund af bindingen af det mærkede konjugat med dets bindingspartner, sædvanlig-35 vis et proteinstof sâsom et antistof. Bestemmelsessystemer af denne type er beskrevet i J.Exp.Med., 122:1029 (1965).

20

DK 157328 B

0 8. Kemisk aktiverede fluorescerende mærkningsstoffer.

I dette System er mærkningsstoffet atter et fluorescerende stof, men det fluorescerende mærknings-5 stofs evne til at blive kemisk aktiveret til en energi-tilstand, i hvilken det fluorescerer, pâvirkes af bin-dingen af det mærkede konjugat med dets bindingspartner. Kemisk aktivering af mærkningsstoffet opnâs almindelig-vis ved udsættelse af det fluorescerende mærkningsstof 10 for en forbindelse med h0j energi dannet in situ. Bestem-melsessystemer af denne type er tidligere beskrevet.

9. Mærkningsstoffer med dobbelt antistof med sterisk hindring. 15

Et andet bestemmelsessystem er det dobbelt anti-stof-immunobestemmelsessystem, der er beskrevet i USA-pa-tentskrifterne nr. 3.935.074 og 3.998.943. Det mærkede konjugat omfatter to epitoper, hvoraf den ene deltager i den 20 immunologiske reaktion med liganden og anti-ligand-anti- stof, og hvoraf den anden kan bindes med et andet antistof, men med den begrænsning, at de to antistoffer er hindret i binding til det mærkede konjugat pâ samme tid. Den anden epitop kan være et fluorescerende stof, hvis fluorescens 25 undertrykkes af bindingen af det andet antistof, eller det kan deltage i en st0ttende, konkurrerende bindingsreaktion med en mærket form af den anden epitop til binding til det andet antistof. Forskellige detekteringssystemer er mulige i et sâdant System som beskrevet i de ovennævnte patent-30 skrifter. Beslægtede bestemmelsessystemer er beskrevet i USA-patentskrifterne nr. 4.130.462 og 4.161.515 samt i bri-tisk patentskrift nr. 1.560.852.

35 0 21

DK 157328 B

10. Energioverf0rings-mærkningsstoffer.

I dette System er mærkningsstoffet den ene del af et energioverf0rings-donor-acceptor-par, og bindings-5 partneren er konjugeret med den anden del af dette par.

Nâr det mærkede konjugat bindes med bindingspartneren, ændres energiudtrykket for donor-komponenten i parret sâledes ved overf0rsel til acceptor-komponenten. Sædvan-ligvis er donoren et fluorescerende stof, og acceptoren 10 er et undertryknings- eller afsvækningsmiddel derfor, og dette middel kan eventuelt selv være et fluorescerende stof. I en sâdan udf0relsesform er det detekterbare signal fluorescens, men andre detekteringssystemer er ogsâ mulige. Sâdanne bestemmelsessystemer er beskrevet i USA-15 -patentskrifterne nr. 3.996.345, 4.174.384 og 4.199.559 samt i britisk patentskrift nr. 2.018.424.

11. Andre mærkningsstoffer.

20 Andre homogène, specifikke bindingsbestemmelses- systemer, der er beskrevet i den kendte teknik, og som kan anvendes i forbindelse med opfindelsen, omfatter anvendel-sen af sâdanne mærkningsstoffer som f.eks.: (a) ikke-enzym katalysatorer, f.eks. elektron- 25 overf0ringsmidler, jfr. USA-patentskrift nr. 4.160.645, (b) ikke-enzym kemoluminiscerende stoffer, jfr. den ovennævnte USA-patentans0gning nr. 894.836, 30 (c) "channeling"-mærkningsstoffer, jfr. britisk patentskrift nr. 2.018.986, (d) "particle"-mærkningsstoffer, jfr. britisk patentskrift nr. 2.019.562, og (e) mærkede liposom-partikler, jfr. USA-patent- 35 skrift nr. 4.193.983.

0 22

DK 157328 B

Ligander

Den foreliggende bestemmelsesmetode kan anvendes til detektering af enhver ligand, for hvilken der er en specifik bindingspartner, og omvendt til detektering af 5. kapaciteten af et flydende medium til binding af en ligand (almindeligvis pâ grund af nærværelsen af en bindings-partner for liganden i mediet). Liganden er sædvanligvis et peptid, et polypeptid, et protein, et carbonhydrat, et glycoprotein, et steroid eller et andet organisk molekyle, 10 for hvilket der findes en specifik bindingspartner i bio-logiske systemer, eller for hvilke en sâdan partner kan syntetiseres. Funktionelt udtrykt er liganden almindeligvis valgt fra gruppen omfattende antigener og antistoffer derfor, haptener og antistoffer derfor, samt hormoner, 15 vitaminer, metaboliter og farmakologiske midler samt deres receptorer og-bindingsstoffer. Almindeligvis er liganden et immunologisk aktivt polypeptid eller protein med mole-kylvægt mellem 1000 og 10.000.000, f.eks. et antistof eller et antigent polypeptid eller protein, eller en hapten med 20 molekylvægt mellem 100 og 1500.

Repræsentative polypeptid-ligander er angiotensin I og II, C-peptid, oxytocin, vasopressin, neurophysin, gastrin, secretin, bradykinnin og glucagon.

Repræsentative protein-ligander omfatter klasser-25 ne af protaminer, mucoproteiner, glycoproteiner, globuliner, albuminer, scleroproteiner, phosphopro-einer, histoner, lipoproteiner, chromoproteiner og nucleoproteiner. Eksemp-ler pâ specifikke proteiner er prealbumin, a^-lipoprotein, humant serumalbumin, α^-glycoprotein, transcortin, thyroxin-30 -bindende globulin, haptoglobulin, hæmoglobin, myoglobin, ceruloplasmin, c^-lipoprotein, (^-macroglobulin, β-lipo-protein, erythropoietin, transferrin, homopexin, fibrinogen, immunoglobulinerne sâsom IgG, IgM, IgA, IgD og IgE og deres fragmenter, f.eks. Fc og F^, komplementfaktorer, prolactin, 35 blodkoagulationsfaktorer sâsom fibrinogen, thombin etc., insulin, melanotropin, somatropin, thyrotropin, follikelstiraulerende 0 23

DK 157328 B

hormon, lutiniserende hormon, gonadotropin, thyroidsti-mulerende hormon, placentalt lactogen, "intrinsic"-faktor, transcobalamin, serumenzymer sâsom alkalisk phosphatase, mælkesyredehydrogenase, amylase, lipase, phosphataser, 5 cholinestérase, glutamin-oxaloeddikesyre-transaminase, glutamin-pyruvinsyre-transaminase og uropepsin, endor-phiner, encephaliner, protamin, vævsantigener, bakterie-antigener og virale antigener sâsom hepatitis-associe-rende antigener, f.eks. HBgAg, HBcAg og HBeAg.

10 Repræsentative hapten-ligander omfatter de gene- relle klasser af lægemidler, metaboliter, hormoner, vita-miner og lignende organiske forbindelser. Hapteniske hormoner omfatter thyroxin og triiodthyronin. Vitaminer omfatter vitamin A, B, f.eks. B·^* C, D, E og K, folinsyre 15 og thiamin. Lægemidlerne omfatter antibiotika sâsom amino- glycosider, f.eks. gentamicin, tobramycin, amikacin, siso-micin, kanamycin og netilmicin, penicillin, tetracyclin, terramycin, chlormycetin og actinomycetin, endvidere nu-cleosider og nucleotider sâsom adenosindiphosphat (ADP), 20 adenosintriphosphat (ATP), flavinmononucleotid (FMN), nico-tinamid-adenin-dinucleotid (NAD) og dets polære dérivât (NADP), thymidin, guanosin og adenosin, endvidere prosta-glandiner, steroider sâsom estrogenerne, f.eks. estriol og estradiol, sterogener, androgener, digoxin, digitoxin 25 samt adrenocorticoide steroider, og andre lægemidler sâsom phénobarbital, phenytoin, primidon, ethosuximid, carbama-zepin, valproat, theophyllin, caffein, propranolol, pro-cainamid, quinidin, amitriptylin, cortisol, desipramin, disopyramid, doxepin, doxorubicin, nortriptylin, metho-30 trexat, imipramin, lidocain, procainamid, N-acetylprocain-amid, amphetaminerne, catecholaminerne og antihistaminerne.

Det flydende medium, pâ hvilket bestemmelsen skal udf0res, kan være en naturligt forekommende eller kunstigt dannet væske, der menes at indeholde liganden, og mediet 35 er almindeligvis en biologisk væske eller en fortynding deraf. Biologiske væsker, der kan anvendes til bestemmelsen, omfatter sérum, plasma, urin, spyt og amniotiske og cere-brospinale væsker.

0 24

DK 157328 B

Bærermateriale

Det her omhandlede bærermateriale kan antage et meget stort antal former og skal derfor opfattes i bred forstand. Materialet kan være mono- eller multifaset og 5 indeholde ët eller flere egnede materialer eller medier med lignende eller forskellige absorptive eller andre fysiske karakteristika. Det kan være hydrofobt eller hydrofilt, væskesugende eller ikke-por0st. I den mest effektive udf0relsesform kan bærermaterialet være omhyg-10 geligt tilpasset efter egenskaberne af det bestemte homogène, specifikke bindingsbestemmelsessystem, der skal an-vendes.

Som her benyttet kan betegnelsen "bærermateriale" sâledes omfatte enhver substans, matrix eller overflade, 15 der er i stand til at blive inkorporeret med specifikke bindingsbestemmelsesreagenser. Materialet kan hâve mange kendte forner, f.eks. de, der anvendes til kemiske og en-zymatiske reagensstrimler til opl0snings-analyse. Eksem-pelvis beskrives i USA-patentskrift nr. 3.846.247 anven-20 delsen af filt, por0se keramiske strimler og vævede eller matterede glasfibre. Som erstatninger for papir beskrives i USA-patentskrift nr. 3.552.928 anvendelsen af træstikker, klæde, svampemateriale og leragtige eller -holdige materialer. Anvendelsen af syntetiske harpiksfiberflor og glas-25 fiberfilt i stedet for papir er foreslâet i britisk pa- tentskrift nr. 1.369.139. I et andet britisk patentskrift, nr. 1.349.623, foreslâs anvendelsen af et lyspermeabelt netværk af tynde filamenter som et dække for et underlig-gende papirbærerelement, I patentskriftet foreslâs ogsâ 30 imprægnering af papir med en del af et reagensSystem og imprægnering af netværket med andre potentielt inkompa-tible kemiske eller enzymatiske reagenser. I fransk patentskrif t nr. 2.170.397 beskrives anvendelsen af bærer-materialer med mere end 50% polyamidfibre deri. Et andet 35 forslag til bærermaterialer er beskrevet i USA-patentskrift 25

DK 157328 B

0 nr. 4.046.513, hvori det foreslâs at anvende tryknings-reagenser pâ et egnet bærestof. I USA-patentskrift nr. 4.046.514 er der beskrevet sammenvævning eller -knytning af filamenter, der bærer reagenser i et reaktantsystem.

5 Aile sâdanne bærermaterialetyper kan anvendes i forbin- delse med den foreliggende opfindelse. Fortrinsvis om~ fatter bærermaterialet et væskesugende materiale, f.eks. filtrerpapir, idet en opl0sning eller suspension af rea-genserne i det specifikke bindingsbestemmelsessystem an-10 vendes til imprægnering af bærermaterialet. Det kan ogsâ omfatte et System, som fysisk indeslutter disse bestand-dele, f.eks. i polymère mikrokapsler, som derpâ rives op ved kontakt med test-pr0ven. Materialet kan omfatte et System, i hvilket bestanddelene er homogent kombineret 15 med bæreren i en fluid eller semi-fluid tilstand, der senere hærdner eller sætter sig, hvorved bestanddelene indesluttes.

Uanset hvilket materiale der vælges til bærermaterialet, hvadenten det er por0st for at tillade inkor-20 porering af bestanddele, sâsom ved mætning med en opl0s- ning indeholdende disse, eller det er ikke-por0st sâsom til anvendelse ved pâtrykt brug af reagenser eller til underst0tning af et kontinuerligt overtræk, hvadenten det er vævet eller knyttet, uanset dets sammensætning 25 eller konfiguration, vil materialets udvælgelse i aile tilfælde være dikteret af den pâtænkte anvendelse og af reagenssystemet. Eksempelvis kan det være 0nskeligt at benytte en flertrins-anvendelse af reagenser. I et sâdant tilfælde fremstilles der to eller flere opl0sninger eller 30 suspensioner af reagenser, og bærermaterialet dyppes i rækkef01ge ned i hver med t0rringstrin indskudt mellem dypningerne. I et sâdant tilfælde kan et por0st materiale sâsom papir være mest fordelagtigt. Alternativt kan det være 0nskeligt at anvende et flerfaset bærermateriale, 35 ··»* 26

DK 157328 B

0 hvor to eller flere lag af por0st materiale er fastgjort oven pâ hverandre. En yderligere mulighed for bærermate-riale-inkorporering er overtrækning i rækkef01ge af en kontinuerlig polymer med overtræk indeholdende forskellige 5 reagenser i immunobestemmelsessystemet. Filtreringslag kan være til stede i bærermaterialet til hindring af, at potentielle interfererende midler nâr frem til bestemmel-sessystemet, medens man tillader adgang til enhver analyt, der er til stede i pr0ven.

10 Det ses sâledes, at det rette valg af bærermate rialet kun afhænger af to faktorer: den tilsigtede anven-delse.og naturen af det specifikke bindingsbestemmelses-system, der skal anvendes. Pâ basis af den foreliggende beskrivelse kræves der kun rutinemæssige fors0g for at 15 kunne udvælge det rette bærermateriale.

Fremstilling af testmaterialet

If0lge opfindelsen tilvejebringes der en fremgangsmâde til fremstilling af testmaterialet if01ge 20 opfindelsen, og denne fremgangsmâde omfatter inkorpore-ring af et bærermateriale med bestanddelene af testsy-stemet. Nâr denne inkorporering sker ved imprægnering med en eller flere opl0sninger af de her omhandlede be-stemmelsesreagenser, t0rres den sâledes imprægnerede bærer 25 derefter. Ud over ved imprægnering kan materialerne if0lge opfindelsen fremstilles ved andre egnede metoder, f.eks. ved trykning eller spr0jtning af kompositionen pâ et lag af bærermateriale, eller ved inkorporering af opl0snin-gerne i filmdannende væsker, hvorpâ den sâledes fremstil-30 lede kombination tillades at hærdne eller st0rkne.

Nâr bærermaterialet omfatter flere lag, f.eks. papir eller andet fibr0st materiale, kan sâdanne lag hol-des i laminær forbindelse med hverandre ved hjælp af ad-hæsiver, der tillader passage af væske mellem lagene.

35 Ved fremstilling af sammenhængende analyseelementer under 0 27

DK 157328 B

anvendelse af filmdannere, kan laget eller lagene for-formes særskilt og lamineres til dannelse af det samlede élément. Materialet i filmlaget eller -lagene kan være et materiale indeholdende et plastificeringsmiddel og en 5 polymer, der er egnet til at meddele dimensionsstabilitet.

Lag fremstillet pâ denne mâde er typisk overtrukne fra opl0sning eller suspension pâ en overflade/ fra hvilken det t0rrede lag kan aftages fysisk. En bekvem metode, ved hvilken man kan undgâ problemer med flere ganges aftagning 10 og laminering, gâr imidlertid ud pâ at overtrække et be- gyndelseslag pâ en fjernelig overflade eller en underst0t-ning, ait efter 0nske, hvorpâ man overtrækker successive lag direkte pâ de allerede ved overtrækning pâf0rte lag.

En sâdan overtrækning kan udf0res manuelt under anvendelse 15 af et Gvertrækningsorgan i form af et blad eller maskinelt ved sâdanne metoder som dyppe- eller perleovertrækning.

Hvis der anvendes maskinel overtrækning, er det ofte mu-ligt at overtrække tilst0dende lag samtidigt under anvendelse af vippetragtovertrækningsteknik, der er vel-20 kendt ved fremstilling af lysf01somme fotografiske film og papirer.

Overtrækspolymerlag kan anvendes som filmlagma-terialet. Filmen dannes pâ et substrat ved opl0sning af en polymer i en blanding af to væsker, hvoraf den ene 25 har et lavere kogepunkt og er et godt opl0sningsmiddel for den polymère, og hvoraf den anden har et h0jere kogepunkt og er et ikke-opl0sningsmiddel eller i ait fald et dârligt opl0sningsmiddel for den polymère. En sâdan poly-meropl0sning overtrækkes derpâ pâ substratet og t0rres 30 under regulerede betingelser. Opl0sningsmidlet med det lavere kogepunkt fordamper lettere, og overtrækket bliver beriget med den væske, der er et dârligt opl0sningsmiddel eller et ikke-opl0sningsmiddel. Nâr fordampningen skrider frem, dannes den polymère som et por0st lag under de rette 35 betingelser. Der kan anvendes mange forskellige polymère, alene eller i kombination, til fremstilling af por0se over- 0 28

DK 157328 B

trækspolymerlag til anvendelse ved opfindelsen. Typiske eksempler er polycarbonater, polyamider, polyurethaner og celluloseestere sâsom celluloseacetat. Til lag sâsom de, der indeholder et mærket konjugat eller andet rea-5 gens, kan der fremstilles en overtrækningsopl0sning eller -dispersion omfattende matrixen og inkorporerede aktive materialer, hvorpâ der overtrækkes som foran omtalt og t0rres til dannelse af et dimensionsstabilt lag.

Tykkelsen af ethvert lag. og dets grad af per-10 meabilitet kan variere i udstrakt grad og afhænger af den faktiske anvendelse. T0rre tykkelser pâ fra ca. 5 yum til ca. 100 pm har været bekvemme, sk0nt en mere bredt va-rierende tykkelse kan være at foretrække under visse om-stændigheder. Hvis der f.eks. kræves forholdsvis store 15 mængder af interaktivt materiale, f.eks. polymère mate-rialer sâsom enzymer, kan det være 0nskeligt at frem-stille lidt tykkere lag.

Det kan ogsâ være 0nskeligt i et bærermateriale at inkludere et eller flere reflekterende lag, eventuelt 20 absorberende, til detektering af strâling, f.eks. til let- telse af signaldetektering ved reflektionsradiometri, f.eks. reflektionsfotometri eller en lignende teknik. En sâdan reflektor kan tilvejebringes ved hjælp af et af de oven-for beskrevne lag, eller den kan tilvejebringes ved hjælp 95 af et yderligere lag, der ikke beh0ver at hâve en yder- ligere funktion i elementet. Reflekterende pigmenter, f.eks. titandioxid og bariumsulfat, kan med fordel anven- des i et reflekterende lag. Overtrækspolymere kan ogsâ udg0re et egnet reflekterende materiale. I en foretrukken udf0relsesform kan der i overtrækspolymerlag ogsâ være inkorporeret et pigment til for0gelse af reflektivitet eller andre funktioner. Den mængde pigment, der kan in- kluderes i et lag sammen med en overtrækspolymer, er i h0j grad variabel, og mængder pâ fra ca. 1 til ca. 10 vægt-35 dele pigment pr. vægtdel overtrækspolymer foretrækkes, idet fra ca. 3 til ca. 6 dele pigment pr. del overtrækspolymer specielt foretrækkes.

29

DK 157328 B

0

Det kan være fordelagtigt at inkorporere ét eller flere overfladeaktive materialer, f.eks. anioniske og ikke-ioniske overfladeaktive materialer, i lagene af bærermaterialet. Disse materialer kan f.eks. for0ge over-5 træksevnen for lagsammensætninger og for0ge omfanget og graden af befugtning i lag, som ikke let fugtes af fly-dende pr0ver i fraværelse af et hjælpemiddel sâsom et overfladeaktivt middel. I lag af bæreren kan det ogsâ være 0nskeligt at inkludere materialer, der ved kemisk 10 reaktion eller pâ anden mâde kan g0re materialer, der er potentielt 0delæggende for den valgte analyse, inaktive ved denne analyse.

Som tidligere nævnt kan de intégrale analytiske elementer være selvunderst0ttende eller overtrukket pâ en 15 underst0tning. Denne kan være opak eller transparent for lys eller anden form for energi. En til et vilkârligt, be-stemt bærermateriale valgt underst0tning skal være forene-lig med den tilsigtede metode til signal-detektering. Fo-retrukne underst0tninger omfatter transparente underst0t-20 ningsmaterialer, der kan transmittere elektromagnetisk strâling med en b01gelængde i omrâdet mellem ca. 200 nm og ca. 900 nm. Underst0tningen beh0ver naturligvis ikke at transmittere over hele omrâdet fra 200 til 900 nm, om-end det til fluorometrisk detektering af analytiske re-25 sultater gennem underst0tningen er 0nskeligt, at under- st0tningen transmitterer over et bredere omrâde eller al-ternativt transmitterer ved absorptions- og emissions-spektrene for de fluorescerende materialer, der anvendes til detektering. Det kan ogsâ være 0nskeligt at hâve en 30 underst0tning, der transmitterer ét eller flere snævre b0lgelængdebând og er opakt for tilst0dende b0lgelængde-bând. Dette kan f.eks. opnâs ved imprægnering eller over-trækning af underst0tningen med ét eller flere farvnings- midler, der har passende absorptionskarakteristika.

35 30

DK 157328 B

0 I det f01gende beskrives nogle foretrukne udf0rel-sesformer for fremstillingen af det omhandlede testmateriale.

Multi-imprægneringsmetode 5 Et lag af bærermateriale imprægneres med en f0rste opl0sning eller suspension af reagenser i et f0rste opl0sningsmiddel og t0rres. Derpâ imprægneres bærermate-rialet med en anden opl0sning eller suspension af de re-sterende reagenser i et andet oplçôsningsmiddel, der hindrer 10 interaktion med reagenser imprægneret med det f0rste opl0s-ningsmiddel, og der t0rres. Pâ denne mâde er reagenserne i de respektive opl0sninger ude af stand til væsentlig interaktion under fremstillingen af testmaterialet og re-agerer sâledes ikke i utide. I en anden foretrukken udf0-15 relsesform inkorporeres visse f0rste reagenser i et lag af bærermateriale under anvendelse af en vandig dyppeme-tode. Et egnet organisk opl0sningsmiddel anvendes til de resterende reagenser, f.eks. toluen, acetone, chloroform, methylenchlorid, n-propanol eller ethylendichlorid. Dette 20 lag hærdes derved, at man lader det organiske opl0snings-middel fordampe. Yderligere enkeltheder findes i de f0l-gende eksempler.

Multilagselement 25 Et multilagselement fremstilles ved inkorporering af et f0rste eller overliggende lag med nogle, men mindre end aile reagenserne i det specifikt anvendte bindings-bestemmelsessystem, inkorporering af et andet eller under-liggende lag med de resterende reagenser, hærdning, f.eks.

30 ved t0rring, af de individuelle lag og fiksering af disse i laminar forbindelse med hverandre. Nâr der anvendes ab-sorberende bærermaterialer, fremstilles disse elementer ved imprægnering af individuelle lag og t0rring af de sâledes imprægnerede lag.

35 0 31

DK 157328 B

Det f0rste lag og det andet lag har hvert et par modstâende overflader. Ën overflade af det f0rste lag er i laminar forbindelse med ën overflade af det andet lag, og pr0ve pâf0res til den anden overflade af 5 hvert af de to lag. Angivelsen af en laminar forbindelse indebærer, at et fluidum, flydende eller gasformigt, kan passere mellem over hinanden anbragte overflader af sâ-danne lag. Sâdanne lag kan være i umiddelbar forbindelse eller adskilt ved mellemliggende lag. Ethvert mellemlig-10 gende lag b0r ikke hindre passage mellem aile lagene.

Fryset0rringsmetode

Denne metode bestâr i en procedure til inkorpo-rering og hindring af reaktion mellem inkompatible rea-15 genser i et enkeltlags-analytisk element. Nâr der f.eks. anvendes absorberende bærermaterialer, inkorporeres en f0rste gruppe af reagenser i lagmaterialet ved forh0jet temperatur (eller alternativt ved fryset0rring), og det behandlede lag hærdes. Den anden gruppe reagenser, der 20 indeholder ethvert reagens, som under omgivelsernes be-tingelser vil reagere med den f0rste gruppe, pâf0res, og elementet fryses hurtigt. Frysningen hindrer reaktion i utide, og den f0lgende fjernelse af vand ved fryset0rring hindrer reaktion i utide, nâr laget f0rs tilbage til 25 stuetemperatur.

I den foretrukne udf0relsesform kan en gruppe af reagenser sættes i vandig opl0sning til et lag og t0rres. Tilsætningen af en anden gruppe af reagenser i vandig opl0sning efterf01ges af hurtig frysning og derpâ 30 fryset0rring til fjernelse af vand. Denne fremgangsmâde tillader inkorporeringen af og hindrer interaktionen mellem nogle reagenser, der kun er vandopl0selige. Desuden und-gâs herved anvendelsen af organiske opl0sningsmidler, af hvilke visse kan reagere pâ generende mâde med nogle rea-35 genser, f.eks. enzymer.

32

DK 157328 B

0

Fremgangsmâden tillader fremstilling af elemen-ter under anvendelse af homogène specifikke bindingsbe-stemmelsesreagenser, idet aile reagenser tilvejebringes inden i et enkelt lagelement.

5

Reversibel kompleksdannelsesmetode

Konkurrence mellem pr0ve-ligand og mærket ligand om binding til en bindingspartner (her eksemplificeret ved et antistof - "Ab") kan sammenfattes ved hjælp af 10 ligningen:

Ligand + Ab:ligand Mærket ligand ---------------------^ + 15 + Ab: mærket ligand

Ab I det ovenfor illustrerede System holdes anti-stoffet og den mærkede ligand adskilt, indtil pr0ven ind- 20 f0res. Denne udf0relsesform for den beskrevne opfindelse g0r brug af den omvendte reaktion og genækvilibrering med liganden som vist ved f01gende ligning:

Ligand Ab:ligand 25 + 1« ' ' TTg +

Ab:mærket ligand mærket ligand hvor mængden af fortrængt mærket ligand er relateret til koncentrationen af pr0ve-liganden. Fordelen er, at aile 30 reagensbestanddele kan kombineres i et inkorporerings- medium til tilvejebringelse af et System, der kun kræver tilsætning af den pr0ve, der skal unders0ges.

Analytiske elementer fremstilles ved inkubering af et givet konjugat med dets respektive antisera i kort tid, f.eks. 15 minutter. Derpâ tilsættes eventuelt yder- qe 0 33

DK 157328 B

ligere recenser, og systemet fâr lov at inkubere i et yderligere tidsrum. Den sâledes dannede opl0sning im-prægneres ind i eller inkorporeres pâ anden mâde iet lag af bærermateriale, som dernæst fâr lov at hærde.

5

Detekterbart respons

Som tidligere omtalt giver mange af de i den seneste tid udformede homogène specifikke bindingsbe-stemmelsessystemer (eller kan let tilpasses til at give) 10 et detekterbart respons sâsom en farveændring, kemolumi-niscens eller fluorescens relateret til nærværelsen eller mængden af den ligand, der bestemmes i den flydende pr0ve.

Den her benyttede betegnelse "detekterbare ma-15 terialer" eller lignende udtryk refererer til atomer, kemiske grupper, dvs. en del af et molekyle, eller ke-miske forbindelser, som selv direkte eller indirekte er detekterbare, og udtrykket "detekterbart respons" og lignende udtryk refererer til den detekterbare manifesta-20 tion af tilstedeværelsen af det detekterbare materiale. Eksempler er elektromagnetiske strâlingssignaler sâsom fluorescens, phosphoroscens, kemoluminiscens, en ændring i lysabsorption, eller reflektans i det synlige spektrum, hvorved der 'frembringes en synlig farveændring, en ændring 25 i lysabsorption eller reflektans udenfor det synlige om-râde, f.eks. det ultraviolette eller infrar0de omrâde.

Som det vil være klart for enhver fagmand med hensyn til immunobestemmelser, skal udtrykket "detekterbart respons" som her anvendt opfattes i dets bredeste forstand. For-30 uden elektromagnetiske strâlingssignaler skal "detekterbart respons" ogsâ omfatte enhver observerbar ændring i en synsparameter, f.eks. en ændring i eller fremkomst af en reaktant, observerbar fældning af en vilkârlig be-standdel i testpr0ven, eller en ændring i enhver anden 35 parameter, sâvel i immunobestemmelsessystemet.som i test- 34

DK 157328 B

0 pr0ven. Sâdanne andre former for detekterbart respons omfatter elektrokemisk respons og kalorimetrisk respons. Endvidere er det detekterbare respons et sâdant, der kan observeres gennem'sanserne direkte eller ved hjælp af hjælpe-detek-5 teringsmidler, f.eks. et spektrofotometer, udstyr med f01somhed for ultraviolet lys, et fluorometer, et spektro-fluorometer, et pH-meter eller en anden form for sensor.

Det er 0nskeligt, at en sâdan detekterbarhed bekvemt kan udstrækkes til den fulde mængde af detekterbart materiale 10 uden pâvirkning af mængden af diffusibelt prodükt, der er et résultat af de analyt-interaktioner, som er basis for den tilsigtede analyse.

Efter at det analytiske résultat er opnâet i form af en detekterbar ændring, mâles det, almindeligvis ved at 15 lede testelementet gennem en zone, i hvilken der findes egnet apparatur til mâling af reflektion, transmission eller fluorescensfotometri. Et sâdant apparatur tjener til at dirigere en strâle af energi, f.eks. lys, gennem understçôtningen, i ën udf0relsesform. Lyset reflekteres 20 derpâ fra elementet tilbage til et detekteringsorgan eller passerer gennem elementet til en detektor i tilfælde af transmissions-detektering. Anvendelsen af spektrofoto-metri kan være fordelagtig i nogle situationer, fordi man herved effektivt undgâr optisk interferens fra even-25 tuelle rester, f.eks. blodceller eller urinsediment, der er blevet efterladt pâ eller i lagene i elementet, eller fra atypiske urinfarver. Om 0nsket kan der ogsâ anvendes konventionelle fluorescens-spektrofotometriske metoder.

Endvidere kan der anvendes transmissionsmetoder til de-30 tektering og kvantitativ mâling af de indikerende reak-tionsprodukter ved reaktion med en str0m af strâlings-energi, f.eks. ultraviolet, synlig eller infrar0d strâ-ling ved en overflade af elementet og mâling af udstr0m- 35 35

DK 157328 B

0 ningen af denne energi fra elementets modstâende over-flade. Generelt har elektromagnetisk strâling i omrâdet fra ca. 200 til ca. 900 nm vist sig nyttig til sâdanne mâlinger, omend· enhver strâling, for hvilken elementet 5 er permeabel, og som er i stand til at resultere i en kvantitativ mâling af det i elementet dannede produkt, kan anvendes. Der kan anvendes forskellige kaliberings-metoder til tilvejebringelse af en kontrol af analysen. Eksempelvis kan en pr0ve af en standardopl0sning af den 10 ligand, der analyseres for, pâf0res op til det areal, hvor drâben af pr0ven anbringes, hvorved det bliver muligt at anvende différentielle mâlinger i analysen.

Eksempler 15 I de f0lgende eksempler beskrives der fors0g, der er udf0rt i forbindelse med udviklingen af opfindelsen. Eksemplerne illustrerer foretrukne udf0relsesformer., 20 A. Immunobestemmelses-testmaterialer mærket med prosthetisk gruppe

Eksempel 1 25 Model System

Der er eksperimentelt blevet udviklet et model-system til studium af forskellige paramétré for inkorpo-rering af det med en prosthetisk gruppe mærkede homogène immunobestemmelsesreagenssystem, der er beskrevet i bri-30 tisk patentskrift nr. 2.023.607, i et t0rt testmateriale.

Den ligand, for hvilken modelsystemet giver respons, er 35 Ο

DK 157328B

36 N-(2,4-dinitrophenyl)- £-aminocapronsyre (DNP). Reagen-ser omfattende de immunokemiske bestanddele af systemet omfatter antistof til DNP, et konjugat af DNP og flavin--adenin-dinucleotid (DNP-FAD) og apoglucoseoxidase.

5 Systemet er udformet til at give respons pâ DNP ved fremkomst af farve pâ grund af aktiveringen af apoglucoseoxidase med DNP-FAD-konjugatet. DNP-FAD, som ikke bliver bundet af antistof, er direkte proportional med DNP-koncentrationen. Det er détekterbart pâ grund af 10 dets evne til at kombinere med apoglucoseoxidase til dannelse af aktivt glucoseoxidase-enzym. Respons-syste-met omfatter sâledes ud over apoenzym, antistof og konjugat et glucoseoxidase-detekteringssystem indeholdende glucose, 3,3',5,5’-tetramethylbenzidin (TMB) og peber-15 rodsoxidase. Ved aktivering af apoenzymet til glucose-oxidase fremkommer der en blâ farve pâ grund af oxida-tionen af glucose til hydrogenperoxid og pâf0lgende om-dannelse af TMB til dets blâ, oxiderede tilstand i nær-værelse af peroxidase.

20 1. Fremstilling af apoenzym

Apoenzym fremstilles ud fra en pr0ve af h0jt-renset glucoseoxidase fra Miles Laboratories, Inc. (Kata-log nr. 31-619). 10,5 ml af denne enzymopl0sning (1000 25 enheder pr. ml) blandes i et bægerglas med 4,5 ml glycerol, og blandingen afk01es til en temperatur pâ 0-4°C. Blan-dingens pH-værdi sænkes, idet der anvendes en 10%'s vandig opl0sning af svovlsyre, indtil der nâs en pH-værdi pâ 1,4. Denne procedure gennemf0res under konstant omr0ring med 30 bægerglasset nedsænket i et isbad, og omr0ringen fortsæt-tes i 2 timer. Derefter hældes opl0sningen ud over en 1,5 x 43 cm-kolonne af Sephadex^G-50 (medium)-tværbundet gel-filtreringsmedium. Sephadex® -mediet er inden indf0relsen af enzymopl0sningen blevet ækvilibreret med en 30 rum-35 fangsprocents vandig glycerolopl0sning med en pH-værdi pâ 37

DK 157328 B

0 1,4. Efter indf0ringen af enzymopl0sningen i SephadesP^--kolonnen anvendes der mere af den 30%'s glycerolopl0s-ning til eluering af apoenzym. Den udstr0mmende væske (effluenten) adskilles i fraktioner og iagttages under 5 anvendelse af UV-absorbans ved 280 nm. De fraktioner, der har absorbans ved denne b01gelængde, kombineres med en pufferopl0sning indeholdende 50 mg aktiveret trækul og 25 mg dextran (Pharmacia Company No. T-70). Pufferen indeholder en vandig opl0sning, der er 1 molær med hen-10 syn til tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, hvortil der sættes glutaminsyre, indtil der nâs en pH-værdi pâ 7,0. pH-værdien af den resulterende effluentopl0sning genind-stilles derpâ pâ 7 under anvendelse af en mættet opl0s-ning af tris-(hydroxymethyl)-aminomethan. Denne endelige 15 opl0sning omr0res i et isbad i 1 time. Apoenzymopl0snin-gen centrifugeres derpâ, og den ovenstâende væske fil-treres gennem 0,5 fxm og 0,22 jm filtre fra Millipore Corporation.

20 2. Fremstilling af DNP-FAD-konjugat g

Konjugatet fremstilles som f01ger. N -(trifluor-acetamidohexyl)-adenosin-5'-monophosphat syntetiseres ved metoden if01ge Trayer et al, Biochem. J., 139, 609-623 g (1974). 57 mg N -(trifluoracetamidohexyl)-adenosin-5'-25 -monophosphat (0,1 mmôl) opl0ses i ca. 10 ml vand, og der tilsættes 25 jil tri-n-butylamin (0,1 mmol). Vandet fjernes under vakuum, og remanensen opl0ses i 10 ml t0rt dimethylformamid, som derefter fjernes under vakuum. Remanensen inddampes fra t0rt dimethylformamid yderligere 30 tre gange. Den endelige remanens opl0ses i 10 ml t0rt dimethylformamid. 80 mg N,N'-carbonyldiimidazol (0,5 mmol) tilsættes, og opl0sningsmidlet fjernes under vakuum. Re- g manensen af N -(trifluoracetamidohexyl)-adenosin-5'-mono-phosphat-imidazolid opl0ses i 10 ml dimethylformamid.

35 0 38

DK 157328 B

47 mg riboflavin-51-monophosphat (0,1 mmol), renset ved metoden if0lge Johnson et al, Anal. Biochem., 86, 526-530 (1978), opl0ses i ca. 10 ml vand og sættes drâbevis til 20 ml acetone indeholdende 43 ^il tri-n-octyl-5 amin (0,1 mmol). Der dannes en fældning, inden tilsætnin-gen er fuldstændig. Opl0sningsmidlet fjernes med en rotations fordamper, indtil riboflavin-5'-monophosphatet er opl0st. Der tilsættes derpâ 5 ml acetone og 5-10 ml di-methylformamid, og blandingen inddampes til t0rhed. Rema-10 nensen opl0ses i 15-20 ml t0rt dimethylformamid, og der inddampes til t0rhed. Denne procedure gentages tre gange. Remanensen opl0ses i 5 ml dimethylformamid og kombineres med den ovennævnte 10 ml opl0sning af imidazolidet i dimethylformamid. Reaktionsblandingen henstilles ved stue-15 temperatur natten over, hvorpâ opl0sningsmidlet fjernes.

Remanensen optages i 50 ml vand og tilf0res en 2,5 x 25 cm kolonne af DEÂE-cellulose (Whatman DE 23, Whatman, Inc., Clifton, New Jersey) pâ bicarbonatformen. Chromatogrammet fremkaldes med en lineær gradient frembragt med 2 liter 20 vand og 2 liter 0,3 M ammoniumbicarbonat (der opsamles fraktioner pâ 23 ml). Tyndtlagschromatografi pâ silicagel 60 F254 (E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland) under anven-delse af en blanding af éthanol og 1 M triethylammonium--bicarbonat med pH=7,8 (i rumfangsforholdet 7:3) viser, 25 at fraktioner med numrene 68-73 indeholder hovedkompo-nent (R^=0,75) og mindre, gule komponenter (R^=0,36).

Disse fraktioner slâs sammen, og det optiske adsorptions-spektrum har maksima ved 267 nm, 373 nm og 450 nm.

Opl0sningsmidlet fjernes fra de nævnte, samlede 30 fraktioner, og remanensen opl0ses i ca. 5 ml vand. Den fremkomne opl0sning indstilles pâ pH=ll,0 med 5 M NaOH og henstilles ved stuetemperatur i 9 timer. Tyndtlagschromatograf i viser, at komponenten med R^=0,75 forsvin-der, medens der viser sig et nyt, gult materiale med 35 Rf=0,37. Reaktionsblandingen indstilles pâ pH 8,0 med 0 39

DK 157328 B

saltsyre og sættes til en kolonne (2,5 x 20 cm) af DEAE--cellulose pâ bicarbonatformen. Chromatogrammet frem-kaldes med en lineær gradient ved hjælp af 1 liter vand og 1 liter 0,2 M ammoniumbicarbonat. Den gule effluent 5 fra kolonnen samles, og opl0sningsmidlet fjernes. Rema-nensen adsorberes pâ 2 g silicagel, der er anbragt pâ toppen af en 50 g-kolonne af silicagel ækvilibreret med en blanding af éthanol og 1 M triethylammonium-bicarbonat i rumfangsforholdet 8:2 og med pH.=7,8. Chromatogrammet 10 fremkaldes med det samme opl0sningsmiddel, den gule kom-ponent med R,.=0,37 opsamles, og opl0sningsmidlet fjernes.

i 6

Udbyttet af flavin-N-6-N-aminohexyladenin-dinucleotid g (i det f0lgende kaldet N -(aminohexyl)-FAD), beregnet pâ basis af absorbansen ved 450 nm, er ca. 10%.

15 Til 10 ml 0,21 M vandig natriumbicarbonatopl0s- g ning indeholdende 0,06 mmol N -(aminohexyl)-FAD sættes der drâbevis 17 jil 2,4-dinitro-fluorbenzen (0,13 mmol) i 1 ml absolut éthanol under omr0ring. Reaktionsblandingen omr0res i m0rke i 4-6 timer, hvorpâ der tilsættes 10 jil 20 2,4-dinitro-fluorbenzen (0,08 mmol), opl0st i 0,5 ml éthanol. Reaktionsblandingen omr0res natten over. Tyndtlags-chromatografi pâ silicagel (Silicagel 60, F-254, E.Merck) under anvendelse af en blanding af éthanol og triethyl-ammoniumbicarbonat (pH 7,5, rumfangsforhold 7:3) som op-25 I0sningsmiddel viser, at det anvendte N^-(aminohexyl)-FAD har reageret fuldstændigt.

Reaktionsblandingen filtreres gennem Whatman nr.

1 papir, ogfiltratet sættes til en 2,5 x 56 cm kolonne (s) af Sephadex LH-20, der er ækvilibreret med 0,3 M ammonium- 30 bicarbonat. Chromatogrammet fremkaldes med dette opl0s- ningsmiddel, og flere gule materialer elueres som sær- skilte toppe. Den top, der elueres mellem 470 og 590 ml 0,3 M ammoniumbicarbonat, er den eneste, der aktiverer apoglucoseoxidase. Ved tyndtlagschromatografi som ovenfor 35 beskrevet opdeles dette materiale i to gule, fluorescerende pletter med R^=0,84 og 0,89. Det optiske absorptionsspek-trum har maksima ved 265, 370 og 455 nm.

O

40

DK 157328 B

En pr0ve af produktet fâr lov at reagere med et slangegift-phosphodiesterase-præparat (Croteus adamatoces) fra Worthington Biochemical Corp. Tyndtlagschromatografi viser, at reaktionsprodukterne er riboflavin-5'-monophos- g 5 phat og N-^^-dinitrophenyl-aminohexylJ-adenosin-S'--monophosphat. Det er âbenbart ud fra intensitéterne af pletterne, at pletten med Rf=0,84 er det materiale, der ford0jes af enzymet. Ford0jelsen er ikke fuldstændig efter tre dage.

10 3. Fremstilling af testmateriale

Materialet fremstilles ved inkorporering af be-standdelene i en papirbærermatrix ved en procès med to neddypninger. Den f0rste imprægnerings-neddypning udf0res 15 med en acetoneopl0sning, der er gjort 2mM med hensyn til TMB. Stykker af Eaton & Dikeman 205 filtrerpapir med st0r-relsen 4 x 4 cm dyppes ned i TMB-opl0sningen (f0rste ned-dypning), fjernes og t0rres i en ovn med forceret luft-t0rring ved 90°C i 1-2 minutter.

20 En anden neddypningsopl0sning fremstilles ved at kombinere de f01gende bestanddele i den anf0rte rækkef01ge:

Vandig puffer (pH=6,4)* 0,4 ml

Glucose (1 M) 0,2 ml 25 Peberrods-peroxidase (153 enheder/mg; 1,25 mg/ml) 0,2 ml

Polyvinyl-alkohol (Monsanto 20-30? 10 gm/100 ml vand) 0,2 ml on

Okseserumalbumin (Miles Laboratories, Inc.j 20 mg/ml vand) 0,05 ml

Apoglucoseoxidase (0,5 nanomol FAD-bindings-35 steder/ml) 0,4 ml

Delvis renset antistof for DNP 0,56 ml 0 41

DK 157328 B

Pufferen indeholder en vandig opl0sning af 10,8 g tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 9,7 g glutaminsyre og 1,6 citronsyre pr. 100 ml opl0sning.

jkjk

Delvis renset antistof fremstilles ud fra et 5 DNP-antiserum fra Miles Laboratories, Inc.. Immunoglo- bulinfraktionen isoleres ved fældning med aramoniumsulfat som beskrevet af Livingston i "Methods of Enzymology",

Vol. XXXIV, W.B. Jakoby and M. Wilchek, 3 ds., p. 725,

Academie Press, New York, 1974. Den endelige fældning 10 fra denne procedure opl0ses i 50 mM kaliumphosphat (pH

6,8) for at bringe det samlede rumfang op til det oprin-delige rumfang af anvendt sérum. Denne opl0sning dialy-seres natten over ved 4°C mod 500 rumfang af den samme puffer (50 mM kaliumphosphat).

15 Inden anvendelsen i det foreliggende fors0g dia- lyseres apoenzymopl0sningen som ovenfor fremstillet mod 20 mM tris-glutamat-puffer ved en pH-værdi pâ 7,0, hvil-ken puffer indeholder 10 vægt-% mannitol.

Den anden neddypningsopl0sning anvendes derpâ 20 til imprægnering af de papirer, der forinden er blevet imprægneret med TMB. De TMB-bærende papirer dyppes i den anden neddypningsopl0snîng, fjernes igen og t0rres i en ovn med forceret luftt0rring ved 90°C i 6 minutter.

Der fremstilles testmaterialer med 0,5 x 0,5 25 cm af det t0rrede papir monteret ved den ene ende af bi-aksialt orienterede polystyrenstrimler, der mâler ca.

0,5 x 8,3 cm. Monteringen udf0res ved anvendelse af et dobbeltsidet adhæsivt tape, der kan fâs fra 3M Company og kendes som Double-Stick^ 30 Reagenssystemet fuldstændigg0res ved at bringe reagensmaterialet som ovenfor fremstillet i kontakt med vandige opl0sninger, der er gjort 1 pM med hensyn til DNP-FAD-konjugat. Aile de opl0sninger, der anvendes til afpr0vning af materialerne, indeholder den nævnte mængde 35 konjugat og enten intet eller varierende mængder af li- ganden, DNP. Der fremstilles sâledes fire testopl0sninger som f01ger: 42

DK 157328 B

0

Testopl0sning Indhold

1 1 jüM DNP-FAD

2 1 pM DNP-FAD og 1 pR DNP-caproat .3 1 pR DNP-FAD og 4 pR DNP-caproat 5 4 1 ^iM DNP-FAD og IO^iM DNP-caproat.

4. Effektivitetsbed0romelse

Ved unders0gelse af effektiviteten af testmateri-alerne fugtes hvert af disse med 15 yul af en af de oven-10 nævnte testopl0sninger. Efter kontakt med testopl0sningen inkuberes hvert materiale i 6 minutter i en tildækket petri-skâl med et fugtet stykke filtrerpapir i bunden. Denne skâl tjener som et fugtigt kammer.

Effektiviteten af de som.ovenfor angivet fremstil-15 lede og inkuberede reagensmaterialer analyseres under an-vendelse af et instrument kendt som en "Rapid Scanner".

Dette instrument er et scanner-reflektans-spektrofotome-ter kombineret med en PDP-12-computer fra Digital Equip-ment Corporation. Instrumentet anvendes til hurtig mâling 20 af reflektansspektre i det synlige omrâde. Computeren til-lader opmagasinering af spektraldata og beregninger. Mâ-linger af effektiviteten af reagensstrimler i Rapid Scanner' en har f0lgende fordele i forhold til visuelle ob-servationer af de samme materialer: 25 1. Lyskilden og betingelserne omkring pr0ven fôr- bliver fikseret. Ved visuelle.aflæsninger kan lyskilden variere, ikke blot med hensyn til b01gelængde-bestanddele, men ogsâ i relation til anbringelsen af de strimler, der observeres.

30 2. Detektor-karakteristika forbliver fikseret i

Rapid Scanner'en. Ved visuel iagttagelse varierer detek-toren (dvs. i den iagttagende persons 0jne) fra person til person og med samme person fra dag til dag.

35 43

DK 157328 B

0 3. Rapid Scanner'en tillader mere præcis kvan-tisering af data end menneskelig iagttagelse, og den tillader sanimenligninger mellem resultaterne pâ en mere ob-jektiv mâde end ved visuel iagttagelse.

5 Rapid-Scanner-instrumentet er konstrueret af

Ames Company Division of Miles Laboratories, Inc., Elk-hart, Indiana, USA, hvorfra fuldstændig information med hensyn til strukturelle egenskaber og effektivitet kan fâs.

10 Testmaterialer, der er blevet inokuleret med de fire opl0sninger, analyseres under anvendelse af Rapid Scanner'en. Spektre, der fâs ved denne analyse, illu-streres i figur 1 pâ tegningen. De fire kurver i figur 1 repræsenterer procent reflektans versus b01gelængde.

15 særiig interesse er effektiviteten af strimlerne ved 660 nm, den maksimale absorptionsb01gelængde i det blâ farveomrâde for oxideret TMB. Procenten af reflektans formindskes med stigende ligandkoncentration, hvilket viser effektiviteten af materialet til kvantitativ ana- 20 lyse af opl0sninger med varierende koncentrationer af DNP-caproat. Endvidere er forskellene i farve med hensyn til hver af ligandopl0sningerne stor nok til opnâelse af visuel korrelation mellem farven af testmaterialet og koncentrationen af liganden.

25 Dette fors0g viser, at antistof og apoenzym kan konkurrere samtidigt om det respektive konjugat, i dette tilfaelde DNP-FAD, uden en ordnet sekvens for reagenstil-sætning. Endvidere viser fors0get, at det er praktisk muligt at blande og opbevare reagenserne i et immunoke- 30 misk bestemmelsessystem i lang tid inden tidspunktet for den faktiske udf0relse af bestemmelsen.

35 0 44

DK 157328 B

Eksempel 2

En immunobestemmelses-testmateriale-enhed

Der udf0res et eksperiment, ved hvilket der g0res et fors0g pâ at forbedre modelsystemet if01ge 5 eksempel 1 ved inkorporering af konjugatet direkte i bærerelementet inden udf0relsen af bestemmelsen, hvor-ved der tilvejebringes et homogent immunobestemmelses--testmateriale med enhedskarakter.

Et stykke Buckeye S-22 papir med mâlene 3,75 x 10 6,25 cm neddyppes i en f0rste neddypningsopl0sning af 5 mM TMB i acetone indeholdende 0,1 g pr. 100 ml af et emulgeringsmiddel (GAF ON-870 fra General Aniline & Film Corp.)· Denne sidstnævnte bestanddel af neddypningsopl0s-ningen er en polyethylenoxidpolymer, hvis terminale ender 15 er afsluttet med en langkædet fedtalkohol. Molforholdet mellem ethylenoxid og fedtalkohol indeholdende den polymère er 30il. Papiret t0rres derpâ ved 50°C i 1 minut.

Efter t0rring neddyppes papiret i en anden ned-dypningsopl0sning, der fremstilles ved kombination af 20 f0lgende bestanddele:

Vandig puffer (IM tris-glutamat, pH=6,3) 0,4 ml

Glucose (1,0 m) 0,2 ml 25

Peberrodsperoxidase (153 enheder/mg, 1,25 mg/ml) 0,2 ml

Polyvinylalkohol (Monsanto 20-30; 10 g/100 ml vand 0,2 ml

Okseserumalbumin 30 (Miles Laboratories, Inc.; 20 mg/ml vand) 0,05 ml

Apoglucoseoxidase (50 nanomol FAD-bindingssteder/ml) 0,08 ml

Delvist renset antistof for DNP 0,27 ml 35 (se eksempel 1)

Destilleret vand 0,6 ml 0 45

DK 157328 B

Efter t0rring ved 50°C i 12 minutter neddyppes papiret i en tredie neddypningsopl0sning fremstillet ved blanding af 250 μΐ af 80 pîA DNP-FAD-konjugat i vand med 9,75 ml n-propanol til dannelse af en neddypningsopl0s-5 ning, der er 2 yuM med hensyn til DNP-FAD. Efter den tredie imprægnering t0rres papiret ved 50°C i 4 minutter.

Der fremstilles testmaterialer med 0,5 x 0,5 cm stykker af det trelags imprægnerede papir monteret ved den ene ende af biaksialt orienterede polystyrenstrimler 10 med st0rrelsen ca. 0,5 x 8,3 cm. Monteringen udf0res under anvendelse af et dobbeltsidet adhæsivt tapemate-riale med betegnelsen Double-Stic^fra 3M Company.

Disse materialer afpr0ves for deres respons pâ forskellige koncentrationer af DNP ved dypning i de re-15 spektive opl0sninger, inkubering af de nedddyppede strim-ler i 3 minutter og analyse af strimlerne i Rapid Scanner, jfr. eksempel 1, til bestemmelse af reflektansen af lys.

De data, der fâs ved 660 nm, er angivet grafisk i figur 2, hvor K/S er afsat mod DNP-koncentrationen. K/S er define-20 ret som f0lger: K _ (1-R)2

S 2R

hvor K er en konstant, S er spredningskoefficienten for det anvendte reflekterende medium, og R er fraktionen 25 af reflektans fra teststrimlen. Denne relation er en sim-plificeret form for den velkendte Kubelka-Munk-ligning (Gustav Kortüm, "Réflectance Spectroscopy", pp. 106-111, Springer-Verlag, New York (1969)).

Resultaterne opnâet med Rapid Scanner anvendes 30 ogsâ til bed0mmelse af effektiviteten ved beregning af farvedifferensenheder (AE), der er angivet i tabel A.

Δε er en værdi, der er proportional med fremkomsten af farve som et résultat af nærværelsen af apoenzym og DNP--FAD-konjugat sammen med indikatoren, peroxidase og glu-35 cose til stede i testmaterialet. Tristimulus-værdier fra den anvendte Rapid Scanner anvendes til beregning afAE

46

DK 157328 B

0 if01ge den konvention, der er beskrevet i "Supplément No. 2 to Commission Internationale de L'Eclairage (Paris), Publication No. 15, Colorimetry, (E.-1.3.1), 1971".

5 Tabel A

DNP-caproat Δ E

(m) _ 0-1 10,5 10 1-2 3,2 2-4 4,5 4-8 5,2

Disse data viser anvendeligheden af en fuldstæn-15 dig enheds-homogen-immunobestemmelse i den faste tilstand.

Eksempel 3

Forbedret stabilitet af apoenzym i en bærermatrix - · -Eksperimentelle arbejder har været rettet mod en 20 fremgangsmâde til stabilisering af apoglucoseoxidase i en bærermatrix sâsom papir, hvorved der sikres st0rre reak-tivitet, sensitivitet og opbevaringslevetid for testmate-riàlét. Der fremstilles reagensstrimler pâ lignende mâde som i eksempel 1, men med den undtagelse, at antistoffet 25 udelades. Der anvendes et System med to neddypninger, idet stykker af Eaton & Dikeman 205 papir med mâlene 4x4 cm, imprægneret med en f0rste neddypnxngsopl0sning indehol-dende TMB og acetone, t0rres og genimprægneres med en anden neddypningsopl0sning indeholdende de 0vrige bestand-30 dele, der udg0r et reagenssystem, som er sensitivt for konjugat. Materialer fremstillet pâ denne mâde varmepâ-virkes og inokuleres med konjugat til studium af effekten af okseserumalbumin (BSA) og polyvinylalkohol (PVA) pâ stabiliteten af apoenzymet.

35 0 47

DK 157328 B

2 ml af en 2 inM opl0sning af 3,3 ' ,5,5’-tetra-methylbenzidin (TMB) i acetone anvendes til imprægnering af et 4 x 4 cm stykke af Eaton & Dikeman 205 filtrerpapir. Papiret t0rres ved 90°C i 1-2 minutter i en ovn med for-5 ceret luftgennemgang.

Der fremstilles en anden neddypningsopl0sning, der indeholder tris-glutamatcitratpuffer (pü=6,4) i en koncentration pâ 0,33 M (se eksempel 1), glucose i en koncentration pâ 0,1 M, 19 enheder pr. ml af peberrods-10 peroxidase, glucoseoxidaseapoenzym (1,3 nmol FAD-bindings- steder pr. ml), okseserumalbumln (BSA) i en mængde pâ 0,5 mg/ml og polyvinylalkohol (PVA) i en mængde pâ 10 mg/ml.

De TMB-imprægnerede papirer neddyppes derpâ momentant i den anden neddypningsopl0sning, fjernes igen og t0rres i 15 en ovn ved 90°c i ca. 7 minutter under anvendelse af for-ceret luftgennemgang.

Der fremstilles testmaterialer med st0rrelsen 0,5 x 0,5 cm af det imprægnerede og t0rrede papir monte-ret pâ enderne af biaksialt orienterede polystyrenstrimler 20 med st0rrelsen ca. 0,5 x 8,3 cm. Monteringen udf0res ved anvendelse af dobbeltsidet adhæsivt tape fra 3M Company, kendt under betegnelsen Double-Stic]^ Strimler fremstil-let pâ denne mâde opbevares sammen med silicagel-t0rrings-middel i ravfarvede flaser ved 4°C inden udsættelse for 25 varmebehandlingseksperimenter.

Strimler, der indeholder BSA og PVA, samt strimler, der ikke indeholder disse materialer, underkastes varmebehandling ved opbevaring i de tillukkede, t0rrings-middel-holdige flasker i 3 dage ved 50°C. De behandlede 30 reagensstrimlers effektivitet bed0mmes ved afpipettering af 15 jjlI aliguoter af en 4 pm DNP-FAD-opl0sning pâ under-laget og inkubering i 6 minutter i en lukket petriskâl med et fugtigt stykke filtrerpapir i bunden. De ubehand-lede strimler inokuleres som ovenfor og inkuberes i 2 mi-35 nutter. Efter inkubering analyseres strimlerne under an- 48

DK 157328 B

0 vendelse af det i eksempel 1 beskrevne Rapid Scanner-apparat. Informationen fra Rapid Scanner-apparatet udtrykkes soin farvedifferensenheder (Ae) , idet der som reference anvendes ikke-reagerede strimler, dvs. de strimler, der 5 . kun er fugtede med destilleret vand i stedet for DNP-FAD--konjugatet. Resultaterne af Rapid Scanner-analysen af de behandlede testmaterialer fremgâr af tabel B.

Tabel B

10 BSA/PVA_Ae ubehandlet_Δε behandlet intet 2,2 2,1 BSA + PVA 19,9 13,6 15 De i tabel B angivne data viser, at uden nærvæ- relsen af BSA og PVA er strimlernés respons mærkbart ned-sat, medens der ved nærværelse af BSA og PVA ses en 6,5 til 9 ganges for0gelse i farvedifferensenhederne. End-videre stabiliserer nærværelsen af BSA og PVA i materia-20 lerne pâ mærkbar mâde strimlerne mod varmepâvirkning. De i dette fors0g opnâede data viser sâledes en meget væsent-lig fordel ved anvendelse af disse stabiliserende midler ved apoenzym-baseret immunobestemmelse i den faste tilstand.

25 Eksempel· 4

Anvendelse af modelsystemet til en theophyllin-bestemmelse Der udf0res et eksperiment i et fors0g pâ at be-nytte det i eksempel 1-3 beskrevne modelsystem til en prak-tisk anvendelse med klinisk betydning, dvs. en test for 30 theophyllin. Theophyllin (1,3-dimethyl-xanthin, jfr. The

Merck Index, 9th Ed., p. 1196 (1976)) er et lægemiddel, der er nyttigt ved behandling af astma. Hos de fleste patienter ligger det terapeutiske omrâde for serumkoncen-trationen mellem 10 og 20 mikrogram pr. milliliter (ug/ml), 35 * medens toksiciteten næsten altid viser sig ved blodniveau-er pâ over 35 yag/ml. Der fremstilles et testmateriale pâ 0 49

DK 157328 B

samme mâde som i de foregâende eksempler, men med den undtagelse, at det anvendte konjugat indeholder FAD forbundet covalent med theophyllin, og det anvendte anti-stof er delvist renset antistof til theophyllin.

5 1» Konjugat-syntese

Det konjugat-molekyle, hvormed FAD er bundet covalent til theophyllin, fremstilles som f0lger: 1,3-di-methyl-1,6,7,8-tetrahydropyrido(1,2e)-£>urin-2,4,9-(3H)-10 -trion (0,9 mg eller 3,62 jamol) , fremstillet ved metoden if0lge Cook et al (Cook, C.E., Twine, M.E., Meyers, M., Amerson, E., Kepler, J.A. & Taylor, G.F., Res. Commun.

Chem. Path. Pharmacol., 13, 497-505 (1976)), sættes til 0,2 ml dimethylsulfoxid indeholdende 2,4/imol N^-(amino-15 hexyl)-FAD. Efter 4 timer tilsættes der yderligere 1,8 mg (7,3 yumol) af trionen. Opl0sningen omr0res natten over, opl0sningsmidlet fordampes under vakuum (0,1 mm Hg), og remanensen chromatograferes pâ en kolonne (2,5 x 90 cm) af Sephade;s!^jH-20 ækvilibreret med 0,3 M triethylammoni-20 umbicarbonat, pH=7,8. Det râ produkt, der elueres ved mellem 216 og 246 ml effluent, opsamles, pâf0res en 20 x 20 cm x 100 jim silicagelplade og chromatograferes under anvendelse af en blanding af éthanol og IM triethylammo-niumbicarbonat i rumfangsforholdet 8:2, pH-værdi 7,8. Det 25 bând, der indeholder det 0nskede produkt (Rf = 0,77), af-skrabes fra pladen, ekstraheres med 1 M triethylammonium-bicarbonat-puffer, pH=7,8, filtreres og koncentreres. Ende-lig rensning ved chromatografi pâ Sephade^bH-20 ækvilibreret med 0,3 M puf fer giver 1,26 jimol theophyllin-FAD 30 som bestemt ved absorbansen ved 450 nm, hvilket svarer til et udbytte pâ 53%.

Det sâledes fremstillede konjugat har den i det foregâende angivne struktur under overskriften "Mærknings-stoffer i form af enzym-prosthetiske grupper", hvor -R-L 35 har strukturen

O

50

DK 157328 B

0 HN-jf^ii-CH3 -A A0

5 I

CH3 2. Fremstilling a£ testmaterialet

Under anvendelse af theophyllin-FAD-konjugatet fremstilles der reagensstimler til bestemmelse af theo- 10 phyllin. Stykker af Bucheye S-22 papir med st0rrelsen 4 x 4 cm imprægneres med en f0rste neddypningsopl0sning indeholdende 5 mM TMB i acetone indeholdende 0,1 g pr.

100 ml af en emulgator kendt som ON-870, der markedsf0res af General Aniline and Film Corporation. Efter dypning 15 i den f0rste dyppeopl0sning t0rres det imprægnerede papir ved 50°C i 1 minut i en ovn med forceret luftgennemstr0m-ning. Efter t0rring imprægneres papiret derpâ med en anden dyppe°pl0sning. Denne anden opl0sning er en vandig opl0s-ning, der er 0,33 M med hensyn til den puffer, der er be- 20 skrevet i eksempel 1, hvorved der fas en pH-værdi pa 6,4, 0,1 M med hensyn til glucose og indeholder 19 enheder pr.

ml af peberrodsperoxidase, glucoseoxidase-apoenzym (1,0 nmol FAD-bindingssteder pr. ml), delvist renset antistof til theophyllin (0,14 ml antistof pr. ml dyppeopl0sning), 25 0,5 mg/ml af okseserumalbumin og 0,5 g polyvinylalkohol pr. 100 ml. Antiserum til theophyllin indsamles fra kani- ner, der er immuniseret med et theophyllin-immunogen-kon- jugat som beskrevet af Cook et al. i Res. Comm. Chem. Path.

Pharmacol, 13, 494-505 (1976) . Dette sérum renses partielt 30 som i eksempel 1. Efter kortvarig neddypning af de t0rre-de papirer i den anden neddypningsopl0sning udf0res der en anden t0rring ved 50°C i 12 minutter i en ovn med forceret luftgennemgang.

De dobbeltimprægnerede papirer imprægneres derpâ 35 yderligere med en tredie opl0sning indeholdende FAD-theophyl-lin-konjugat i en koncentration pâ 0,5 pM i acetone. Disse papirer t0rres dernæst ved 50°C i 1 minut i en ovn med forceret luftgennemgang.

DK 157328B

51 Ο

Der fremstilles testmaterialer med stykker pâ 0/5 x 0,5 cm af de tre gange imprægnerede papirer mon-teret pâ strimler af polystyren med mâlene 0,5 x 8,3 cm under anvendelse af dobbeltsidet adhæsiv kendt som Double--Sticfc^ra 3M Company.

Til afpr0vning af effektiviteten af de ovenfor fremstillede testmaterialer fremstilles der opl0sninger af theophyllin i vand med theophyllin-koncentrationer i omrâdet fra 0 til 8 juM. Materialerne dyppes i disse op- 10sninger, og efter en inkubationsperiode pâ 2 minutter analyseres de i den Rapid Scanner, der er beskrevet i eksempel 1. Dosis-respons-kurven er vist i figur 3, hvor K/S er afsat mod theophyllin-koncentrationen.

De pâ kurven afsatte data viser, at der er en 15 observerbar farveintensitetsændring for varierende mæng-der af theophyllin i opl0sning, og at ændringen indike-rer den bestemte theophyllin-koncentration, som fore-findes.

20

Eksempel 5

Anvendelse af modelsystemet til en phenytoin-bestemmelse

Som i eksempel 4 udf0res der et fors0g med henblik pâ tilpasning af modelsystemet if0lge eksempel 1-3 til en bestemmelse af en klinisk signifikant analyt, nemlig phe-25 nytoin. Fors0get viser egnetheden af en homogen immuno-bestemmelse under anvendelse af en mærkning med en pro-sthetisk gruppe i forbindelse med en t0r reagensstrimmel til phenytoin-detektering. Som i de foregâende eksempler tillader bærerens opbygning samtidig konkurrence mellem

OU

med prosthetisk gruppe mærket phenytoin og analyten (phe-nytoin) til binding til et antistof til phenytoin.

1. Phenytoin-FAD-konjugat syntese 35 Til 14,7 mg (40,0 jlmol) 5-(2 '-carboxybutyloxy- phenyl)-5-phenylhydantoin i 1,8 ml molekylsigte-t0rret dimethylformamid (DMF) under argon sættes der 0,10 ml 0 52

DK 157328 B

(40f0 jimol) af en 400 jiM opl0sning af isobutylchlor-formiat i DMF. Reaktionsblandingen omr0res i 1 time ved stuetemperatur. Til reaktionsblandingen sættes der en g opl0sning af 10,0 jjmol N -(aminohexyl)-FAD i 2f0 ml 5 molekylsigte-t0rret dimethylsulfoxid (DMSO), efterfulgt af 0,05 ml af en 400 jiM opl0sning af triethylamin i DMP. Blandingen omr0res i 19 timer ved stuetemperatur, fortyndes derpâ til 450 ml med vand og pâf0res en 1,5 x 30 cm kolonne af Whatman DE-52 ceilulose-anionbytterhar-10 piks (bicarbonat-form) ved hjælp af en peristaltisk pumpe. Kolonnen elueres derefter med en gradient pâ 1,5 liter vand til 1,5 liter 0,3 M vandig triethylammoniumbicarbo-nat-opl0sning. Der opsamles fraktioner pâ ca. 16 ml, idet fraktionerne 70 til 88 bestemmes som indeholdende produk-15 tet pâ basis af aktiviteten med apoglucoseoxidase. Disse fraktioner kombineres, og opl0sningens pH-værdi indstil-les pâ 7. üdbyttet bestemmes som 4,78 ^ntiol (47,8%'s ud-bytte) pâ basis af opl0sningens absorbans ved 450 nm under anvendelse af den millimolære ekstinktionskoeffi-20 cient for FAD (E^,-q=11,3) .

2. Fremstilling af testmaterialer

Testmaterialerne fremstilles ved neddypning i rækkef01ge af et stykke papir i 3 opl0sninger, der hver 25 indeholder forskellige bestanddele af et immunobestemmel-sessystem, der giver potentielt respons pâ nærværelsen af phenytoin, idet der t0rres mellem hver neddypning. Et stykke papir pâ 4 x 4 cm (S-22, Buckeye Cellulose Corp., Memphis, Tennessee) neddyppes sâledes i en 5 mM opl0sning 30 af TMB i acetone indeholdende 0,1% (vægt/rumfang) af en emulgator kendt som ON-870 fra General Aniline & Film Corp.. Efter t0rring ved 50°C i 1 minut neddyppes papiret i en anden, vandig opl0sning, der er 0,2 M med hensyn til tri-glutamat-puffer, har en pH-værdi pâ 6,4, er 0,1 35 M med hensyn til glucose og indeholder 19 enheder pr. ml 53

DK 157328 B

0 af peberrodsperoxidase, apoglucoseoxidase (1,0 nmol FAD--bindingssteder pr. ml),. 0,5 mg/ml af okseserumalbumin, 0,5 g pr. 100 ml af polyvinylalkohol (se eksempel 3) og antiphenytoinserum (0,14 ml antiserum pr. ml). Antise-5 rum fremstilles mod o-caproyldiphenylhydantoin pâ lig-nende mâde som i eksempel 4.

Efter t0rring ved 50°C i 12 minutter i en ovn med forceret luftgennemgang imprægneres papiret ved ned-dypning i en tredie opl0sning indeholdende FAD-phenytoin-10 -konjugatet (0,05 joM) i n-propanol sammen med 0,1 g Gaf-quat 734 pr. 100 ml (en polymer med vedhængende kvarter-nære aminogrupper (General Aniline & Film Corp.).

Efter t0rring ved 50°C i 3=4 minutter anvendes det imprægnerede papir til fremstilling af teststrimler 15 med et stykke pâ 0,5 x 0,5 cm af det reagensbærende papir monteret ved den ene ende af en strimmel biaksialt orien-teret polystyrenfilm med mâlene 0,5 x 8,3 cm. Monteringen udf0res ved hjælp af et dobbeltsidet .adhæsivt tape kendt som Double-Stic^Era 3M Company.

20 Til bed0mmelse af anvendeligheden af disse test- materialer med hensyn til respons pâ tilstedeværelsen af phenytoin inokuleres de med testopl0sninger indeholdende analyten i koncentrâtioner fra 0 til 8 pM, og der analyseras i Rapid Scanner 2 minutter efter inokuleringen.

25 Figur 4 viser ændringen i K/S i forhold til phenytoin-kon-centrationer pâ 0, 0,5, 1, 2, 4 og 8 ;jM i vand.

De data, der fremgâr af figur 4, viser, at test-materialet responderer godt pâ nærværelsen af phenytoin, hvilket muligg0r let bestemmelse af forskellige koncen-30 trationer af analyten.

35 54

DK 157328 B

0

Eksempel 6

Anvendelse af enheds-modelsystemet til et fluorescens-iromunobesteïnmel sestestmater iale

Der udf0res et fors0g for at unders0ge enheds-5 -modelsystemets (if01ge eksempel 2) anvendelighed til fluorescens-immunobestemmelser. Der fremstilles sâledes et testmateriale som i eksempel 2, hvori p-hydroxyphenyl--eddikesyre er anvendt i stedet for TMB. Oxidation af p-hydroxyphenyl-eddikesyre med peroxid i nærværelse af 10 peroxidase resulterer i et fluorometrisk detekterbart produkt.

Materialet fremstilles som f0lger: et stykke Buckeye S-22-papir imprægneres med en opl0sning inde-holdende: 15

Tris-glutamat-puffer (1 M, pH=6,4) 0,8 ml

Glucose (1 M vandig opl0sning) 0,4 ml

Peberrodsperoxidase 20 (153 enheder/mg, 1,25 mg/ml) 0,4 ml

Polyvinylalkohol ( 5 g/100 ml) 0,4 ml

Okseserumalbumin (20 mg/ml) 0,1 ml

Gafguat.734 (10 g/100 ml vand,.

se eksempel 5) 0,2 ml 25 Apoglucoseoxidase (40 nmol FAD- -bindingssteder/ml) 0,16 ml

Delvis renset DNP-antistof (se eksempel 1) 0,54 ml p-Hydroxypheny1-eddikesyre 30 ( 80 mM i vand) 0,04 ml

Destilleret vand 0,96 ml

Efter imprægnering t0rres papiret i en luftovn ved 50°C i 22 minutter.

35 0 55

DK 157328 B

Det t0rrede papir imprægneres med en 2 juM op-10sning af DNP-FAD-konjugat i n-propanol og t0rres ved 50°C i 5 -minutter.

Metallisk Mylar^-tape (3M Company) pâf0res den 5 ene side af det t0rrede reagenspapir. Papiret monteres pâ biaksialt orienteret polystyrenfilm under anvendelse af Double-Sticl^-adhæsiv tape pâf0rt pâ Mylai® -laget. Det fremkomne testmateriale omfatter et ca. 0,5 x ca. 1,0 cm stykke Mylar®-beklædt reagenspapir monteret pâ en poly-10 styrenstrimmel med mâlene ca. 0,5 cm x ca. 8,8 cm.

Som et kontrolmateriale til sammenligning med testmaterialet anvendes der uimprægneret papir, der pâ tilsvarende mâde er pâf0rt med Mylai® og Double-Stic]^ pâ polystyrenstrimler.

15

De fluorescerende strimler unders0ges med hensyn til deres effektivitet under anvendelse af et foto-multi-plikatorr0r. En kvartsfiberoptik anbringes i en vinkel pâ 45° i forhold til planen for det materiale, der unders0-ges. Denne fiberoptik er udstyret med en kviks01vlampe og 20 et excitations-bândpassagefilter ved 314 nm. Fluorescen-sen af et givet materiale fâs direkte fra en anden fiberoptik anbragt i en vinkel pâ 45° til planen af pr0vema-terialet og udstyret med et interferensfilter (420 nm).

Intensiteten afl0ses i millivolt under anvendelse af en 25 foto-multiplikator.

Til afpr0vning af effektiviteten af de fluorés- cerende testmaterialer afpipetteres der 30 jil aliquoter af DNP-holdige testopl0sninger pâ reagenspapirdelene, og der tillades inkubering i 11 minutter ved stuetemperatur 30 i et fugtigt kammer. DNP-testopl0sningerne varierer i koncentration fra 0 til 8 juM DNP. Fluorescens-intensite-ten mâles for 0, 1, 2, 4 og 8 |jM opl0sninger under anvendelse af foto-multiplikatorr0r-apparatet. Mâlingen gentages under anvendelse af kontrolmaterialer. Figur 5 35 viser dosis-respons-forholdet for testmaterialerne. Data 56

DK 157328 B

0 fra kontrolmaterialerne sikrer, at de i figur 5 angivne data ikke pâvirkes af nogen iboende fluorescens fra DNP--analyten.

Dette fors0g viser utvetydigt den heldige an-5 vendelse af en homogen iinmunobestemmelsesteknik under an-vendelse af fluorescens som det detekterbare respons i forbindelse med et fastfase-materiale.

B. Enzymsubstrat-markede immunobestemmelses-testmaterialer 10

Eksempel 7

Papir-multilags-element I forbindelse med det fors0g, der er beskrevet i dette eksempel, fremstilles der et intégrait multilags-ana-15 lytisk element, og dette afpr0ves for dets evne til kvan-titativ bestemmelse af nærværelsen af theophyllin i en flydende pr0ve som aflæst ved frontfladefluorometri.

Fremstilling af antiserum 20 Antiserum til theophyllin fremstilles ved en metode, der tidligere er beskrevet.

25 Fremstilling af konjugat

Galactosyl-umbelliferon-theophyllin (konjugat) fremstilles ved en metode, der tidligere er beskrevet.

30 Fremstilling af element

Den opl0sning, der anvendes til fremstilling af êt lag af det theophyllin-specifikke element, indeholder f01gende bestanddele: 35 Ο 57

DK 157328B

Bestanddel Mængde

Vand 27 jil 0,1 M Bicin-puffer (pH 8,5) .20 jil

Theophyllin-antisera 100 jil 5 0-Galactosidase (78 enheder/ml) 3 yl (Galactosidase-enhederne er defineret ± Clin. Chem., 23, 1402 (1977)).

Et 3 x 1,2 cm lag af Whatman 31 ET papir (Whatman, 10 Clifton, New Jersey) monteres ved hjælp af dobbeltsidet adhæsivt tape pâ en 8,2 x 1,2 cm polystyrenunderst0tning, hvorpâ den som ovenfor fremstillede opl0sning pipetteres ud pâ laget af Whatman 31 ET papiret. Papiret t0rres i en konvektionsovn ved 50°C i 10 minutter.

15 Der fremstilles derpâ en anden opl0sning ved op- 10sning af konjugatet i 50 pl vand til en slutkoncentra-tion pâ 14,4 ^oM for denne opl0sning. Den sâledes fremstillede opl0sning pipetteres derefter over pâ et 1,0 x 3,0 cm lag af Whatman 54 papir. Dette imprægnerede lag t0rres der-20 pâ i en konvektionsovn ved 50°C i 10 minutter.

Det andet lag fikseres derefter ved den ene kant til det f0rste ved en strimmel af dobbeltsidet adhæsivt tape.

25 Testopl0sning

Theophyllin sættes til aliquoter af 0,05 M Bicin--puffer pH=8,5, til opnâelse af endelige theophyllin-kon-centrationer pâ henholdsvis 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 og 40 mikro-gram pr. ml (^ug/ml) .

30

Analysemetode

De analyseelementer, der er fremstillet og fik-seret til underst0tningerne som beskrevet ovenfor, ind-sættes hver i en mekanisk holder, der .er egnet til verti-35 kal anbringelse af materialet i et fluorometer. Netop inden isætningen af elementet og holderen i fluorometret afpipet- 0 58

DK 157328 B

teres der en 250 p.1 aliquot af en af de soin ovenfor frem-stillede theophyllin-opl0sninger pâ den fri overflade af det konjugat-holdige lag.

Fluorometret er justeret til at tilvejebringe 5 en excitations-lyskilde med en b01gelængde pâ 405 nm, som rammer elementets overflade under en vinkel pâ 60° i forhold til normalen pâ overfladen, og det er tillige justeret til at detektere lys udsendt ved en b01gelængde pâ 450 nm. En frontoverflade-mâling af fluorescensen ud-10 f0res ved en vinkel pâ 30°C i forhold til normalen pâ overfladen.

Fluorescens-responset for hver pr0ve mâles f0rst gennem tiden (0-200 sekunder) og der foretages derpâ af-læsninger af hver ved 200 sekunder.

15

Resultater

De aflæsninger, der fâs ved denne analysemetode, er aflæsninger af relativ fluorescens. Den iagttagne relative fluorescens sammenlignes med den mængde theophyllin, 20 der er til stede i den anvendte pr0ve. Fluorescens-responset med tiden er vist i figur 6. Fluorescensen ved 200 sekunder er afsat som funktion af theophyllin-koncentra-tionen til frembringelse af theophyllin-standardkurven i figur 7.

25

Konklusion

De fremkomne data viser, at det intégrale ana-lytiske element tilvejebringer et kvantitativt detekter-bart respons pâ theophyllin-koncentrationen i hver af de 30 aliquoter, der unders0ges. Inhibering af reaktionen for- ârsages af nærværelsen af antistof til theophyllin. For-0gelse af koncentrationen af theophyllin bevirker over-vindelse af inhiberingen, hvilket resulterer i en theo-phyllin-afhængig for0gelse af dannelsen af fluorescerende 35 produkt.

0 59

DK 157328 B

Eksempel 8 Fryset0rret element I det fors0g, der beskrives i dette eksempel/ opnâs der et enkeltlagselement til theophyllin-bestem-5 melse under anvendelse af temperaturreguleringsteknik til hindring af interaktion af reagenser i utide.

Fremstilling af antiserum 10 Antiserum til theophÿllin fremstilles ved en metode, der tidligere er beskrevet. Dette antiserum fældes med vandigf ammoniumsulfat i en mængde pâ 33 mg/dl, fældningen opl0-ses i og dialyseres mod 0,05 M Bicin-puffer (pH=8,5), og der fâs et theophyllin-antistof-kpncentrat. Dette koncen-15 trat indeholder ca. 200 yumol theophyllin-bindingssteder pr. ml.

Fremstilling af konjugat

Galactosyl-umbelliferon-theaphyllin (konj ugat) 20 fremstilles ved en metodey- der tidligere er beskrevet.

Fremstilling af element

Den f0rste opl0sning, der anvendes til fremstil-25 ling af det for theophyllin specifikke enkeltlags-element, indeholder de f01gende bestanddeles

Bestanddel Mængde 0,5 M Bicin-puffer (pH=8,5) 10 pi 30 Theophyllin-antistof-koncentrat 150 jil

β-Galactosidase (88 enheder/ml) 40 jjlI

Et 0,5 x 1,0 cm lag af Whatman 31 ET papir (What- man, Inc., Clifton, New Jersey) monteres ved hjælp af 35 dobbeltsidet adhæsivt tape pâ en 8,2.x 0,5 cm polystyren-underst0tning, hvorpâ der afpipetteres 20 jil af den som 60

DK 157328 B

0 ovenfor fremstillede opl0sning pâ laget af Whatman 31 ET papir. Papiret t0rres i en konvektionsovn ved 50°C i 10 minutter og for-k01es derefter pâ t0r is i 5 minutter i et rum med lav fugtighed.

5 En 6,13 mM opl0sning af theophyllin-umbelliferon- -galactose i dimethylsulfoxid (DMSO) fortyndes til en 0,077 mM opl0sning i vand, og der pâf0res 20 jil pâ hvert af de papirlag, der er blevet behandlet soin ovenfor be-skrevet. Elementerne fryset0rres natten over.

10

Testopl0sning

Theophyllin sættes til aliguoter af 0,05 M Bicin--puffer til opnâelse af endelige theophyllin-koncentrati-oner pâ henholdsvis 0,0, 4,0, 16,0 og 40 jig/ml.

15

Analysemetode

De analyseelementer, der er fremstillet og fikse-ret til underst0tninger som ovenfor beskrevet indsættes hvert i en mekanisk beholder, der er egnet til horisontal 20 anbringelse af materialet i et reflektans-fotometer. Netop inden isætningen af elementet og holderen i reflektans-fotometer et afpipetteres der en 50 jül aliquot af en af de som ovenfor fremstillede theophyllin-opl0sninger pâ den frie overflade. Fotometeret er indstillet til at f01ge 25 ændringen i reflektans ved 400 nm.

Reflektansen af hvert element mâles f0rst over tiden (0-200 sekunder), og derpâ foretages der aflæsnin-ger ved 200 sekunder.

30 Rësultater

De data, der opnâs ved den ovenfor beskrevne me-tode, er illustreret grafisk i figur 8. Ordinat-enhederne (K/S) er defineret som i eksempel 2.

35

DK 157328B

61 Ο

Konklusion

De fremkomne data viser, at det intégrale ana-lytiske element giver et kvantitativt chromogent respons pâ theophyllin-koncentrationen i hver af de aliquoter, 5 der unders0ges.

ünder disse betingelser inhiberes reaktionen ved tilstedeværelsen af antisera, og denne inhibering overvindes progressivt ved stigende koncentrationer af theophyllin.

10

Eksempel 9

Element med flere ganges imprægnering I det fors0g, der er beskrevet i dette eksempel, fremstilles der et enkeltlags-element, og dette afpr0ves 15 for dets evne til kvantitativ bestemmelse af nærværelsen af theophyllin i en flydende pr0ve, bestemt ved frontflade--fluorometri.

Fremstilling af antiserum 20 Antiserum til theophyllin fremstilles ved ..en me- tode, der tidligere er beskrevet.

Konjugatfremstilling 25 Galactosyl-umbelliferon-theophyllin (Konjugat) frem stilles ved en metode, der tidligere er beskrevet.

Elementfremstilling 30 De opl0sninger, der anvendes til fremstilling af det for theophyllin specifikke element, indeholder f01gende bestanddele:

Vandig opl0sning 35 Bestanddel Mængde

Theophyllin-antiserum 400 pl 0,5 M Bicin-puffer, pH=8,5 160 pl

Vand 35 pl 0 62

DK 157328 B

Organisk opl0sning

Bestanddel Mængde

Methylenchlorid 1,00 ml

Konjugat (771 jM i DMSO) 4,2 μΐ 5

Et 1 x 1 cm lag af Whatman 31 ET papir lamineres pâ s0lv-Mylar (3M Co.) og monteres ved hjælp af dobbelt-sidet adhæsivt tape pâ en 8,3 x 1 cm polystyren-underst0t-ning, hvorpâ den som ovenfor fremstillede vandige opl0s-10 ning udpipetteres pâ laget af Whatman 31 ET papir. André underliggende, reflekterende lag, f.eks. sâdanne, der er s01vagtige eller opake, er ligeledes egnede. Papiret t0r-res i en konvektionsovn ved 50°C i 15 minutter. Den or-ganiske opl0sning udpipetteres derefter pâ papiret inde-15 holdende den t0rrede remanens af den vandige opl0sning og t0rres i en konvektionsovn ved 50°C i 15 minutter.

Testopl0sning

Theophyllin sættes til aliquoter af vand til frem-20 bringelse af theophyllin-slutkoncentrationer pâ henholds-vis 0,125, 0,25, 0,50, 1,00, 10,0, 20,0 og 40,0 jig/ml.

Analysemetode

De analyseelementer, der er blevet fremstillet 25 og fikseret til underst0tninger som beskrevet ovenfor, isættes i en mekanisk holder, der er egnet til at holde materialet horisontalt i et fluorometer. Netop inden i-sætningen af elementet og holderen i fluorometeret afpi-petteres der en 70 jal aliquot af en af de som ovenfor 30 beskrevet fremstillede theophyllin-opl0sninger pâ ele-mentets frie overflade.

Fluorometeret er indstillet til at tilvejebringe en excitations-lyskilde ved 405 nm, der rammer elementets overflade under en vinkel pâ 90°, og til detektering af 35 lys emitteret ved en b01gelængde pâ 450 nm. En frontflade-mâling af fluorescensen udf0res ved en vinkel pâ 90° i forhold til materialet.

63

DK 157328B

Ο

Fluorescens-responset fra hvert materiale mâles f0rst over tiden (0-6 minutter), og der foretages der-pâ aflæsninger hvert sjette minut.

5 Résultater

De data, der fâs ved den ovenfor beskrevne metode, er illustreret grafisk i figur 9. Ordinat-enhederne er ud-trykt i millivolt.

10 Konklusion

De fremkomne data viser, at det analytiske élément giver et kvantitativt detekterbart respons pâ theo-phyllin-koncentrationen i hver af de unders0gte aliquo- ter.

15

Under disse betingelser mhiberes reaktionen af nærværelsen af antiserum, og denne inhibering kan progressât overvindes ved stigende koncentrationer af theophyl-lin.

20

Eksempel 10

Elément med reversibel kompleksdannelse I de fors0g, der er beskrevet i dette eksempel, 25 fremstilles der enkeltlags-elementer, og disse afpr0ves for deres evne til kvantitativ bestemmelse af nærværelsen af theophyllin, carbamazepin, tobramycin og gentamicin, idet der benyttes frontflade-fluorometri. De terapeutiske omrâ-der for serumkoncentration og de minimale toksiske niveauer 30 for hvert lægemiddel er anf0rt i den f01gende tabel: Lægemiddel Terapeutisk Toksicitets-niveauer _ omrâde___

Theophyllin 10-20 jug/ml 35 jag/ml

Carbamazepin 4-12 jug/ml 15 iug/ml

WW

Tobramycin 5-10 jug/ml 12 pg/ml

Gentamicin 5-10 pg/ml 12 ^ig/ml 64

DK 157328 B

0

Fremstilling af antisera

Antisera til theophyllin, carbamazepin, tobramycin og gentamicin fremstilles ved metoder, der tidligere er beskrevet.

5

Fremstilling af konjugat

Galactosyl-umbelliferon-theophyllin, galactosyl--umbelliferon-carbamazepin, galactosyl-umbelliferon-tobra-mycin og galactosyl-umbelliferon-sisomicin (en analog til 10 gentamicin) fremstilles ved metoder, der tidligere er be skrevet.

Fremstilling af element

De opl0sninger, der anvendes til fremstilling af et lag af 15 de for theophyllin, carbamazepin, tobramycin og gentamicin specifikke elementer, indeholder de bestanddele, der er angivet i den f0lgende tabel C.

1 x 1 cm lag af Whatman 31 ET papir (Whatman, Inc.,

(3V

Clifton, New Jersey) lamineres pâ s01v-Mylarû'og monteres 20 ved hjælp af dobbeltsidet adhæsivt tape pâ 8,3 x 1 cm polystyren-underst0tninger, hvorpâ de ovenfor fremstillede opl0sninger pipetteres pâ lagene af Whatman 31 ET papir. Papirerne t0rres i en konvektionsovn ved 50°C i 15 minutter.

25 30 35 65

DK 157328 B

0

Testopl0sninger

Theophyllin, carbamazepin, tobramycin og gentamicin sættes til aliquoter af vand til fremstilling af pr0ver med slutkoncentrationsomrâder som angivet i den f0lgende tabel: 5 Lægentiddel Koncentrationsomrâde

Theophyllin 0-4,0 ^ig/ml

Carbamazepin 0-0,4 jug/ml

Tobramycin 0-0,6 /ig/ml 10 Gentamicin 0-2,0 /ig/ml

Analysemetode,'

De analytiske elementer, der er blevet fremstil-let og fikseret til underst0tninger som beskrevet ovenfor, 15 anbringes i et kammer, der er egnet til opretholdelse af en konstant fugtighed. Inden kammeret lukkes, afpipetteres der 70 ftl aliquoter af lægemiddelopl0sninger fremstillet som ovenfor beskrevet pâ den frie overflade af hvert enkelt analytisk element.

20 25 30 35

DK 157328 B

66 0 8 >1 ω a) p tt i d -h

•H rH

U H H S! H H d c -h +> 5 g t! ^ ^ ^ ^

Ct) CD OCNOOO Cl - .(J g Ο «. Γ- «a1 ** «a* d (ϋ h σ> vd m 0) H H ^ en

O CD

1d u >1 ω

CD

10 fi s

“H S

0 rH I—! >i-P H H -H d d S d d ή ^ ^ tO CD ^ S d r" σ>

Hg o «a< d - - Λ CD Ο ^ ^ Ο Η'φ OH H en ^ ld

Eh CD σι

CN

15 W

d ·—

•H O

0-j CQ H H

cü h h s: d. d

N d, d Q H

nj +> ^ d σ> en 20 gdocaS! -*· « (D o «-do en *3* Λ g H H ^ m d (D vo (ti H en U CD en 25 d

•H

H H i—I -—* H i—I H

h d. d o d^ ^ s.

ïh-P ^ ω ,d d o r- SJ ο ^ σι

OjCD o ·* q *a< *· 30 0 g H H en *? CD <D -H in Λ H _ M CD S! =k

H

t"- r» ' .·-s in

λ «» CD

oc d oo ω 35 o ce •h i il τ) +> d h h nj h îa ra CD Mono

1¾ nj 4J +J -H —' -P

u <3 u ce d ra o d CD tn 0) U rt h d en d υ S! cü h (D -p H -ri d Ή Ό ιί

n rn jJ rt n ioiu ci CD

67

DK 157328 B

0

Den fluorescens, der frembringes ved stuetempe-ratur efter 15 minutters forl0b, mâles i et fluorometer ud-styret med en mekanisk holder egnet til horisontal an-bringelse af det analytiske element. Fluorometeret er ind-5 stillet til frembringelse af excitations-lyskilde ved 405 nm, som rammer overfladen under en vinkel pâ 90°, og til detek-tering af lys, som emitteres ved en b01gelængde pâ 450 nm.

En frontflade-mâling af fluorescensen udf0res under en vinkel pâ 90° i forhold til materialet.

10

Resultater

De data, der opnâs ved den ovenfor beskrevne me-tode, er vist grafisk i figurerne 10, 11, 12 og 13 for hen-holdsvis theophyllin, carbamazepin, tobramycin og gentamicin.

15 Ordinat-enhederne er udtrykt som elektrisk output.

Konklusion

De fremkomne data viser, at de intégrale analytiske elementer giver kvantitativt, detekterbart respons pâ kon-20 centrationsomrâderne for de respektive lægemidler. Stigende koncentrationer af theophyllin, carbamazepin, tobramycin og gentamicin resulterer i en lægemiddel-afhængig for0gelse af fluorescensen for de respektive analytiske elementer. Den teknik, der anvendes i de omtalte fors0g, har gjort det mu-25 ligt at inkorporere aile bestanddele i et enkelt element.

Eksempel 11

Element med multilagsfilm I det fors0g, der beskrives i dette eksempel, 30 fremstilles der et intégrait dobbeltlags-analyseelement under anvendelse af to film indeholdende bestemmelsesbestanddele for den substrat-mærkede fluorescens-immunobestemmelse. Ele-mentet unders0ges for dets evne til kvantisering af theophyllin ved frontflade-fluorometri.

35

DK 157328 B

0 ' 68

Fremstilling af antisera og konjugat

Fremstillingen af antisera og af konjugat udf0res som beskrevet i eksempel 7.

5 Fremstilling af element

Der anvendes f0lgende forrâdsopl0sningerî 2% agarose (Miles nr. 49-051) i 0,05 M Bicin-puffer med pH=8,5. Pr0ven bringes i opl0sning ved 100°C, og holdes derpâ ved 60°C ved hjælp af en termostat.

10 10% Triton® x 100.

β-Galactosidase, 86 enheder pr. ml, i 0,5 M Bicin-puffer med pH=8,5.

6,67% Polyvinylpyrrolidon (Aldrich nr. 85.647-9), gennem-snitsmolekylvægt 360.000) i chloroform.

15 Galactosyl-umbelliferon-thephyllin (konjugat), 6,16 mM i dimethylsulfoxid.

Theophyllin-antisera og β-galactosidase inkorpo-reres i agaroseopl0sningen ved 60°C til frembringelse af en komposition med sammensætningen: 20

Bestanddel Mængde

Agaroseopl0sning 0,25 ml

Theophyllin-antisera 0,75 ml β-Galactosidase 0,03 ml 25 Triton® x loo 0,01 ml

De anvendte antisera forvarmes til 60°C inden sammenblanding. En 2,5 cm bred filnr spredes ud over et polyesterark (3M Co., type 2352) under anvendelse af en 30 konventionel rakel, der er indstillet til en filmtykkelse pâ 0,5 cm. Efter gelering t0rres filmen ved 47°C i 10 minutter.

En anden film spredes ud over den f0rste under anvendelse af en udstrygningskniv, der er indstillet til 0,005 cm. Filmen indeholder konjugat i en opl0sning af polyvinylpyrro-35 lidon (PVP) i chloroform, og sammensætningen er f0lgende:

DK 157328B

Ο 69

Bestanddel Mængde PVP i chloroform 0,4 ml

Chloroform 0,6 ml

Konjugat-opl0sning 0,015 ml 5

Filmen t0rres ved stuetemperatur. Polyesterarket monteres pâ s0lv-Myla3®ved hjælp af dabbeltsidet adhæsivt tape. Segmenter pâ 0,5 x 1 cm af dette materiale monteres pâ en polystyren-bærer, idet der igen anvendes dobbeltsidet 10 adhæsiv.

Testopl0sning

Theophyllin sættes til aliquoter af 0,05 M Bicin--puffer med pH=8,5 til opnâelse af theophyllin-slutkoncen-15 trationer pâ 1, 2, 4, 8 og 40 ^ug/ml.

Analysemetode

Et rumfang pâ 30 juliter af en af testopl0sningerne pâf0res de analytiske elementer, der er beskrevet ovenfor, og 20 fluorescens-responset mâles efter 5 minutter. Fluorescensen mâles som angivet i eksempel 10.

Resultater

De data, der fâs ved den ovenfor beskrevne proce-25 dure, er vist grafisk i figur 14. Fluorescensen i arbitrære enheder er afsat versus theophyllin-koncentrationen.

Konklusion

Resultaterne viser, at inkompatible reagenser til 30 en immunobestemmelse kan samles i forvejen i et analytisk element under anvendelse af flerlagsfilm, der ikke resulterer i reaktion i utide mellem bestemmelses-bestanddelene, og som tillader kvantitativ detektering af analyter efter tilsætning af den pr0ve, der skal analyseres.

35 0 70

DK 157328 B

C. Immunobestemmelses-testmaterialer med fluorescensunder-trykkelse.__

Eksempel 12

Ved det fors0gf der er beskrevet i dette eksempel, 5 fremstilles der et enkeltlagselement, og dette afpr0ves for dets evne til anvendelse til en direkte undertrykkelses--fluoroimmunobestemmelse, ved hvilken der kvantitativt be-stemmes nærværelsen af theophyllin i en flydende pr0ve, af-læst ved frontflade-fluorometri.

10

Fremstilling af antiserum

Antiserum til theophyllin fremstilles ved en metode, der tidligere er beskrevet.

15

Fremstilling af konjugat

Umbelliferon-theophyllin (konjugat) fremstilles ved hydrolyse af galactosyl-umbelliferon-theophyllin (GUT) med β-galactosidase. GUT fremstilles ved en metode, der tidligere er beskrevet.

Fremstilling af element

De opl0sninger, der anvendes til fremstilling af det for theophyllin specifikke element, indeholder f01gende 25 bestanddele:

Vandig opl0sning

Bestanddel

Theophyllin-antisera 50 yul

Vand 30 yul 0,5 M Bicin, pH=8,5 20 μΐ

Organisk opl0sning

Bestanddel 35 Toluen 1,00 ml

Konjugat (0,16 mM forrâds- 4 yul materiale i toluen) 0 71

DK 157328 B

Et 1 k 1 cm lag af Whatman 31 ET papir lamineres pâ s01v-Mylai^og monteres ved hjælp af dobbeltsidet adhæsivt tape pâ en 8,3 x 1 cm polystyren-underst0tning, hvorpâ 20 /il af den ovenfor fremstillede vandige opl0sning pipetteres pâ 5 laget af Whatman 31 ET papir. André underliggende, reflekte-rende lag, sâsom de, der er s01vagtige eller opake, er lige-ledes egnede. Papiret t0rres i en konvektionsovn ved 40°C i 20 minutter, Den organiske opl0sning (20 jul) pipetteres dernæst ud pâ papiret indeholdende den t0rrede remanens af 10 den vandige opl0sning og t0rres i en konvektionsovn ved 50 C i 15 minutter.

Testopl0sninq

Theophyllin sættes til aliquoter af vand til op-15 nâelse af theophyllin-slutkoncentrationer pâ henholdsvis 0,125, 0,25, 0,50, 1,00, 10,0, 20,0 og 40,0 yug/ml.

Analysemetode

De analytiske elementer, der er blevet fremstillet 20 og fikseret pâ underst0tninger som ovenfor beskrevet, isættes i en mekanisk holder, der er egnet til horisontal anbringelse af materialet i et fluorometer. Netop inden isætningen af elementet og holderen i fluorometeret udpipetteres der en 70 μΐ aliquot af en af de som ovenfor beskrevet fremstillede 25 theophyllinopl0sninger pâ elementets frie overflade.

Fluorometeret er indstillet til tilvejebringelse af en excitations-lyskilde ved 405 nm, der rammer elementets overflade under en vinkel pâ 90°, og til detektering af lys emitteret ved en b0lgelængde pâ 450 nm. En frontflade-mâling 30 af fluorescensen foretages under en vinkel pâ 90°C i forhold til materialet.

Fluorescens-responset for hvert materiale mâles efter 2 minutter.

35 Resultater

De data, der fâs ved den ovenfor beskrevne procedure, er illustreret grafisk i figur 15. Ordinat-enhederne er udtrykt som procent undertrykkelse.

0 72

DK 157328 B

Konklusion

De fremkomne data viser, at det analytiske element tilvejebringer et kvantitativt detekterbart respons pâ theophyllin-koncentrationen for hver af de unders0gte 5 aliquoter.

Under disse betingelser undertrykkes fluorescens i nærværelse af antiserum, og denne undertrykkelse kan progressât overvindes ved for0gelse af koncentrationen af theophyllin.

10 D. Enzym-mærkede immunobestemmelses-testmaterlaler Eksempel 13

Ved det fors0g, der beskrives i dette eksempel, 15 fremstilles der et flerlags-element, der indeholder aile de bestanddele, der er n0dvendige til udf0relse af en enzym-mær-ket homogen immunobestemmelse for theophyllin.

Antiserum ^ 2q Antiserum til theophyllin fâs fra et EMIT -aad- -theophyllin-testsæt indk0bt fra Syva Company, Palo Alto, Californien.

Fremstilling af konjugat 25 G6PDH-theophyllin (konjugat) fâs ligeledes fra et EMIT -aad-theophyllin-testsæt.

Fremstilling af element

Den opl0sning, der anvendes til fremstilling af et 30 lag af det for theophyllin specifikke element, er den, der er betegnet som reagens A (indeholdende antiserum til theo- (§) phyllin og enzymsubstrat) i EMIT ^-aad-theophyllin-testsættet fra Syva Company.

Et 0,5 x 1,0 cm lag af Whatman 54 papir (Whatman, 35 Inc., Clifton, New Jersey) monteres ved hjælp af dobbeltsidet adhæsivt tape pâ en 8,2 x 0,5 cm polystyrenunderst0tning.

0 73

DK 157328 B

hvorpâ 10 jil af den ovennævnte opl0sning udpipetteres pâ laget af Whatman 31 ET papir. Papiret t0rres i en konvek-tionsovn ved 50°C i 10 minutter.

Der fremstilles derefter en anden opl0sning ved 5 blanding af lige store rumfang af en diaphorase/p-iodnitro-tetrazolium-violet(INT)-opl0sning (1,5 mg diaphorase og 1 mg INT i 2,5 ml 0,055 M tris-(hydroxymethyl)-aminomethan--puffer, pH=7,9) og den opl0sning, der betegnes som reagens B i EMIT ^-aad-sættet (indeholdende det en zym-mærkede theophyllin-10 -konjugat). 20/il udpipetteres pâ et 0,6 x 1,0 cm lag af Whatman 54 papir. Dette imprægnerede lag t0rrés derpâ i en konvektionsovn ved 50°C i 10 minutter.

Det andet lag fikseres derefter ved den ene kant til det f0rste lag ved hjælp af en strimmel af dobbeltsidet 15 adhæsivt tape.

Testopl0sning

Theophyllin sættes til aliquoter af vand til opnâelse af theophyllin-slutkoncentrationer pâ henholdsvis 0,5, 1,0,2,5, 20 5, 0 og 4 0 /ug/ml.

Analysemetode

De analytiske elementer, der er fremstillet og fikseret til polystyren-underst0tninger som beskrevet ovenfor, 25 isættes hver i en mekanisk holder, der er egnet til horisontal anbringelse af materialet i et reflektans-fotometer. Netop inden isættelsen af elementet og holderen i fotometeret udpipetteres der en 50 ^Lil aliquot af en af de som ovenfor beskrevet fremstillede theophyllinopl0sninger pâ den frie 30 overflade., Fotometeret er indstilleligt til at f01ge ændringer i reflektansen ved 500 nm,

Reflektansen for hvert materiale mâles f0rst over tiden (0-200 sekunder), og derpâ foretages der aflæsninger 2 for hvert materiale for hver 200 sekunder (K/S = (1-R) /2R, 35 hvor R er reflektansen).

74

DK 157328 B

0

Resultater

De data, der fâs ved den ovenfor beskrevne metode, er vist grafisk i figur 16.

5 Konklusion

De opnâede data viser, at det intégrale analytiske element tilvejebringer et semi-kvantitativt detekterbart respons pâ theophyllin-koncentrationen i hver af de under-s0gte aliquoter.

10 15 20 25 30 35

Claims (17)

1. Testmateriale til bestemmelse af en ligand i en væskeprove ved hjælp af homogen immunanalyse, hvilket mate-riale omfatter (1) en fast bærerbestanddel, som udg0r en 5 absorbent for væskeprdven, og (2) et reagensmateriale, som er inkorporeret i bærerbestanddelen og indeholder (i) et antistof eller andet naturligt forekommende bindingsprotein for liganden og (ii) et ligandkonjugat eller en analog deraf, som antistoffet eller bindingsproteinet ogsâ formâr at binde, 10 covalent bundet til et mærkningsstof, som kan detekteres ved hjælp af et elektromagnetisk signal, som er forskelligt, nâr det mærkede konjugat er bundet til antistoffet eller andet bindingsprotein, og nàr det ikke er sâledes bundet, hvorhos signalet er en funktion af ligandmængden i proven, 15 kendetegnet ved, at antistoffet eller andet bindingsprotein og det mærkede konjugat er inkorporeret i den faste bærerbestanddel i det væsentlige ubundne til hverandre, og at materialet er fremstillet ved i en f0rste væske at inkorporere et af reagenserne, hvilke reagenser er konjugatet 20 og antistoffet eller bindingsprotein i bæreren, hvorpâ der t0rres, hvorefter man (A) enten i bæreren inkorporerer det andet af de nævnte reagenser, som ikke indeholder vand, hvorpâ bæreren t0rres, eller man (B) forst dybfryser bæreren, inkorporerer det andet af reagenserne, hvilke reagenser er 25 konjugatet og antistoffet eller bindingsproteinet, i en anden væske, i bæreren, udsætter denne for en temperatur, ved hvilken den anden væske fryser, og lyofiliserer bæreren.

2. Materiale if0lge krav 1, kendetegnet ved, at reagenserne er i det væsentlige homogent inkorporeret 30. bærerbestanddelen.

3. Materiale if0lge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at bærerbestanddelen udgores af en stofmatrix bestâende af naturfibre eller syntetiske polymerfibre.

4. Materiale if0lge krav 1 eller 2, kendeteg-35 net ved, , at bærerbestanddelen er en polymerfilm eller -gel. DK 157328 B

5. Materiale ifolge ethvert af kravene 1-4, k e n -detegnet ved, at mærkningsstoffet er deltager i en enzymatisk reaktion, som producerer det elektromagnetiske signal.

6. Materiale ifolge krav 5, kendetegnet ved, at mærkningsstoffet er substrat for et enzym, som indgâr i reagensmaterialet, der er inkorporeret i bærerbestanddelen, og er i stand til at indvirke sâledes pâ substratet, at der dannes et produkt, som kan detekteres ved hjælp af et elek- 10 tromagnetisk signal.

7. Materiale if0lge krav 5, kendetegnet ved, at mærkningsstoffet er en prostetisk gruppe, som forenes med et apoenzym og derved danner et aktivt enzym, hvilken apoenzym indgâr i reagensmaterialet, som er inkorporeret i 15 bærerbestanddelen.

8. Materiale if0lge krav 7, kendetegnet ved, at mærkningsstoffet er flavinadenindinucleotid, og at apoenzymet er apoglucoseoxidase.

9. Materiale if0lge krav 5, kendetegnet 20 ved, at mærkningsstoffet er et enzym eller en enzyminhibitor.

10. Materiale ifolge ethvert af kravene 1-9, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter et strâ-lingsreflekterende lag og et understotningslag, hvorhos regenserne er inkorporeret i et strâlingspermeabelt reagens- 25 lag, og det strâlingsreflekterende lag er et for strâling ikke-permeabelt lag, som (a) er anbragt mellem reagenslaget og underst0tningslaget, (b) er ikke-permeabelt for liganden, reagenserne i reagenslaget og produkterne fra reaktioner mellem disse og (c) er indiffèrent i forhold til lignanden, 30 reagenserne i reagenslaget og produkterne fra reaktioner mellem disse.

11. Materiale if0lge krav 10, kendetegnet ved, at det strâlingsreflekterende lag omfatter en for strâling ikke-permeabel spejloverflade.

12. Materiale ifolge ethvert af kravene 1-11, ken detegnet ved, at det elektromagnetiske signal er DK 157328 B fluorescens.

13. Fremgangsmâde til bestemmelse af en ligand i væskeprove, soin skal analyseres, hvilken fremgangsmâde om-fatter folgende trin: 5 a) pr0ven bringes i kontakt med et analyse- eller testmateriale, som omfatter (1) en fast bærerbestanddel, der udg0r en absorbent for væskeproven, og (2) et reagens-materiale, der er inkorporeret i bærerbestanddelen og in-deholder (i) et antistof eller et andet naturligt forekom-10 mende bindingsprotein for liganden og (ii) et ligandkonjugat eller en analog deraf, som antistoffet eller det andet bindingsprotein' ogsâ er i stand til at binde, covalent bundet til et mærkningsstof, der kan detekteres ved hjælp af et elektromagnetisk signal, som er forskelligt, nâr det mærkede 15 konjugat er bundet til antistoffet eller andet bindingsprotein, og nâr det ikke er sâledes bundet, hvorhos signalet er en funktion af ligandmængden i proven, og b) det frembragte elektromagnetiske signal mâles pâ bærerbestanddelen uden fysisk adskillelse af det mærkede 20 konjugat, som er bundet til antistoffet eller bindingspro-teinet fra konjugatet, som ikke bindes, kendetegnet ved, at antistoffet eller andet bindingsprotein og det mærkede konjugat inkorporeres i den faste bærerbestanddel i det væsentlige ubundne til hinanden, 25 og at materialet er fremstillet ved i en forste væske at inkorporere et af reagenserne, hvilke reagenser er konjugatet og antistoffet eller bindingsproteinet, i bæreren, hvorpâ denne torres, hvorefter man enten (A) ved at inkorporere i bæreren det andet af de nævnte reagenser i en væske, som 30 ikke indeholder vand, hvorpâ bæreren torres, eller (B) ved forst at dybfryse bæreren, inkorporerer det andet af reagenserne, hvilke reagenser er det nævnte konjugat og antistof eller bindingsprotein, i en anden væske, i bæreren, udsætter denne for en temperatur, ved hvilken den anden væske fryser, 35 og lyofiliserer bæreren.

14. Fremgangsmâde til fremstilling af et testmateriale DK 157328 B til bestemmelse af en ligand i en væskeprove ved flere ganges inkorporering af reagens i en fast bærerbestanddel, hvilket testmateriale omfatter (1) en fast bærerbestanddel, der udgor en absorbent for væskeproven, og (2) et reagensmateri-5 ale, som er inkorporeret i bærerbestanddelen og indeholder (i) et antistof eller andet naturligt forekommende bindings-protein for liganden og (ii) et 1igandkonjuga t eller en analog deraf, som antistoffet eller bindingsproteinet ogsâ er i stand til at binde, kovalent bundet til et mærknings-10 stof, som kan detekteres ved hjælp af et elektromagnetisk signal, som er forskelligt, nâr det mærkede konjugat er bundet til antistoffet eller andet bindingsprotein, og nâr det ikke er sâledes bundet, hvorhos signalet er en funktion af ligandmængden i pr0ven, kendetegnet ved, at 15 man a) inkorporerer et af reagenserne, som er det mærkede konjugat og bindingspartneren, i bæreren i en f0rste væske, og derefter b) inkorporerer det andet af reagenserne, som er 20 mærket konjugat og bindingspartner i bæreren, i en væske, som ikke indeholder vand, hvorpâ bæreren terres, hvorhos det mærkede konkugat og bindingspartneren ikke samtidig indferes i samme milje, hvorved bindingsreaktionen mellem dem i det væsentlige forhindres, og antistoffet eller andet 25 bindingsprotein og det nævnte mærkede konjugat er inkor poreret i bæreren i det væsentlige ubundne til hinanden-

15. Fremgangsmâde ifolge krav 14, kendetegnet ved, at man i trin a) inkorporerer en vandig oplesning eller suspension af den nævnte bindingspartner i bæreren, 30 hvorpâ bæreren t0rres, og at man i trin b) inkorporerer en opl0sning af det nævnte mærkede konkugat i et organisk op-l0sningsmiddel i bæreren, hvorpâ bæreren terres.

16. Lyofiliseringsfremgangsmâde til fremstilling af et testmateriale til bestemmelse af en ligand i en væske- 35 preve, hvilket testmateriale omfatter (1) en fast bærerbestanddel, som udger en absorbent for væskeproven, og (2) et DK 157328 B reagensmateriale, sont er inkorporeret 1 bærerbestanddelen og indeholder (i) et antistof eller andet naturligt forekom-mende bindingsprotein for liganden og (ii) et ligandkonjugat eller en analog deraf, sont antistoffet eller bindingsprote-5 inet ogsâ er i stand til at binde, kovalent bundet til et mærkningsstof, som kan detekteres ved hjælp af et elektro-magnetisk signal, som er forskelligt, nâr det mærkede kon-jugat er bundet til antistoffet eller andet bindingsprotein, og nâr det ikke er sâledes bundet, hvorhos signalet er en 10 funktion af ligandmængden i proven, kendetegnet ved, at fremgangsmâden omfatter folgende trin: a) enten det nævnte mærkede konjugat eller den nævnte bindingspartner inkorporeres i bæreren i en forste væske, b) bæreren terres, 15 c) bæreren dybfryses, og et andet af de nævnte rea- genser eller mærket konjugat eller bindingspartner inkorporeres deri i en anden væske, d) bæreren udsættes for en temperatur, ved hvilken den anden væske fryser, og 20 e) bæreren lyofiliseres, hvorhos det mærkede konkugat og bindingspartneren ikke samtidig indfores i samme milje i noget væsentligt tidsrum, hvorved bindingsreaktionen mellem dem i det væsentlige forhindres, og det nævnte antistof eller andet bindingsprotein og det nævnte mærkede konjugat 25 sâledes inkorporeres i bærerbestanddelen i det væsentlige ubundne til hinanden.

17. Fremgangsmâde ifolge krav 16, kendetegnet ved, at bâde den forste og den anden væske indeholder vand.