JP3304350B2 - 定性免疫クロマトグラフィー方法および装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 （発明の分野） 特定の化合物のアッセイにおいて、その化合物に対応
する天然のレセプターまたは抗体を使用することが可能
であるということが、イムノアッセイ研究の発展をもた
らした。各アッセイでは、リガンドおよびレセプター
（アンチリガンド）を含む特異的結合対「sbp成分」）
成分の相同対、通例、免疫対を用い、そのsbpの一方を
検出可能なシグナルを発生する標識で標識する。イムノ
アッセイ法を行うと、sbp成分の複合体と結合したシグ
ナル標識および未結合シグナル標識間にシグナル標識の
分布が生じる。結合シグナル標識と未結合シグナル標識
の識別は、未結合シグナル標識から結合シグナル標識を
物理的に分離するか、または結合および未結合シグナル
標識の検出可能なシグナルを変調することにより行うこ
とができる。 通例、イムノアッセイは、臨床研究室において関心の
対象である多種の化合物の定量に供されており、比較的
精巧な装置および慎重な技術を必要とする。イムノアッ
セイは、半定量的または定性的結果を目的とし、測定に
非実験技術者があたる場合（例えば、家庭または病院に
おいて）広くは実用化されていない。臨床研究室におい
ても、非熟練者でも実施し得る簡単で迅速なスクリーニ
ング試験があれば、多くの費用を節約することができ
る。 免疫検定法の開発については、考慮すべきことが多
い。その１つは、結合したシグナル標識から発生するシ
グナルと未結合シグナル標識から発生するシグナルとの
実質的な識別である。また問題の化合物の含有が疑われ
る試料中の内在物質からの妨害を最小にすることも考慮
しなければならない。さらに、シグナルを検出し、関心
のある濃度範囲内での濃度の測定を容易にすることも考
慮しなければならない。他の要素としては、試薬調製の
容易さ、材料および試薬溶液の調製および測定に要する
正確さ、試薬の貯蔵安定性、プロトコルに要する操作数
および各操作の遂行に要する技術と正確さがある。した
がって、非熟練者でも実施し得る検定、例えば、家庭
で、法医学において、または開業医等 によって実施し得る検定の開発においては、プロトコル
の実施方法の相異によって影響を受ける結果の変動を最
小限にし、そして種々の操作の実施方法を簡単にすべき
である。 一般に、２種またはそれ以上のアナライトの同時測定
が可能な免疫検定法の計画を立てるのは困難であり、実
施された免疫検定法では別々のアナライト類似体に対し
て相異なる放射性標識を使用している。 （先行技術の記載） 試料特性の測定用、特に液体試料中の物質の測定用の
試験装置が、米国特許第4094647号に開示されている。
薄層クロマトグラフィー装置およびクロマトグラフィー
試験法が、米国特許第4384958号に開示されている。標
識抗体を固定化アナライト類似体から排除する免疫検定
法が、米国特許第4434236号に記載されている。ミオグ
ロビン検出装置および検出法が、米国特許第4189304号
に開示されている。液体に溶解した物質を分析するため
のテストストリップが、米国特許第4438067号に記載さ
れている。液体試料成分測定用多層試験装置およびかか
る装置の使用法が、米国特許第4160008号に記載されて
いる。不溶性抗体を用いた標識抗原による抗原測定法
が、日本国昭和48年特許出願公開第5925号（昭和48年１
月25日）に開示されている。 ヘテロジニアス免疫検定における濃縮域法が、米国特
許第4366241号に開示されている。米国特許第4168146号
は、免疫検定用テストストリップを記載している。米国
特許第3990850号および第4055394号は、診断テストカー
ドを記載している。生体液の自動定量分析方法は、米国
特許第4327073号に記載されている。色素生成支持体免
疫検定法は、国際出願第PCT/US83/01887号に開示されて
いる。 広い範囲の特許および特許出願によって、免疫検定法
において検出可能なシグナルを発生させる多様な技術に
関する文献が提供されている。以下のリストは、この発
明において適用性を示し得るこれらの幾つかの技術の単
なる例示である。以下、米国特許および特許出願並びに
使用される標識の型のリストを示す。米国特許第364634
6号、放射性標識、同第4654090号、同第3791932号およ
び同第3817838号、酵素標識、同第3996345号、フルオレ
ッサー−クエンチャー標識、同第4062733号、放射性標
識、同第4067959号、フルオレッサーまたは酵素標識、
同第4104029号、化学発光標識、および同第4160645号、
非酵素触媒標識。米国特許第3966879号には抗体域を用
いる電気泳動技術が、また同第4120945号には標識アナ
ライトを最初に抗体を介して固体支持体に結合させるRI
A（ラジオイムノアッセイ）が記載されている。米国特
許第4233402号では酵素対標識、同第4720450号では化学
誘導蛍光標識、および同第4287300号では酵素アニオン
負荷標識を使用する。 〔発明の要約〕 この発明の方法および装置は、１種またはそれ以上の
アナライトの含有が疑われる試料中における予め決定さ
れた最少検出可能量の複数のアナライトの１種またはそ
れ以上の存否の測定に有用である。この装置は毛管移動
によって少なくとも一方向に試験溶液を浸透させ得る吸
収性材料片である。試験溶液は、試料および各々アナラ
イトの１つと類似している、予め決定された量の２種ま
たはそれ以上の第1sbp成分を含む。吸収性材料は、少な
くとも前記接触部分および接触部分から離れた吸収性材
料片の予め定められた部位の間に実質的に均一および非
拡散結合した予め決定された量の複数の第2sbp成分の２
種またはそれ以上を含む。第2sbp成分は各々アナライト
の１つおよび対応する第1sbp成分と結合し得る。予定量
の１種またはそれ以上のアナライトが存在する場合、類
似第1sbp成分は予め定められた部位に移動する。この装
置は、これと結合された予め定められた部位でのみ１種
またはそれ以上の第1sbp成分を検出し得る手段を含み得
る。 この方法では、予め定められた部位から離れた吸収性
材料片の接触部分と前記試験溶液を接触させると、試験
溶液は毛管移動によって吸収性材料に浸透する。少なく
とも試験溶液の一部を吸収性材料に浸透させる。予め定
められた部位を第1sbp成分の存在について検査するが、
これは通常検出可能なシグナルの存在により示される。
前記シグナルは直接検出され得るか、または予め定めら
れた部位を第1sbp成分と相互作用し得るシグナル発生手
段に曝して検出可能なシグナルを発生させることができ
る。予め定められた部位にシグナルが存在するというこ
とは、試験溶液中に１個またはそれ以上のアナライトが
存在することを示す。 この発明の方法および装置は、使用法が簡単で単一試
験溶液中の複数のアナライトに適用され得るため有利な
ものである。試験溶液中の１種またはそれ以上のアナラ
イトの存否は、単一吸収性材料片並びに適当な第１およ
び第2sbp成分を用いることにより容易に行うことができ
る。 〔実施態様の記載〕 前述したように、この発明は、１種またはそれ以上の
アナライトの含有が疑われる試料中における予め決定さ
れた最少検出可能量の複数のアナライトの１種またはそ
れ以上の存否を測定する方法および装置に関する。水性
媒質中で試料および予め決定された量の、各々アナライ
トの１つに類似した少なくとも２種またはそれ以上の第
1sbp成分、通常アナライトの１つと標識のコンジュゲー
トを合わせることにより、試験溶液を調製する。毛管移
動によってこの試験溶液を少なくとも一方向に浸透させ
得る吸収性材料の一部分、すなわち「接触部分」、普通
は片、通常ストリップの端部を試験溶液と接触させる。
吸収性材料は、各々アナライトの１つおよび対応する第
1sbp成分と結合し得る。予め決定された量の、少なくと
も２種またはそれ以上の第2sbp成分を含む。第2sbp成分
を少なくとも吸収性材料の接触部分および接触部分から
離れた予め定められた部位間に実質的に均一および非拡
散結合させることにより、予定量の１種またはそれ以上
のアナライトが存在する場合のみ、第1sbp成分は予め定
められた部位に移動する。少なくとも試験溶液の一部を
毛管移動によって吸収性材料に浸透させる。次に、予め
定められた部位に結合した第1sbp成分があればこれが検
出される。例えば第1sbp成分を放射性標識で標識すると
直接検出され得るが、また予め定められた部位を光線、
熱または標識と相互作用し得る化学試薬のようなシグナ
ル発生手段に曝して試験溶液中の１種またはそれ以上の
アナライトの量に応じたシグナルを発生させることによ
り検出することもできる。次いで予め定められた部位で
発生したシグナルを検出する。この装置は、これと結合
した、予め定められた部位でのみ第1sbp成分を検出し得
る手段を有し得る。試料中に１種またはそれ以上のアナ
ライトが存在する場合、１種またはそれ以上の第1sbp成
分は予め定められた部位に移動する。シグナル発生手段
は第1sbp成分との反応性を示し、１種またはそれ以上の
アナライトが試料中に存在する場合に予め定められた部
位で検出可能なシグナルを発生させるのに必要な試薬を
含む。 この発明の実施態様の記載をさらに進める前に、幾つ
かの用語を定義する。 アナライト（分析質）…抗体に特異的に結合し得る測
定すべき化合物または組成物、通常は抗原または薬剤。 抗原性および薬剤アナライトの正確な性質および多数
の例は、共にリトマン等による米国特許第4299916号、
特に16〜23欄および米国特許第4275149号17および18欄
に開示されており、それらの記述を引用して説明の一部
とする。 アナライトは、単一結合部位（１価）または複数結合
部位（多価）を有することを特徴とする。通常多価アナ
ライトは、ポリ（アミノ酸）、すなわちポリペプチド類
および蛋白質、多糖類、核酸およびそれらの組合わせで
ある。そのような組合わせまたは集合体には、細菌、ウ
イルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜
等がある。 類似構造特性を有する蛋白質、特定の生物機能を有す
る蛋白質、特定の微生物、特に病因となる微生物に関連
する蛋白質等の種類について広範な種類の蛋白質が考え
られ得る。 モノエピトープリガンドアナライトは、一般に約100
〜2000の分子量、さらに普通は125〜1000の分子量を有
する。興味の対象であるアナライトには、薬剤、中間代
謝物、農薬、汚染物質等がある。興味ある薬剤にはアル
カロイド類が含まれる。アルカロイド類には、モルヒネ
アルカロイド類、例えばモルヒネ、コデイン、ヘロイ
ン、デキストロメトルファン、それらの誘導体および中
間代謝物、コカインアルカロイド類、例えばコカインお
よびベンゾイルエクゴニン、それらの誘導体および中間
代謝物、麦角アルカロイド類、例えばリゼルギン酸ジエ
チルアミド、ステロイドアルカロイド類、イミナゾイル
アルカロイド類、キナゾリンアルカロイド類、イソキノ
リンアルカロイド類、キノリンアルカロイド類、例えば
キニンおよびキニジン、ジテルペンアルカロイド類、そ
れらの誘導体および中間代謝物がある。 次群の薬剤には、ステロイド類、例えばエストロゲ
ン、アンドロゲン、副腎皮質ステロイド類、胆汁酸、強
心性グリコシド類およびアグリコン類、例えばジゴキシ
ンおよびジゴキシゲニン、サポニンおよびサポゲニン、
それらの誘導体および中間代謝物がある。またステロイ
ド擬似物質例えばジエチルスチルベストールも含まれ
る。 次群の薬剤には、５〜６員環を有するラクタム類、例
えばバルビツエート類、例えばフェノバルビタールおよ
びセコバルビタール、ジフェニルヒダントニン、プリミ
ドン、エトスクシミドおよびそれらの中間代謝物があ
る。 次群の薬剤には、２〜３個の炭素原子を有するアルキ
ルを有するアミノアルキルベンゼン類、例えばアンフェ
タミン類、カテコールアミン類、例えばエフェドリン、
Ｌ−ドーパ、エピネフリン、ナルセイン、パパベリンお
よびそれらの中間代謝物がある。 次群の薬剤には、ベンゼン複素環類、例えばオキサゼ
パム、クロロプロマジン、テグレトール、イミプラミ
ン、それらの誘導体および中間代謝物があり、複素環は
アゼピン、ジアゼピンおよびフェノチアジンである。 次群の薬剤には、プリン類、例えばテオフィリン、カ
フェイン、それらの中間代謝物および誘導体がある。 次群の薬剤には、マリファナ由来の物質、例えばカン
ナビノールおよびテトラヒドロカンナビノールがある。 次群の薬剤には、ビタミン類、例えばＡ、Ｂ、例えば
B₁₂、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＫ、葉酸およびチアミンがあ
る。 次群の薬剤にはプロスタグランジンがあり、これらは
ヒドロキシル化および不飽和の程度および部位により区
別される。 次群の薬剤には、抗生物質、例えばペニシリン、クロ
ロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラサイクリ
ン、テラマイシン、それらの中間代謝物および誘導体が
ある。 次群の薬剤には、ヌクレオシドおよぶヌクレオチド、
例えばATP、NAD、FMN、アデノシン、グアノシン、チミ
ジンおよびシチジンがあり、これらは適当な糖およびホ
スフェート置換基を有する。 次群の薬剤には、種々雑多な個々の薬剤、例えばメタ
ドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジン、アミ
トリプチリン、ノルトリプチリン、リドカイン、プロカ
インアミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノロ
ール、グリセオフルビン、バルプロ酸、ブチロフェノン
類、抗ヒスタミン剤、抗コリン作用薬、例えばアトロピ
ン、それらの中間代謝物および誘導体がある。 疾患状態に関連した中間代謝物には、スペルミン、ガ
ラクトース、フェニルピルビン酸およびポルフィリン１
型がある。 次群の薬剤には、アミノグリコシド類、例えばゲンタ
マイシン、カナマイシン、トブラマイシンおよびアミカ
シンがある。 興味ある農薬には、ポリハロゲン化ビフェニール類、
燐酸エステル類、チオホスフェート類、カーバメート
類、ポリハロゲン化スルフェンアミド類、それらの中間
代謝物および誘導体がある。 レセプターアナライトの場合、分子量は一般に10000
〜２×10⁸、さらに普通は10000〜10⁶の範囲である。免
疫グロブリン類、IgA、IgG、IgEおよびIgMの場合、分子
量は一般に約160000〜約10⁶の範囲である。酵素は普通
約10000〜1000000の範囲の分子量を有する。天然レセプ
ターの場合は広範に変化するが、一般に少なくとも約25
000の分子量を有し、10⁶またはそれ以上の分子量もあり
得、例としてはアビジン、DNA、RNA、チロキシン結合グ
ロブリン、チロキシン結合プレアルブミン、トランスコ
ルチン等がある。 特異的結合対の成分（「sbp成分」）…２種の相異な
る分子の一員であって、他方の分子の特定の空間的およ
び極性構成と特異的に結合するためそれに相補的である
と定義される領域を表面または空洞部に有する分子。特
異的結合対の成分とはリガンドおよびレセプター（アン
チリガンド）を指す。これらは普通免疫対、例えば抗原
−抗体の成分であり、他の特異的結合対、例えばビオチ
ン−アビジンホルモン−ホルモンレセプター、核酸二重
らせん、IgG−蛋白質Ａ、DNA−DNA、DNA−RNA等も免疫
対ではないがこの定義に含まれる。 リガンド…これに対するレセプターが天然に存在する
かまたは製造され得る有機化合物。 レセプター（アンチリガンド）…分子の特定の空間的
および極性構成、例えばエピトープまたは決定部位を認
識し得る化合物または組成物。レセプターの例には、天
然レセプター、例えばチロキシン結合グロブリン、抗
体、酵素、Fab断片、レクチン、核酸、蛋白質Ａ、補体
成分Clq等がある。 標識sbp成分…第1sbp成分に結合した、一般に電気化
学的検出または電磁放射線の吸収もしくは放射が可能な
標識、触媒、多くの場合酵素。標識sbp成分はシグナル
発生系の一員であり、アッセイの特定のプロトコルに従
って第1sbp成分を選択して第2sbp成分に結合させる。 抗体…他方の分子の特定の空間的および極性構成と特
異的に結合するためそれに相補的であると定義される領
域を表面または空洞部に有する免疫グロブリンまたはそ
の誘導体もしくはフラグメント。抗体はモノクローナル
またはポリクローナルであり得、当業界でよく知られた
技術、例えば宿主の免疫化および血清の採取またはハイ
ブリッドセルライン技術により製造され得る。 アナライトの抗体…アナライトに特異的な抗体。 第1sbp成分…第2sbp成分、通常レセプターまたは抗体
との結合に関して類似アナライトと競合し得る修飾アナ
ライトまたはアナライト類似体もしくは代用物であっ
て、修飾により標識とアナライト類似体を連結して標識
sbp成分を提供する手段が得られる。アナライト類似体
は、通常ハブまたは標識にアナライト類似体を連結する
結合による１個の水素の置換以上の点でアナライトとは
異なるが、必ずしも断言はできない。アナライト代用物
の語は、アナライトの抗体との結合能力を有する化合物
を指す。すなわち、アナライト代用物は、アナライトに
対すると同様にアナライトの抗体に結合し得る。他方、
代用物は例えばアナライトの抗体のイディオタイプに対
する抗体であり得る。 第2sbp成分…アナライトおよび第1sbp成分に結合し得
るsbp成分。第2sbp成分はアナライトの決定部位および
第1sbp成分の決定部位に結合し得る。好ましい第2sbp成
分は抗体である。 吸収性材料…少なくとも0.1μ、好ましくは少なくと
も1.0μの孔を有する多孔質材料であり、毛管作用に応
じて水性媒質を浸透させ得る。かかる材料は一般に親水
性であるか、または親水性となり得、例としては、無機
質粉末、例えばシリカ、硫酸マグネシウムおよびアルミ
ナ、天然ポリマー性材料、特にセルロース性材料および
セルロース由来の材料、例えば繊維を含む紙、例えば濾
紙、クロマトグラフィー用紙等、合成または修飾された
天然ポリマー、例えばニトロセルロース、酢酸セルロー
ス、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋デ
キストラン、アガロース、ポリアクリレート等があり、
単独または他の材料、セラミック材料等と組み合わせて
使用される。吸収性材料は支持体に付着され得る。他
方、吸収性材料はそれ自体の支持体を提供し得る。吸収
性材料は、多官能性であるかまたは多官能性化されるこ
とにより、レセプターまたは抗体の共有結合を可能に
し、またシグナル発生系の一部を形成する他の化合物の
結合を可能にし得る。 吸収性材料とレセプターおよび抗体の結合は、文献に
おいて一般に使用され得る公知技術により達成され得
る。例えば、「インモビライズド・エンザイムズ」（Im
mobilized Enzymes）、チバタイチロウ、ハルステッド
・プレス、ニューヨーク（1978年）およびクアトレカサ
ス、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー」（J.Bio.Chem.）、245:3059（1970年）参照。 吸収性材料片は、単一構造、例えばストリップに切断
されたシートであり得るか、または幾つかのストリップ
または例えば薄層クロマトグラフィーで見られるように
支持体もしくは固体表面に結合した粒状材料であり得、
完全な部分としてまたは液体接触部に吸収性パッドを有
し得る。また吸収性材料片は、表面にレーンを有するシ
ートであり得、またはスポットすることによりレーンが
形成され得るが、各々のレーンにおいて独立した測定を
行うことができる。吸収性材料片は、毛管現象による試
験溶液の浸透方向が少なくとも１つは存在する場合、直
角四辺形、円形、長円形、（triagonal）または他の形
状を呈し得る。他の浸透方向は、例えば長円形または円
形片が試験溶液と中央部で接触した場合に生じ得る。し
かしながら、主として予め定められた部位への少なくと
も１方向の流れが存在するものとする。以下の記述にお
いて、吸収性材料のストリップを具体的に説明するが、
限定するわけではない。 支持体が望ましいかまたは必要な場合、吸収性材料の
支持体は、通常水に不溶性で、非多孔質で堅く、また通
常吸収性ストリップと同じ長さおよび幅を有するが、大
きいかまたは小さい場合もあり得る。支持体がストリッ
プの毛管現象を妨げたり、検定成分と非特異結合した
り、シグナル発生系を妨げたりしない限り、天然および
合成材料を含む広範な種類の有機および無機材料および
それらの組合わせを使用することができる。ポリマーの
例としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４
−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレー
ト、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ
（ビニルブチレート）、ガラス、セラミック、金属等が
ある。吸収性パッドは、親水性吸収性材料、例えば紙、
スポンジ、フェルト、多孔質ポリマー等であり得る。 標識…標識は、シグナル発生に必要とされる第1sbp成
分に結合した分子であり得る。本発明において、標識
は、不活性であり、単にシグナル発生手段の一員の結合
部位としての役割を果たし得るか、または自発的に検出
可能なシグナルを発生し得るか、またはシグナル発生手
段と協働して検出可能なシグナルを発生し得る。標識
は、同位体または非同位体、好ましくは非同位体であり
得る。しかしながら、写真フィルムによるラジオオート
グラフィー検査を行う場合、高感度の達成に同位体標識
が好まれることもあり得る。 シグナル発生手段…標識と相互作用して検出可能なシ
グナルを発生し得る手段。そのような手段には、例えば
電磁放射線、熱、化学試薬等がある。化学試薬を用いる
場合、幾つかの化学試薬を顕色液の一部として含ませる
ことができる。化学試薬には、基質、補酵素、促進剤、
第２酵素、活性剤、コファクター、阻害剤、スカベンジ
ャー、金属イオン、シグナル発生物質の結合に必要な特
異的結合物質等が含まれ得る。幾つかの化学試薬、例え
ば補酵素、酵素生成物、他の酵素および触媒と反応する
物質等を吸収性材料に結合させることもできる。 シグナル発生系…シグナル発生系は１種またはそれ以
上の成分を含み得、少なくとも１成分は標識sbp成分で
ある。シグナル発生系は、標識と相互作用してシグナル
を発生させ得るシグナル発生手段を含めて測定可能なシ
グナルを発生させるのに必要な試薬をすべて含む。 シグナル発生系は、外的手段、通常電磁放射線の測
定、望ましくは可視的試験により検出され得るシグナル
を発生する。殆どの場合、シグナル発生系は発色性基質
および酵素を含み、発色性基質は紫外線または可視光
線、燐光体または蛍光剤の光線を吸収する色素に酵素変
換される。 シグナル発生系は、標識として少なくとも１種の触
媒、通常少なくとも１種の酵素および少なくとも１種の
基質を含み得、２種またはそれ以上の触媒および複数の
基質を含み得、また一方の酵素の基質が他方の酵素の生
成物である関係の酵素の組合わせを含み得る。シグナル
発生系の作用は、予め定められた部位における標識の存
在に応じて、予め定められた部位に検出可能なシグナル
を提供する生成物を生産することである。 ２種の触媒として酵素および非酵素触媒の組合わせま
たは２種の酵素が使用され得るが、２種の触媒は一方の
生成物が他方の基質であるという関係にある。この系で
は、触媒により触媒された連続変化を受け得る基質だけ
が必要であり、その結果検出可能なシグナルの発生に係
る化合物が得られる。しかしながら、殆どの場合、普通
連続変化における第１酵素の基質および第２化合物が存
在し、後者がシグナル発生に係る化合物の前駆体として
の役割を果たし、通常シグナルを発生する化合物を提供
する。すなわち、第１酵素の生成物はシグナルを発生す
る化合物の前駆体と反応してシグナルを発生する化合物
を生成し得る。 ２種の酵素を使用する場合、関与する反応は、殆どの
場合加水分解またはレドックス反応である。加水分解の
場合、加水分解的に不安定な結合を有する誘導体化色素
前駆体、加水分解酵素および放出された色素前駆体に接
触して色素変換生成物をもたらす酵素は、このタイプの
系の一例である。レドックス反応では、第１酵素は第２
酵素に必要な必須酸化基質を生成し得、第２酵素は酸化
基質および色素前駆体間の反応を触媒する。 ２種の酵素を用いる場合、第１酵素反応は加水分解開
裂または基質のレドックス反応を含み得、その結果他方
の酵素の基質である生成物が得られる。第１の状況の例
として、グルコース−６−ホスフェートをアルカリホス
ファターゼによる触媒加水分解によりグルコースを得る
反応を挙げることができ、この場合グルコースはグルコ
ースオキシダーゼの基質である。第２の状況の例とし
て、グルコースをグルコースオキシダーゼにより酸化し
て過酸化水素を得、これが白色色素と酵素反応すること
によりシグナル発生物質を生成する場合を挙げることが
できる。 また２種の触媒として酵素および非酵素触媒も使用さ
れ得る。酵素が非酵素触媒により触媒された反応をうけ
る反応体を生成し得るか、または非酵素触媒が酵素の基
質（補酵素を含む）を生成し得る。広範な種類の使用可
能な非酵素触媒が米国特許第4160645号（1979年７月10
日付）に記載されており、適当な部分を引用して説明の
一部とする。 多様な組合わせの酵素を用いてシグナル発生化合物を
生成することができる。特に、ヒドロラーゼの組合わせ
を用いて不溶性シグナル発生物質を生成することができ
る。別法として、ヒドロラーゼおよびオキシドレダクタ
ーゼの組合わせによりシグナル発生化合物を生成するこ
とができる。また、オキシドレダクターゼの組合わせを
用いて不溶性シグナル発生化合物を生成することができ
る。 酵素の組合わせの場合、一方の酵素は吸収性材料と非
拡散結合し得、他方の酵素はアナライトにコンジュゲー
トした標識である。さらに、選択された特定のシグナル
発生系または後の特定のプロトコルにより異なるが、１
種またはそれ以上のシグナル発生系の他の成分を吸収性
材料に結合させることができる。 検出可能なシグナルを得るためには、予め定められた
部位における標識の存在により発生するシグナルを増幅
する手段を供給するのが望ましい。したがって、標識と
しては、通常触媒または発光性化合物または放射性同位
元素が好ましく、最も好ましくは触媒である。好ましく
は、触媒は、単一標識から多数のシグナル発生分子を生
成し得る酵素および補酵素である。 生成物を生産することにより所望の増幅をもたらす酵
素または補酵素が使用され、光線を吸収する物質、例え
ば色素、または照射すると光線を発する物質、例えば蛍
光剤がある。別法として、触媒反応を直接発光例えば化
学発光に導くこともできる。前記生成物を供給する多数
の酵素および補酵素が、米国特許第4275149号19〜23欄
および米国特許第4318980号、10〜14欄に記載されてお
り、それらの記載を引用して説明の一部とする。 幾つかの酵素の組合わせが米国特許第4275149号23〜2
8欄に記載されており、これらはこの発明に適用され得
る。この記載を引用して説明の一部とする。 特に興味深いのは、過酸化水素の生成および過酸化水
素を用いた色素前駆体酸化による色素の生成に関与する
酵素である。特定の組合わせには、サッカリドオキシダ
ーゼ類、例、グルコースおよびガラクトースオキシダー
ゼ、または複素環オキシダーゼ類、例えばウリカーゼお
よびキサンチンオキシダーゼを、過酸化水素を用いて色
素前駆体を酸化する酵素、すなわちペルオキシダーゼ例
えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダ
ーゼまたはミクロペルオキシダーゼと組合わせたものが
ある。さらに別の酵素の組合わせも説明の一部として引
用された内容中に記載されている。単一酵素を標識とし
て用いる場合、他の酵素、例えばヒドロラーゼ類、トラ
ンスフェラーゼ類およびオキシドレダクターゼ類、好ま
しくはヒドロラーゼ類例えばアルカリホスファターゼお
よびβ−ガラクトシダーゼも使用され得る。別法とし
て、ルシフェラーゼ類、例えばほたるルシフェラーゼお
よび細菌性ルシフェラーゼを使用することができる。 使用され得る補酵素の例には、NAD［Ｈ］、NADP
［Ｈ］、ピリドキサル燐酸、FAD［Ｈ］、FMN［Ｈ］等が
あり、通常補酵素は閉環反応に関与する。特に米国特許
第4318980号参照。 酵素反応の生成物は普通色素または蛍光剤である。蛍
光剤の多数の例が米国特許第4275149号30および31欄に
記載されており、その記載を引用して説明の一部とす
る。 補助物質…この発明によるアッセイでは多様な補助物
質を用いることが多い。例えば、アッセイ媒質には通像
緩衝剤および安定剤が存在する。これらの添加剤に加え
て、多くの場合、追加の蛋白質、例えばアルブミン類ま
たは界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、結合促進
剤、例えばポリアルキレングリコール類等が含まれ得
る。 予め定められた部位でのみ１種またはそれ以上の第1s
bp成分の検出を可能にする、吸収性材料と結合した手段
…予め定められた部位以外に１種またはそれ以上の第1s
bp成分を結合させ得る吸収性材料の部分を隠す封入物の
形をとり得る手段。通常、吸収性材料における接触部分
および予め定められた部位間の部分は封入物により隠さ
れている。前記封入物は、吸収性材料を包囲し、予め定
められた部位が見える開口部または窓を有し得る。封入
物は、不活性材料、例えばプラスチック、ガラス等、好
ましくはプラスチックにより製作され得る。封入物の寸
法は吸収性材料の寸法により決定される。開口部のサイ
ズもまた、シグナルが存在するか否かを正確に観察でき
る程度に予め定められた部位の充分な面積が見えること
を第１に考慮した上で吸収性材料の寸法により決定され
る。一般に開口部は、予め定められた部位の配置に対応
する吸収性材料の面に沿って位置する。封入物もまた吸
収性材料片の接触部分またはその付近に開口部を有し、
そこから試験溶液および他の液体試薬を導入する。 別の態様において、前記手段は、アッセイを実施する
場合に第1sbp成分と接触し得る予め定められた部位以外
の部位で吸収性材料と結合したシグナル阻害物質であり
得る。その結果、シグナルは単に予め定められた部位で
生成され、検出される。シグナル阻害物質は使用された
シグナル発生手段に基づいて選択される。シグナル阻害
物質は、シグナル発生手段と相互作用してシグナル生成
をある期間遅らせたり完全にシグナル生成を阻害するこ
とができる。例えば、標識として触媒例えば酵素を用い
る場合、シグナル阻害物質は、前記触媒の別の基質また
は触媒生成物および基質と反応する化合物であり得る。
アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルが、ペル
オキシダーゼ酵素のシグナル阻害物質として使用され得
る。シグナル阻害物質の他の例には、フェリシアン化
物、尿酸、ヒドロキノン、グルタチオン、ジチオトレイ
トール、亜硫酸ナトリウム等がある。シグナル阻害物質
の量は、アッセイで使用される対応するシグナル発生系
成分の量により決定される。一般に、シグナル阻害物質
の量は、予め定められた部位でシグナルを検出するのに
充分な期間予め定められた部位以外におけるシグナル発
生を阻害するのに充分な量である。 この発明の方法では、各々試料中に存在する疑いのあ
るアナライトの１つに類似した少なくとも２種の第1sbp
成分を水性媒質中で試料と合わせることにより、水性試
験溶液を調製する。第１に、試料および第1sbp成分を含
む試験溶液をストリップの接触部分と接触させ、毛管移
動によりストリップに浸透させることを考慮すべきであ
る。この浸透は上向き、下向き、水平またはそれらの組
合わせであり得る。第1sbp成分の１個が予め定められた
部位に移動したか否かは、試料中の予め決定された最少
検出可能量を越える量の対応するアナライトの存在と関
連している。 ストリップを試験溶液と接触させ、毛管移動をさせた
後、ストリップをシグナル発生手段に曝す。標識および
シグナル発生手段により異なるが、曝す方法には、照
射、加熱または化学薬剤との接触が挙げられ得る。後者
の場合、少なくとも予め定められた部位と化学薬剤を含
む顕色剤を接触させる。１個またはそれ以上の第1sbp成
分が予め定められた部位に存在する場合、シグナル発生
系は検出可能なシグナルを提供する。 試験溶液および／または顕色液の溶媒は通常水系媒質
であり、約40重量％以下の他の極性溶媒、特に１〜６個
の炭素原子、さらに普通は１〜４個の炭素原子を有する
酸素化溶媒、例えばアルコール類、エーテル類等であり
得る。通常、約20重量％未満の割合で共溶媒が存在す
る。試料の性質によりある程度状況は異なるが、試料自
体が水性媒質の一部または全部を占め得る。 媒質のpHは、通常４−11、さらに普通は５−10の範囲
および好ましくは約６−９の範囲である。結合成分の結
合親和力を有する重要な部位およびシグナル発生系によ
るシグナルの最適な発生を維持できるようにpHを選択す
る。様々な緩衝液を用いて所望のpHを達成し、アッセイ
の間そのpHを維持することができる。例えば、ほう酸緩
衝液、燐酸緩衝液、トリス緩衝液、バルビタール等があ
る。使用する特定の緩衝液は厳密ではないが、個々のア
ッセイにおいて、ある緩衝液の方が別の緩衝液よりも好
ましいことはあり得る。 望ましくは、約0.05〜0.5重量％の非イオン性デター
ジェントを試料中に含ませる。約200〜20000ダルトンの
様々なポリオキシアルキレン化合物が使用され得る。 アッセイを実施する場合、通常中程度および望ましく
は実質的に一定の温度を用いる。アッセイおよび検出可
能なシグナルの製造温度は、一般に約４゜−50℃の範
囲、さらに普通は約10゜−40℃の範囲であり、周囲温
度、すなわち約15゜−25℃であることが多い。 測定され得るアナライトの水性試験溶液中における濃
度は、一般に約10−^４〜約10−¹⁵モル、さらに普通は約
10−^６〜10−¹⁴モルの範囲である。問題のアナライトの
濃度およびプロトコル等を考慮して通常他の試薬の濃度
を決定する。 試料および試薬溶液中の様々な試薬の濃度は一般にア
ナライトの関心の対象となる濃度範囲により決定される
が、各試薬の最終濃度は、普通対象範囲外で測定感度を
最適化するよう経験的に決定される。ある種のプロトコ
ルの場合、個々の試薬は、測定感度に有害な影響を与え
なければ実質的過剰量で使用され得る。 ストリップのサイズについては幾つか考慮すべき点が
ある。第１に考慮すべき点は、１種またはそれ以上のア
ナライトが試験溶液中に存在し、高感度で正確な測定を
達成するに充分なシグナルが発生する場合、充分な量の
１種またはそれ以上の第1sbp成分を予め定められた部位
に移動させることである。毛管の流れが主に上向きであ
る場合、ストリップの長さおよび厚さによりストリップ
に沿って通過し得る溶液の量が左右される。大量の試験
溶液の移動が望ましい場合、予め定められた部位の上方
のストリップの流体吸収力は、所望の容量に適う程度に
充分でなければならない。ストリップを用いて主に下向
きの流れを与えることにより試験溶液を吸収する場合、
この容量条件は要求されない。さらに、吸収性材料を試
験溶液との接触に使用されていないストリップの端部と
接触させる場合もまた、容量に関する必要条件は除外さ
れる。一般に、上向きの流れのストリップの場合、流体
保持容量は、通常20μより大きく、好ましくは少なく
とも50−200μである。下向きの流れのストリップの
場合、２−20μの低い保持容量でも使用され得るが、
20−200μの容量が好ましい。 ストリップの厚さは厳密ではないが、通常0.1−2mm、
普通は0.15−1mm、好ましくは0.2−0.7mmである。一般
的に、最少限の厚さは材料の強さおよび容易に検出可能
なシグナルを生産する必要性により決定されるが、最大
幅は操作の便利さおよび試薬の費用により決定される。 試薬の保存を可能にし、限られたサイズの試料を提供
するためには、ストリップの幅は一般的に比較的狭く、
通常20mm未満、好ましくは10mm未満である。一般的に、
ストリップの幅は約1.0mm未満ではなく、普通約2mm〜12
mm、好ましくは約4mm〜8mmの範囲である。 ストリップの横断面の寸法については、矩形に関して
前記事項で記載したが、これは説明を目的とするもので
限定ではない。前述のように、他の横断面の形状、例え
ば円形、三角形（triagonal）、長円形等の場合も等し
くこの発明の範囲内に含まれる。それらの寸法は、この
明細書を参考として当技術分野の熟練者により測定され
得る。 ストリップの長さは、１種またはそれ以上のアナライ
トの濃度および実用上考慮すべきこと、例えば操作の容
易さにより異なり、約1cm〜40cm、普通約2cm〜25cm、好
ましくは約４〜20cmであるが、実用的な長さであればよ
い。ストリップの構造は多様であり得、微細、中程度に
微細、並、中程度に粗大および粗大なものを含む。一般
に、孔のサイズが小さく材料が微細であると、毛管の流
れは遅くなりストリップ上の結合コンジュゲートの捕獲
は効果的となる。当然材料が高多孔質であると、流れは
速くなるが、捕獲の効率は低下する。材料の多孔性は所
定のアッセイにおける成分の結合割合に従い選択され
る。 予め定められた部位の位置は、この発明に係る基礎原
理により決定される。接触部分からの最少距離は、その
間の吸収性材料が約2sbp成分と非拡散結合する能力によ
り決定される。すなわち、結合されなければならない各
sbp成分の最少量は、予め測定された最少検出可能アナ
ライト量と等しい。アナライトが存在しない場合、第1s
bp成分は接触部分からある程度距離をおいたストリップ
の部分で第2sbp成分に結合する。アナライトが存在する
場合この距離は増すため、明らかに、予め定められる部
位の位置は、不正確な（偽の）陽性測定結果を避けるた
めに接触端部からさらに距離をあけなければならない。
非常に高感度の検出が要求される場合、さらに僅かだけ
距離をあけて部位を定めるのが望ましい場合もあり得
る。感度が厳密ではない場合、ストリップの接触部分と
反対のストリップ端部の近くに部位を定めるのが望まし
い。望ましくは、部位をストリップの接触部分から少な
くとも10mm、好ましくは少なくとも30mmの部分に定める
べきである。試験溶液が毛管作用によって前記部位を通
過して未結合第1sbp成分を捕らえることができれば、端
部との距離をさらに広げることもあり得る。こうして、
部位を前記端部から「離して」定める。 シグナル発生系の成分である他の試薬の濃度は、特定
のプロトコルおよびシグナル発生におけるそれらの役割
により大きく変化し得る。第１および第2sbp成分の量
は、試験溶液中に存在するアナライトの予め測定された
最少検出可能量および予め定められた部位の位置に基づ
いて選択される。通常、試験溶液中の各第1sbp成分の濃
度は、試験溶液が予め測定された最少検出可能量のアナ
ライトを含有する結果、試験溶液中の対応するアナライ
トの濃度を越えることはない。好ましくは第1sbp成分の
濃度は対応するアナライト濃度より５〜20倍低い。一般
に、アナライトが全く存在しない場合に、予め定められ
た部位に移動する第1sbp成分が皆無となるように第1sbp
成分の量を選ぶ。 第2sbp成分は実質的に均一にストリップに結合する。
接触部分および予め定められた部位間に結合した各第2s
bp成分の量は、アナライトの予め測定された最少検出可
能量プラス試験溶液中の対応する第1sbp成分の量と大体
等しい。従って、前記部位を接触部分から遠くへ動かす
ことが望ましい場合、ストリップの各第2sbp成分の密度
を減らすだけでよい。逆に、ストリップ上の第2sbp成分
の密度を増やすことにより前記部位を接触部分の近くへ
移動させることができる。 測定を実施するとき、通常プロトコルには水性媒質中
にアナライトの含有が疑われる試料と対応する第1sbp成
分を合わせて水性試験溶液を生成することが含まれる。
試料は、多様な供給源例えば生理的液体、例えば唾液、
血液、血清、血漿、尿、水晶体液、髄液等、食物、例え
ばミルクおよびワイン、化学処理流体、食物廃液等に由
来するものであり得る。 通常接触部分を試験溶液中に浸すことにより、ストリ
ップの接触部分、通常端部を試験溶液と接触させる。し
かしながら、吸収性材料と試験溶液との接触は、他の技
術、例えば吸収性材料片に試験溶液を滴下することによ
り行うことができる。この技術は円形、長円形、シート
状等の吸収性材料片に対して特に適している。毛管作用
によりストリップを湿らす場合は、普通少なくとも前記
部位が湿るまで続けられる。普通、ストリップの大部分
を試験溶液で湿らす。 殆どの場合、比較的短時間で試験溶液をストリップに
浸透させることができる。通常、試験溶液がストリップ
に浸透する所要時間は、少なくとも30秒かつ１時間以
内、普通は約１分〜30分である。シグナル発生手段に酵
素を用いる場合、一般にシグナル発生の所要時間は30秒
〜30分、普通は約30秒〜５分の範囲である。 液体がストリップに浸透した後、検出可能なシグナル
の存在について予め定められた部位を検査する。シグナ
ルが放射性標識等の結果である場合、直接シグナルを検
出することができる。化学薬剤が標識を含むシグナル発
生手段の一部を形成する場合、ストリップの接触部分を
顕色液に浸すことにより、ストリップに沿って予め定め
られた部位まで毛管作用で移動させ得る。別法として、
予め定められた部位を例えばスポッティングにより、顕
色液と直接接触させることができる。 酵素を標識として用いる場合、基質は通常顕色液中に
実質的過剰量で存在するため濃度の制限は生じない（Km
より高い濃度）。顕色液は普通酵素系において適度に緩
衝状態を呈している。 前記部位を顕色液と接触させた後、ストリップを顕色
液もしくは試験溶液中に存在しないかまたはストリップ
上に存在するシグナル発生系の残りの成分があればこれ
と接触させる。シグナル測定前に充分な時間をおいて必
要量のシグナル発生化合物を生成させる。検出可能なシ
グナルが発生すると、試料中のアナライトの少なくとも
１種が予め測定された最少検出可能量またはそれ以上で
存在することが判る。 ストリップを広範な種類の材料で被覆することによ
り、強化特性を与えることができる。被覆には蛋白質被
覆、多糖類被覆、合成ポリマー、糖等を挙げることがで
き、これらは特にストリップにコンジュゲートした材料
の安定性強化に用いられる。またこれらの化合物を用い
て材料の結合、例えば抗体結合等を改良することができ
る。 ストリップを反応性官能基で活性化して、例えば米国
特許第4168146号に記載されているが（この中の適切な
箇所を引用して説明の一部とする）、共有結合により有
機材料をストリップにコンジュゲートさせることができ
る。 第2sbp成分、および所望によりシグナル発生系の成分
を共有結合ではなく吸着により結合させることができる
が、この結合は非拡散的ではないものとする。この方法
は、材料を含む溶液と吸収性支持体とを接触させてスト
リップと結合させ、ストリップを乾燥させることを必要
とする。一般に、この方法は吸収性支持体が比較的疎水
性であるか高い表面電荷を有する場合のみ有用であり、
蛋白質、デタージェント、多糖類、または非特異的結合
部位を遮断し得る他の材料による後処理が必要とされ得
る。 この発明の好ましい態様において、複数の薬剤の１種
またはそれ以上を含有する疑いのある試料を１種または
それ以上の薬剤の存在についてスクリーニングすること
ができる。適当な液体媒質中で試料および少なくとも２
種またはそれ以上の複数の第1sbp成分、例えば各々薬剤
の１つと標識から成るコンジュゲート（ただし、各コン
ジュゲートは同一または異なり得る）を一緒に混合する
ことにより試験溶液を調製する。アッセイの結果は、例
えばスクリーニングアッセイにおいていずれか１種の薬
剤が存在するか否かを示すものであるが、どの薬剤が存
在するかを示すものではない。 例えば、この発明の一態様では、１価の薬剤である２
種のアナライトが存在する。薬剤の含有が疑われる試料
を酵素と各薬剤の１つとの予め測定された量のコンジュ
ゲートと混合して水性試験溶液を生成する。吸収性スト
リップには予め測定された量の各薬剤の抗体が均一に結
合している。その結果、接触部分を試験溶液と接触させ
ると、試験溶液が予め定められた部位に達する前に予め
測定された最少検出可能量に満たない量の薬剤およびコ
ンジュゲートは捕獲される。薬剤が試料中に存在する場
合、薬剤およびコンジュゲートは一緒にストリップに浸
透する。試料中に薬剤が多いとき、コンジュゲートおよ
び薬剤は予め定められた部位に向かってさらに移動す
る。どちらの薬剤も試料中に存在しない場合、各コンジ
ュゲートは全部薬剤の抗体と結合し、予め定められた部
位に到達する前に捕獲される。予め測定された最少量を
越えた量の薬剤の一方または両方が存在する場合、コン
ジュゲートの一方または両方は予め定められた部位に移
動する。酵素基質との接触によるテストストリップの後
続の顕色では、試料中に与えられた１種またはそれ以上
の薬剤の存在は、予め定められた部位におけるシグナル
の発生により示される。 この方法では、毛管作用により試験溶液はストリップ
の全体または一部に浸透し得る。試験溶液を予め定めら
れた部位を通ってストリップ全体に浸透させる場合、続
いて酵素基質を含む顕色液にストリップを浸すことがで
きる。前記態様の変形として、試験溶液の容量をストリ
ップの一部のみに浸透し得る程度の量にすると、ストリ
ップの乾燥部分の液体吸収力を少なくとも接触部分から
予め定められた部位までの部分の液体吸収力と等しくす
ることができる。次にストリップの接触部分を顕色液と
接触させ得る。顕色液は毛管現象によりストリップに沿
って移動する。その際、顕色液により試験溶液の残りは
予め定められた部位を通って移動する。１種またはそれ
以上のアナライトが試験溶液中に存在する場合、シグナ
ルが発生する。 便宜上、この発明の装置は、１種または複数のアナラ
イトの測定に使用される予め測定された量の試薬をパッ
ケージした組合わせを含むキットとして提供され得る。
酵素が標識として使用される場合、試薬は酵素標識アナ
ライトを含み、顕色液は、酵素の基質または前駆体を含
み、例えばさらに必要な基質、酵素およびコファクター
並びに酵素生成物の反応相手があればそれも含むことに
より、検出可能な発色団または蛍光団を提供し得る。さ
らに、他の添加剤、例えば補助試薬、例えば安定剤、緩
衝剤等も含有され得る。様々な試薬の相対量を広い範囲
で調節することにより、実質的に測定感度を最適化する
溶液中の試薬濃度を達成することができる。賦形剤を含
めて試薬は、通常凍結乾燥した乾燥粉末として提供され
得、溶解することにより測定の遂行に適した濃度を有す
る試験溶液を調製することができる。 〔実施例〕 以下、実施例によりこの発明をさらに詳しく説明す
る。温度は摂氏（℃）である。 実施例１ HRPのコンジュゲートの製造 反応フラスコ中に8.1mgの１−メチル−３−（3'−カ
ルボキシプロピル）キサンチン、3.8mgのＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド（NHS）、6.7mgの１−エチル−３−
（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDCI）お
よび125μのジメチルホルムアミド（DMF）を導入し、
混合物を室温で一夜放置した。 0.1モルの炭酸ナトリウム（pH9.0）中HRP−オキシア
ミン（1mg）の1.3m試料に上記で調製したエステルを
加えた。このために0.217mのDMFおよび66μの上記
エステル調製液を合わせ、約２時間にわたって8.25μ
の増量割合で加えた。加えている間温度を４゜に維持
し、次いで混合物を４゜で一夜放置した。 次いで反応混合物を標準緩衝液を用いてＧ−25セファ
デックス（商標）によるクロマトグラフィーにかけた。 フェノバルビタール、フエニトイン、カルバマゼピン
およびモルヒネとHRPのコンジュゲートもまた同様の方
法で製造された。 （試薬） 0.1モル燐酸緩衝液、0.2モルNaCl含有、pH7.0 2.0mg/mうしガンマグロブリン 0.1mg/mグルコースオキシダーゼ 0.05％トリトンQS−15デタージェント（シグマ・ケミ
カル社、セントルイス、ミズーリ） HRP−コンジュゲート、下記の中の１種または全部。 0.25μg/mHRP−テオフィリン 0.50μg/mHRP−フェノバルビタール 0.15μg/mHRP−フェニトイン 2.00μg/mHRP−カルバマゼピン （顕色液） 1.17g/ NaH₂PO₄ 0.90g/ Na₂HPO₄ 50ミリモル ベータＤ−（＋）−グルコース 400μg/m ４−クロロ−１−ナフトール 20μ/m N,N−ジメチルホルムアミド 0.05％トリトンQS−44、pH6.5 （用紙の製造） 溶液 １）浸漬液−pH9.5 0.1モル重炭酸ナトリウム緩衝液 2mg/m フェニトインに特異的な抗体（またはフェ
ニトイン、フェノバルビタール、テオフィリンおよびカ
ルバマゼピンの抗体混合物）＋ひつじ免疫グロブリン ２）キャッピング溶液、pH9.5 0.3モル エタノールアミン 0.15モル HCl ３）洗浄溶液 0.1モル燐酸緩衝液＋0.2モルNaCl、pH7.0、脱イオン
水 ４）保存剤 0.6％ポリビニルアルコール20/30 ５）手順 カルボニルジイミダゾール活性化ワットマン31ET紙を
浸漬液に浸し、室温で１時間インキュベートした。前記
の紙を室温で一夜キャッピング溶液により処理した。こ
の紙を燐酸緩衝液で２回および脱イオン水で１回各々20
分間洗浄した。前記の紙を約20分間保存剤に浸すことに
より保存した。この紙をトンネル乾燥器中65℃で約８分
間乾燥した。 （アッセイプロトコル） 1.0mの試験溶液を16×100mmの試験管に注ぎ、試験
アナライト（テオフィリン、フェノバルビタール、フェ
ニトインおよびカルバマゼピン）の１種または全部を含
む12.0μのキャリブレーターを加えた。製造された紙
の１片（ストリップ）を試験溶液と一緒に試験管に入
れ、室温で15分間毛管作用により紙に吸収させた。次い
で10mの顕色液を含む第２の16×100mm試験管に前記ス
トリップを移した。５分後顕色液からストリップを取り
出した。ストリップにおける青色の存在を調べた。 A.単一系…試験溶液中に１種のアナライト。 試験溶液はHRP−フェニトインおよび12μの各フェ
ニトインキャリブレーターを含んでいた。前記の紙はフ
ェニトイン特異的抗体のみを含んでいた。 B.複数系…試験溶液中に上記アナライトの全部。 試験溶液は４種のHRP−アナライトコンジュゲート全
部、および４種のアナライト全部を含有する12μのキ
ャリブレーター（各々下記第１表に示す濃度）を含んで
いた。全部の紙は前述の４種の特異的抗体全部を含んで
いた。 （結果） 単一および複数系は等しい結果をもたらしたが、これ
は本発明の装置および方法を用いて試料中の１種または
それ以上のアナライトの存在を測定することができるこ
とを示す。試験溶液中に存在する疑いのある薬剤の特定
の予め測定された最少量により異なるが、第１表のデー
タを参考にして吸収性材料上に予め部位を定めることが
できる。 実施例２ 実施例１の記載と同様に製造された試薬および用いら
れた方法を用いて下記第２表に要約されたアッセイを行
った。結果は３種の独立した実験の平均であり、下記２
−５表に記載する。 上記のデータから、この発明の方法および装置を用い
て１種またはそれ以上のアナライトの含有が疑われる試
料中における１種またはそれ以上のアナライトの存在の
測定を行い得ることが判る。試験溶液中に存在する疑い
のある薬剤の特定の予め測定された最少量により異なる
が、第２−５表のデータを参考にして吸収性材料上に予
め部位を定めることができる。 特定の実施例を用いて本発明の詳細な記載を行った
が、この発明の精神および範囲内で変形および修正が行
なわれ得ることはいうまでもない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デイビット・ジェイ・リットマン アメリカ合衆国カリフォルニア 94022、 ロス・アルトス、オーク・アベニュー （番地の表示なし) (72)発明者 トーマス・エム・リー アメリカ合衆国カリフォルニア 95035、 ミルピタス、アバディーン・ウェイ 666番 (72)発明者 ローラ・リー・ブエルテマン アメリカ合衆国カリフォルニア 95125、 サン・ホセ、ハートフォード・アベニュ ー（番地の表示なし) (72)発明者 エミー・トン−イン・ウォン アメリカ合衆国カリフォルニア 94022、 ロス・アルトス・ヒルズ、アルタ・ティ エラ・ロード 13080番 (56)参考文献 特開 昭60−249057（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−28662（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−142463（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−227168（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−25553（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．各々のアナライトがリガンドおよびそれに相補的な
   レセプターから成る特異的結合対（「sbp成分」）の一
   員である、１種またはそれ以上の前記アナライトの含有
   が疑われる試料中に予め決定された最少検出可能量また
   はそれ以上の量で存在する複数のアナライトの１種また
   はそれ以上の存在の測定方法であって、 （ａ）前記試料、および各々前記アナライトの１つと類
   似した２種またはそれ以上の第1sbp成分の予め決定され
   た量を含む試験溶液と、毛管移動によって前記試験溶液
   を少なくとも一方向に浸透させ得る吸収性（bibulous）
   材料片の接触部分とを接触させ、ただし前記吸収性材料
   には各々前記アナライトおよび第1sbp成分に結合し得る
   ２種またはそれ以上の第2sbp成分の予め決定された量が
   実質的に均一および非拡散結合しているため、予め決定
   された量の各アナライトが存在する場合、類似第1sbp成
   分は少なくとも前記接触部分から離れた吸収性材料片上
   の予め定められた部位に移動し、 （ｂ）毛管移動によって少なくとも試験溶液の一部を前
   記吸収性材料片に浸透させて少なくとも前記の予め定め
   られた部位に到達させ、 （ｃ）予め定められた部位において１種またはそれ以上
   の第1sbp成分を検出する ことを含んで成る方法。 ２．第1sbp成分と相互作用して検出可能なシグナルを発
   生し得るシグナル発生手段に吸収性材料を曝すことによ
   り第1sbp成分が検出され、予め定められた部位における
   シグナルの存在が試料中における１種またはそれ以上の
   アナライトの存在を示す、特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ３．予め定められた部位における第1sbp成分の存在が前
   記予め定められた部位をシグナルの存在について検査す
   ることにより直接検出される、特許請求の範囲第１また
   は２項記載の方法。 ４．ストリップが紙のストリップである、特許請求の範
   囲第１、２または３項記載の方法。 ５．第2sbp成分の各々がそれぞれアナライトの抗体であ
   る、特許請求の範囲第１〜４項のいずれか１項記載の方
   法。 ６．各第1sbp成分がそれぞれ標識とコンジュゲートさせ
   る、特許請求の範囲第１〜５頁のいずれか１項記載の方
   法。 ７．標識が酵素である、特許請求の範囲第６項記載の方
   法。 ８．第２酵素が吸収性材料の少なくとも予め定められた
   部位を含む領域に均一に結合し、酵素間の関係として一
   方の酵素の生成物が他方の酵素の基質である、特許請求
   の範囲第７項記載の方法。 ９．アナライトの各々が薬剤であり、第1sbp成分の各々
   が標識にコンジュゲートされた対応する薬剤類似体であ
   り、各第2sbp成分がそれぞれ前記薬剤の１つに対応する
   抗体である、特許請求の範囲第１〜８項のいずれか１項
   記載の方法。 １０．（ｂ）段階において試験溶液を前記吸収性材料片
   に浸透させて予め定められた部位を通過させる、特許請
   求の範囲第１〜９項のいずれか１項記載の方法。 １１．吸収性材料がこれと結合した予め定められた部位
   においてのみ１種またはそれ以上の第1sbp成分を検出し
   得る手段を有する、特許請求の範囲第１〜10項のいずれ
   か１項記載の方法。 １２．前記手段が吸収性材料の前記接触部分および予め
   定められた部位間の部分を視覚から隠している、特許請
   求の範囲第11項記載の方法。 １３．１種またはそれ以上のアナライトの含有が疑われ
   る試料中に予め決定された最少検出可能量またはそれ以
   上の量で存在する複数のアナライトの１種またはそれ以
   上の存在の測定方法であって、 （ａ）前記試料、および各々酵素にコンジュゲートされ
   た２種またはそれ以上のアナライト類似体の予め決定さ
   れた量を含む試験溶液と、毛管移動によって前記試験溶
   液を浸透させ得る吸収性材料ストリップの端部とを接触
   させ、ただし前記ストリップには予め決定された量の２
   種またはそれ以上の抗体が実質的に均一および非拡散結
   合しており、各々の抗体は前記アナライト類似体および
   その対応するアナライトの１つと結合し得、その結果予
   め決定された量のアナライトが存在する場合対応するア
   ナライト類似体が少なくとも前記端部から離れた予め定
   められた部位に移動し、 （ｂ）少なくとも試験溶液の一部を毛管移動によって前
   記ストリップに浸透させて予め定められた部位を通過さ
   せ、そして （ｃ）１種またはそれ以上の前記アナライト類似体の存
   在について予め定められた部位を検査し、それが存在す
   る場合には試料中に１種またはそれ以上のアナライトの
   存在を示す ことを含んで成る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １４．各アナライトが特異的結合対の一員であり、各々
   がアナライトの１つにそれぞれ類似している２種または
   それ以上の第1sbp成分の予め決定された量を含む試験溶
   液中に予め決定された最少量またはそれ以上の量で存在
   する複数のアナライトの１種またはそれ以上の存在を測
   定する装置であって、 毛管移動によって前記試験溶液を浸透させ得る、試験溶
   液との接触部分を有する吸収性材料片および 前記吸収性材料に実質的に均一および非拡散結合した、
   各々前記アナライトの１つに相補的である、予め決定さ
   れた量の２種またはそれ以上の第2sbp成分（ただし前記
   予め決定された量の前記第2sbp成分は前記アナライトの
   少なくとも１つの存在下で第1sbp成分が前記接触部位か
   ら離れた吸収性材料片上の予め定められた部位に移動す
   るものである）および 予め定められた部位においてのみ１種またはそれ以上の
   第1sbp成分を検出し得る、前記吸収性材料に結合した手
   段 を含んで成る装置。 １５．試験溶液中のアナライトの存在の測定に用いられ
   るキットであって、 （ａ）各アナライトが特異的結合対の一員であり、各々
   がアナライトの１つにそれぞれ類似している２種または
   それ以上の第1sbp成分の予め決定された量を含む試験溶
   液中に予め決定された最少量またはそれ以上の量で存在
   する複数のアナライトの１種またはそれ以上の存在を測
   定する装置であって、 毛管移動によって前記試験溶液を浸透させ得る、試験溶
   液との接触部分を有する吸収性材料片および 前記吸収性材料に実質的に均一および非拡散結合した、
   各々前記アナライトの１つに相補的である、予め決定さ
   れた量の２種またはそれ以上の第2sbp成分（ただし前記
   予め決定された量の前記第2sbp成分は前記アナライトの
   少なくとも１つの存在下で第1sbp成分が前記接触部位か
   ら離れた吸収性材料片上の予め定められた部位に移動す
   るものである）および 予め定められた部位においてのみ１種またはそれ以上の
   第1sbp成分を検出し得る、前記吸収性材料に結合した手
   段 を含んで成る装置、 （ｂ）シグナル発生系の一部としての２種またはそれ以
   上の第1sbp成分、 （ｃ）必要な場合には１種またはそれ以上のアナライト
   が存在する場合に検出可能なシグナルを発生させるのに
   役立つシグナル発生系の他の成分、および （ｄ）必要に応じた補助物質 をパッケージした組み合わせとして含むキット。