JP2723128B2 - 改良１段階ヘテロジニアスアツセイ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明の分野） ハプテン、抗原およびレセプターのようなアナライト
（analyte、分析質）の迅速かつ正確な定量法として、
数多くの方法が開発されている。一群のアッセイには、
吸収性（bibulous）支持体と酵素コンジュゲートが含ま
れる。支持体上の色素の存否がアッセイ媒質中のアナラ
イト量の指標となる。このようなアッセイの開発に際し
ては、プロトコルを単純化することが望ましい。多数の
独立した手操作を含むプロトコルは、多数の誤差をもた
らし得る。また、技術者が異なると結果に大きな相違が
生じ得る。さらに、多段階プロトコルは、そのプロトコ
ルが自動化できない限り通常退屈である。自動化アッセ
イは普通精巧な機械を必要とし、そのため大形臨床実験
室以外での該アッセイの遂行が妨げられる。 したがって、プロトコルを単純化し、アッセイの実施
または結果を向上させることの容易性を保持することに
よって既存のアッセイを単純化し得ることには関心が持
たれる。アッセイ試薬を予め定めた量で供給し、使用者
による計量を回避するということが特に重要である。 （従来の技術） 米国特許第4168146号は、テストストリップイムノア
ッセイを記載している。米国特許第4299916号は、吸収
性支持体およびアッセイ媒質中のアナライト量に関係し
て支持体に結合する酵素を用いる酵素アッセイを記載し
ている。また、4299916号の部分継続出願である米国特
許第4391904号も参照されたい。米国特許第4366241号
は、イムノアッセイ実施用の別の装置を記載している。
出願番号第398505号（1982年７月15日出願）は、２種の
酵素を含む酵素的クロマトグラフィー・イムノアッセイ
を記載している。 １段階ヘテロジニアスアッセイは1984年４月20日出願
の米国特許出願第602297号〔欧州特許出願第85302761.3
号（1985年４月19日出願）〕に記載されている。モルフ
ィンについての内部対照テストストリップイムノアッセ
イは、リトマン等によるクリニカル・ケミストリー（Cl
in.Chem.）1983年、29巻、1598〜1603頁に記載されてい
る。 ［発明の要約］ この発明によると、特異的結合対の構成員およびシグ
ナル発生系の構成員を含むアッセイのための方法および
組成物が提供される。シグナル発生系は、アナライトの
含有が推察される試料中のアナライトの存在または量に
関係して検出可能なシグナルを発生することができる。
本発明の改良点は、引き続きの別段階で試薬の添加を行
なわずにイムノアッセイにおいてシグナルの発生を一時
的に遅延させることからなる。シグナル発生系の構成員
は、例えば、相互に反応して、直接、または例えば色素
もしくはクロモゲインとの相互作用によってシグナルを
産生することのできる生成物を生成する酵素およびその
基質を含むことができる。シグナル発生の遅延は、有効
量のシグナル阻害剤を使用することにより達成でき、こ
の物は酵素のもう１つの基質となり得、または酵素およ
びその基質の生成物と反応することができる。 本発明は、シグナル発生の一時的遅延が望まれるヘテ
ロジニアスおよびホモジニアスアッセイの両者に対し適
用性を有する。 ［個々の態様の記述］ 上述のごとく、本発明は、アナライトの含有が推察さ
れる試料中のアナライトの量に関係してシグナルを発生
する、特異的結合対の構成員およびシグナル発生系の構
成員を含むアッセイに関するものである。本発明の結果
として、シグナルの発生は引き続き試薬の添加をするこ
となく遅延させることができる。好ましい態様において
は、少なくとも２種のシグナル発生系の構成員間の反応
が遅延する。 このようなアッセイの例は、ヘテロジニアスおよびホ
モジニアス両者の酸素的イムノアッセイである。例えば
このようなアッセイの１つは、同種性（homologous）特
異的結合対の構成員間の反応を介した、吸収性支持体へ
の酵素の結合を含んでいる。アッセイの結果は、酵素触
媒により基質から生成物が形成される結果として起こる
顕色の変化によって測定する。酵素の基質はアッセイ媒
質に溶解可能であるか、または支持体に含浸させること
ができる。特異的結合対の構成員は、通常、吸収性支持
体に非拡散結合する。 本発明を適用し得るアッセイの別の例は防御アッセイ
であり、この場合、酵素に対する抗体は非結合酵素の活
性を制限するが、アナライトとの免疫複合体中の酵素の
活性は制限し得ない。このようなアッセイに際しては、
酵素活性が充分に制限されるまでシグナルを遅延させる
ことが望ましい。このようなアッセイは米国特許第4233
401号に記載されており、これは参照のために付記して
本明細書の一部とする。 本発明においては、シグナル発生反応のための阻害剤
をアッセイ媒質中に添加する。阻害剤の性質および量
は、シグナルの発生を一時的に遅延させる、即ち、一定
の時間、かつ一定の時間に限り、シグナル発生を遅らせ
るような性質および量である。例えば、シグナルの発生
は、特異的結合対の構成員とその相補的特異的結合対の
構成員の結合に要する時間と同等の時間だけ遅延させる
ことができる。別の方法では、シグナルの発生は、アッ
セイ媒質が吸収性材料のストリップを移動するに要する
のと同等の時間だけ遅延させることができる。 本発明の特定の態様についてさらに記述を進めるに先
立って、一連の用語を定義する。 アナライト：測定される化合物または組成物であって、
リガンドであってよい特異的結合対の構成員であり、こ
れは１価または多価の、通例抗原性またはハプテン性で
ある、単一化合物、または少なくとも１個の共通結合部
位もしくは決定部位またはレセプターを共有する化合物
群である。 リガンドアナライトは１価または多価であるという特
徴を有し、一方レセプターアナライトは単一のまたは多
数の結合部位を有し得る。多価アナライトは、通常ポリ
（アミノ酸）、即ちポリペプチドおよび蛋白質、多糖
類、核酸、およびその組み合わせである。このような組
み合わせまたは集合体には、バクテリア、ウイルス、染
色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜等が含まれ
る。 大抵、多価リガンドアナライトは少なくとも約5000、
より普通には少なくとも約10000の分子量を有する。ポ
リ（アミノ酸）の範疇においては、興味深いポリ（アミ
ノ酸）は通常約5000〜5000000の分子量、より普通には
約20000〜1000000の分子量であり、興味深いホルモンで
は約5000〜60000の分子量である。 有用なリガンドの詳細な列挙は米国特許大4275149号
の12〜17欄にかけての記載に見出すことができ、これを
引例としてここに付記する。 １エピトープ性リガンドアナライトは通例約100〜200
0の分子量、より普通には約125〜1000の分子量である。
興味深いアナライトには、医薬、代謝産物、農薬、汚染
物質等が含まれる。 興味深い多数のアナライトが米国特許第4275149号17
および18欄に列挙されており、これを引例としてここに
付記する。 興味深い医薬にはアルカロイドが包含される。アルカ
ロイドの中には、モルフィン、コデイン、ヘロイン、デ
キストロメトルファン、これらの誘導体および代謝産物
を包含するモルフィンアルカロイド；コカインおよびベ
ンゾイルエクゴニン、これらの誘導体および代謝産物を
包含するコカインアルカロイド、リセルグ酸のジエチル
アミドを包含するエルゴットアルカロイド；ステロイド
アルカロイド；イミナゾイルアルカロイド；キナゾリン
アルカロイド；イソキノリンアルカロイド；キニンおよ
びキニジンを包含するキノリンアルカロイド；ジテルペ
ンアルカロイド、これらの誘導体および代謝産物があ
る。 医薬の次の群には、エストロゲン、エストゲン、アン
ドロゲン、男性副賢皮質ステロイド、胆汁酸を包含する
ステロイド類、ジゴキシンおよびジゴキシゲニンを包含
する強心配糖体およびアグリコン、サポニンおよびサポ
ゲニン、これらの誘導体および代謝産物が含まれる。さ
らに包含されるのは、ジエチルスチルベストロールのよ
うな疑似ステロイド物質である。 医薬の次の群は、５〜６の環成員を有するラクタム類
であって、これにはフェノバルビタールおよびセコバル
ビタールのようなバルビツール酸塩類、ジフェニルヒダ
ントイン、ピリミドン、エトスクシイミド、およびこれ
らの代謝産物が含まれる。 医薬の次の群は、炭素原子数２〜３個のアルキルを有
するアミノアルキルベンゼン類であり、これには、アン
フェタミン類、エフェドリン、Ｌ−ドーパ、エピネフリ
ン、ナルセイン、パパベリンを包含するカテコールアミ
ン類、およびこれらの代謝産物が含まれる。 医薬の次の群は、ベンズ複素環類であり、これにはオ
キサゼパム、クロルプロマジン、テグレトール、イミプ
ラミン、これらの誘導体および代謝産物が含まれ、該複
素環はアゼピン類、ジアゼピン類およびフェノチアジン
類である。 医薬の次の群は、プリン類であって、これにはチオフ
ィリン、カフェイン、これらの代謝産物および誘導体が
含まれる。 医薬の次の群は、大麻から誘導される医薬であって、
これはカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノー
ルを含む。 医薬の次の群には、Ａ、Ｂ、例えばB₁₂、Ｃ、Ｄ、Ｅ
およびＫ、葉酸、チアミンのようなビタミンが包含され
る。 医薬の次の群はプロスタグランジン類であり、これは
ヒドロキシ化および不飽和の程度と部位によって異な
る。 医薬の次の群は抗生物質であって、これにはペニシリ
ン、クロロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラサ
イクリン、テラマイシン、その代謝産物および誘導体が
含まれる。 医薬の次の群はヌクレオシドおよびヌクレオチドであ
って、これには、適当な糖およびリン酸置換基を含むAT
P、NAD、FMN、アデノシン、グアノシン、チミジン、お
よびシチジンが含まれる。 医薬の次の群は、多岐に渡る個々の医薬であって、こ
れにはメサドン、メプロバメート、セロトニン、メペリ
ジン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、リドカイ
ン、プロカインアミド、アセチルプロカインアミド、プ
ロプラノロール、グリセオフルビン、バルプロン酸、ブ
チロフェノン類、抗ヒスタミン薬、アトロピンのような
抗コリン薬、これらの代謝産物および誘導体が含まれ
る。 病的状態に関連する代謝産物には、スペルミン、ガラ
クトース、フェニルピルビン酸、およびポルフィリン１
型が含まれる。 医薬の次の群は、ゲンタマイシン、カナマイシン、ト
ブラマイシン、およびアミカシンのようなアミノ配糖体
である。 興味深い農薬の中には、ポリハロゲン化ビフェニル
類、リン酸エステル類、チオホスファート類、カルバメ
ート類、ポリハロゲン化スルフェンアミド類、これらの
代謝産物および誘導体がある。 好適には、アナライトはテオフィリン、フェノバルビ
タールまたはフェニトイン（ジフェニルヒダントイン）
である。 レセプターアナライトについては、分子量が一般に約
10⁴〜２×10⁸、より普通には約３×10⁴〜２×10⁶であ
る。免疫グロブリン、例えばIgA、IgD、IgE、IgMについ
ては、分子量は通例約160000〜約10⁶まで変化する。酵
素は、通常約10000〜600000ダルトンまで変化する。天
然のレセプターは広範に変化し、一般に少なくとも約25
000分子量であって10⁶およびそれ以上であることもあ
り、このような物質として、アビジン、チロキシン結合
グロブリン、チロキシン結合プレアルブミン、トランス
コルチン、膜表面蛋白質等が含まれる。 多エピトープ性リガンドアナライトは普通、ポリ（ア
ミノ酸）、即ちポリペプチドおよび蛋白質、多糖類、核
酸、およびその組合わせである。このような組み合わせ
には、バクテリア、ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコ
ンドリア、核、細胞膜等が包含される。 特異的結合対の構成員:2種の異なる分子のうちの一方で
あって、他方の分子の特定の空間的および極性構成（or
ganization）に対して特異的に結合する領域を表面上ま
たはキャビティ内に有する。特異的結合対の構成員は、
リガンドおよびレセプター（アンチリガンド）と称され
る。これらは通例免疫対の構成員であるが、ビオチン−
アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター等のような他
の特異的結合対は免疫対ではない。相補物質はリガンド
およびレセプターであり、一方、類似物質はリガンドま
たはレセプターのいずれかであって、これらは何らかの
方法、例えば標識化によって識別される。 リガンド：これに対するレセプターが天然に存在する
か、またはレセプターを製造し得る有機化合物。 レセプター（「アンチリガンド」）：分子の特定の空間
的および極性構成、即ちエピトープ部位または決定部位
を認識できる化合物または組成物。レセプターの例に
は、天然に存在するレセプター類、例えばチロキシン結
合グロブリン、抗体、酵素、Fabフラグメント類、レク
チン類、核酸、プロティンＡ、補体成分Ｃlq等が含まれ
る。 リガンド類縁体：類似リガンドとレセプターを競合し
得る修飾リガンド（modified ligand）であり、修飾は
リガンド類縁体を他の分子に結合する手段を提供する。
通例リガンド類縁体は、リガンド類縁体とハブ（hub）
または標識とを連結する結合による水素の置換より多く
の点で、リガンドと異なるが、これが必要条件ではな
い。 リガンドが別の分子または支持体にコンジュゲートし
ている場合、このリガンドは、しばしば修飾されて特定
の部位に特定の官能基を備える。この修飾がリガンド類
縁体と称される生成物を作り出す。米国特許第4275149
号にも、18欄および19欄にかけてリガンド類縁体の詳細
な記述があり、これを参照のため本明細書に引用する。 ポリ（リガンド類縁体）：通例ハブ核に共有結合した多
数のリガンドまたはリガンド類縁体。ハブ核は、通常重
合した多官能性物質であり、普通、結合部位として多く
の官能基、例えばヒドロキシ、アミノ、メルカプト、エ
チレン等を有する。ハブ核は通例水に可溶、または少な
くとも分散可能であって、普通、少なくとも約35000ダ
ルトンであるが、一般に約600000ダルトンを超えない。
ハブ核の例としては、多糖類、ポリペプチド（蛋白質を
含む）、核酸、イオン交換樹脂等が含まれる。 吸収性材料：毛管力によって溶媒、通常は水性媒質のよ
うな移動性物質を通過させ易い、孔径が少なくとも0.1
μの多孔質材料。このような材料は、一般に親水性であ
るか、または親水性とすることができ、シリカ、硫酸マ
グネシウムおよびアルミナのような無機粉末；天然ポリ
マー材料、特にセルロース性材料およびセルロースから
誘導される材料、例えば繊維含有紙（例えば瀘紙、クロ
マトグラフ紙等）；ニトロセルロース、酢酸セルロー
ス、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋デ
キストラン、アガロース、ポリアクリレート等のような
合成または修飾天然ポリマーを含み、そのまま、または
セラミック材料等の他の材料と組み合わせて使用する。
吸収性材料は支持体に付着することができる。他方、吸
収性材料はこれ自身を支持体とすることができる。吸収
性材料は、多官能性であるか、または多官能性となるこ
とができ、sbp成分の共有結合および他の化合物の結合
を許し、シグナル発生系の一部を形成し得る。 吸収性材料は、その性質を向上させるために多様な材
料で被覆することができる。被覆は蛋白質被覆、多糖類
被覆、糖などを含み、これらは支持体にコンジュゲート
した材料の安定性を高めるために特に用いられる。これ
らの化合物は、吸収性材料に結合した特異的結合対の構
成員またはシグナル発生系の構成員のような材料の結合
を改善するために使用することもできる。 吸収性材料は反応性官能基によって活性化され、米国
特許第4168146号に記載のごときストリップにコンジュ
ゲートする有機材料の共有結合を提供できる。 吸収性材料に結合する特異的結合対の構成員の量は、
標識化した全特異的結合対の構成員を結合するに要する
量に依存して変わり、これは米国特許第4435504号に記
載されている。特異的結合対の構成員と吸収性材料の結
合は、通例文献に記載のよく知られた技術によって達成
できる。例えば「イモビライズド・エンザイムズ（Immo
bilized Enzymes）」、シバタイチロウ、ハルステッド
・プレス、ニューヨーク、1978年、およびカトレカサ
ス、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Bio.Chem.）245巻3059頁（1970年）を参照された
い。 吸収性材料は、ストリップ状に切断したシートのよう
な単一構造であるか、または例えば薄層クロマトグラフ
ィーに見られるような、支持体または固体表面に結合し
た粒状材料であってよい。 支持体を所望するかまたは必要とする場合、吸収性材
料の支持体は、通常水不溶性、非多孔質かつ硬質であ
り、普通吸収性ストリップと同じ長さおよび幅を有する
が、これより大きくても小さくてもよい。支持体がスト
リップの毛管作用またはアッセイ成分の非特異的結合を
妨害せず、またシグナル発生系を妨害しない限り、多様
な天然および合成の有機および無機材料ならびにその組
み合わせを使用し得る。ポリマーの例としては、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、
ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテ
レフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレー
ト）、ガラス、セラミックス、金属等が含まれる。 標識特異的結合対の構成員：特異的結合対の構成員にコ
ンジュゲートした標識（例えば触媒、通例酵素である）
であって、シグナル発生系の一員である。 標識：標識は、他の分子または吸収性支持体にコンジュ
ゲートした任意の分子であってよく、２種の分子が含ま
れる場合には、いずれの分子を標識にするかは随意に選
択される。本発明においては、標識は支持体または特異
的結合対の構成員にコンジュゲートしたシグナル発生系
の一員である。標識は通例触媒、例えば補酵素および酵
素である。 シグナル発生系：シグナル発生系は１またはそれ以上の
成分を有していてよく、少なくとも１成分は特異的結合
対の構成員にコンジュゲートした標識である。シグナル
発生系は、測定可能なシグナルの発生に必要な全ての試
薬を含んでおり、標識にコンジュゲートしている場合の
特異的結合対の第１構成員および顕色剤の成分を含む。
特異的結合対の第１構成員が標識にコンジュゲートして
いない場合、標識は通例特異的結合対の第１構成員に相
補的な特異的結合対の構成員に結合し、普通、顕色剤の
一部に含まれている。顕色剤の他の成分には、基質、補
酵素、エンハンサー、第２酵素、活性化剤、補因子、阻
害剤、捕捉剤、金属イオン、シグナル産生物質の結合に
必要な特異的結合物質等がある。シグナル発生系の成分
は、補酵素、酵素生成物と反応する物質、他の酵素およ
び触媒等のようにストリップに結合していてよい。シグ
ナル発生系は、外的手段、通例電磁放射の測定、好まし
くは視覚的検査によって検出できるシグナルを提供す
る。大抵、シグナル発生系は発色性基質および酵素を含
み、発色性基質は、紫外または可視領域の光線、燐光ま
たは蛍光を吸収する色素に酵素的に変換される。 シグナル発生系は、少なくとも１種の触媒（通例少な
くとも１種の酵素）および少なくとも１種の基質を含む
ことができ、２種またはそれ以上の触媒および複数の基
質を含んでいてもよく、１つの酵素の基質が他の酵素の
生成物であるような酵素の組み合わせを含んでいてもよ
い。シグナル発生系の働きは、標識特異的結合対の構成
員からなる特異的結合対の構成員複合体の形成の結果、
支持体に結合した触媒の量に関係した検出可能なシグナ
ルを提供する生成物を生成することである。 シグナル発生系は、通例シグナル産生化合物である化
合物の生成を導くが、幾つかの例においては、この化合
物は、表面に結合してシグナル産生化合物の生成、増強
または破壊を伴う別の化合物と反応し得る。酵素性およ
び非酵素性触媒の両者を使用できるが、通常シグナル発
生系には少なくとも１種の酵素触媒を使用する。１種類
の触媒だけがある場合、この触媒は、普通特異的結合対
の構成員複合体の生成によって特異的結合対の構成員に
コンジュゲートする。触媒に加えて、変換を受けて測定
表面での検出可能なシグナルの変化をもたらす基質がな
ければならない。大抵の場合、標識特異的結合対の構成
員により触媒される変換がもたらす生成物は、シグナル
産生化合物である。 １種の酵素および１種の非酵素性触媒の組み合わせ、
または一方の酵素の生成物が他方の基質であるという関
係にある２種の酵素、という２種の触媒を使用すること
もできる。この系においては、これらの触媒により触媒
される連続的変化を受け、その結果、検出可能なシグナ
ルの発生を行なう化合物を導く、ただ１種の基質しか必
要としない。しかしながら通例は、一連の反応における
第１の酵素のための基質と、通常シグナルを発生する化
合物を提供する、シグナル発生に関係する化合物の前駆
体としての役割を果たす第２の化合物とが存在する。即
ち、第１の酵素の生成物は、シグナル発生化合物の前駆
体と反応して、シグナル産生化合物を提供し得る。 通常、含まれる反応は加水分解または酸化還元反応で
ある。加水分解の場合、酵素的変化を受け易い結合を有
する誘導色素前駆体、および不溶性色素生成物への変換
を触媒する酵素が、この型の系の例である。酸化還元反
応の場合、第１酵素が第２酵素のために必須の酸化基質
を生成し、そこで第２酵素がこの酸化基質と色素前駆体
との間の反応を触媒する。 ２種の酵素を使用する場合、第１の酵素反応は、別の
酵素の基質となる生成物を提供するための、基質の加水
分解的開裂または酸化還元反応を含むことができる。第
１の状況は、アルカリホスファターゼによってグルコー
スに触媒的加水分解されるグルコース−６−リン酸によ
って例示でき、ここでグルコースはグルコースオキシダ
ーゼに対する基質である。第２の状況は、グルコースが
グルコースオキシターゼにより酸化されて過酸化水素を
生成し、これがロイコ色素と酵素的に反応してシグナル
産生物を生成することによって例示できる。 対で用いる触媒には、さらに、酵素および非酵素性触
媒を含んでいてもよい。非酵素性触媒によって触媒され
る反応を受ける反応体を酵素が生成することができ、ま
たは、酵素に対する基質（補酵素を含む）を非酵素性触
媒が生成し得る。使用できる多種の非酵素性触媒が米国
特許第4160645号（1979年７月10日登録）に記載されて
おり、その適当な部分を参照のためここに付記する。 シグナル産生化合物を得るために多様な酵素の組み合
わせを使用することができる。特に、加水分解酵素の組
み合わせは、不溶性シグナル産生物の生成に用いること
ができる。別法として、加水分解酵素および酸化還元酵
素の組み合わせがシグナル産生化合物を提供することが
できる。さらに、酸化還元酵素の組み合わせが不溶性シ
グナル産生化合物の生成に使用し得る。 酵素の組み合わせに対しては、一方の酵素がストリッ
プに非拡散結合でき、他方の酵素がsbp成分にコンジュ
ゲートする。さらに、選択される特定のシグナル発生系
または続く特定のプロトコルに応じて、１またはそれ以
上のシグナル発生系の他の成分がストリップに結合し得
る。 シグナルの性質の故に、検出可能なシグナルを得るた
めには、標識の存在によって生成するシグナルを増幅す
る手段を供給することが望ましい。したがって、標識は
通常触媒または発光性化合物であることが好ましく、最
も好ましくは触媒である。好ましい触媒は酵素および補
酵素であって、これらは単一の標識から多数のシグナル
産生分子を生成することができる。 例えば色素のように光を吸収し、または蛍光剤のよう
に照射時に光を放射する生成物を生成することにより所
望の増幅を与える酵素または補酵素が使用される。別法
として、触媒反応により直接的放射、例えば化学的発光
を導くことができる。このような生成物を提供するため
の多数の酵素および補酵素が、米国特許第4275149号19
〜23欄にかけて、そして米国特許第4318980号10〜14欄
に示されており、これらを参照のため本明細書に付記す
る。 特に興味深いのは、一方の酵素の生成物が他方の酵素
の基質であるという関係にある酵素の組み合わせの使用
である。この方法においては、変化を受け易い基質に至
る安定な前駆体が供給でき、第２酵素のための基質は、
時期尚早に反応を開始することなく第１酵素と組み合わ
されて蓄積され得る。 数多くの酵素の組み合わせが米国特許第4275149号23
〜28欄にかけて開示されており、これらの組み合わせを
本発明に利用することができる。この記載は参照のため
に本明細書に記すものである。 特に興味深いのは、過酸化水素の生成と、その過酸化
水素を色素前駆体から色素への酸化に使用することを含
む酵素である。特定の組み合わせには、色素前駆体の酸
化に過酸化水素を使用する酵素、即ち西洋ワサビペルオ
キシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、およびミクロペ
ルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼと組合わせた
糖オキシダーゼ、例えばグルコースおよびガラクトース
オキシダーゼ、またはウリカーゼおよびキサンチンオキ
シダーゼのような複素欄オキシダーゼが含まれる。その
他の酵素の組み合わせは、参照のために引用した文献に
見出すことができる。 １つの酵素を標識として使用する場合、他の酵素は、
加水分解酵素、トランスフェラーゼ、および酸化還元酵
素、好ましくはアルカリホスファターゼおよびβ−ガラ
クトシダーゼのごとき加水分解酵素のような用途を見出
すことができる。別法として、ホタルルシフェラーゼお
よび細菌性ルシフェラーゼのようなルシフェラーゼを使
用してもよい。 使用可能な補酵素の例としては、NAD〔Ｈ〕;NADP
〔Ｈ〕、ピリドキサルリン酸;FAD〔Ｈ〕;FMN〔Ｈ〕等が
あり、通常補酵素は還化反応を含んでおり、特に米国特
許第4318980号を参照されたい。 酵素反応の生成物は通例、色素または蛍光物質であ
る。多数の蛍光物質の例が米国特許第4275149号30およ
び31欄に示されており、これを参照のためにここに付記
する。 補助材料：本発明に係るアッセイでは、しばしば種々の
補助材料を用いる。例えば、通例アッセイ媒質中には緩
衝剤が存在し、これは安定剤を含んでいてもよい。これ
らの添加物に加えて、さらに、アルブミン類のような蛋
白質、または界面活性剤、特にポリアルキレングリコー
ル類等のような非イオン性界面活性を含んでいてもよい
ことがしばしばである。 イムノクロマトグラフ：イムノクロマトグラフは、吸収
性支持体に一部位において結合したリガンドまたはレセ
プターである特異的結合対の構成員を有し、これは、毛
管現象によりその部位を横切ってアナライトおよび適宜
シグナル発生系の任意の成分の運搬を伴った液体の移動
をさせる。特異的結合対の構成員は共有結合または非共
有結合のいずれかで支持体に非拡散的に結合する。特異
的結合対の構成員が均一に結合している領域を「免疫吸
着領域」と称する。さらに、１またはそれ以上のシグナ
ル発生系の成分が、共有結合または非共有結合により、
吸収性支持体に非拡散的に結合することができる。ま
た、酵素基質のような特異的結合対の構成員のための反
応体が支持体に結合し得る。 特に興味深い１つの装置が米国特許第4168146号に記
載されている。修飾を施したこの装置は、吸収性ストリ
ップの大半の部分に渡って均一に非拡散結合した特異的
結合対の構成員を有している。この装置の末端または先
端は、相補的特異的結合対の構成員を含む試料溶液（ア
ッセイ媒質）中に浸漬しており、試料溶液は装置の上方
の他の末端の方へ移動することができる。洗浄後、この
装置を酵素に結合した特異的結合対の構成員（「特異的
結合対の構成員−酵素コンジュゲート」）を含む溶液中
に浸漬すると、コンジュゲートは装置上に残っている結
合可能な部位に結合する。これらの部位は、試料中のア
ナライトの存否の結果にしたがって利用可能となる。装
置を洗浄した後、酵素の基質を有する顕色剤溶液に浸漬
する。装置上の検出可能な色素の所在は、試料中のアナ
ライトの量に関係する。 このような装置には種々の変更を施して単純化したプ
ロトコルを得ることができる。特に興味が持たれるのは
酵素の組み合わせの使用であり、この場合特異的結合対
の構成員の対に加えて１種の酵素もまた装置の大半の部
分に結合する。第２の酵素は特異的結合対の構成員に結
合する。２種の酵素は、一方の基質が他方の生成物であ
るという関係にある。この酵素の組み合わせを使用する
ことにより、第１酵素の基質を伴う特異的結合対の構成
員・酵素コンジュゲートと試料とを結び付けることでプ
ロトコルを単純化することができる。アッセイ結果は色
素の顕示された最大範囲によって測定し、これは主とし
て線状であるが、特異的結合対の構成員−酵素コンジュ
ゲートが結合している全域にわたって広がることもあ
る。このアッセイのより詳細な記述については米国特許
第4435504号を参照されたく、この引例は参照のために
ここに付記するものである。 浸漬ストリップ：別の興味ある装置は、アッセイ試料中
に導入された吸収性成分を含むものである。この吸収性
成分は支持体上に装着された小形素子であってよく、当
該素子はアッセイ媒質中に完全に浸漬する。素子に結合
するのは特異的結合対の構成員と、適当であれば酵素と
であって、上記記載と同一の機能を有する。特異的結合
対の構成員−酵素コンジュゲートが使用され、これはア
ッセイ媒質中のアナライト量に比例して素子に結合す
る。素子は、洗浄により、または場合によって洗浄しな
くてもアッセイ媒質から離脱し、しかる後、酵素の基質
を含む顕色剤中に浸漬する。アナライトが試料中に存在
する場合は着色不溶性生成物が得られる。この着色生成
物は、素子に結合した特異的結合対の構成員（アナライ
ト）−酵素コンジュゲートの量に比例して、素子上に沈
殿する。この装置は米国特許第4391904号に記載されて
おり、この引用は参照のためにここに記すものである。 浸漬ストリップは、しばしばアッセイ媒質中に浸漬さ
れる２種の素子を含む。一方の素子はアッセイ素子であ
り、他方の素子は標準である。 イムノクロマトグラフおよび浸漬ストリップは、どち
らも特異的結合対の構成員−酵素コンジュゲートの基質
を吸収性因子中に含浸することによって修飾でき、その
結果色素が生産される。このアッセイ条件下では、基質
は酵素の作用を受けて、酸素的触媒作用により速やかに
着色生成物に変換され、これが吸収性因子と結合して、
アッセイ媒質中のアナライト量に関係する検出可能なシ
グナルを発生する。発色を行なう物質と共に吸収性因子
を含浸することにより、アッセイ媒質を調整するために
用いられる試薬混合物が単純化し、バックグラウンドが
減少し、より定量的な結果が得られる。この改良法は、
1984年４月20日出願の米国特許出願第602297号（1985年
４月19日出願の欧州特許出願第8530276.3号）に記載さ
れており、この引用は参照のためにここに付記するもの
である。 シグナル阻害剤：シグナル発生系の構成員の存在下で一
時的に検出可能シグナルの発生を遅延させる化合物。
「一時的に」という語は、シグナル発生が、一定時間、
かつ一定時間に限り遅れることを意味する。障害剤は、
シグナル発生系の構成員の１つとの反応またはシグナル
発生系の構成員の生産物との反応といったようなシグナ
ル発生系の構成員との相互作用により、このような反応
を遅延させることができる。この意味においてシグナル
障害剤は消耗され得る。例えば、シグナル発生系の構成
員が触媒である場合、シグナル阻害剤は、この触媒によ
り触媒される反応を受ける化合物であってよい。酵素お
よび酵素基質であるシグナル発生系の構成員に対して
は、シグナル阻害剤は、その酵素の別の基質または基質
の酵素触媒反応によって生成する生成物と反応する化合
物であってよい。 酵素ペルオキシダーゼであるシグナル発生系の構成員
のためのシグナル阻害剤の特定の例は、アスコルビン酸
または塩、エステル等のようなその誘導体である。本発
明に係るシグナル阻害剤のその他の例としては、フェリ
シアン化物、尿酸、ヒドロキノン類、グルタチオン、ジ
チオエリスリトール／ジチオトレイトール、亜硫酸ナト
リウム等がある。その他の例には、システイン、並びに
dl−Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトンおよびＮ
−アセチル−Ｌ−システインのようなシステイン誘導
体、２−メルカプト−プロピオニルグリシン、重亜硫酸
ナトリウムのような亜硫酸塩、ならびに2,3−ジメルカ
プト−１−プロパンスルホン酸が含まれる。阻害剤の組
み合わせを使用することもできる。 このアッセイの実施にあたり、プロトコルは通例、ア
ナライトの含有が予想される試料を水性媒質に溶解する
ことを含む。試料は多様な供給源から得られ、例えば唾
液、血液、血清、血漿、尿、眼内レンズ液、脊髄液等の
ような生理的液体、化学的加工後の流液、食物、農薬、
汚染物質等がある。 水性媒質は、他の極性溶媒の約40重量％までとするこ
とができ、特に炭素原子数１〜６個、より普通には１〜
４個の酸素化溶媒であってよく、アルコール類、エーテ
ル類等を含む。通例約20重量％より少量の共存溶媒を存
在させる。 媒質のpHは通常４〜11、より普通には５〜10の範囲と
し、好ましくは約6.5〜9.5の範囲とする、pHは、特異的
結合対の構成員の結合親和性をかなりのレベルに維持で
きるよう選択する。所望のpHを実現しアッセイの間その
pHを維持するために、種々の緩衝剤を使用することがで
きる。緩衝剤の例は、硼酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリ
ス、バルビタール等である。どの特定の緩衝剤を使用す
るかは決定的とはならないが、個々のアッセイでは、あ
る１種の緩衝剤が他のものより好ましいことがある。 好ましくは約0.05〜0.5重量％の非イオン性洗浄剤を
試料に含有させる。約200〜20000ダルトンの種々のポリ
オキシアルキレン化合物が使用できる。 中位の、そして望ましくは実質上一定の温度を通例こ
のアッセイの実施に用いる。アッセイおよび検出可能シ
グナルの発生のための温度は、一般に約10゜〜50℃、よ
り普通には約15゜〜50℃の範囲であり、しばしば周囲温
度、即ち約15゜〜25℃である。 液体試料中のアッセイ可能なアナライトの濃度は、一
般に約10^-4〜約10^-15M、より普通には約10^-6〜10^-14Mま
で変わり得る。関心の対象であるアナライトおよびプロ
トコルのような事柄を考慮することにより、通例他の試
薬の濃度が決定される。 試料中の種々の試薬および試薬溶液の多くの濃度は、
一般に関心の対象であるアナライトの濃度範囲によって
決定されるが、各試薬の最終濃度は、通例、関心の対象
である範囲に渡りアッセイ感度を最適とするよう実験的
に定められる。しかしながらあるプロトコルについて
は、個々の試薬を、アッセイ感度に有害な影響を及ぼさ
ない実質的過剰量で使用してよい。 シグナル発生系の成分である他の試薬は、特定のプロ
トコルおよびシグナル発生の際におけるその役割に応じ
て、濃度を広範に変え得る。通常、標識sbp成分は、関
心の対象である最大アナライト濃度の10倍を超えず、関
心の対象である最小濃度の0.5倍より少なくはない。他
の多くの状況においては、特異的結合対の構成員複合体
形成の際に用いられる他の試薬の量は、アナライトの結
合当量より実質上少ないか、またはアナライトの結合当
量に対し実質的過剰量で存在し得る。したがって、単純
な相関を述べることはできない。 シグナル阻害剤はアッセイ媒質中に有効量、即ちシグ
ナルの発生を一時的に遅延させるに充分な量だけ存在さ
せる。したがってこの量は、かかる遅延の達成を所望す
る時間の長さ、シグナル発生系の構成員の性質、シグナ
ル阻害剤の性質、アッセイがヘテロジニアスかホモジニ
アスか、等によって決定される。通例シグナル阻害剤は
アッセイ媒質中に約10^-7〜５×10^-1モル、好ましくは10
^-6〜10^-2モル、より好ましくは10^-5〜10^-3モルの量を存
在させる。 このアッセイを実施するにあたり、プロトコルは通
常、試料をアッセイ媒質中に溶解することを含み、これ
はさらに１またはそれ以上のシグナル発生系の構成員お
よび有効量のシグナル阻害剤を含有していてもよい。 イムノクロマトグラフについては、クロマトグラフの
一端がアッセイ媒質に接触している。先端の溶媒が完全
に免疫吸着領域に移動するまで充分な時間をかける。こ
の領域は、これに結合した充分量の特異的結合対の構成
員を有しているため、領域内に結合し特異的結合対の構
成員を使い尽くしてしまうことなく全てのアナライトを
確実に領域内にに結合させることができる。 多様なプロトコルを使用することができるが、通例ア
ッセイ溶液には、試料、アナライト、特異的結合対の構
成員コンジュゲート、およびシグナル阻害剤、ならびに
緩衝剤、洗浄剤、酵素の別の基質のようなその他の試薬
が含まれる。有用な結果を得るための種々の試薬の特定
濃度は実験的に定めることができる。 アッセイ媒質は充分な時間をかけて免疫吸着領域に移
動させ、その結果、先端の溶媒は、免疫吸着領域の全て
または実質上全てに移動する。得られたイムノクロマト
グラフは次いで充分な時間放置して、シグナル阻害剤を
消費させ、発色をさせる。着色の高さをアッセイ媒質中
のアナライト量の指標として読み取ることができる。 浸漬ストリップについては、このストリップは、少な
くとも酵素コンジュゲート、試料、およびシグナル阻害
剤を有する上記と同様の成分を有するアッセイ媒質中に
浸漬する。酵素コンジュゲートと、吸収性因子に結合し
たその相互結合成分との反応、ならびにシグナル阻害剤
の消耗に充分な時間を経た後、この因子をアッセイ媒質
から除去し、シグナル阻害剤が使い尽くされている場合
は直ちに、または検出可能なシグナルが観察されるに充
分な時間だけ放置して読み取りを行なう。洗浄は必要で
ある場合も必要でない場合もある。 複合体を形成していない酵素の酵素活性を制限する、
酵素に対する抗体を含む、防御アッセイについては、こ
のアッセイ媒質は、アナライトの含有が予想される試
料、類縁体と酵素のコンジュゲート、アナライトに対す
る抗体、酵素に対する抗体、酵素基質、および酵素活性
が完全に制限されるまでシグナル発生を遅延させるに足
る量のシグナル阻害剤を含む。酵素活性が制限され、シ
グナル阻害剤が消費されるだけの時間が経過した後に、
媒質の酵素活性を測定して標準に対する関係を求め、ア
ナライトの量を決定する。 簡便のために、アナライトのアッセイにおける使用の
ために予め定められた量にパッケージされた組み合わせ
のキットとして試薬類を提供することができる。この試
薬類には、酵素または酵素群（酵素標識特異的結合対の
構成員を含む）、酵素または酵素群のための基質、シグ
ナル阻害剤、酵素の必要とするその他の基質および補因
子、検出可能な発色団または蛍光発色団を提供する色素
前駆体、ならびに適当な場合には吸収性ストリップ等が
含まれている。さらに補助試薬のようなその他の添加
物、例えば安定剤、緩衝剤等を含んでいてもよい。種々
の試薬の相対値は、アッセイ感度を実質上最適とする試
薬の溶液中濃度を与えるよう、広範に変化させ得る。試
薬は通例賦形剤を含有する凍結乾燥させた乾燥粉末とし
て供給でき、これは溶解すると、アッセイの実施のため
に適当な濃度を有する試薬溶液を提供する。 ［実施例］ 以下の実施例を、限定のためではなく例示のために提
示する。 以下の略語を以後使用する。h:時間、HRP:西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、NHS:N−ヒドロキシスクシンイミ
ド、EDAC:エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミ
ド、DMF:ジメチルホルムアミド、BSA:牛血清アルブミ
ン。温度は別途指定しない限り摂氏であり、また、割合
は、容量による液体混合物の場合を除き、重量によるも
のである。 実施例１ HRP−オキシアミンの製造 5mMの酢酸ナトリウム（pH4.5）緩衝液中の10mg/mlの
西洋ワサビペルオキシダーゼ5mlに0.2M過ヨウ素酸ナト
リウム50mlを加え、混合物を30分間撹拌し、引き続き2m
Mの酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）で溶出するＧ−50セ
ファデックスカラムのグロマトグラフィーに付す。蛋白
分画を29mlになるまで集め、混合物を４℃に冷却し、４
℃の0.5M炭酸塩緩衝液（pH9.5）中の0.2M2,2′−オキシ
−ビス−エチルアミン2.9mlを加える。混合物のpHを1N
水酸化ナトリウムで9.5に調節し、2h撹拌し、4mg/mlの
水素化硼素ナトリウム水溶液3.52mlを加え、この混合物
を3h反応させ、その後セファデックスＧ−50カラムのク
ロマトグラフィーに付す。 HRP400mgおよび2,2′−オキシ−ビス−エチルアミン
3.5gを用いて上記操作を反復する。元のアミンと、さら
に約４個のアミノ基を有する修飾アミンとの間に、酵素
活性において有意な変化は認められなかった。 実施例２ グルコースオキシダーゼアミンの製造 グルコースオキシダーゼ（シグマ製、E.C.1.1.3.4）
を360mlから60mlに濃縮（32mg/ml）し、２回透析し、濾
過する。グルコースオキシダーゼ溶液51.5mlに0.2M過ヨ
ウ素酸ナトリウム5.15mlを滴下し、25分間にわたり反応
させる。生成物を2mMの酢酸ナトリウム（pH4.5）を用い
て2.5×60cmのセファデックスＧ−50カラムでクロマト
グラフィーに付し、主要なグルコースオキシダーゼのピ
ークを集めると、アルデヒド誘導体を含有する溶液91.5
mlが得られる。この溶液に、0.2M炭酸ナトリウム（pH9.
5）に入れた3Mエチレンジアミン6mlを滴下し、反応を３
時間進行させる。この混合物に10mg/mlの水素化硼素ナ
トリウム約3.9mlを加える。混合物を一夜インキュベー
トし、次いでクロマトグラフィーにかけて水素化硼素ナ
トリウムを除去する。 実施例３ イムノクロマトグラフの製造 ワットマン31ET紙１枚（185×230mm）をピリジン1.8
中のカルボニルイミダゾール0.2Mに浸漬し、混合物を
室温で１時間穏やかに撹拌する。同じ活性化溶液中でも
う１枚を活性化する。次いで各々のシートをテトラヒド
ロフラン300mlで洗浄し、空気噴射器で約20分間風乾す
る。 重炭酸塩緩衝液〔pH9.5（NaHCO₃70mMおよびNa₂CO₃30m
M）〕中に抗テオフィリン（2mg/ml）およびグルコース
オキシダーゼアミン（0.1mg/ml）を含有する溶液（100m
l）を盆に入れる。上記のごとく調製した紙１枚をこの
盆に入れ、上記の抗体溶液中に漬ける。1h後、エタノー
ルアミン500mlを盆に加える。さらに１時間後、シート
を盆から取り、NaH₂PO₄100mM（pH7.0）およびNaCl200mM
を含む緩衝液500mlで２回洗浄する。次いでこのシート
を脱イオン水500mlで１回洗浄する。 上記の洗浄の後、シートを、水性0.5％ポリビニルア
ルコール250mlに、または酵素基質をイムノクロマトグ
ラフに含浸させる場合は４−クロロ−１−ナフトール40
0μg/mlを含む水性0.5％ポリビニルアルコール250ml
に、約20分間浸漬する。シートをポリビニルアルコール
溶液から出し、吸取紙で吸い取り、65℃で５分間トンネ
ル乾燥する。 実施例４ テオフィリンおよびHRPのコンジュゲート 反応フラスコに１−メチル−３−（３′−カルボキシ
プロピル）キサンチン8.1mg、NHS3.8mg、EDAC6.7mgおよ
びDMF125μを導入し、混合物を室温で一夜放置する。 0.1M炭酸ナトリウム中にHRP−オキシアミン（1mg）を
入れた４個の1.3mlの試料に、上記で調製した種々の量
のエステルを加えて、テオフィリン対HRPのモル比が40
0、200、および100のものを２個調製する。第１の反応
混合物（モル比400）にDMF0.217mlおよび増分8.25μ
で上記エステル66μを約2hかけて添加する。第２の反
応混合物（モル比200）にはDMF0.238mlを加え、増分8.2
5μでエステル33μを漸次加える。第３の反応混合
物（モル比100）にはDMF0.24mlを加え、増分8.2μで
エステル16.5μを加え、一方最後の反応混合物（モル
比100）にはDMFは添加せず、増分2.1μでエステル8.2
5μを加える。添加の間、温度は４゜に維持し、次い
で混合物を４゜で一夜放置する。 次に反応混合物を、標準的緩衝液を用いるＧ−25セフ
ァデックスのクロマトグラフィーによって後処理する。
フォリンおよびUV分光分析により、テオフィリン/HRP比
がそれぞれ6.9、4.0、1.6および2.1であることが示され
た。 実施例５ イムノクロマトグラフィーアッセイテオフィ
リン（各10μ）を緩衝化媒質と合して、テオフィリン
濃度が各々０、10および40μg/mlとなるようにする。こ
の緩衝化媒質は水性緩衝化媒質（pH7.0のリン酸塩緩衝
化食塩水）であって、この外に実施例４のコンジュゲー
ト150ng/ml、グルコース0.05M、BSA1mg/ml、および４−
クロロ−１−ナフトール200μg/mlを含有している。各
試料をアスコルビン酸についてそれぞれ0.001M、0.002
M、0.01M、および0.02Mとする。対照はアスコルビン酸
を含まないが、上記に列挙した他の試薬は含有させる。 実施例３で調製した４−クロロ−１−ナフトール含浸
シートを予め6.5×90mmのストリップに切っておく。ス
トリップの末端（約5mm）を上記試料の各々に浸し、媒
質を10分間ストリップ中で移動させる。 ストリップの発色を観察した。アスコルビン酸を含む
アッセイ媒質と接触させたストリップ上では、各々発色
はおよそ３分（0.001M）、７分（0.002M）、30分（0.01
M）、および60分間（0.02M）遅れた。着色は最初免疫吸
着領域の上部に顕われ、漸次ストリップの下部に向かっ
て下方に広がった。着色先端の図形は鮮明であり、着色
の形成は均一であった。この結果は対照より優れてお
り、対照において発色は下部から上方に向かって直ちに
始まり、散漫な先端と不均一な着色となった。 実施例６ クロモゲンとして４−クロロ−１−ナフトー
ルを用いる全血試料のイムノクロマトグラフィーアッセ
イ 各々０、2.5、５、10、20、および40μg/mlのテオフ
ィリンを含有する全血試料（12.5μ）を、緩衝化媒質
1.0mlと合する。この緩衝化媒質は水性媒質（pH7.0のリ
ン酸塩緩衝化食塩水）であって、この外に実施例４のコ
ンジュゲート1.6μg/ml、グルコース0.05M、アスコルビ
ン酸塩0.003M、４−クロロ−１−ナフトール400μg/m
l、BSA16mg/ml、およびヒト赤血球に対する抗体15μ
を含有している。 実施例３で調製したシートを予め4.5×90mmのストリ
ップに切っておく。ストリップの末端（約5mm）を上記
試料の１つずつに浸し、媒質を毛管作用によってストリ
ップの頂点へと移動させる（10分間）。 15分後にストリップの発色を観察した。ストリップの
下部から着色領域の頂点までの距離を、種々のテオフィ
リン濃度を有する試料について測定し、以下の結果を得
た。 実施例７ クロモゲンとしてジ−カルボキシジンを用い
るイムノクロマトグラフィーアッセイ 各々５、15、および30μg/mlのテオフィリンを含有す
る全血試料（12.5μ）を、緩衝化媒質1.0mlと合す
る。緩衝化媒質は水性媒質（pH7.0のリン酸塩緩衝化食
塩水）であって、この外に、実施例４のコンジュゲート
1.0μg/ml、BSA2mg/ml、ジカルボキシジン600μg/ml、
アスコルビン酸塩0.002M、およびヒト赤血球に対する抗
体40μを含有している。 実施例３で調製したシート（酵素基質に含浸していな
いもの）を予め4.5×90mmのストリップに切っておく。
ストリップの末端（約5mm）を上記試料の１つずつに浸
し、媒質を毛管作用によりストリップの頂点へと移動さ
せる（10分間）。 15分後にストリップの発色を観察する。ストリップの
下部から着色領域の頂点までの距離を測定することによ
り、種々のテオフィリン試料について以下の結果が得ら
れた。 上記の結果は、本発明に従えば１段階で全血試料中の
テオフィリンの正確なアッセイが実施できることを立証
するものである。発色は、シグナル阻害剤（上記実施例
ではアスコルビン酸）を含まないアッセイ媒質に比べ、
より鮮明であり、より均質であり、かつ優れている。 実施例８ クロモゲンとしてジ−カルボキシジンを用い
るフェニトインのイムノクロマトグラフィーアッセイ 各々０、2.5、５、10、20および30μg/mlのフェニト
インを含有する血清試料（12.5μ）を緩衝化媒質1.0m
lと合する。緩衝化媒質は水性媒質（pH7.0のリン酸緩衝
化食塩水）であり、この外に実施例４と同様の方法で製
造したフェニトインHRPコンジュゲート0.5μg/ml、BSA2
mg/ml、ジカルボキシジン600μg/ml、およびアスコルビ
ン酸塩0.004Mを含んでいる。 抗フェニトインを用いる実施例３のようにして調製し
たシート（酵素基質に含浸していないもの）を予め4.5
×90mmのストリップに切っておく。ストリップの末端
（約5mm）を上記試料の１つずつに浸し、媒質を毛管作
用によってストリップの頂点へと移動させる（10分
間）。 15分後にストリップの発色を観察する。ストリップの
下部から着色領域の頂点までの距離を測定することによ
り、種々のフェニトイン試料について以下の結果が得ら
れた。 上記の結果は、本発明に従えば１段階で血清試料中の
フェニトインの正確なアッセイが実施できることを立証
するものである。発色は、シグナル阻害剤（上記実施例
ではアスコルビン酸）を含まないアッセイ媒質に比べ、
より鮮明であり、より均質であり、かつ優れている。 実施例９ クロモゲンとしてジ−カルボキシジンを用い
るフェノバルビタールのイムノクロマトグラフィーアッ
セイ 各々０、５、10、20、40および80μg/mlのフェノバル
ビタールを含有する血清試料（12.5μ）を緩衝化媒質
1.0mlと合する。緩衝化媒質は水性媒質（pH7.0のリン酸
塩緩衝化食塩水）であり、この外に、実施例４と同様の
方法で製造したフェノバルビタールHRPコンジュゲート
0.9μg/ml、BSA2mg/ml、ジカルボキシジン600μg/ml、
およびアスコルビン酸塩0.003Mを含有している。 抗フェノバルビタールを用い実施例３のようにして調
製したシート（酵素基質に含浸していないもの）を予め
4.5×90mmのストリップに切っておく。ストリップの末
端（約5mm）を上記試料の１つずつに浸し、媒質を毛管
作用によってストリップの頂点へと移動させる（10分
間）。 15分後にストリップの発色を観察する。ストリップの
下部から着色領域の頂点までの距離を測定することによ
り、種々のフェノバルビタール試料について以下の結果
が得られた。 上記の結果は、本発明に従えば１段階で血清試料中の
フェノバルビタールの正確なアッセイが実施できること
を立証するものである。発色は、シグナル阻害剤（上記
実施例ではアスコルビン酸）を含まないアッセイ媒質に
比べ、より鮮明であり、より均質であり、かつ優れてい
る。 実施例10 クロモゲンとしてジ−カルボキシジン、シグ
ナル阻害剤としてＮ−アセチル−Ｌ−システインを用い
るイムノクロマトグラフィーアッセイ 各々０、25、および40μg/mlのテオフィリンを含有す
るテオフィリン試料（12.5μ）を緩衝化媒質1.0mlと
合する。緩衝化媒質は水性媒質（pH7.0のリン酸塩緩衝
化食塩水）であり、外に実施例４のコンジュゲート0.5
μg/ml、BGGmg/ml、ジカルボキシジン600μg/ml、およ
びＮ−アセチル−Ｌ−システイン1mg/mlを含有してい
る。 実施例３で調製したシート（酵素基質に含浸していな
いもの）を予め4.5×90mmのストリップに切っておく。
ストリップの末端（約5mm）を上記試料の１つずつに浸
し、媒質を毛管作用によりストリップの頂点へと移動さ
せる（10分間）。 15分後にストリップの発色を観察する。ストリップの
下部から着色領域の頂点までの距離を測定することによ
り、種々のテオフィリン試料について以下の結果が得ら
れた。 上記の結果は、本発明に従えば１段階でテオフィリン
の正確なアッセイが実施できることを立証している。発
色は、シグナル阻害剤（上記実施例ではＮ−アセチル−
Ｌ−システイン）を含まないアッセイ媒質に比べ、より
鮮明であり、より均質であり、かつ優れている。 実施例11 クロモゲンとして４−クロロ−１−ナフトー
ルを用いるイムノクロマトグラフィーアッセイにおける
他のシグナル阻害剤の使用 チオフィリンの濃度が各々０、および40μg/mlとなる
ように、テオフィリン（各々10μ）を緩衝化媒質と合
する。緩衝化媒質は水性緩衝化媒質（pH7.0のリン酸塩
緩衝化食塩水）であって、外に実施例４のコンジュゲー
ト0.8μg/ml、グルコース0.05M、BSA1mg/ml、および４
−クロロ−１−ナフトール200μg/mlを含有している。
各試料はさらに亜硫酸ナトリウム9mM、ジチオエリスリ
トール3mMまたはアスコルビン酸塩2mMを含むように調製
する。対照はアスコルビン酸を含まないが、上に列挙し
たその他の試薬は含んでいる。 実施例３で調製した４−クロロ−１−ナフトール含浸
シートを予め4.5×90mmのストリップに切っておく。ス
トリップの末端（約5mm）を上記試料の各々に浸し、媒
質を10分の間ストリップを移動させる。 ストリップの発色を観察する。亜硫酸ナトリウム、ジ
チオエリスリトールまたはアスコルビン酸を含むアッセ
イ媒質に接触させたストリップ上では発色が遅れた。ま
た着色は、免疫吸着領域の上方部分で最初に顕われ、徐
々にストリップの下部に向かって下方に広がった。着色
先端の図形は鮮明であり、色の生成は均質であった。こ
の結果は対照より優れており、対照においては発色は直
ちに下部から上方へと始まり、散逸した先端および不均
質な着色となった。 実施例12 クロモゲンとしてジ−カルボキシジンを用い
るイムノクロマトグラフィーアッセイにおけるシグナル
阻害剤対の使用 テオフィリン濃度が2.5μg/mlとなるように、テオフ
ィリン（各々12.5μ）を緩衝化媒質と合する。緩衝化
媒質は水性緩衝化媒質（pH7.0のリン酸塩緩衝化食塩
水）であって、外に実施例４のコンジュゲート0.5μg/m
l、グルコース0.05M、BGG2mg/ml、ジ−カルボキシジン6
00μg/mlおよびアスコルビン酸4mMを含有している。さ
らに各試料は第２のシグナル阻害剤（Ｎ−２−メルカプ
トプロピオニルグリシン1mg/ml、システイン0.5mg/ml、
重亜硫酸ナトリウム0.125mg/ml、2,3−ジメルカプト−
１−プロパンスルホン酸1mg/mlまたはＮ−アセチル−Ｌ
−システイン0.5mg/ml）を含むように調製する。対照は
第２のシグナル阻害剤を含まないが、上記に列挙した他
の試薬は含んでいる。 実施例３で調製したシート（酵素基質に含浸していな
いもの）を予め4.5×90mmのストリップに切っておく。
ストリップの末端（約5mm）を上記試料の各々に浸し、
媒質を10分の間ストリップを移動させる。 ストリップの発色を観察する。アスコルビン酸のみを
含むアッセイ媒質に接触させたストリップ上では、発色
がおよそ25分間遅れた。アスコルビン酸に加え第２のシ
グナル阻害剤を含むアッセイ媒質に接触させたストリッ
プについては、発色は30分以上遅れた。全事例におい
て、着色は最初免疫吸着領域の上方部分に顕われ、スト
リップの下部に向かって徐々に下方へと広がった。着色
先端の図形は鮮明であり、色の生成は均質であった。 実施例13 クロモゲンとしてジ−カルボキシジンを用い
るイムノクロマトグラフィーアッセイにおける、シグナ
ル阻害剤としてのＮ−アセチル−Ｌ−システインの使用 テオフィリン濃度が40μg/mlとなるように、テオフィ
リン（12.5μ）を緩衝化媒質と合する。緩衝化媒質は
水性緩衝化媒質（pH7.0のリン酸塩緩衝化食塩水）であ
り、この外に実施例４のコンジュゲート0.5μg/ml、グ
ルコース0.05M、BGG2mg/ml、およびジ−カルボキシジン
600μg/mlを含有する。各試料はＮ−アセチル−Ｌ−シ
ステインについてそれぞれ0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/
ml、0.8mg/mlおよび1.0mg/mlとする。対照にはＮ−アセ
チル−Ｌ−システインを含有させないが、上記に列挙し
た他の試薬は含ませる。 実施例３で調製したシート（酵素基質に含浸させない
もの）を予め4.5×90mmのストリップに切っておく。ス
トリップの末端（約5mm）を上記試料の各々に浸し、媒
質を10分の間ストリップを移動させる。 ストリップの発色を観察する。Ｎ−アセチル−Ｌ−シ
ステインを含むアッセイ媒質に接触させたストリップ上
では、発色がそれぞれ２分40秒（0.2mg/ml）、６分（0.
4mg/ml）、７分（0.6mg/ml）、９分10秒（0.8mg/ml）お
よび11分20秒（1mg/ml）遅れた。着色は、最初免疫吸着
領域の上方部分に顕われ、ストリップの下部に向かって
徐々に下方へと広がった。着色先端の図形は鮮明であ
り、色の形成は均質であった。この結果は対照より優れ
たものであり、対照においては、発色は下部から上方へ
と直ちに始まり、散逸した先端と不均質な着色を与え
た。 実施例14 クロモゲンとして可溶性グルコースオキシダ
ーゼおよびジ−カルボキシジンを用いるイムノクロマト
グラフィーアッセイ 各々０、2.5、５、10、20および40μg/mlのテオフィ
リンを含有する試料（12μ）を緩衝化媒質1.0mlと合
する。緩衝化媒質は水性媒質（pH7.0のリン酸塩緩衝化
食塩水）であって、外に実施例４のコンジュゲート1.0
μg/ml、BSA2mg/ml、ジカルボキシジン600μg/mlおよび
アスコルビン酸塩0.003Mを含有している。 実施例３で調製したシート（酵素基質およびグルコー
スオキシダーゼアミンに含浸させていないもの）を予め
4.5×90mmのストリップに切っておく。１段階アッセイ
の開始直前に、グルコースオキシダーゼ（100μg/ml）
５μを各試料に添加する。ストリップの末端（約5m
m）を次いで上記試料の１つずつに浸し、媒質を毛管作
用によってストリップの頂点へと移動させる（10分
間）。 15分後にストリップの発色を観察する。ストリップの
下部から着色領域の頂点までの距離を測定することによ
り、種々のテオフィリン試料について以下の結果が得ら
れた。 上記の結果は、本発明に従えば１段階で試料中のテオ
フィリンの正確なアッセイが実施できることを立証して
いる。グルコースオキシダーゼアミンをイムノクロマト
グラフ上に固定化するか、またはその代わりに本実施例
に例示するように、１段階アッセイの開始直前にグルコ
ースオキシダーゼを液体酵素試薬中に加えることができ
る。 上記本発明は、例示ならびに明瞭化および理解を目的
とする実施例によって、若干詳細に記載したが、特許請
求の範囲の範囲内においてある程度の変更または修飾を
施すことができるということは明白であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−28662（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−218957（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−20134（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．水性媒質中においてアナライトの含有が予想される
   試料中の該アナライトの存在または量に関係して検出可
   能なシグナルを発生することのできるシグナル発生系の
   構成員の反応、および特異的結合対の構成員の反応を含
   み、特異的結合対の構成員の少なくとも１つはシグナル
   発生系の構成員の１つに結合したものであるイムノアッ
   セイ方法において、該シグナルの発生に先立って、水性
   媒質中に、シグナル発生系の構成員の反応を化学的に阻
   害する化合物であるシグナル阻害剤の有効量を存在させ
   ることにより、該シグナルの発生を一時的に遅延させる
   ことからなる改良法。 ２．少なくとも２種のシグナル発生系の構成員の反応を
   遅延させることによりシグナルの発生を遅延させる、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３．シグナル阻害剤が酵素のもう１つの基質である特許
   請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。 ４．シグナル阻害剤が酵素とその基質との反応生成物に
   反応する、特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか
   １項に記載の方法。 ５．シグナル阻害剤がアスコルビン酸またはその誘導体
   である特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６．特異的結合対の構成員が対応同種性特異的結合対の
   構成員と結合するための時間とほぼ同等な時間、シグナ
   ルの発生を遅延させるに充分な量のシグナル阻害剤が存
   在する、特許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれか１
   項に記載の方法。 ７．アナライトの含有が予想される試料中の該アナライ
   トの存在を測定する特許請求の範囲第１項乃至第６項の
   いずれか１項に記載の方法であって、アナライトがリガ
   ンドおよびその相補的レセプターから成る特異的結合対
   の１構成員であり、かつ試料を含有する水性媒質が吸収
   性材料を移動し、上記方法は、 （ａ）該媒質を、特異的結合対の構成員が非拡散結合し
   ている該吸収性材料に接触させ、かつこの媒質はさら
   に、（１）特異的結合対の構成員、および酵素基質を含
   むシグナル発生系の一部である酵素のコンジュゲート、
   ならびに（２）少なくとも、媒質が吸収性材料中を実質
   上移動するための時間と同等な時間、シグナルの発生を
   遅延させるに充分な量の、消耗され得るシグナル阻害剤
   を含有しており、 （ｂ）該媒質に該吸収性材料中を移動させ、そして、 （ｃ）試料中のアナライトの量に関係する検出可能なシ
   グナルについて該吸収性材料を検査する、 ことからなる方法。 ８．特異的結合対の構成員およびシグナル発生系の構成
   員を含み、特異的結合対の構成員の少なくとも１つはシ
   グナル発生系の構成員の１つに結合したものであるアッ
   セイ用組成物であって、水性媒質中において （１）シグナル発生系が、アナライトの含有が予想され
   る試料中の該アナライトの存在または量に関係して検出
   可能なシグナルを発生することができ、かつ、少なくと
   も１種の特異的結合対の構成員が吸収性支持体に結合し
   ている、１またはそれ以上の該シグナル発生系の構成
   員、および（２）該シグナルの発生を一時的に遅延させ
   るに充分な量の、シグナル発生系の構成員のシグナル発
   生反応を化学的に阻害する化合物である、シグナル阻害
   剤を含む組成物。 ９．特許請求の範囲第８項記載の組成物であって、
   （１）該シグナル発生系の構成員が、１またはそれ以上
   の酵素を含むものであり、該酵素が特異的結合対の１成
   分とのコンジュゲートを形成して結合したものであり、
   （２）該シグナル発生阻害剤が、少なくとも媒質が吸収
   性材料を実質上移動するための時間と同等な時間、シグ
   ナル発生反応を遅延させるに充分な量の、消耗され得る
   シグナル発生反応の阻害剤であり、さらに（３）該酵素
   の基質を含み、これらを含有する水性媒質が、対応同種
   性特異的結合対の構成員を含有する吸収性材料中を移動
   することができる、クロマトグラフィーアッセイにおけ
   る使用のための組成物。 １０．特異的結合対の構成員と、アナライトの含有が予
   想される試料中の該アナライトの存在または量に関係し
   て検出可能なシグナルを発生することのできるシグナル
   発生系の構成員との反応を含むアッセイ方法における使
   用のためのキットであって、該特異的結合対の構成員の
   少なくとも１つはシグナル発生系の構成員の１つに結合
   したものであり、水性媒質中において、（１）１または
   それ以上の該シグナル発生系の構成員、および（２）該
   シグナルの発生を一時的に遅延させるに充分な量の、シ
   グナル発生系の構成員のシグナル発生反応を化学的に阻
   害する化合物である、シグナル発生阻害剤を、パッケー
   ジとして含んでなるキット。