JPS59218957A - ペルオキシダ−ゼ活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はペルオキシダーゼ活性測定法とこの測定用試薬
組成物に関するものである。

、ペルオキシダーゼ、例えばホースラディツシュベルオ
キシタ“−ゼ（■ｔＲｐｏ）には、酵素免疫測定法（Ｅ
ＩＡ）におけるマーカー酵素として広い用途がある。す
べてのＥＩＡ系に共通な特徴は反応剤（抗原又は抗体）
の一つの濃度測定のだめの抗原−抗体反応の開発である
。多くのＥＩＡ系が既に記載されている。これらは酵素
標識抗原金有する系と酵素標識抗体を有する系とに分類
できる。

標識抗原を有するＥＩＡ系の一つの例は競合的な固相Ｅ
ＩＡ　（酵素リンク免疫収着体測定（ＦＬＩＳＡ）　）
である。この方法においては既知量の酵素標識抗原と測
定されるべき抗原（分析物ａｎａｌｙｔｅ　）が固定さ
れる特定の抗体の限定数の結合箇所で競合する。分析物
の濃度が高くなればなるほど、固定された抗体に結合さ
れる酵素標識抗原の量が少くなる。測定カーブ全利用し
て、抗体との反応によって固相に結合される酵素活性を
測定することによって分析物の濃度の測定が可能となる
。

抗体標識ＥＩＡの典型は”ザンドイツチ”測定（又は二
箇所酵素免疫測定テスト）である。このテストには二つ
の免疫学反応が含捷れる：第一の反応においては、固相
に固定された抗体に巨大分子の抗原が多少完全に結合さ
れる。反応溶液除去後、結合された抗原を特定の抗体と
抗原からなる過剰量の接合体と反応させる。酵素標識抗
体の結合の程度は抗原の量に比例し、かくて過剰の接合
体除去後の残留酵素活性の測定により抗原の量が測定さ
れる。

かくして酵素活性の測定はすべてのＥＩＡ法において必
須の工程である。一般に酵素活性は、周知の方法によっ
て、典型的には酵素作用によって実施される適当な基質
の光学的性質（吸着、螢光、発光）の変化に従うことに
よって測定される。適切な測定器具が用いられ、測定信
号と酵素量間の直線的比例が有利である。ペルオキシダ
ーゼ測定には、過酸化水素と組合わせてベンジジンとそ
の誘導体、たとえば０−アニンジン、０−トリジン。

ジカルボキシジンと３．３’、５．５’−テトラメチル
ベンジジンが有効である。

例えば抗体力価の血清学的測定におけるＥＩＡの種々の
用途にとって、器具測定によって達しうる高い精度は少
ししか価値がない。というのは、対照に対して２〜４倍
の濃度の向上だけが意味あシと考えられ、一方力バーさ
れるべき全濃度範囲には数桁の大きさが含まれるからで
ある。かかる測定には終点希釈滴定法が応用できる。こ
れは原液の最高希釈度の測定にあり、これは限られた検
出法において問題の分析物に実際的な結果を与える。

この最高の希釈度（例えばｌ　：　１０００）の逆数は
一般に「力価（Ｌｉｔｅｒ）　Ｊと呼ばれる。乙の数値
は勿論使用する検出法の感度によって左右され、これは
性能の変動によって個々に異なるかもしれない。

これはすべての測定において実施される既知又は所定の
濃度の対照に対する力価の標準化によって克服すること
ができる。

実際、試料溶液は適当な希釈剤で系列的に、普通等比級
数的に（例えば力価段階１　：　ｌ　Ｏ：１００；１ｏ
ｏｏ・・・・・・又はｌ：２；４；８：・・・・・・又
はｌ：ｌ。５；２；３；４：６；・・・）希釈される。

この目的のためには種々の簡単な技術的手段、たとえば
微量滴定（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ−）の系が利用できる
。同じ容積の各力価段階をテスト反応にかけ、イエス・
ノーの形の応答で最高の力価を固定できる。もし視覚で
観察しうる検出反応が用いられれば測定器具は必要でな
い。

検出反応の応用性は明瞭性に大いに依存し、これにより
（わずかに）肯定的な結果を否定的な結果（イエスノ一
応答）と区別することができる。

しかし、色素産生の（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）基質で
酵素活性を測定すると、一般に発色の連続的増加（減少
）と酵素濃度の上昇（降下）を来し、希釈終点の明快な
固定が殆んど不可能となる。

本発明の目的は、視覚で観察しうる特性の急激な変化（
カラージャンプ）によっである量の酵素の過剰（不゛足
）を明瞭に示し、かくして終点滴定の検出を明瞭ならし
めること、即ち閾濃度に対して不足か過剰かを示す明確
な境界を示しうるペルオキシダーゼ検出反応を提供する
こと、及びこの反応を実施するための組成物を提供する
ことである。

この目的は終点希釈ペルオキシダーゼ測定条件下、ベン
ジジン誘導体で、発色遅延叶の非色素産生又は低色素産
生プロトンドナーの存在下、ペルオキシダーゼを終点希
釈滴定して鋭敏な希釈終点を可能ならしめるに十分な時
間発色を遅らせ、その後ペルオキシダーゼ活性を検出す
る、改良された方法によって達成される。

別異の起源のペルオキシダーゼ、例えば日本だいこん（
Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、
特にホースラディツシュ（ｈｏｒｓｏ　ｒａｄｉｓｈ　
）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）（ＥＣ６，１１，１，
７）を測定することができる。

ベンジジン誘導体は一般式（Ｉ） Ｒ２Ｒ２ （式中Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、アミン基、Ｃ１
〜Ｃ１１アルキル基、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ基、カルボ
キシ基、スルホ基又はカルボキシプロピルオキシ基を表
わし、Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜ＣＩｌア
ルキル基を表わす）を有する化合物又はその塩である。

Ｃ１〜Ｃ１ｌアルキル基は分枝又は非分枝アルキルであ
シ、同様に０１〜Ｃ１１アルコキシ基は分枝のもの又は
非分枝のものでありうる。

メチル基とメトキシ基が好ましい。ノ・ロゲン原子には
臭素、塩素とフッ素が含まれ、その中塩素が好ましい。

Ｒ．が水素原子、メチル基又はメトキシ基を示し、Ｒ２
が水素原子又はメチル基金示す式（Ｉ）の化合物が好ま
しい。

Ｒ１とＲ２がアミン基に対しオルトの位置のメチル基を
表わす式（Ｉ）の化合物が特に好ましい。

非色素産生又は低色素産生プロトンドナーは一般式（Ｉ
Ｉ） （式中、Ｒ３とＲｑは同−又は別異で、水酸基、アミノ
基、０１〜Ｃ１１アルキルアミノ基又はベンジルアミノ
基を表わす） のフェニレン誘導体である。

フェニレン誘導体の好ましい例は、／・イドロキノン、
１，２−ジヒドロキシベンゼン、レゾルシノール、ｏ−
、ｍ−、ｐ−フェニレンジアミン、４−アミノフェノー
ル、４−メチルアミンフェノール、４−ベンジルアミノ
フェノールである。選ばれたフェニレン誘導体（ＩＩ）
はＯ−フェニレンジアミンと４−アミンフェノール、特
にノーイドロキノンでおる。

上述のように終点希釈滴定によるペルオキシダーゼ活性
測定法はよく知られておシ、ペルオキシダーゼ終点希釈
測定条件下に実施される。同様に、本発明の改良された
方法は、ペルオキシダーゼ活性希釈滴定測定条件下に、
十分な量のベンジジン誘導体、一般に過剰量で十分な過
酸化水素又はその付加物を用いて実施される。この過酸
化水素は反応に添加してもよく又はその場で発生させて
もよい。このような条件には適当な反応温度、例えば４
℃〜３７℃と測定中ｐＨを約４．５〜７に維持するため
に緩衝液たとえばＴＲＩＳを使用することが含まれる。

ベンジジンの適当な量は、ペルオキシダーゼ測定に知ら
れている慣例的な実験によって定めることができる。例
えばペルオキシダーゼ酵素を含有するテスト試料ｌｒｎ
ｔ当！０　０．０　１　−　０．２　１ｎ？の範囲とす
ることができる。

本発明によれば、ペルオキシダーゼベンジジン誘導体反
応の間フェニレン誘導体■が存在する。

色素の存在又は不存在下の鋭敏な終点測定を可能ならし
めるに十分な時間発色を遅延させるような発色遅延量で
、上記誘導体が用いられる、たとえば、これはペルオキ
シダーゼ酵素を含んでいるテスト試料−当シ約０．０　
０　０　５〜Ｏ．ＯＩＷＯ量で用いられる。他の方法で
表わすと、ベンジジン誘導体Ｉの約０．１〜約ｌＯ重址
チの量のフェニレン誘導体を存在させる。

フェニレン誘導体■の混合はカラー吸収ピークに影響を
与えない。反応系ＩＡ（２０２／ペルオキシダーゼに対
する■の混合は発色開始遅延音もたらし、その期間は添
加される■の量に正比例し、酵素の量に逆比例する。遅
延相の間、発色は完全に抑制される。発色開始後、その
速さは同じ条件下ＩＩの混合なしで観察されるものと同
じである。可視範囲の吸収スペクトルは定性的には不変
のままである。

酵素による発色遅延と発色観察の一定の反応時間と組合
わせることにより、明瞭なイエス／ノー信号、この場合
、着色／未着色の信号による閾濃度の通過にこたえる所
望の能力がもたらされる。

本発明を一例としてＦＩＲＰＯ測定のために３　、　３
’。

５、５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とノ・イ
ドロキノンを組合わせ用いた場合について史に説明する
。

ＴＭＢでは、青色の最大吸収ピークは６４５ｎｍでえら
れる。とれはハイドロキノンの混合によって変わること
はない。

しかし、反応ＴＭＢ　：Ｈ２Ｏ２　：ＨＲＰＯへのハイ
ドロキノンの混合はスペクトルの全可視範囲（７００〜
３００ｎｍ）で発色開始の遅延を招き、その期間は加え
られるハイドロキノンの量に正比例し、ＨＲＰＯの崖に
逆比例する（、２１図と第２図参照）。

遅延相の間、発色は完全に抑制される。発色開始後、そ
の速さは同じ条件下ノ・イドロキノンを添加せずに観察
されるのと同じである。

色観察のための一定の反応時間と組合わせてＨＲＰＯＯ
量に逆比例する青色発色開始遅延は明瞭なイエス／ノー
信号、この場合青色／非青色によって閾濃度の通過に応
答する所望の能力がえられる。これを第１表（光学的に
測定して見られた吸収値は本発明によシ終点希釈滴定を
器械によらず目で評価することができるという効果を示
すためにのみ役立つ）に示される実験によって説明する
。

基質混合物−当シ１．Ｉ　Ｘ　１０　　ｆ　ＨＲＰＯで
出発して、希釈倍数１：１．５；２：３；４：６；・・
・・・・・・・１２８：１９２の二つ平行的な希釈シリ
ーズを調製する。高希釈度の酵素（Ａ６４５，１ｃｒｎ
≦１）でプロトンドナーとしてＴＭＢのみを含む基質混
合物で保温することによって、漸次低下する青色がえら
れ、これはＨＲＰＯＯ量に正比例する。同じ条件下で少
量のハイドロキノンを含む基質混合物を用いるならば希
釈終点が間違いなく固定できる（可視青色での最大希駅
度：３０分後でｌ：８，６０分後で１：１２）。

第　　１　　表 ０Ｄ６１１５　（６４５ｎｍでの光学濃度）酵素の閾濃
度は二つの要素；適当な発色を与えるべきフェニレン誘
導体■の濃度と反応時間、を適当に選択することによっ
て、必要条件に適合させることができる。

１．５倍低下させた酵素の量への終点のシフトによシ少
くとも同じ倍数だけ必要な反応時間が増大する。

反応時間と終点の測定が適当に選ばれるならば（例えば
３０分）、この値からの偏差（例えば２４〜３６分の間
の反応時間）は精々一つの力価段階で別異の結果をもた
らすであろう（倍数：　１．５　）。

反応時間と終点測定は発色が十分である範囲、即ち５〜
６０分の間が適当であろう。

終点測定の明瞭さは検出感度のわずかなロスで交換され
る。しかしこれは目で評価するＥＩＡの多くの応用分野
では重要でなく適当に測定を工夫することによってつぐ
なうことができる。

必要とする設備の低コストと高い融通性及び酵素免疫法
による広い測定範囲について終点希釈滴定の原理によっ
て与えられる好ましい特性（特異性、感度、検出反応の
普通性）を組合わせることが非常に好ましい。

ここにＴＭＢ−ハイドロキノンの組合わせについて詳細
に述べたものに相当する結果がベンジジン誘導体Ｉとフ
ェニレン誘導体ＩＩとの他の組合わせで得られる。これ
はＴＭＢ／ｐ−フェニレンジアミン：　ＴＭＢ　／　ｍ
−フェニレンジアミン：ＴＭＢ／１．２−ジヒドロキシ
ベンゼン：０−）リジン／ｐ−フェニレンジアミン：ｏ
−）！ｊジン／ｍ−フェニレンフェニレンジアミンジン
７１．２−ジヒドロキシベンゼンと０−）リジン／４−
アミンフェノールの組合わせの場合真実であり、特に次
の組わせ、−ＴＭＢ　／ハイドロキノン：　ＴＭＢ／４
−アミンフェノール−ＴＭＢ　／　ｏ−フェニレンジア
ミン；ｏ−トリジン／バイドロキノン −ｏ　−）　ＩＪ　シフ　／　ｏ−フェニレンシアミン
０−ジアニシジン／ハイドロキノン −ベンジジン／ハイドロキノン の場合に真実である。

本発明はまた色形成によってベルオキシダーゼ活性を測
定するのに十分な量の一般式■のベンジジン誘導体と、
鋭敏な終点測定を可能ならしめるに十分な時間色形成を
防止するべき発色遅延量の一般式■のフェニレン誘導体
とを含んでいる、終点希釈によるペルオキシダーゼ測定
用試薬組成物に関するものである。

この試薬には、色形成を助けるに十分な量の過酸化水素
又はその付加物、たとえば尿素又はホウ酸ナトリウム−
Ｈ２０２伺加物、測定中ｐＨの範囲を４．５〜７に維持
する量の緩衝液、たとえばＴＲｌ５と重金属をキレート
化するためのキレート化量のキレート剤を含む通常量の
通常の添加物を含有させることができる。

本発明によるペルオキシダーゼ測定用のかかる試薬はそ
のま＼の形で、又はキットの形で市販することができる
。もしキットの形で市販するならば、このキットはベン
ジジン誘導体、フェニレン誘導体、通常の添加物、ペル
オキシダーゼ標識抗原又は抗体接合体と抗原又は抗体で
被覆された反；座容器又は他の固体支持体全含有してい
る〇以下に示す例は本発明を説明するだめのものであシ
、これに限定するためのものではない。

例　　１ 作業指図（−例としてＴＭＢ　／ハイドロキノン）色原
体既成溶液 １．１０ｆの３．３’、５．５’−テトラメチルベンジ
ジン（分析級、フリーベース）をジメチルスルホキサイ
ドにとかして１００　ｍｌとした。

２、Ｏ，ｌｆのハイドロキノンをジメチルスルホキサイ
ドに溶かして１００−とした。

トリス−サイトレート緩衝液ｐＨ５ １２，１Ｆのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
と１０．！ＩＭのクエン酸−１−水和物を蒸溜水にとか
してｉｚとする。

基質混合物（４Ｍ日新しくつくられる）５０ゴのトリス
サイトレート緩衝液、二つの色原体既成溶液の各０．０
５ｍ／！と３％過酸化水素００ｌｄを混合する。

それぞれの希釈度の西洋わさびペルオキシダーゼの０．
Ｏ１＋ｉに夫々の基質混合物１　ｒｎｌを速かに添加し
て反応全開始する。色変化の評価は５〜６０分後、好ま
しくは１５〜４０分後に行なう。

例　　２ ヒト血清におけるストレプトリジン−〇に対する抗体評
価用キット このキットは ａ０本発明によシ目で評価しうる終点希釈滴定によるペ
ルオキシダーゼ活性測定用試薬−ジメチルスルホキサイ
ド中１０ｍｆ／−の３゜３’、５，５’−テトラメチル
ベンジジン溶液−ジメチルスルホキサイド中０．１　ｍ
ｌ　／　ｒｎｌのハイドロキノン溶液 一３％過酸化水素溶液 −ｐＨ５，トリスーサイトレート緩衝液０．１モノＬ、
／７ｂ６　　西洋わさびペルオキシダーゼと、ヒ）　Ｉ
ｇＧに対するウサギＩｇＧの接合体の溶液 Ｃ０抗原被覆反応容器としてストレプトリジン−〇で被
覆された微積滴定板 ｄ、テストされるべき血清試料と抗体−ベルオキシダー
ゼ−接合体す用希釈剤として０．　ｌ　％　Ｔｗｅｅｎ
２０を含むｐＨ７、８、０，１モル／ｌのトリス−ＨＣ
ｌの緩衝液

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は夫々反応系ＴＭＢ　：　Ｈ２Ｏ２：
ＨＲＰＯにハイドロキノンを加えた系のハイドロキノン
の量を変えたとき及びＨＲＰＯＯ量を変えたときの発色
開始時期の変化を示すグラフである。 第１図において曲１ｌｌＡは基質混合物１ｒｎｔ中５．
５Ｘ　１０　　　ＨＲＰＯｌｏ、Ｉ　Ｘ　１０　　ｆ　
ＴＭＢ、　ハイドロキノンＯの場合、Ｂ、Ｃ，Ｄは夫々
順にハイドロキノンを１．２．４（ＸＩＯｆ）加えた場
合を示し、第２図において曲線Ａは基質混合物ｉｙ中０
．Ｉ　Ｘ１０”−３ｆ　ＴＭＢ　、　　２　Ｘ　１０　
　ｆ　ハイドロキノンに４．４×１０＝０ｆ　ＨＲＰＯ
を含む場合を示し、Ｂ、Ｃ，Ｄは順にＨＲＰＯを３．３
　、２．２　、１．６５　（ＸＩＯｆ　）含む場合を示
す。 （外２名）゛１ 手　ｉＪｃ　補　正　書（自発） 昭和５９年ＧＪＨ］１９日 特許庁長官殿 １、事件の表示　　　１．１・願昭５９−６３０９０号
２、発明の名称 ベルオキンダーゼ活性測定方法 ３、補正をする渚 ゲー二ムベーへ− ５、補正の対象 （１）願書の優先権主張の最初の出願の出願番号の欄（
２）願書の特許出願人の代表者の氏名の欄（３）委任状
およびその訳文 （４）図　面 ６、補正の内容 （１）依頼者のオーダー書の誤った最初の出願の出願番
号に基づいて優先権主張をしたので、別紙の通り補正す
る。 （２）特許出願人の代表者の氏名を別紙の通り補正する
。 （３）別紙の通り委任状およびその訳文を補充する。 （４ン図面の浄書（内容に変更なし） 以上

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　ペルオキシダーゼを十分な量のベンジジン誘
   導体と反応させるペルオキシダーゼ終点希釈滴定測定条
   件下終点希釈滴定によってベルオキシタ゛−ゼ活性を測
   定する方法において、ベンジジン誘導体として一般式Ｉ Ｒ２Ｒ２ （式中Ｒ１は水素原子、）１０ゲン原子、アミノ基、ｃ
   ｌ＋ｃｑアルキル基、Ｃ１〜ｃｑアルコキシ基、カルボ
   キシ基、スルホ基、又はカルボキシプロピルオキシ基を
   示し、そしてＲ２は水素原子、ハロゲン原子、０１〜Ｃ
   １１アルキル基を示す）のベンジジン誘導体又はこのベ
   ンジジン誘導体の塩を、一般式■ （式中ＲうとＲ１１は同じ又は違うものであシ、水酸基
   、アミン基、Ｃｌ−Ｃ１１アルキルアミノ基又はベンジ
   ルアミノ基を示す） の非発色性又は低発色性フェニレン誘導体の発色遅延址
   存在下に用いて、鋭敏な希釈終点を可能ならしめるに十
   分な時間発色を遅延させ、その後ペルオキシダーゼ活性
   を測定することを特徴とするペルオキシダーゼ活性測定
   方法。
2. （２）ベンジジン誘導体■のＲ１は水素、メチル又はメ
   トキシを表わし、Ｒ２は水素又はメチルを表わす特許請
   求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）　　ベンジジン誘導体ＩのＲ１とＲ２は夫々のア
   ミノ基に対してオルトの位置のメチルを表わす特許請求
   の範囲第１項記載の方法。
4. （４）　　フェニレン誘４体ＩＩはノ・イドロキノン、
   ０−フェニレンジアミン又は４−アミノフエ／−にであ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。
5. （５）フェニレン誘導体■はハイドロキノンである特許
   請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）　　発色は５〜６０分間遅延する特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
7. （７）　　発色は１５〜４５分間遅延する特許請求の範
   囲第６項記載の方法。
8. （８）　　色形成によってペルオキシダーゼ活性の測定
   を可能ならしめるに十分な量の一般式１（式中Ｒ１は水
   素原子、ハロゲン原子、アミン基、０１〜Ｃ１ｌアルキ
   ル基、Ｃ１〜Ｃ１１アルコキシ基、カルボキシ基、スル
   ホ基、又はカルボキシプロピルオキシ基を表わし、そし
   てＲ２は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜ＣＩ＋アルキ
   ル基金表わす）ノヘンシシン誘導体又はこのベンジジン
   Ｕｊ　ｈ　体（７）塩と、鋭敏な終点測定を可能ならし
   めるに十分な時間色形成を防ぐべき発色遅延量の一般式
   ■（式中Ｒ３とＲ１１は同−又は別異であシ、水酸基、
   アミン基、Ｃ１〜Ｃ１１アルキルアミノ基又はベンジル
   アミノ基を示す） のフェニレン誘導体とを有する終点希釈滴定によるペル
   オキシダーゼ活性測定用試薬。
9. （９）　（ａ）　　一般式■ Ｒ２Ｒ２ （式中Ｒ１は水素原子、ハロゲン原、子、アミノ基、０
   １〜Ｃ１ｌアルキル基、０１〜ＣＩｌアルコキシ基、カ
   ルボキシ基、スルホ基、又はカルボキシプロピルオキシ
   基を表わし、Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ
   Ｉｌアルキル基を表わす）のベンジジン誘導体、又はこ
   のベンジジン誘導体の塩、 （ｂ）　　一般式■ （式中Ｒ５とＲ１１は同−又は別異で水酸基、アミノ基
   、Ｃ１〜Ｃ４アルキルアミノ基又はベンジルアミノ基を
   示す） のフェニレン誘導体、 （、）　　過酸化水素又はその付加物、（ｄ）　　西洋
   わさびペルオキシダーゼと抗原又は抗体との接合体、 （Ｃ）　　測定されるべき分析物と反応する抗原又は抗
   体で被覆された固体支持体、 とを有する終点希釈滴定によるペルオキシダーゼ活性測
   定用キット。