JP2763910B2 - 血液中の特異的結合性物質の検出方法及び該方法実施用の試験キット - Google Patents
血液中の特異的結合性物質の検出方法及び該方法実施用の試験キットInfo
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- JP2763910B2 JP2763910B2 JP1087836A JP8783689A JP2763910B2 JP 2763910 B2 JP2763910 B2 JP 2763910B2 JP 1087836 A JP1087836 A JP 1087836A JP 8783689 A JP8783689 A JP 8783689A JP 2763910 B2 JP2763910 B2 JP 2763910B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、特異的結合性物質とその対応反応性物質と
の間の結合親和性を利用して血液または血液由来分画中
の特異的結合性物質を定量的及び／または定性的に検出
する方法に係る。ペルオキシダーゼ活性をもつ反応性成
分を使用し、特異的結合性物質とその対応反応性物質と
を含有する反応混合物をインキュベートすることによっ
て該反応混合物または反応混合物由来分画中のペルオキ
シダーゼ活性を測定する。ペルオキシダーゼ活性が特異
的結合性物質の量及び／または存在の尺度となる。本発
明はまた該方法を実施するための試験キットを提供す
る。この種のペルオキシターゼ活性を明示する方法は既
にオランダ特許第154,600号に開示されている。
の間の結合親和性を利用して血液または血液由来分画中
の特異的結合性物質を定量的及び／または定性的に検出
する方法に係る。ペルオキシダーゼ活性をもつ反応性成
分を使用し、特異的結合性物質とその対応反応性物質と
を含有する反応混合物をインキュベートすることによっ
て該反応混合物または反応混合物由来分画中のペルオキ
シダーゼ活性を測定する。ペルオキシダーゼ活性が特異
的結合性物質の量及び／または存在の尺度となる。本発
明はまた該方法を実施するための試験キットを提供す
る。この種のペルオキシターゼ活性を明示する方法は既
にオランダ特許第154,600号に開示されている。
前記方法においてはしばしば抗体を結合させたマイク
ロタイタープレートの小ウェルの壁が担体材料として使
用される。検査すべき血液または血液由来分画例えば血
清をマイクロタイタープレートの小ウェルに導入する。
小ウェルの壁に結合させておいた抗体が血液または血液
由来分画中に存在する抗原と反応し、その結果として該
抗原が結合する。免疫化学的反応の有無を検出するため
に、検出すべき抗原に対する標識抗体を使用し得る。こ
の標識抗体は固相に既に形成されている抗体−抗原複合
体と反応する。標識抗体は酵素好ましくはペルオキシダ
ーゼ酵素と結合させておく。次の段階で無色溶液（基質
＋色原体）を添加する。この溶液は酵素によって有色化
合物に変換される。有色化合物の色の濃さは酵素の量に
依存し、酵素の量は結合した抗原の量に比例する。停止
薬を加えて色を変えることも可能である。この方法では
血液または血液由来分画中の抗原を検出するためにサン
ドイッチ法を使用している。その他の免疫化学的方法、
例えば阻害反応及び競合反応を使用することも可能であ
る。特に適当な酵素の例は、アルカリホスファターゼ、
ウレアーゼ及び前記のペルオキシダーゼ好ましくは西洋
ワサビペルオキシダーゼ（HRP）である。HRPは水中で基
質即ちペルオキシド化合物の変換を触媒する。この反応
に必要な電子テトラメチルベンジジン（TMB）のごとき
発色物質によって供給される。TMBは有色複合体に変換
されこれが酵素反応の指標となる。呈色を視覚的に観察
してもよくまたは酵素反応を分析的に適当な方法で検出
してもよい。
ロタイタープレートの小ウェルの壁が担体材料として使
用される。検査すべき血液または血液由来分画例えば血
清をマイクロタイタープレートの小ウェルに導入する。
小ウェルの壁に結合させておいた抗体が血液または血液
由来分画中に存在する抗原と反応し、その結果として該
抗原が結合する。免疫化学的反応の有無を検出するため
に、検出すべき抗原に対する標識抗体を使用し得る。こ
の標識抗体は固相に既に形成されている抗体−抗原複合
体と反応する。標識抗体は酵素好ましくはペルオキシダ
ーゼ酵素と結合させておく。次の段階で無色溶液（基質
＋色原体）を添加する。この溶液は酵素によって有色化
合物に変換される。有色化合物の色の濃さは酵素の量に
依存し、酵素の量は結合した抗原の量に比例する。停止
薬を加えて色を変えることも可能である。この方法では
血液または血液由来分画中の抗原を検出するためにサン
ドイッチ法を使用している。その他の免疫化学的方法、
例えば阻害反応及び競合反応を使用することも可能であ
る。特に適当な酵素の例は、アルカリホスファターゼ、
ウレアーゼ及び前記のペルオキシダーゼ好ましくは西洋
ワサビペルオキシダーゼ（HRP）である。HRPは水中で基
質即ちペルオキシド化合物の変換を触媒する。この反応
に必要な電子テトラメチルベンジジン（TMB）のごとき
発色物質によって供給される。TMBは有色複合体に変換
されこれが酵素反応の指標となる。呈色を視覚的に観察
してもよくまたは酵素反応を分析的に適当な方法で検出
してもよい。
血液中の抗原または抗体の存在を検出する場合、一般
には検出を行なう以前に検出すべき抗原または抗体を含
有する血清を血球から分離する。
には検出を行なう以前に検出すべき抗原または抗体を含
有する血清を血球から分離する。
実際には、特に酵素としてペルオキシダーゼを使用し
てエンザイムイムノアッセイ（EIA）を行なう場合に
は、異常に濃い呈色という好ましくない結果がしばしば
生じる。同様の現象はまた部分呈色として現れることも
ある。
てエンザイムイムノアッセイ（EIA）を行なう場合に
は、異常に濃い呈色という好ましくない結果がしばしば
生じる。同様の現象はまた部分呈色として現れることも
ある。
このような部分呈色現象が好ましくない結果及び結論
に導くことは明らかであろう。特に、所謂エイズの抗体
検査の場合にはこのような現象が不利に作用する。即ち
エイズの抗体検査では、供血者の血清中でエイズウイル
スに対する抗体の存在を検査するためにエンザイムイム
ノアッセイの定型手順を用いるからである。
に導くことは明らかであろう。特に、所謂エイズの抗体
検査の場合にはこのような現象が不利に作用する。即ち
エイズの抗体検査では、供血者の血清中でエイズウイル
スに対する抗体の存在を検査するためにエンザイムイム
ノアッセイの定型手順を用いるからである。
従って本発明の特徴は、第四アンモニウム塩の存在下
にペルオキシターゼ活性の測定を行なうことにある。
にペルオキシターゼ活性の測定を行なうことにある。
使用できる第四アンモニウム塩は例えば、ドデシルト
リメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチ
ルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアン
モニウムブロミド、アルキルジメチルベンジルアンモニ
ウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド、ベンジルジ
メチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、セチルジメ
チルエチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウム
ブロミド、セチルピリジニウムクロリド、ジメチルジオ
クタデシルアンモニウムブロミド及びメチルベンズエト
ニウムクロリドである。特に好ましい第四アンモニウム
塩は、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（DTA
B）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（C
TAB）またはアルキルジメチルベンジルアンモニウムク
ロリド（ベンズアルコニウムクロリド）である。その他
の洗浄剤、特に第四ホスホニウム塩のごときカチオン性
洗浄剤またはＮ−ラウロイルサルコシン、ラウリル硫酸
ナトリウムもしくはドデシル硫酸ナトリウムのごときア
ニオン性洗浄剤を任意に使用してもよい。
リメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチ
ルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアン
モニウムブロミド、アルキルジメチルベンジルアンモニ
ウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド、ベンジルジ
メチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、セチルジメ
チルエチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウム
ブロミド、セチルピリジニウムクロリド、ジメチルジオ
クタデシルアンモニウムブロミド及びメチルベンズエト
ニウムクロリドである。特に好ましい第四アンモニウム
塩は、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（DTA
B）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（C
TAB）またはアルキルジメチルベンジルアンモニウムク
ロリド（ベンズアルコニウムクロリド）である。その他
の洗浄剤、特に第四ホスホニウム塩のごときカチオン性
洗浄剤またはＮ−ラウロイルサルコシン、ラウリル硫酸
ナトリウムもしくはドデシル硫酸ナトリウムのごときア
ニオン性洗浄剤を任意に使用してもよい。
意外にも、前記のごとき第四アンモニウム塩を添加す
ることによって部分呈色を有意に抑制しながらペルオキ
シダーゼ活性を測定することが可能なことが判明した。
所望の場合、希釈または非希釈の全血を標本として使用
しペルオキシダーゼ活性の測定以前に赤血球をできるだ
け除去する。第四アンモニウム塩は第四アンモニウム塩
含有溶液の形態または固体化合物の形態で試験標本に添
加され得る。
ることによって部分呈色を有意に抑制しながらペルオキ
シダーゼ活性を測定することが可能なことが判明した。
所望の場合、希釈または非希釈の全血を標本として使用
しペルオキシダーゼ活性の測定以前に赤血球をできるだ
け除去する。第四アンモニウム塩は第四アンモニウム塩
含有溶液の形態または固体化合物の形態で試験標本に添
加され得る。
第四アンモニウム塩を基質または色原体または基質／
色原体と共に試験標本に添加してもよい。
色原体と共に試験標本に添加してもよい。
本発明はまた、ペルオキシダーゼ酵素結合体のごとき
成分と第四アンモニウム塩とを含む本発明方法を実施す
るための試験キットに係る。
成分と第四アンモニウム塩とを含む本発明方法を実施す
るための試験キットに係る。
血液または血液由来分画中の特異的結合性物質を定量
的及び／または定性的に検出するための本発明の方法
は、特異的結合性物質とその対応反応性物質との結合が
ペルオキシダーゼ活性をもつ反応性成分で測定できるよ
うないかなる反応において使用されてもよい。ペルオキ
シダーゼ活性の測定は特異的結合性物質の量及び／また
は存在の尺度となる。
的及び／または定性的に検出するための本発明の方法
は、特異的結合性物質とその対応反応性物質との結合が
ペルオキシダーゼ活性をもつ反応性成分で測定できるよ
うないかなる反応において使用されてもよい。ペルオキ
シダーゼ活性の測定は特異的結合性物質の量及び／また
は存在の尺度となる。
例えば、前記のごときサンドイッチ反応、阻害反応ま
たは競合反応のいずれの使用も可能である。
たは競合反応のいずれの使用も可能である。
「特異的結合性物質」は、例えばハプテン、抗原もし
くはそのフラグメント、抗体もしくはそのフラグメン
ト、プロテインＡ、DNAまたはRNAを意味すると理解され
たい。
くはそのフラグメント、抗体もしくはそのフラグメン
ト、プロテインＡ、DNAまたはRNAを意味すると理解され
たい。
「その対応反応性物質」は、特異的結合性物質に結合
親和性をもつ物質、例えばハプテン、抗原もしくはその
フラグメント、抗体もしくはそのフラグメント、プロテ
インＡ、DNAまたはRNAを意味すると理解されたい。その
対応反応性物質は任意に担体材料に結合されてもよい。
親和性をもつ物質、例えばハプテン、抗原もしくはその
フラグメント、抗体もしくはそのフラグメント、プロテ
インＡ、DNAまたはRNAを意味すると理解されたい。その
対応反応性物質は任意に担体材料に結合されてもよい。
「反応性成分」は、ペルオキシダーゼ活性をもち、固
体担体に結合される必要がなく、また固体形態、凍結乾
燥形態または溶液形態で使用され得る物質、例えばハプ
テン、抗原もしくはそのフラグメント、抗体もしくはそ
のフラグメント、プロテインＡ、DNAまたはRNAを意味す
ると理解されたい。
体担体に結合される必要がなく、また固体形態、凍結乾
燥形態または溶液形態で使用され得る物質、例えばハプ
テン、抗原もしくはそのフラグメント、抗体もしくはそ
のフラグメント、プロテインＡ、DNAまたはRNAを意味す
ると理解されたい。
本発明方法を使用しサンドイッチ反応で抗原を検出す
る場合、該抗原を、測定すべき該抗原に対する抗体を予
め結合させた担体材料と共にインキュベートする。担体
としては例えばガラスまたはプラスチックから成る試験
管、マイクロタイタープレート、棒、ビーズまたは円
板、等を使用し得る。固体担体に結合させた抗体と測定
すべき抗原との間の複合体の形成を検出するために、次
に酵素標識した第２抗体を添加する。
る場合、該抗原を、測定すべき該抗原に対する抗体を予
め結合させた担体材料と共にインキュベートする。担体
としては例えばガラスまたはプラスチックから成る試験
管、マイクロタイタープレート、棒、ビーズまたは円
板、等を使用し得る。固体担体に結合させた抗体と測定
すべき抗原との間の複合体の形成を検出するために、次
に酵素標識した第２抗体を添加する。
酵素は特に反応性と安定性とに基づいて選択される。
好ましい酵素はアルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、
グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及
びペルオキシダーゼであり、特にペルオキシダーゼ類が
好ましい。これらの酵素は、有色成分が関与するペルオ
キシド基質の変換を触媒する。ペルオキシダーゼ類のう
ちでも特に、安定性がよく廉価なHRPが好ましい。この
酵素反応に必要な電子供与物質は例えば色原体である。
適当な色原体は例えば、テトラメチルベンジン、ｏ−フ
ェニレンジアミン、５−アミノサリチル酸、2,2′−ア
ジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフ
ォネート］であり、テトラメチルベンジジン（TMB）が
特に好ましい。TMBは反応中に有色複合体に変換され、
これによって酵素反応が検出され、測定すべき抗原の定
性的及び／又は定量的尺度を与える。
好ましい酵素はアルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、
グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及
びペルオキシダーゼであり、特にペルオキシダーゼ類が
好ましい。これらの酵素は、有色成分が関与するペルオ
キシド基質の変換を触媒する。ペルオキシダーゼ類のう
ちでも特に、安定性がよく廉価なHRPが好ましい。この
酵素反応に必要な電子供与物質は例えば色原体である。
適当な色原体は例えば、テトラメチルベンジン、ｏ−フ
ェニレンジアミン、５−アミノサリチル酸、2,2′−ア
ジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフ
ォネート］であり、テトラメチルベンジジン（TMB）が
特に好ましい。TMBは反応中に有色複合体に変換され、
これによって酵素反応が検出され、測定すべき抗原の定
性的及び／又は定量的尺度を与える。
次に本発明を実施例に基づいて説明する。
実施例 血清中のHBsAg（Ｂ型肝炎表面抗原）の検出 HBsAg陰性の血清プールを検査した。
A.試薬 1.被覆されたマイクロタイタープレート 免疫化学において公知の方法を用いポリスチレンマイ
クロタイタープレートの小ウェルの内面をHBsAgに対す
るモノクローナル抗体で被覆した。
クロタイタープレートの小ウェルの内面をHBsAgに対す
るモノクローナル抗体で被覆した。
2.結合体 免疫化学において公知の方法を用いHBsAgに対する抗
体と西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）との結合体を
調製した。
体と西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）との結合体を
調製した。
3.基質／色原体 基質として尿素ペルオキシダーゼ溶液を使用し色原体
としてTMB溶液（ジメチルスルホキシドに溶解したテト
ラメチルベンジジン）を使用した。基質／色原体溶液を
等容の２つの部分に分け、一方の部分に濃度0.2g/lのの
第四アンモニウム塩（CTAB）を添加し（グループＡ）、
他方の部分には第四アンモニウム塩を導入しなかった
（グループＢ）。
としてTMB溶液（ジメチルスルホキシドに溶解したテト
ラメチルベンジジン）を使用した。基質／色原体溶液を
等容の２つの部分に分け、一方の部分に濃度0.2g/lのの
第四アンモニウム塩（CTAB）を添加し（グループＡ）、
他方の部分には第四アンモニウム塩を導入しなかった
（グループＢ）。
B.試験手順 被覆したマイクロタイタープレートの各小ウェルに0.
1mlの被検血清を入れプレートを50℃で30分間インキュ
ベートした。
1mlの被検血清を入れプレートを50℃で30分間インキュ
ベートした。
次に小ウェルを除液し洗浄バッファ（PBS/Tween（登
録商標））で４回洗浄し再度除液した。
録商標））で４回洗浄し再度除液した。
次に各小ウェルに0.1mlの結合体を導入した。50℃で3
0分間インキュベートし小ウェルの除液、洗浄、除液を
繰り返した。
0分間インキュベートし小ウェルの除液、洗浄、除液を
繰り返した。
次にマイクロタイタープレートを２つのグループ、グ
ループＡとグループＢとに分けた。グループＡのプレー
トの小ウェルに0.1mlの基質／色原体混合物をCTABと共
に添加した。グループＢのプレートの小ウェルにCTABを
加えない基質／色原体混合物を添加した。
ループＡとグループＢとに分けた。グループＡのプレー
トの小ウェルに0.1mlの基質／色原体混合物をCTABと共
に添加した。グループＢのプレートの小ウェルにCTABを
加えない基質／色原体混合物を添加した。
25℃で30分間イキュベートし、0.1mlの硫酸溶液（2
M）を各小ウェルに添加して酵素反応を停止させた。
M）を各小ウェルに添加して酵素反応を停止させた。
C.結果 双方のグループについて得られた結果を表に示す。
フロントページの続き (72)発明者 ペトルス・アドリアヌス・レオナルドウ ス・ホーセンス オランダ国、5344・エー・エム・オツ ス、リスツハールデ・218
Claims (6)
- 【請求項１】血液または血液由来分画中の特異的結合性
物質を定量的及び／または定性的に検出するために、該
特異的結合性物質とその対応反応性物質との間の結合親
和性を利用し、ペルオキシダーゼ活性をもつ反応性成分
を添加して特異的結合性物質とその対応反応性物質とを
含む反応混合物をインキュベートし、前記反応混合物ま
たは反応混合物由来分画中のペルオキシダーゼ活性を測
定し、該ペルオキシダーゼ活性が特異的結合性物質の定
量及び／または存在の尺度を与える方法において、ペル
オキシダーゼ活性の測定を第四アンモニウム塩の存在下
に行なうことを特徴とする方法。 - 【請求項２】第四アンモニウム塩を基質と共に添加する
ことを特徴とする請求項１に記載の血液または血液由来
分画中の特異的結合性物質の定量的及び／または定性的
検出方法。 - 【請求項３】第四アンモニウム塩を色原体と共に添加す
ることを特徴とする請求項１に記載の血液または血液由
来分画中の特異的結合性物質の定量的及び／又は定性的
検出方法。 - 【請求項４】第四アンモニウム塩を基質／色原体と共に
添加することを特徴とする請求項１に記載の血液または
血液由来分画中の特異的結合性物質の定量的及び／また
は定性的検出方法。 - 【請求項５】第四アンモニウム塩としてドデシルトリメ
チルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルア
ンモニウムブロミドまたはアルキルジメチルベンジルア
ンモニウムクロリドを使用することを特徴とする請求項
１から４のいずれかに記載の血液または血液由来分画中
の特異的結合性物質の定量的及び／又は定性的検出方
法。 - 【請求項６】−ペルオキシダーゼと、 −ペルオキシダーゼの基質と、 −色原体と、 −第四アンモニウム塩とを含むことを特徴とする請求項
１から４に記載の方法実施用の試験キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8800874 | 1988-04-06 | ||
| NL8800874 | 1988-04-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01304900A JPH01304900A (ja) | 1989-12-08 |
| JP2763910B2 true JP2763910B2 (ja) | 1998-06-11 |
Family
ID=19852074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1087836A Expired - Lifetime JP2763910B2 (ja) | 1988-04-06 | 1989-04-06 | 血液中の特異的結合性物質の検出方法及び該方法実施用の試験キット |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0336481B1 (ja) |
| JP (1) | JP2763910B2 (ja) |
| KR (1) | KR0151584B1 (ja) |
| AT (1) | ATE105937T1 (ja) |
| AU (1) | AU633479B2 (ja) |
| CA (1) | CA1339891C (ja) |
| DE (1) | DE68915323T2 (ja) |
| DK (1) | DK160689A (ja) |
| ES (1) | ES2056191T3 (ja) |
| IE (1) | IE63033B1 (ja) |
| ZA (1) | ZA892405B (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7235404B2 (en) * | 2005-05-04 | 2007-06-26 | Beckman Coulter, Inc. | Cyanide-free lytic reagent composition and method of use for hemoglobin and white blood cell measurement |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA841078B (en) * | 1983-03-01 | 1984-09-26 | Warner Lambert Co | Peroxidase activity detection composition |
| JPH0653074B2 (ja) * | 1984-02-24 | 1994-07-20 | 大日本印刷株式会社 | 体液検査体 |
| CA1260370A (en) * | 1984-09-26 | 1989-09-26 | Robert W. Schumacher | Tableted peroxidase activity indicator reagent |
| GB8505899D0 (en) * | 1985-03-07 | 1985-04-11 | Boots Celltech Diagnostics | Assay reagents |
-
1989
- 1989-03-24 AT AT89200761T patent/ATE105937T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-24 DE DE68915323T patent/DE68915323T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-24 EP EP89200761A patent/EP0336481B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-24 ES ES89200761T patent/ES2056191T3/es not_active Expired - Lifetime
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