DE68915323T2 - Verfahren zum Nachweis einer spezifisch bindenden Substanz in Blut sowie Reagenzsatz zur Ausführung dieser Methode. - Google Patents
Verfahren zum Nachweis einer spezifisch bindenden Substanz in Blut sowie Reagenzsatz zur Ausführung dieser Methode.Info
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Description
- Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum quantitativen und/oder qualitativen Nachweis einer spezifisch bindenden Substanz in Blut oder einer davon abgeleiteten Fraktion unter Anwendung der Bindungsaffinität zwischen der spezifisch bindenden Substanz und ihrem Reaktionspartner. Ueberdies wurde eine Reaktionskomponente mit Peroxidaseaktivität verwendet, indem ein Reaktionsgemisch, welches die spezifisch bindende Substanz und ihren Reaktionspartner enthält, inkubiert wurde, und wodurch die Peroxidaseaktivität in dem Reaktionsgemisch oder einer davon abgeleiteten Fraktion bestimmt wurde. Die Peroxidaseaktivität ist ein Mass für die Menge und/oder die Gegenwart der spezifisch bindenden Substanz. Auch eine Testgarnitur zur Durchführung dieses Verfahrens gehört zur Erfindung. Ein solches Verfahren zum Nachweis einer Peroxidaseaktivität wurde bereits im holländischen Patent 154 600 beschrieben.
- Als Trägermaterial wurde in diesem Verfahren oft die Wand einer kleinen vertiegfung in einer Mikrotitrierplatte verwendet, an welche Antikörper gebunden sind. Das zu untersuchende Blut oder eine davon abgeleitete Fraktion, wie Serum, wird in die Vertiefungen der Mikrotitrierplatte eingeführt. Der gebundene Antikörper ist fähig, mit dem im Blut oder einer davon abgeleiteten Fraktion vorhandenen Antigen zu reagieren, was dazu führt, dass das Antigen gebunden wird. Um feststellen zu können, ob eine immunochemische Reaktion stattgefunden hat, kann man anschliessend markierte Antikörper verwenden, welche gegen das zu bestimmende Antigen gerichtet sind. Diese markierten Antikörper reagieren mit dem bereits auf der festen Phase gebildeten Antikörper-Antigen-Komplex. Die markierten Antikörper bestehen aus Antikörpern, an welche ein Enzym, vorzugsweise ein Peroxidaseenzym, gebunden ist. In der nächsten Stufe wird eine farblose Lösung (Substrat + Chromogen) zugesetzt. Das Enzym ist fähig, diese Lösung in eine gefärbte Verbindung umzuwandeln. Die Intensität der Farbe hängt von der Menge an Enzym ab, welche proportional zur Menge an gebundenem Antigen ist. Diese Farbe kann durch Zusatz eines Stopp- Reagens geändert werden. Das derart beschriebene Verfahren zur Bestimmung eines Antigens in Blut oder einer davon abgeleiteten Fraktion ist ein Verfahren vom Sandwich-Typ. Andere immunochemische Verfahren, wie eine Inhibitionsreaktion und eine Kompetitionsreaktion, können auch verwendet werden. Als geeignete Enzyme kann man u.a. alkalische Phospatase, Urease und eine zuvor erwähnte Peroxidase, vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase (HRP), verwendet werden. Die HKP katalysiert die Umwandlung des Substrates, einer Peroxidverbindung, in Wasser. Die für diese Reaktion benötigten Elektronen können durch chromogene Substanzen, wie Tetramethylbenzidin (TMB) geliefert werden. Das TMB wird als Folge davon in gefärbte Komplexe umgewandelt, durch welche die Enzymreaktion sichtbar gemacht wird. Die gebildete Farbe kann entweder visuell nachgewiesen werden oder die Enzymreaktion kann in einer analytisch geeigneten Weise bestimmt werden.
- Bei der Untersuchung von Blut auf die Gegenwart von Antigenen oder Antikörpern ist es üblich, dass das die zu bestimmenden Antigene oder Antikörper enthaltende Serum vor der Bestimmung von den Blutzellen getrennt wird.
- In der Praxis wird sichtbar, dass oft eine unerwünschte erhöhte Farbintensität erzeugt wird, insbesondere bei der Durchführung eines immunologischen Tests (EIA), wenn eine Peroxidase als Enzym verwendet wird. Diese Erscheinung wird auch als partielle Färbung beschrieben.
- Es ist klare dass diese Erscheinung der partiellen Färbung zu unerwünschten Resultaten und Folgerungen führt. In diesem Zusammenhang kann man die sogenannten AIDS-Antikörpertests erwähnen. In diesen Tests werden Seren von Blutspendern routinemässig in einem immunologischen Enzymtest auf die Anwesenheit von gegen den AIDS-Virus gerichtete Antikörper untersucht.
- Die vorliegende Erfindung ist daher dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Peroxidaseaktivität in Gegenwart eines quaternären Ammoniumsalzes ausgeführt wird.
- Als quaternäre Ammoniumsalze kann man z.B. Dodecyltrimethylammoniumbromid, Hexadecyltrimethylammoniumbromid, Tetradecyltrimethylammoniumbromid, Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid, Benzethoniumchlorid, Benzyldimethylhexadecylammoniumchlorid, Cetyldimethyläthylammoniumbromid, Cetylpyridiniumbromid, Cetylpyridiniumchlorid, Dimethyldioctadecylammoniumbromid und Methylbenzethoniumchlorid verwenden. Vorzugsweise werden als geeignete quaternäre Ammoniumsalze Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB), Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) oder Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid (Benzalkoniumchlorid) eingesetzt.
- Es ist überraschend, dass die Peroxidaseaktivität bestimmt werden kann unter Zusatz dieser quaternären Ammoniumsalze, wobei die partielle Färbung wesentlich unterdrückt wird. Falls erwünscht, kann Vollblut, verdünnt oder unverdünnt, als Probe verwendet werden, wobei die roten Blutzellen so gut wie möglich vor der Bestimmung der Peroxidaseaktivität entfernt werden. Das quaternäre Ammoniumsalz kann zum Test in der Form einer, das quaternäre Ammoniumsalz enthaltenden Lösung oder als eine feste Verbindung zugesetzt werden.
- Dieser Zusatz der quaternären Ammoniumsalze zum Test kann entweder zusammen mit dem Substrat oder zusammen mit dem Chromogen oder zusammen mit einem Substrat/Chromogen-Gemisch erfolgen.
- Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Testgarnitur, welche die Komponenten, wie ein Peroxidase-Enzym-Konjugat und ein quaternäres Ammoniumsalz enthält, zur Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung.
- Das Verfahren gemäss der Erfindung zum quantitativen und/oder qualitativen Nachweis einer spezifisch bindenden Substanz in Blut oder einer davon abgeleiteten Fraktion kann in jeder Reaktion ausgeführt werden, in welcher die Bindung der spezifisch bindenden Substanz mit ihrem Reaktionspartner bestimmt wird durch Verwendung einer Reaktionskomponente, welche Peroxidaseaktivität aufweist. Die Bestimmung der Peroxidaseaktivität ist ein Mass für die Menge und/oder die Gegenwart der spezifisch bindenden Substanz.
- So kann man z.B. die zuvor erwähnte Sandwich-, aber auch eine Inhibitions- oder Kompetitionsreaktion anwenden.
- Eine "spezifisch bindende Substanz" kann z.B. ein Hapten, ein Antigen oder ein Fragment davon, einen Antikörper oder ein Fragment davon oder Protein A, DNA oder RNA bedeuten.
- "Ihr Reaktionspartner" bedeutet z.B. ein Hapten, ein Antigen oder ein Fragment davon, einen Antikörper oder ein Fragment davon oder Protein A, DNA oder RNA, wobei dieser Reaktionspartner eine Bindungsaffinität zur spezifisch bindenden Substanz aufweist. Dieser Reaktionspartner kann gegebenenfalls an Trägermaterial gebunden sein.
- Eine "Reaktionskomponente" bedeutet z.B. ein Hapten, ein Antigen oder ein Fragment davon, einen Antikörper oder ein Fragment davon oder Protein A, DNA oder RNA, durch welche diese Reaktionskomponente auch Peroxidaseaktivität besitzt, wobei diese Komponente nicht an einen festen Träger gebunden zu sein braucht und welche Komponente auch in fester Form, in gefriergetrockneter Form oder in Lösung verwendet werden kann.
- Wenn das Antigen im Verfahren gemäss der Erfindung mit Hilfe einer Sandwichreaktion bestimmt wird, kann das Antigen mit einem Trägermaterial inkubiert werden, an welches bereits Antikörper gebunden wurden, die gegen das zu bestimmende Antigen gerichtet sind. Als Träger kann man z.B. Reagensröhrchen, Mikrotitrierplatten, Stäbe, Perlen oder Scheiben, hergestellt aus z.B. Glas oder Kunststoff, verwenden. Die Bestimmung, ob Komplexbildung zwischen dem an den festen Träger gebundenen Antikörper und das zu bestimmende Antigen erfolgte, wird durch nachfolgenden Zusatz eines zweiten, mit einem Enzym versehenen Antikörpers durchgeführt.
- Das Enzym wird u.a. auf der Basis der Reaktionsfähigkeit und Stabilität ausgewählt. Enzyme, wie alkalische Phosphatase, Urease, Glukoseoxidase, Galaktoseoxidase und Peroxidase werden bevorzugt, insbesondere die Gruppe der Oxidasen. Diese Enzyme sind fähig, eine Konversion eines Peroxidase-Substrats, an welcher gefärbte Komponenten beteiligt sind, zu katalysieren.
- In dieser Gruppe wird HRP-Enzym hauptsächlich wegen guter Stabilität und niederem Kaufpreis bevorzugt. Die ebenfalls für diese Enzymreaktion benötigten Elektronen-liefernden Substanzen können z.B. Chromogene sein. Geeignete Chromogene sind z.B. Tetramethylbenzidin, o-Phenylendiamin, 5-Aminosalicylsäure, 2,2'-Azino-di-[3-äthylbenzothiazolin- 6-sulfonat], wobei Tetramethylbenzidin (TMB) bevorzugt wird. Das TMB wird während der Reaktion in gefärbte Komplexe umgewandelt, auf Grund deren die Enzymwirkung nachgewiesen wird, und dies ergibt ein qualitatives und/oder quantitatives Mass für das zu bestimmende Antigen.
- Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf das folgende Beispiel näher erläutert.
- Ein Serum-Pool, welches auf HBsAg negativ war, wurde untersucht.
- Die kleinen Vertiefungen von Polystyrol-Mikrotitrierplatten wurden auf der Innenseite mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen HBsAg gerichtet war, nach einem in der Immunchemie bekannten Verfahren beschichtet.
- Ein Konjugat von gegen HBSAg gerichteten Antikörpern und Meerrettinch-Peroxidase (HRP) wurde gemäss einem Verfahren hergestellt, das in der Immunchemie üblich ist.
- Als Substrat wurde eine Harnstoff-Peroxidase-Lösung verwendet, während als Chromogen eine TMB-Lösung (Tetramethylbenzidin gelöst in Dimethylsulfoxid) eingesetzt wurde. Die Substrat/Chromogen-Lösung wurde in zwei gleiche Teile geteilt. Zu einem Teil wurde ein quaternäres Ammoniumsalz (CTAB) in einer Konzentration von 0,2 g/l (Gruppe A) zugesetzt, während im anderen Teil (Gruppe B) kein quaternäres Ammoniumsalz eingeführt wurde.
- Die beschichteten Mikrotitrierplatten wurde während 30 Minuten bei 50ºC mit 0,1 ml des zu untersuchenden Serums in den jeweiligen kleinen Vertiefungen inkubiert.
- Anschliessend wurden die kleinen Vertiefungen abgesogen und viermal mit einem Waschpuffer (PBS/Tween ) gewaschen und wieder abgesaugt.
- 0,1 ml des Konjugates wurden anschliessend in jede der kleinen Vertiefungen eingeführt. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 50ºC wurden die kleinen Vertiefungen wieder abgesaugt, gewaschen und abgesaugt.
- Anschliessend wurden die Mikrotitrierplatten in zwei Gruppen geteilt: Gruppe A und Gruppe B. Die zur Gruppe A gehörenden kleinen Vertiefungen erhielten sodann 0,1 ml Substrat/Chromogen-Gemisch zusammen mit dem CTAB. Die zur Gruppe B gehörenden kleinen Vertiefungen erhielten das Substrat/Chromogen-Gemisch, zu welchem kein CTAB zugesetzt worden war.
- Nach Inkubation während 30 Minuten bei 25ºC wurde die Enzymreaktion gestoppt durch Zusatz von 0,1 ml Schwefelsäurelösung (2 M) zu jeder kleinen Vertiefung.
- Die aus beiden Gruppen erhaltenen Resultate sind in der Tabelle zusammengestellt. Tabelle CTAB zugesetzt (Gruppe A) CTAB nicht zugesetzt (Gruppe B) Beispiel 1 Anzahl untersuchter kleiner Vertiefungen, Anzahl kleiner Vertiefungen, in welchen partielle Färbung festgestellt wurde Beispiel 2 Anzahl untersuchter kleiner Vertiefungen Anzahl kleiner Vertiefungen, in denen partielle Färbung festgestellt wurde
Claims (6)
1. Verfahren zum quantitativen und/oder
qualitativen Nachweis einer spezifisch bindenden Substanz in
Blut oder einer davon abgeleiteten Fraktion unter Anwendung
der Bindungsaffinität zwischen der spezifisch bindenden
Substanz und ihrem Reaktionspartner, wobei eine
Peroxidaseaktivität aufweisende Reaktionskomponente aufgebracht
wird, ein Reaktionsgemisch, welches die spezifisch bindende
Substanz und ihren Reaktionspartner enthält, inkubiert wird
und die Peroxidaseaktivität in diesem Reaktionsgernisch oder
einer davon abgeleiteten Fraktion bestimmt wird, wobei die
Peroxidaseaktivität ein Mass für die Menge und/oder die
Gegenwart der spezifisch bindenden Substanz liefert, dadurch
gekennzeichnet, dass die Bestimmung der peroxidaseaktivität
in Gegenwart eines quaternären Ammoniumsalzes durchgeführt
wird.
2. Verfahren zum quantitativen und/oder
qualitativen Nachweis einer spezifisch bindenden Substanz in
Blut oder einer davon abgeleiteten Fraktion nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternäre Amminiumsalz
zusammen mit dem Substrat zugesetzt wird.
3. Verfahren zum quantitativen und/oder
qualitativen Nachweis einer spezifisch bindenden Substanz in
Blut oder einer davon abgeleiteten Fraktion nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternäre Ammoniumsalz
zusammen mit dem Chromogen zugesetzt wird.
4. Verfahren zum quantitativen und/oder
qualitativen Nachweis einer spezifisch bindenden Substanz in
Blut oder einer davon abgeleiteten Fraktion nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternäre Ammoniumsalz
zusammen mit einem Substrat/Chromogengemisch zugesetzt
wird.
5. Verfahren zum quantitativen und/oder
qualitativen Nachweis einer spezifisch bindenden Substanz in
Blut oder einer davon abgeleiteten Fraktion nach den
Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als
quaternäres Ammoniumsalz Dodecyltrimethylammoniumbromid,
Hexadecyltrimethylammoniumbromid oder
Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid verwendet wird.
6. Testgarnitur zur Durchführung des
Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die
Garnitur enthält:
- ein Enzymkonjugat, welches Peroxidaseaktivität aufweist,
- Substrat für das Enzym,
- Chromogen und
- ein quaternäres Ammoniumsalz.
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