DE2906732B1 - Verfahren und Reagenz zur Bestimmung der Peroxidase - Google Patents

Verfahren und Reagenz zur Bestimmung der Peroxidase

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Description

Enzym-Immuno-Assays, die POD als Markerenzym einsetzen. Bei dieser bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens führt man die POD-Bestimmung im Rahmen einer immunologischen Haptenbestimmung durch, bei der man eine bekannte Menge eines mit POD markierten Haptens der zu untersuchenden, eine unbekannte Menge des Haptens enthaltenden Probe zusetzt, die Probe dann mit einem an einen festen Träger gebundenen spezifischen Antikörper des Haptens kontaktiert, die feste von der flüssigen Phase trennt und in einer der beiden Phasen die POD-Aktivität mißt (ELISA-Tests).
Zur Erläuterung der Erfindung soll im folgenden ein derartiger ELISA-Test am Beispiel eines handelsüblichen Tests zur Bestimmung von Digoxinkonzentrationen im Blutserum erläutert werden. Die innere Oberfläche eines Reagenzgläschens ist mit spezifischen Antikörpern gegen Digoxin beladen, wobei die Antikörper kovalent oder adsorptiv so fest an die Röhrchenwand gebunden sind, daß sie sich nicht auswaschen lassen. Gibt man in ein solches Reaktionsgefäß eine Digoxinlösung, so wird Digoxin von den trägergebundenen Antikörpern gebunden. Handelt es sich um ein mit POD markiertes Digoxin, so kann man nach Herauswaschen des in der Lösung verbliebenen Überschusses an POD-markierten Digoxinmolekülen die Menge der an die Gefäßwand über den Antikörper gebundenen POD-markierten Digoxinmoleküle oder die in der Lösung verbliebene Menge durch Messung ihrer POD-Aktivität quantitativ bestimmen.
Will man nun in einer Probe eine unbekannte Konzentration an Digoxin bestimmen, so gibt man ein Aliquot dieser Probe zusammen mit einer bekannten Menge an POD-markiertem Digoxin in das Reaktionsgefäß. Die markierten und die unmarkierten Digoxin- moleküle konkurrieren um die Bindungsstellen, wobei sich ein Gleichgewicht einstellt. Je mehr unmarkiertes Digoxin mit der Probe in das Reaktionsgefäß eingebracht wird, desto weniger markiertes Digoxin wird an die Wand gebunden. Mit Hilfe einer Eichkurve läßt sich daher die Menge an Digoxin in der Probelösung durch Bestimmung der POD feststellen.
Beispiele für andere Haptene, die sich nach dieser Methode bestimmen lassen, sind Thyroxin (T4) oder Insulin.
Bei den handelsüblichen ELISA-Tests wird vielfach die Aktivität der POD photometrisch unter Verwendung von ABTS als chromogenes Substrat bestimmt. Die untere Empfindlichkeitsgrenze dieses Verfahrens liegt bei 1 ng/ml Testvolumen. Dieses Verfahren ist daher zwar empfindlicher als die bisher bekannten Methoden unter Anwendung einer Chemilumineszenzreaktion. Jedoch erfordert die photometrische ABTS-Methode eine Inkubationszeit von 60 Minuten zur Farbentwicklung.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, die Meßzeit für die reine Enzymaktivitätsbestimmung bei derartigen ELISA-Tests von 60 Minuten auf 2 bis 3 Minuten herabzusetzen bei gleicher oder noch besserer Empfindlichkeit. Die Messung erfolgt vorzugsweise derart, daß die in einem bestimmten Zeitintervall emittierte Lichtmenge gemessen wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird zweckmäßig bei pH-Werten zwischen 6 und 9, vorzugsweise zwischen pH 7,5 und 8,5, durchgeführt. Als Puffer wird Kaliumphosphatpuffer oder Glycin-NaOH-Puffer bevorzugt, obwohl auch andere Puffersubstanzen, wie z. B. Tris-HCI, Tris-Sulfat und Tris-Acetat gut geeignet sind.
Die bevorzugte Pufferkonzentration beträgt dabei 10 bis 100OmM. Das erfindungsgemäß verwendete chromogene Substrat wird zweckmäßig in Mengen zwischen 10 μΜ und 10OmM verwendet. Die erfindungsgemäße Bestimmung kann bei den für enzymatische Bestimmungen üblichen Temperaturen, die zwischen etwa 20 und 370C liegen, durchgeführt werden. Besonders bevorzugt wird dabei der Temperaturbereich zwischen 22 und 300C.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Bestimmung der POD, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es 7-Dimethylaminonaphthalin-1,2-dicarbonsäurehydrazid, einen H2O2-Lieferanten und Puffersubstanz, pH 6 bis 9, enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält dieses Reagenz
0,1 bis 100 μΜ 7-DimethylaminonaphthaIin-1,2-dicarbonsäurehydrazid,
50 bis 500 mM Kaliumphosphat- oder
Glycin-Puffer,
10 bis 200 μΜ H2O2 und gegebenenfalls
0,01 bis 1 mM eines Sequestrierungsmittels.
Als gegebenenfalls zu verwendendes Sequestrierungsmittel kommen die hierfür bekannten Substanzen, wie Äthylendiaminotetraessigsäure (EDTA) und ähnliche, dem Fachmann bekannte Verbindungen in Betracht. Außerdem kann das Reagenz übliche Stabilisierungsmittel, wie Serumalbumin, Kohlehydrate und dergleichen enthalten. Als H2O2-Lieferant werden im Rahmen der Erfindung H2O2 selbst sowie die bekannten, H2O2 freisetzenden Substanzen, wie Harnstoffperhydrat (»festes H2O2«) und ähnliche, sowie organische Hydroperoxide, bei denen eines der Wasserstoffatome durch einen organischen Rest ersetzt ist, verstanden. Auch die festen Salze des H2O2, wie Natriumperoxid, die sich bei Auflösen in Wasser wie eine Mischung aus H2O2 und der entsprechenden Hydroxylverbindung verhalten, können verwendet werden. Beispielsweise kann eine Kombination aus Glycin und Natriumperoxid verwendet werden, die beim Auflösen in Wasser den Glycin-NaOH-Puffer sowie H2O2 bildet.
Außer den oben genannten Bestandteilen enthält das erfindungsgemäße Reagenz vorzugsweise auch mit POD markiertes Hapten sowie einen trägergebundenen spezifischen Antikörper gegen das jeweilige Hapten, wenn das Reagenz im Rahmen des Enzym-Immun-Tests verwendet werden soll. Daneben können die anderen, in derartigen ELISA-Reagenzien üblichen Bestandteile, wie weitere Puffer, Stabilisierungsmittel und dergleichen, enthalten sein.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Ein handelsüblicher enzym-immunologischer in-vitro-Test zur quantitativen Bestimmung von Digoxin nach dem ELISA-Prinzip (Enz-Immun-Test Digoxin, Boehringer Mannheim) wurde wie folgt durchgeführt:
In ein Kunststoffreagenzröhrchen, welches auf der Innenseite mit ca. 60 pg Digoxin-Antikörpern beschichtet ist, wurden 1,0 ml einer Lösung von POD-markiertem Digoxin (ca. 12 U/l POD) in Phosphatpuffer 40 mM/I, pH 6,8, die 0,25% Rinderserumalbumin enthält sowie 0,1 ml Serum als Probe gegeben, gemischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur (20 bis 25° C) stehengelassen. Nach Beendigung dieser Inkubationszeit wird der Röhrcheninhalt ausgesogen und verworfen und das Röhrchen einmal mit gekühltem Leitungswasser ausge-
spült. Dann wurde in das Röhrchen 1 ml einer Lösung von 100 μΐη/ηιΐ T-Dimethylaminonaphthalin-l^-dicarbonsäurehydrazid in lOOmM/1 Kaliumphosphatpuffer, pH 8,2, welche 0,1 mM/1 EDTA enthält, gegeben. Dann wurde die Reaktion durch Zusatz von 120 μΜ H2C>2 gestartet. In einem Photometer (ATP-Photometer der Firma SAI, San Diego, Kalifornien) wurde zwischen der 2. und 5. Minute nach dem Start das emittierte Licht gemessen. Das auf dem Schreibgerät aufgezeichnete Signal wurde integriert. Aus einer Eichkurve, die in analoger Weise unter Verwendung von bekannten Digoxinmengen gewonnen wurde, wurde die dem gemessenen Lichtsignal entsprechende Digoxinmenge bestimmt.
In der Zeichnung zeigt F i g. 1 die erhaltene Eichkurve, dargestellt als Digoxinmenge gegen emittierte Lichtmenge, im Vergleich zum herkömmlichen photometrischen Verfahren unter Verwendung der Farbreaktion mit ABTS, wobei die Kurve das Verhältnis von Digoxinmenge zu Extinktion bei Wellenlänge HE 405 nm wiedergibt.
Beispiel 2
Analog Beispiel 1 wurde die enzymimmunologische Bestimmung von Thyroxin (T4) nach dem ELISA-Prinzip unter Verwendung eines handelsüblichen Tests (Boehringer Mannheim GmbH) durchgeführt. Zur Inkubation wurden in diesem Fall 1 ml einer Lösung verwendet, weiche POD-markiertes T4 (ca. 12 U/l POD) in Phosphatpuffer 17,8 mM/1, pH 8,6, der 120 mM/1 Barbiturat und 0,20% Rinderserumalbumin und 0,04% 8-Anilino-l-naphthalinsulfinsäure enthält, verwendet. Die Serummenge beträgt 0,02 ml.
Nach 2stündiger Inkubation bei Zimmertemperatur (20 bis 25° C) wird wie in Beispiel 1 beschrieben der Röhrcheninhalt ausgesaugt und das Röhrchen mit Leitungswasser ausgewaschen. Dann wurde die gleiche Lösung wie in Beispiel 1 beschrieben zugegeben und in gleicher Weise ausgewertet. F i g. 2 der Zeichnung zeigt in graphischer Darstellung die in der beschriebenen Weise unter Verwendung von Standardserum mit unterschiedlicher Verdünnung erhaltene Eichkurve im Vergleich zu einer nach dem bekannten Verfahren unter Verwendung ABTS als chromogenem Substrat erhaltenen Kurve.
Beispiel 3
Analog zu dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde unter Verwendung eines handelsüblichen enzymimmunologischen Tests nach dem ELISA-Prinzip (Insulin-ELISA der Firma Boehringer Mannheim GmbH) die immunologische Reaktion in dem mit Antikörper gegen Insulin beschichteten Kunststoffreagenzgläschen (Insulin-Bindungskapazität 6 bis 10 μΌ/ Gläschen) durchgeführt. 0,2 ml Serum als Probe wurden mit 1,0 ml einer Lösung von POD-markiertem Insulin (ca. 15 U/l POD) in Phosphatpuffer, 40 mM/1, pH 6,8, welche 0,25% Rinderserumalbumin enthält, nach Vorschrift inkubiert, anschließend die flüssige Phase verworfen, das Röhrchen mit kaltem Wasser gespült und wie in Beispiel 1 beschrieben unter Verwendung der gleichen Reagenzlösung die Bestimmung des an die Gläschenwand gebundenen POD durchgeführt. F i g. 3 der Zeichnung zeigt die auf diese Weise erhaltene Eichkurve im Vergleich mit einer Eichkurve unter Verwendung von ABTS als chromogenes Substrat.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (11)

1 2
1.11.1.7) bezeichnet eine Gruppe von Enzymen, welche
Patentansprüche: die Dehydrogenierung einer großen Anzahl organischer
Verbindungen katalysieren. Bedeutung hat die POD-Be-
1. Verfahren zur Bestimmung von Peroxidase in Stimmung vor allem in Verbindung mit vorgeschalteten Gegenwart einer Verbindung, die bei ihrer enzym- 5 Reaktionen, bei denen H2O2 gebildet wird, beispielsweikatalysierten Oxidation mit einer Peroxy verbindung se für die Blutzuckerbestimmung sowie bei enzymimmu-Licht emittiert, und Messung des emittierten Lichts, nologischen Bestimmungsverfahren, die POD als dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierungsenzym verwenden, erlangt. Andere Analy-Licht emittierende Verbindung 7-Dimethylamino- senmethoden, bei denen die POD-Bestimmung von naphthalin-l,2-dicarbonsäure-hydrazid verwendet. io Bedeutung ist, sind beispielsweise die Galactose-,
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Wasserstoffperoxid-, Katalase- oder Oxidasen-Bestimzeichnet, daß man die Peroxidase-Bestimmung im mung.
Rahmen einer an sich bekannten immunologischen Es ist bekannt, POD durch Abnahme des H2O2 oder Haptenbestimmung durchführt, bei der man eine des Wasserstoffdonators sowie durch Entstehung der bekannte Menge eines mit der Peroxidase markier- 15 dehydrierten Verbindung zu messen. Besondere Bedeuten Haptens der zu untersuchenden, eine unbekann- rung hat dabei die letztere Methode gefunden, wobei als te Menge des Haptens enthaltenden Probe zusetzt, der Dehydrierung unterworfene Substrate beispielsweidie Probe dann mit einem an einen festen Träger se Di-o-anisidin, Guajakol oder ABTS (2,2'-Azinodi[3-gebundenen spezifischen Antikörper des Haptens äthyl-benzthiazolin-(6)-sulfonsäure] verwendet werden, kontaktiert, die feste von der flüssigen Phase trennt 20 Diese bekannten Methoden haben sich zwar bewährt, und in einer der beiden Phasen die Peroxidaseaktivi- es besteht jedoch ein Bedarf an Methoden höherer tat mißt. Empfindlichkeit, welche insbesondere geeignet sind, die
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch POD-Bestimmung im Rahmen von Enzymimmun-Tests gekennzeichnet, daß man die in einem bestimmten erheblich zu verkürzen. Wie bereits erwähnt, spielt POD Zeitintervall emittierte Lichtmenge mißt. 25 als Markierungsenzym bei den sogenannten »Enzym-
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Immuno-Assays« (ELISA-Tests) eine große Rolle. Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Zahlreiche, auf diesem System beruhende TestreagenpH-Wert zwischen 6,0 und 9,0 einstellt. zien sind handelsüblich. Bei diesen Reagenzien bzw.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn- Verfahren dauert die eigentliche POD-Bestimmung z.B. zeichnet, daß man den pH-Wert mit einer Puffersub- 30 mit ABTS als Substrat etwa 60 Minuten. Eine stanz der Konzentration 10 bis 1000 mM einstellt. wesentliche Verringerung dieses Zeitbedarfs wird daher
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch angestrebt.
gekennzeichnet, daß man Kaliumphosphat- oder Aus der DE-OS 28 11 228 ist bereits ein Verfahren zur
Glycin-Puffer verwendet. Bestimmung von POD in Gegenwart einer phenolischen
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden 35 Verbindung bekannt, die bei ihrer enzymkatalysierten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man 10 bis Oxidation mit H2O2 und H2O2 enthaltenden Verbindun-200 μηι H2O2 zusetzt. gen Licht emittiert, und Messung des emittierten Lichts.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Als phenolische Verbindung wurde dabei Pyrogallol Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man verwendet Mit diesem Verfahren war bereits eine 10 μΜ bis 10OmM 7-Dimethylaminonaphthalin-l,2- 40 Erhöhung der Empfindlichkeit zu erzielen, jedoch ließ dicarbonsäurehydrazid zusetzt. die Quantenausbeute immer noch zu wünschen übrig.
9. Reagenz zur Bestimmung von POD nach dem Gleiches gilt auch gegenüber dem für denselben Zweck Verfahren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn- schon vorgeschlagenen Luminol.
zeichnet, daß es 7-Dimethylaminonaphthalin-l,2-di- Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein
carbonsäurehydrazid, ein H2O2 lieferndes System 45 Verfahren zur Aktivitätsbestimmung von Peroxidasen und Puffersubstanz, pH 6 bis 9 enthält. mit Hilfe einer Chemilumineszenz-Reaktion zu schaffen,
10. Reagenz nach Anspruch 9, dadurch gekenn- welches eine bessere Quantenausbeute liefert als die zeichnet, daß es bisher, bekannten Verfahren dieser Art und es
0,1 bis 100 μΜ 7-Dimethylaminonaphthalin- ermöglicht, die Empfindlichkeit der POD-Bestimmung
1,2-dicarbonsäurehydrazid, 50 und die Zeitdauer der POD-Bestimmung im Rahmen
50 bis 500 mM Kaliumphosphat- oder des Enzym-lmmuno-Assays wesentlich herabzusetzen.
Glycin-Puffer, Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur
10 bis 200 μΜ H2O2 und gegebenenfalls Bestimmung von Peroxidase in Gegenwart einer
0,01 bis 1 mM eines Sequestrierungsmittels Verbindung, die bei ihrer enzymkatalysierenden Oxida-
enthält. 55 tion mit einer Peroxyverbindung Licht emittiert und
11. Reagenz nach Anspruch 9 oder 10, dadurch Messung des emittierten Lichts welches dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mit Peroxidase gekennzeichnet ist, daß man als Licht emittierende markiertes Hapten und trägergebundenen spezifi- Verbindung 7-Dimethylaminonaphthalin-l,2-dicarbonschen Antikörper gegen das Hapten enthält. säurehydrazid verwendet.
60 Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß 7-Dimethylaminonaphthalin-1,2-dicar-
bonsäurehydrazid bei seiner mit POD katalysierten
Oxidation durch Perverbindungen eine um ein Vielfaches höhere Quantenausbeute liefert, verglichen mit den
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung 65 bisher hierfür verwendeten lumineszierenden Substravon Peroxidase (POD) und ein hierfür geeignetes ten.
Reagenz. Neben der Bestimmung der Peroxidase selbst hat
Peroxidase (POD; Donor: H2O2-Oxidoreduktase, EC dieses Verfahren besondere Bedeutung im Rahmen von
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