DE69028591T2

DE69028591T2 - Haloperoxidase-Säure-Optimum Chemilumineszenztestsystem

Info

Publication number: DE69028591T2
Application number: DE69028591T
Authority: DE
Inventors: Robert Charles Allen
Original assignee: Exoxemis Inc
Current assignee: Exoxemis Inc
Priority date: 1989-10-05
Filing date: 1990-10-04
Publication date: 1997-02-27
Anticipated expiration: 2010-10-05
Also published as: ATE143055T1; IL95900A0; CA2026809C; AU6602890A; WO1991005063A1; EP0421788A3; CA2026809A1; EP0421788B1; US5556758A; JP3184894B2; DE69028591D1; IL95900A; EP0421788A2; JPH05500902A; IE903535A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes System zur Bestimmung von Analyten in einer Testlösung durch Chemilumineszenzanalyse. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein halogenid-abhängiges Analytanalysensystem mit einem saures pH-Wertoptimum unter Verwendung einer Haloperoxidase (Halogenid: Wasserstoffperoxidoxidoreduktase, EC 1.11.1.n), eines Oxidationsmittels und eines Lumineszenzsubstrats, wobei ein Chemilumineszenzsignal erzeugt wird, welches das Vorhandensein oder die Menge eines Analyten in einer Testprobe anzeigt.
Testsysteme zur Konzentrationsbestimmung eines oder mehrerer Analyten in einer Testprobe mit hohem Genauigkeitsgrad sind oft erforderlich. Diese Systeme finden einen weiten Anwendungsbereich, der sich von der Bestimmung toxischer Substanzen in Industrieabfällen bis zur Bestimmung möglicher Verunreinigungen in Nahrungsmitteln erstreckt. Die Entwicklung eines Testsystems für Analyten in biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, Plasma, Urin und ähnliche, hat, aufgrund des Bedarfs von Ärzten an genauen und aktuellen Informationen, die den physiologischen Zustand ihrer Patienten betreffen, um diagnostische und therapeutische Maßnahmen zu unterstutzen, viel Aufmerksamkeit erfahren. In der Folge wurden Testsysteme entwickelt, die imstande sind, die Konzentration verschiedener Analyten in biologischen Flüssigkeiten mit hohem Genauigkeitsgrad zu bestimmen.
Ein derartiges System ist der bekannte Radioimmunoassay, in dem ein radioaktiver Marker, der an ein Analogon des Analyten oder an einen Antikörper gebunden ist, eingesetzt wird. In der klassischen Form läßt man eine bekannte Menge des radioaktiv markierten Analogons des Analyten mit dem Analyten um eine begrenzte Menge des für den Analyten spezifischen Antikörpers konkurrieren. In anderen Formen kann der radioaktive Marker an einen für den Analyten spezifischen Antikörper, der mit dem in der Testprobe vorhandenen Analyten ein "Sandwich" bildet, gebunden sein. Ungeachtet der Testform wird der radioaktive Marker, der mit dem Analyten komplexiert ist oder frei in der Lösung verbleibt, als ein Kennzeichen gemessen, das entweder direkt oder indirekt mit der Menge des Analyten in der Testprobe verknüpft ist. Obwohl hochempfindliche Testsysteme auf Basis der radioaktiven Marker entwickelt wurden, stellen der Bedarf an radioaktiven Materialien, die speziellen Handhabungsverfahren sowie die spezielle Ausrüstung und die Erzeugung radioaktiver Abfälle ernste Nachteile gegen die weitverbreitete und ständige Verwendung der Testverfahren auf Basis radioaktiver Marker dar.
Der Bedarf an radioaktiven Materialien im Bereich der Testverfahren hat durch die Verwendung von enzym-markierten Materialien anstelle von radioaktiven Markern abgenommen. Typische Enzymimmunoassays folgen beispielsweise den Testvorschriften, die denen, welche in den entsprechenden Radioimmunoassays angewandt werden, sehr ähnlich sind, wobei die Menge der Enzymaktivität, die kolorimetrisch bestimmt wird, direkt oder indirekt mit der Menge des Analyten in einer Testprobe schwankt. Die weitverbreitete Verwendung von Systemen mit Enzymmarkern hat die Menge an radioaktiven Materialien, die sonst zum Zweck klinischer Testverfahren verwendet worden wären, wesentlich verringert, aber führte häufig zu einem Empfindlichkeitsverlust des Testverfahrens, zu einem hohen Untergrund sowie zu zweideutigen Testergebnissen.
Vor kurzem wurden Lumineszenzindikatorreaktionen anstelle von Radiomarkern oder Enzymmarkern zur Verwendung in sonst herkömmlichen Testsystemen vorgeschlagen. Lumineszenzreaktionen, die auf der Messung der Lichts, das von einem Bestandteil des Testsystems emittiert wird, beruhen, wurden als Ersatz der Radio- und Enzymmarker in den Immunoassays und als Ersatz für die herkömmlichen, kolorimetrischen oder spektralphotometrischen Indikatorreaktionen, wie in den Testverfahren für Substrate der Oxidasen und Hydrolasen, untersucht. Auf dem Fachgebiet sind im allgemeinen zwei Arten von in Testsystemen nützlichen Lumineszenzindikatorreaktionen bekannt: die Fluoreszenzreaktionen und Chemilumineszenzreaktionen. In einem Fluoreszenztestsystem wird ein Lumineszenzmolekül in einen angeregten Energiezustand befördert, indem Energie von einfallender Strahlung, die von einer Lichtquelle erzeugt wird, auf das Lumineszenzmolekül übertragen wird. Danach relaxiert das Molekül in einen tieferliegenden Energiezustand unter Lichtemission in einer Art und Menge, die von der Menge der im System vorhandenen Lumineszenzmoleküle abhängig ist. In einem Chemilumineszenztestsystem ist jedoch keine einfallende Strahlung erforderlich. Chemilumineszenz wird im allgemeinen als das Energieprodukt aus der Umsetzung zweier oder mehrerer chemischer Reaktanten definiert, wobei ein elektronisch angeregtes, energiereiches Reaktionsprodukt erhalten wird, das in einen tieferliegenden Energiezustand (z.B. den Grundzustand) unter Lichtemission relaxiert. Verfahren zur Bestimmung von Analyten in Lösung mittels Chemilumineszenzverfahren sind nunmehr auf dem Fachgebiet gut eingeführt. Beispiele für Patente, die verschiedene Chemilumineszenztestsysteme beschreiben, werden nachstehend angegeben.
US-Patent Nr. 3 689 391 von Ulman offenbart die Verwendung chemischer oder elektrochemischer Reaktionen, wobei Moleküle in ihren angeregten, energiereichen Zuständen erhalten werden, sowie die Energieübertragung von diesen Molekülen (Energiedonoren) auf die Reaktanten (Energierezeptoren), die dann die photochemische Umwandlung durchmachen, was zur Lichtemission führt.
US-Patent Nr. 4 104 029 von Maier, Jr. offenbart ein Verfahren zum Test biochemisch wirksamer Verbindungen in biologischen Flüssigkeiten, wobei in einem wäßrigen Reaktionsgemisch ein Medium, von dem angenommen wird, daß es die zu bestimmende Verbindung enthält, ein chemilumineszent-markierter Ligand sowie ein löslicher Rezeptor, der über Stellen verfügt, an welche der Ligand und der chemilumineszent-markierte Ligand binden können, zusammengebracht werden. Der Ligand und der chemilumineszent-markierte Ligand konkurrieren dann um eine Bindungswechselwirkung mit dem Ligandrezeptor (Antikörper). Nach der Einstellung des Gleichgewichts wird der Rezeptor (Antikörper) aus dem Medium isoliert und die Chemilumineszenz gemessen, wobei die Menge des chemilumineszent-markierten Liganden, der an den Antikörper gebunden ist, mit der Menge des unmarkierten Liganden, der in der Lösung untersucht wird, verknüpft ist.
US-Patent Nr. 4 160 645 von Ullman beschreibt ein durch einen Katalysator vermitteltes Sättigungstestverfahren für Proteine, unter Verwendung eines Chemilumineszenzmarkers, der an ein Ligandanalogon gebunden ist, eines ersten Redox-Reaktanten, der durch Ein-Elektronentransfer reagiert, sowie eines zweiten Redox-Reaktanten, der durch Zwei-Elektronentransfer reagiert, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit der Umsetzung zwischen dem ersten und dem zweiten Redox-Reaktanten mit dem Chemilumineszenzmarker verglichen wird mit der entsprechenden Geschwindigkeit in einer Testlösung, die eine bekannte Menge des Analyten enthält.
US-Patent Nr. 4 161 516 von Ullman offenbart ein Doppel-Rezeptor-Fluoreszenzimmunoassay, unter Verwendung eines Ligandanalogons, das mit einer Fluoreszenzverbindung verbunden ist, eines Antikörpers für den Liganden sowie eines Antikörpers für die Fluoreszenzverbindung, wobei die Menge der Fluoreszenzverbindung, die an die Antifluoreszenzverbindung gebunden ist, mit der Menge des Liganden, der in einer unbekannten Probe vorhanden ist, sowie mit dem Unterschied im Emissionsspektrum zwischen der ungebundenen Fluoreszenzverbindung und der an den Antikörper gebundenen Fluoreszenzverbindung verknüpft ist.
US-Patente Nrn. 4 220 450 und 4 277 437 von Maggio offenbaren ein Chemilumineszenz-Sättigungstestverfahren für Proteine, wobei ein Chemilumineszenzmarker an den einen Vertreter eines immunologischen Paars gebunden wird, ein Quenchermolekül an den anderen Vertreter des immunologischen Paars gebunden wird, und die Menge des Analyten, der im Testmedium vorhanden ist, bestimmt wird, indem man das aus dem Medium emittierte Licht untersucht.
US-Patent Nr.4 231 754 von Vogelhut offenbart eine mehrschichtige Chemilumineszenztestvorrichtung, einschließlich eines festen Trägers, einer ersten Schicht mit einem ersten Reaktionssystem, das auf das Vorhandensein eines Analyten reagiert, wodurch ein Reaktionsprodukt erzeugt wird, und einer zweiten Schicht mit einem zweiten Reaktionssystem, das auf das Vorhandensein des Reaktionsprodukts reagiert, wodurch die Lumineszenz hervorgerufen wird. Das zweite Reaktionssystem kann ein cyclisches Hydrazid, wie Luminol, ein Eisen(III)ion, Hämoglobin, Hämatin oder ein Mikroperoxidaseproduktkatalysator sowie einen Puffer zum Beibehalten eines pH-Werts im Chemilumineszenzreaktionsmedium von 8,5 bis 12,5 enthalten.
US-Patent Nr. 4 238 195 von Boguslaski et al. offenbart ein spezifisches Bindungstestverfahren zur Bestimmung eines Liganden, wie eines Antigens oder eines Antikörpers, durch chemische Anregung eines Fluoreszenzmarkers und Messen des vom Marker emittierten Lichts. Der Fluoreszenzmarker wird durch Einwirkung eines energiereichen Zwischenprodukts, wie Wasserstoffperoxid und entweder ein Oxylchlorid, ein Oxamid oder einen Bisoxylatester, chemisch angeregt.
US-Patent Nr. 4 269 938 von Frank offenbart ein Peroxidasetestverfahren, das durchgeführt wird, indem eine Probe mit Diacetyldichlorfluorescin und einer Quelle für Wasserstoffperoxid in Kontakt gebracht wird, wobei ein Fluoreszenzprodukt erzeugt wird. Wenn alle anderen Reaktanten außer Peroxidase im Überschuß vorhanden sind, ist die Geschwindigkeit der Fluoreszenzzunahme mit der Menge an in der untersuchten Probe vorhandener Peroxidase verknüpft.
US-Patent Nr. 4 302 534 von Halmann et al. offenbart ein heterogenes Immunoassay, in dem Chemilumineszenz durch eine enzymatisch katalysierte Redox-Reaktion zwischen Wasserstoffperoxid und einer phenolische Verbindung, wie Pyrogallol, Resorcinol, Phloroglucinol oder Hydrochinon, hervorgerufen wird. Im Testverfahren wird Meerrettichperoxidase, Lactoperoxidase, Rübenperoxidase oder Kartoffelperoxidase an einen Antikörper oder em Antigen gebunden, das Konjugat mit einer Probe umgesetzt, das überschüssige Konjugat entfernt, das Lumineszenzsubstrat zugegeben und dann das aus dem System emittierte Licht gemessen.
US-Patent Nr. 4 372 745 von Mandell offenbart ein System zur Bestimmung eines biologischen Analyten, einschließlich eines in eine Mikrokapsel eingeschlossenen Fluoreszenz materials, das an einen für den Analyten spezifischen, immunologischen Bindungspartner gebunden ist, Mittel zum Aufbrechen der Kapsel sowie eine andere Energiequelle als elektromagnetische Strahlung, die imstande ist, eine Fluoreszenzverbindung zu aktivieren.
Über Chemilumineszenztestsysteme, insbesondere diejenigen, welche durch Meerrettichperoxidase katalysiert werden, wurde viel berichtet, und diese sind dafür bekannt, daß sie eine Zahl wesentlicher Vorteile gegenüber anderen herkömmlichen Signalmarkern, die auf dem Fachgebiet gebräuchlich sind, aufweisen, einschließlich einer verhältnismäßig hohen Empfindlichkeit, geringer Kosten, eines ausgedehnten linearen Bereichs, einer verhältnismäßig einfachen Ausrüstung zum Messen des Signals sowie das Fehlen der Verwendung radioaktiver Isotope, wodurch die Notwendigkeit einer Sicherheitsausrüstung und spezieller Handhabungsverfahren, beseitigt werden. Trotz dieser Vorteile war die Verwendung von Chemilumineszenztestsystemen nicht ohne Schwierigkeiten. Beispielsweise sind die durch Peroxidase katalysierten Oxidationen von Luminol gegenüber Veränderungen des pH-Werts hochempfindlich. Gewöhnliche chemilumineszente Oxidationen von Luminol durch Meerettichperoxidase (HRP) werden typischerweise in einem pH-Bereich von 8 bis 12 durchgeführt, wobei die wirksamste Chemilumineszenz bei einem pH-Wert von etwa 10,4 bis 11,5 erzeugt wird. Die HRP-katalysierte Dioxidation von Luminol, wodurch die Chemilumineszenz hervorgerufen wird, ist ein hochgradig komplexer Vorgang, der die Umsetzung von HRP mit Wasserstoffperoxid einschließt, wobei ein erster Komplex (Komplex I) erzeugt wird, der seinerseits mit Luminol reagiert, wodurch ein zweiter Komplex (Komplex II) und ein oxidiertes Luminolradikal erzeugt wird. Komplex II reagiert dann mit einem zweiten Luminolmolekül, wobei ein zweites oxidiertes Luminolradikal und HRP in seinen ursprünglichen Zustand entsteht. Insgesamt werden zwei Luminolmoleküle (2 LH&sub2;) von Hydrazid dehydriert, wobei sich gemäß der folgenden Reaktion zwei Luminolradikale (2 LH ) ergeben: Hydrazid
Man nimmt an, daß die Radikale dann mit weiterem Wasserstoffperoxid reagieren, wobei unter Freisetzung von Stickstoff und unter Emission eines Lichtphotons (hν) Aminophthalat folgendermaßen erzeugt wird: Aminophthalat
Die Lumineszenzreaktion ist am besten zu erreichen, wenn H&sub2;O&sub2; in Form seiner konjugierten Base HO&sub2;&supmin; vorhanden ist. Wie folgt, schreibt der verhältnismäßig hohe pKa-Wert von H&sub2;O&sub2; (11,6; Lange's Handbook of Chemistry, 13. Aufl. 1985) jedoch einen verhältnismäßig hohen pH-Wert vor, damit HO&sub2;&supmin; in bedeutenden Mengen vorhanden ist. Verhältnis von [HO&sub2;&supmin;] zu [H&sub2;O&sub2;] bei verändertem pH-Wert
Beispielsweise bei einem pH-Wert von 5,65 ist die wirksame Konzentration von HO&sub2;&supmin; in einer 1 millimolaren Lösung von H&sub2;O&sub2; 1 nanomolar. Um eine wirksame Oxidation des Luminols zu erreichen, ist es daher gängige Praxis die HRP-katalysierte Oxidation bei alkalischen pH- Werten durchzuführen, insbesondere bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 12, und stärker bevorzugt bei einem pH-Wert von 9 bis 11. Bei hohen pH-Werten unterliegt Luminol jedoch selbst in Abwesenheit eines katalytischen Enzyms einer basen-katalysierten Oxidation, was zu einem Verbrauch an Peroxid, hoher Untergrundchemilumineszenz und häufig zu nicht annehmbar niedrigen Signal-Rausch-Verhältnissen führt.
Diese Anforderungen an den pH-Wert stellen ernste Begrenzungen für die weitverbreitete Verwendung der peroxidase-katalysierten Luminol-Lumineszenz für die klinische Anwendung und die Anwendung in der Forschung dar. Zum Beispiel ist die Peroxidase- katalyse am wirksamsten in einem pH-Bereich von 7 bis 9; oberhalb eines pH-Werts von 9 weist die Peroxidase eine wesentlich geringere Wirksamkeit auf. Die enzymatischen Oxidasereaktionen zeigen jedoch typischerweise ein pH-Optimum im Bereich von etwa 5 bis etwa 7. Wenn enzymätische Oxidasereaktionen verwendet werden, um Wasserstoffperoxid für die Messung eines peroxidase-katalysierten Indikatorsystems zu erzeugen, können die enzymatischen Primärvorgänge, wobei Wasserstoffperoxid erzeugt wird, nicht gleichzeitig mit der Lumineszenzreaktion erfolgen (wo ein wesentlich höherer pH-Wert das Optimum darstellt) ohne schwerwiegende Kompromisse hinsichtlich der Lumineszenzintensität und den Geschwindigkeiten der enzym-katalysierten Reaktionen. Zusätzlich zur Erhöhung der Untergrundchemilumineszenz, können die verhältnismäßig hohen pH-Werte, die für die peroxidase- katalysierte Lumineszenzreaktion erforderlich sind, die Geschwindigkeit der Umsetzung zwischen Wasserstoffperoxid und reduzierenden Bestandteilen in der biologischen Probe erhöhen, wodurch Wasserstoffperoxid verbraucht wird bevor es mit Luminol reagieren kann die beobachtete Lumineszenz des Systems verringert und die genaue Messung des zu bestimmenden Analyten künstlich beeinträchtigt wird. Siehe W.R. Seitz "Chemiluminescence Detection of Enzymatically Generated Peroxide" in Meth. Enzymol. 57 (1978), 445 - 462.
US-Patent Nr. 4 598 044 von Kricka et al. offenbart eine verbesserte Lumineszenzreaktion zwischen einem Peroxidaseenzym, einem Oxidationsmittel und einem 2,3-Dihydro- 1,4-phthalazindion, in der für die gesamte Lichtemission aus der Lumineszenzreaktion angegeben wird, daß sich diese erhöht (oder das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert wird), wenn bestimmte phenolische Verbindungen dem Lumineszenzreaktionsgemisch zugegeben werden. Das verbesserte Testverfahren wird jedoch immer noch vorzugsweise bei einem alkalischen pH-Wert durchgeführt. Die Verwendung der phenolischen Verbindungen zur Verbesserung oder Beschleunigung der peroxidase-katalysierten Oxidation anderer Lumiphore wird auch in US-Patent Nr. 4 521 511 offenbart. Wenngleich die Verwendung der Verbesserungsmittel gezeigt hat, daß die Bestimmung der Lumineszenz verbessert wird, verhindern die Empfindlichkeiten der Testverfahren sowie die schlechten Signal-Rausch-Verhältnisse weiterhin die weitverbreitete Verwendung dieser Lumineszenzsysteme in der klinischen Umgebung.
Für das "verbesserte" Lumineszenztestverfahren, in dem phenolische Verbesserungsmittel zur Erhöhung der Lichtemission eingesetzt werden, wurde ein weiteres Problem hinsichtlich der Lagerunsstabilität der im Testverfahren verwendeten Reagenzien beschrieben, wenn die Reagenzien bei dem für die Durchführung der Chemilumineszenzreaktion erforderlichen hohen pH-Wert gehalten werden. Um dieses Problem zu überwinden, beschreibt die Europäische Patentveröffentlichung Nr. 235 970 das Beibehalten des pH-Werts der Reagenzien in einem Bereich von etwa 3 bis etwa 6 vor der Verwendung. Um eine wirksame Lichtemission zu erreichen, muß in dem in dieser Europäischen Anmeldung offenbarten Testverfahren jedoch während der Chemilumineszenzreaktion ein alkalischer Puffer verwendet werden, um den pH-Wert des Reaktionsgemischs auf einen Wert im Bereich von 7 bis 9 zu erhöhen.
Aus dem vorhergehenden ist klar, daß die Abhängigkeit der lichtemittierenden Reaktion vom pH-Wert die Nutzbarkeit der peroxidase-katalysierten Chemilumineszenzverfahren als Testverfahren in der Vergangenheit wesentlich begrenzt hat. Es besteht ein starker Bedarf an verbesserten Chemilumineszenzindikatorsystemen, welche diese Schwierigkeiten und die mit den Chemilumineszenztestsystemen nach dem Stand der Technik verbundenen Begrenzungen überwinden werden.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Lumineszenztestsystemen sind chemische Reaktionen, in denen Chemilumineszenz hervorgerufen wird, bekannt, die bei verschiedenen biologischen Systemen natürlich auftreten. Beispielsweise ist Myeloperoxidase (MPO) eine Oxidoreduktase, die bis zu 5 Gew.-% der polymorphkernigen (PMN) Leukozyten von Säugern ausmacht. Die Wirksamkeit von MPO zur Entgiftung von Diphterietoxin in Gegenwart von Wasserstoffperoxid wurde zuerst von Agner (Nature 159 (1947), 271) beschrieben, ebenso wie seine Abhängigkeit von einem Halogenid-Cofaktor (Agner, J. Exp. Med. 92 (1950), 334; Agner, Rec. trav. chim. 74 (1955), 373; Agner, Abstr. Communs. 4th Congr. Biochem. Vienna (1958), 64). Die antibakterielle Wirkung von MPO, einem Halogenid und Wasserstoffperoxid auf Escherichia coli oder Lactobacillus acidophilus wurde von Klebanoff in "Myeloperoxidase-Halide-Hydrogen Peroxide Antibacterial System" J. Bacteriol. 95 (1968), 2131 - 2138 beschrieben. Die antibakterielle Wirkung von MPO im MPO-Halogenid- Wasserstoffperoxid-System ist von einer natürlichen (d.h. es wird kein chemilumineszenzerzeugendes Substrat zugegeben) Chemilumineszenz begleitet (Allen "Studies on the Generation of Electronic Excited States in Human Polymorphonuclear Leukocytes and Their Participation in Microbiocidal Activity", Dissertation, Tulan University, 13. Juli 1973), wobei diese vom pH-Wert (Allen "The Role of pH in the Chemiluminescent Response of Myeloperoxidase-Halide-HOOH Antimicrobial System" Biochem and Biophys. Res. Comm. 63(3) (1975), 684 - 691) sowie vom Halogenid (Allen "Halide Dependance of the Myeloperoxidase-Mediated Antimicrobial System of the Polymorphonuclear Leukocyte in the Phenomenon of Electronic Excitation" Biochem. and Biophys. Res. Comm. 63(3) (1975), 675 - 683) abhängig ist.
Die Oxidoreduktase Eosinophilperoxidase (EPO) ist in hoher Konzentration in Eosinophilen vorhanden, und es wurde gezeigt, daß diese eine antiparasitische Wirkungsweise ähnlich der von MPO aufweist (Caulfield et al., J. Cell. Biol. 86 (1980), 64 - 76). EPO katalysiert die Oxidation von Chloridionen zu Hypochloriger Säure in Gegenwart von Wasserstoffperoxid bei einem sauren pH-Wert (Ben et al. "Some Properties of Human Eosinophil Peroxidase, A Comparision With Other Peroxidases" Biochem. et Biophys. Acta 784 (1984) 177 - 186). Andere Chlorperoxidasen sind bekannt und wurden in der Literatur charakterisiert, wie diejenige, welche aus Schimmelpilz Caldariomyces fumago isoliert wurde, wie von P.D. Shaw und L.P. Hager (JACS 81 (1001)(1959), 6527; JBC 234 (1959), 2560; 234 (1960), 2565 und 236 (1961), 1626) beschrieben.
Wenngleich das natürliche in vivo MPO/EPO-Halogenid-HOOH-antibakterielle System (ohne Zugabe eines chemilumineszenzerzeugenden Substrats) untersucht und in der Literatur beschrieben wurde, ist die Verwendung eines Haloperoxidase-Halogenid-Oxidationsmittel- Lumineszenzsubstrat-Indikatorsystems zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge emes Analyten in einer Probe auf dem Fachgebiet nicht berichtet oder vorgeschlagen worden.
Es wurde nunmehr gefunden, daß ein hochempfindliches Chemilumineszenzindikatorsystem eingesetzt werden kann, um das Vorhandensein oder die Menge eines Analyten in emer flüssigen Probe zu bestimmen ohne viele der Nachteile, die herkömmlichen Chemilumineszenzindikatorsystemen eigen sind. Das neue Säureoptimum-Chemilumineszenzindikatorsystem umfaßt Haloperoxidase (Halogenid:Wasserstoffperoxid-oxidoreduktase), Halogenid, Oxidationsmittel sowie ein chemilumineszenzerzeugendes Substrat. Das Indikatorsystem wirkt als Synthesemittel für hochreaktiven, molekularen Singulett-Sauerstoff (¹O&sub2;), der mit dem chemilumineszenzerzeugenden Substrat reagiert, wobei sich ein oxidiertes Reaktionsprodukt in angeregtem Zustand ergibt. Das Reaktionsprodukt im angeregten Zustand relaxiert dann in einen tieferliegenden Energiezustand (z.B. den Grundzustand) unter Emission von meßbarem Licht. Zur Verwendung im erfindungsgemäßen Indikatorsystem geeignete Haloperoxidasen schließen Myeloperoxidase (MPO), Eosinophilperoxidase (EPO), Lactoperoxidase (LPO) und Chlorperoxidase (CPO) ein. Geeignete Halogenide schließen Bromid, Chlorid oder Iodid ein, wobei Bromid oder Chlorid bevorzugt werden, wenn die Haloperoxidase MPO oder CPO ist, und Bromid, wenn die Haloperoxidase EPO oder LPO ist. Das Oxidationsmittel ist vorzugsweise ein Peroxid, am stärksten bevorzugt Wasserstoffperoxid. Nützliche chemilumineszenzerzeugende Substrate schließen Substrate ein, die durch molekularen Singulett-Sauerstoff, durch Hypohalogenit oder durch Hypohalogenit und Peroxid katalytisch oxidiert (d.h. dioxidiert) werden, wodurch ein oxidiertes Reaktionsprodukt im angeregten Zustand erhalten wird, das unter Emission von meßbarem Licht in einen tieferliegenden Energiezustand relaxiert. Bevorzugte chemilumineszenzerzeugende Substrate schließen Endoperoxidvorstufen, z.B. cyclische Hydrazide, sowie Dioxetanvorstufen ein.
Die Menge des durch das Indikatorsystem emittierten Lichts ist mit der Menge eines jeden in der Reaktionslösungs vorhandenen Reaktionsteilnehmers verknüpft. Demgemäß werden bekannte, nicht-geschwindigkeitsbegrenzende Mengen der drei Reaktionsteilnehmer in der Testverfahrenslösung bereitgestellt, um das Vorhandensein oder die Menge des vierten Teilnehmers in einer Testprobe zu bestimmen. Der vierte Teilnehmer in der Testprobe kann der zu bestimmende Analyt sein, oder kann in der Testprobe durch einen oder mehrere vorgelagerte Umsetzungen, an denen der letztlich zu bestimmende Analyt beteiligt ist, erzeugt oder verbraucht werden, wobei die Menge des vierten Teilnehmers mit der Menge des Analyten in der Testlösung verknüpft ist. Demgemäß kann das erfindungsgemäße Indikatorsystem zur Bestimmung einer großen Vielzahl von Analyten eingesetzt werden.
Zusätzlich zur hohen Empfindlichkeit funktioniert das erfindungsgemäße Indikatursystem am wirksamsten in einem Bereich von sauren bis zu leicht basischen pH-Werten, und dadurch werden die vorstehend beschriebenen Probleme nach dem Stand der Technik bei basischen Chemilumineszenzreaktionsbedingungen vermieden. Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Indikatorreaktion in einem pH-Bereich von etwa 3 bis etwa 8, stärker bevorzugt in einem pH-Bereich von etwa 4,0 bis etwa 7,0 durchgeführt.
Ebenfalls beschrieben wird eine Vielzahl von illustrativen Testverfahrensformen, in denen die erfindungsgemäße Indikatorreaktion eingesetzt werden kann, ebenso wie Kits zur Verwendung bei der Durchführung der Testverfahren mittels des erfindungsgemäßen Haloperoxidase/Halogenid/Oxidationsmittel/Substrat-Indikatorsystems.
Figur 1 ist eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Indikatorsystems, wobei Wasserstoffperoxid als ein stellvertretendes Oxidationsmittel eingesetzt wird.
Figur 2 ist ein Diagramm, das die Wirkung der Wasserstoffperoxidkonzentration auf den Spitzenwert der Chemilumineszenzgeschwindigkeit in einem erfindungsgemäßen Indikatorsystem zeigt.
Figur 3A und 3B sind doppelt-reziproke Diagramme, in denen die Wirkung der Wasserstoffperoxidkonzentration auf die Chemilumineszenzgeschwindigkeit (vCL, die Geschwindigkeit der Lichtemission) in einem erfindungsgemäßen Indikatorsystem gezeigt werden. Figur 3A zeigt an, daß in einem gewöhnlichen doppelt-reziproken Diagramm von vCL gegen die Wasserstoffperoxidkonzentration keine gerade Linie erhalten wird, wie dies zu erwarten sein sollte, wenn die Beziehung erster Ordnung wäre. Figur 3B zeigt an, daß eine nahezu lineare Beziehung erhalten wird, wenn die reziproke Wasserstoffperoxidkonzentration gegen die reziproke Quadratwurzel von vCL aufgetragen wird, d.h. die Umsetzung ist hinsichtlich der Wasserstoffperoxidkonzentration zweiter Ordnung. Zum Vergleich zeigt Figur 3C (Stand der Technik) eine Beziehung erster Ordnung hinsichtlich der Wasserstoffperoxidkonzentration in emem herkömmlichen meerrettichperoxidase(HRP)-katalysierten System.
Figur 4 ist ein doppelt-reziprokes Diagramm, das die Wirkung der Chloridkonzentration auf die Geschwindigkeit der myeloperoxidase-katalysierten Lichtemission im erfindungsgemäßen Indikatorsystem zeigt.
Figur 5 ist ein doppelt-reziprokes Diagramm; das die Wirkung der Bromidkonzentration auf die Geschwindigkeit der Lichtemission im durch Myeloperoxidase ("M") oder Eosinophilperoxidase ("E") katalysierten, erfindungsgemäßen Indikatorsystem zeigt.
Die vorliegende Erfindung ist im wesentlichen auf die Verwendung eines haloperoxidase-abhängigen Indikatorsystems ausgerichtet, wobei eine meßbare Chemilumineszenz erzeugt wird, die das Vorhandensein oder die Menge eines Analyten in einer Probe anzeigt. Die primären Reaktanten im erfindungsgemäßen Indikatorsystem umfassen ein Oxidationsmittel, emen Halogenid-Cofaktor sowie ein chemilumineszenzerzeugendes Substrat. Eine Haloperoxidase, vorzugsweise Myeloperoxidase (MPO) oder Eosinophilperoxidase (EPO), katalysiert die Erzeugung der Chemilumineszenz im sauren bis mäßig basischen pH-Bereich, wodurch ein hochempfindliches Analytenmesssystem mit hohem Signal-Rauschen-Verhältnis bereitgestellt wird.
Haloperoxidasen, wie in der praktischen Durchführung der Erfindung eingesetzt, dienen als ein Halogenid (X&supmin;):Wasserstoffperoxidoxidoreduktase. Die katalysierte Reaktion kann als zwei Redox-Halbreaktionen aufgefaßt werden. Halogenid wird zum entsprechenden Hypohalogenit (OX&supmin;) und 2 reduzierenden Äquivalenten (H&spplus; + e&supmin;) oxidiert: Haloperoxidase
Ein Oxidationsmittel, wie Wasserstoffperoxid, wird durch die beiden reduzierenden Äquivalente reduziert, wodurch sich Wasser ergibt:
H&sub2;O&sub2; + 2 H&spplus; + 2e&supmin; T 2H&sub2;O (2)
Die Netto-Reaktion, d.h. die Summe aus den Umsetzungen (1) und (2), ist die haloperoxidase-katalysierte Erzeugung von Hypohalogenit aus Wasserstoffperoxid und Halogenid: Haloperoxidase
Das im Indikatorsystem erzeugte Hypohalogenit kann nach einem der beiden in Figur 1 aufgezeigten Reaktionswege weiterreagieren. Im ersten Reaktionsweg, in Figur 1 als molekularer Singulett-Sauerstoff-Weg bezeichnet, reagiert das Hypohalogenit mit einem zusätzlichen Wasserstoffperoxidmolekül, wobei das Halogenid und der molekulare Singulett-Sauerstoff (¹O&sub2;), einer hochreaktiven Molekülart von Sauerstoff der in Spin-erlaubten Oxidationsreaktionen als Elektrophil teilnehmen kann, erhalten wird, dies ist in Übereinstimmung mit den Reaktionsmechanismen zur Erzeugung von Singulett-Sauerstoff, wie von Kasha et al. in "The Physics, Chemistry and Biology of Singlet Molecular Oxygen" Annals of the New York Academy of Sciences 171 (1970), 7 - 23 offenbart, dessen Offenbarung durch die Bezugnahme hierin eingeschlossen ist. Die Erzeugung von molekularem Singnlett-Sauerstoff aus Hypohalogenit kann wie folgt wiedergegeben werden:
H&sub2;O&sub2; OX&supmin; T X&supmin; + H&sub2;O + ¹O&sub2; (4)
Die Netto-Reaktion aus den Reaktionen (3) und (4) ist die Reaktion zweier Moleküle Wasserstoffperoxid in Gegenwart einer Haloperoxidase sowie eines Halogenid-Cofaktors, wobei ein Molekül des molekularen Singulett-Sauerstoffs erhalten wird: Haloperoxidase/X&supmin; (netto aus 3 und 4)
Der im System erzeugte, molekulare Singulett-Sauerstoff wird dann mit einem geeigneten chemilumineszenzerzeugenden Substrat (CLS), wie einem cyclischen Hydrazid, umgesetzt, wodurch ein Endoperoxid-Zwischenprodukt erhalten wird, oder mit einem beliebigen einer Zahl bekannter, organischer Moleküle, die mit dem molekularen Singulett-Sauerstoff reagieren, umgesetzt, wobei ein Dioxetan- oder ein Dioxetanon-Zwischenprodukt erhalten wird. Diese energiereichen, dioxidierten Zwischenprodukte unterliegen einer Spaltung, wodurch eine elektronisch angeregte Carbonyleinheit erhalten wird, die
1) unter Lichtemission in einen tieferliegenden Energiezustand relaxiert, oder
2) seine Energie auf ein anderes Molekül überträgt, das dann seinerseits unter Lichtemission in einen tieferliegenden Energiezustand relaxiert.
Auf dem alternativen Weg, der in Figur 1 als Halogenierungs-Peroxidierungs-Weg bezeichnet ist, reagiert das in der vorstehenden Reaktion (3) erzeugte Hypohalogenit direkt mit dem chemilumineszenzerzeugenden Substrat, wodurch ein halogeniertes chemilumineszenzerzeugendes Substrat (CLS-X) erhalten wird, das sich dann mit Wasserstoffperoxid umsetzt, wobei sich das energiereiche, dioxidierte Zwischenprodukt, wie vorstehend beschrieben, ergibt. Für beide Wege kann die Oxidation des Substrats sowie die Erzeugung von Licht wiedergegeben werden als: Haloperoxidase, H&spplus;, X&supmin;
wobei CLS das chemilumineszenzerzeugende Substrat ist, CLS-O&sub2; das dioxidierte Zwischenprodukt darstellt (z.B. Peroxid, Endoperoxid, Dioxetan oder Dioxetanon), P* das energiereiche Reaktionsprodukt ist, P das Reaktionsprodukt im tieferliegenden Energiezustand darstellt, und hν ein Photon (oder ein emittiertes Lichtquant) bedeutet. Die Netto-Reaktion über alle Stufen des erfindungsgemäßen Indikatorsystems, die sich aus den Reaktionen (5) bis (7) ergibt, kann wiedergegeben werden als: Haloperoxidase/Halogenid netto aus 5 bis 7
Die Menge des aus dem Indikatorsystem emittierten Lichts hν ist mit der Menge eines jeden im Reaktionsgemisch vorhandenen, primären Reaktionsteilnehmer - Oxidationsmittel; Haloperoxidase, Halogenid und chemilumineszenzerzeugendes Substrat - verknüpft. Indem man für bekannte, nicht-begrenzende Mengen für beliebige drei der primären Teilnehmer unter geeigneten Reaktionsbedingungen sorgt, kann demgemäß das Vorhandensein oder die Menge des vierten primären Teilnehmers einfach durch Messen des emittieren Lichts (Energieprodukt) aus dem System und Vergleichen des gemessenen Werts mit dem eines Standards, der bekannte Mengen des begrenzenden Reaktanten enthält, bestimmt werden. Zusätzlich zu einem der vier primären Teilnehmer können andere Analyten durch das erfindungsgemäße Indikatorsystem gemessen werden, indem eine oder mehrere vorgelagerte Umsetzungen durchgeführt werden, die zur Erzeugung oder zum Verbrauch eines der vier primären Teilnehmer führen, wie nachstehend ausführlicher beschrieben. Der vorstehende Reaktionsmechanismus ist in Figur 1 schematisch aufgezeichnet, wobei Wasserstoffperoxid als das gegenwärtig bevorzugte Oxidationsmittel angeben ist, und X&supmin;, OX&supmin;, CLS, P* und P die vorstehend definierten Bedeutungen besitzen.
In der vorliegenden Erfindung nützliche Haloperoxidasen werden als Halogenide: Wasserstoffperoxidoxidoreduktasen definiert (z.B. EC Nr. 1.11.1.7 und EC Nr. 1.11.1.10, nach der International Union of Biochemistry), für die das Halogenid Elektronendonor oder Reduktionsmittel ist, und Peroxid Elektronenrezeptor oder Oxidationsmittel darstellt. Eine beliebige Haloperoxidase, welche die halogenid-abhängige Lumineszenzreaktion eines geeigneten chemilumineszenzerzeugenden Substrats katalysiert, beispielsweise ein 2,3-Dihydro-1,4- phthalazindion, wie Luminol, kann bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Geeignete Haloperoxidasen, wie nachstehend gezeigt, schließen Myeloperoxidase (MPO), Eosinophilperoxidase (EPO), Lactoperoxidase (LPO) und Chlorperoxidase (CPO) ein, wobei die gegenwärtig bevorzugten Haloperoxidasen Myeloperoxidase und Eosinophilperoxidase sind. Es wurde festgestellt, daß MPO und CPO ähnliches halogenid- abhängiges Verhalten zeigen, und daß EPO und LPO ähnliches halogenid-abhängiges Verhalten zeigen, wie nachstehend weiter beschrieben.
Die Form, die das Peroxidaseenzym in der erfindungsgemäßen Lumineszenzreaktion annimmt, wird vom Typ des betrachteten Testverfahrens abhängen. Wenn die Haloperoxidase als Marker verwendet wird, kuppelt die Peroxidase typischerweise an einen Liganden, wie beispielsweise ein Protein, Hormon, Lectin, Hapten, Steroid, eine Nükleinsäure, ein Stoffwechselprodukt, Antigen, einen Antikörper, eine Nucleinsäuresonde, Bakteriophage oder einen Virus. Im allgemeinen wird die Haloperoxidase durch einen verbindenden Rest oder emen verbrückenden Seitenarm an den Liganden gebunden. Geeignete verbindende Reste oder verbrückende Seitenarme sowie Kupplungsverfahren sind für einen Fachmann naheliegend und schließen diejenigen, welche hierin im Hinblick auf das Kuppeln des Chemilumineszenzsubstrats an einen Liganden beschrieben sind, ein. In anderen Testverfahrensformen kann das Haloperoxidaseenzym frei in der Lösung oder mittels herkömmlicher Verfahren immobilisiert an einer festen Phase oder Matrix vorliegen.
Da die Indikatorreaktion die Umsetzung des Peroxids und des Halogenids, wobei Hypohalogenit erzeugt wird, sowie die Umsetzung des Peroxids und des Hypohalogenits, wobei, wie vorstehend beschrieben, molekularer Singulett-Sauerstoff(¹O&sub2;) entsteht, umfaßt, kann das bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung eingesetzte chemilumineszenzerzeugende Substrat (CLS) ein beliebiges Substrat sein, das durch molekularen Singulett-Sauerstoff(¹O&sub2;), durch Hypohalogenit oder durch Hypohalogenit und Peroxid katalytisch oxidiert wird, wodurch ein oxidiertes Produkt im angeregten Zustand erzeugt wird, das dann unter Emission von meßbarem Licht in einen tieferliegenden Energiezustand relaxiert.
In einer gegenwärtig bevorzugten, der Illustration dienenden Ausführungsform kann das chemilumineszenzerzeugende Substrat ein cyclisches Hydrazid sein, das unter den hierin beschriebenen Reaktionsbedingungen Peroxid- oder Endoperoxid-Zwischenprodukte ergibt. Geeignete cyclische Hydrazide schließen Verbindungen der Formel:
wobei R&sub1; ein Amino-, Amido-, substituiererter Amino- oder substituierter Amidorest ist, und R&sub2;, R&sub3; sowie R&sub4; jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus H, gegebenenfalls substituierten C&sub1;-C&sub6;-Alkyl-, Alkenyl, Hydroxyl-, C&sub1;-C&sub6;-Alkoxyl-, Carboxyl-, Amino-, Amido-, substituierten Amino- oder substituierten Amidoresten gewählt werden, oder R&sub1; und R&sub2; zusammengenommen ein Amino-, Amido-, substituiertes Amino- oder substituiertes Amidoderivat eines Benzorests darstellen, ein. Gegenwärtig besonders bevorzugte Substrate dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform sind 5-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion (Luminol), 6-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion (Isoluminol) und 7-Dimethylamino-naphthylen-1,2-dicarbonsäurehydrazid.
Im allgemeinen unterliegen die cyclischen Hydrazide in Gegenwart von molekularem Singulett-Sauerstoff(¹O&sub2;) einer elektrophilen Dioxidierung, wobei ein instabiles Peroxid- oder Endoperoxidzwischenprodukt erzeugt wird, das Zwischenprodukt lagert sich schnell in das entsprechende, elektronisch angeregte Phthalat um, und das Phthalat im angeregten Zustand relaxiert unter Lichtemission gemäß dem folgenden Reaktionsschema:
wobei R&sub1; bis R&sub4; wie vorstehend angegeben definiert sind.
In einer weiteren gegenwärtig bevorzugten, der Illustration dienenden, erfindungsgemäßen Ausführungsform kann das chemilumineszenzerzeugende Substrat eine beliebige Dioxetanvorstufe sein, die mit molekularem Singulett-Sauerstoff reagiert, wobei die entsprechende instabile oder stabile 1,2-Dioxetanverbindung entsteht. Die Entstehung von instabilen 1,2-Dioxetanen ist vom schnellen Abbau des Dioxetans begleitet, wobei sich ein elektronisch angeregtes Carbonylprodukt ergibt, das unter Lichtemission relaxiert. Stabile 1,2-Dioxetane können hergestellt und für das spätere "Triggern" des Verbindungsabbaus sowie die Chemilumineszenzmessung gelagert werden, wie nachstehend weiter beschrieben. Zur Verwendung als chemilumineszenzerzeugende Substrate geeignete 1,2-Dioxetanvorstufen schließen bei der praktischen Durchführung der Erfindung Alkene, denen reaktive allylische Wasserstoffatome fehlen, und Enamine ein, wie von Kopecky in "Synthesis of 1,2-Dioxetanes" Chemical and Biological Generation of Excited States, Acacdemic Press (1982), 85 - 144 beschrieben, die sich dann mit molekülarem Singulett-Sauerstoff umsetzen, wobei das entsprechende 1,2-Dioxetan folgendermaßen erzeugt wird:
Stellvertretende Beispiele solcher Dioxetanvorstufen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Wieringa et al., Tetrahedron Lett. (1972), 169 - 172; Bartlett et al., J. Am. Chem. Soc. 96 (1974), 627 - 629; Schaap, Tetrahedron Lett. (1971), 1757 - 1760; Schaap et al., J. Am. Chem. Soc. 99 (1977), 1270ff Zaklika et al., J. Am. Chem. Soc. 100 (1978) 318 - 320 und 4916 - 4918; sowie Zaklika et al., Photochem. Photobiol. 30 (1979), 35 - 44. Das chemilumineszenzerzeugende Substrat kann eine Alkylenvorstufe für eine stabile 1,2-Dioxetanverbindung sein, wie in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 254 051 A2 offenbart. Das chemilumineszenzerzeugende Substrat kann beispielsweise eine Verbindung der Formel:
wobei ArOR ein Arylrest ist, dessen Arylring mit einem R-oxyrest substituiert ist, der ein instabiles Oxidzwischenprodukt der 1,2-Dioxetanverbindung erzeugt, wenn es enzymatisch oder chemisch durch das Entfernen des Rests R verändert wird, sein. Insbesondere kann die 1,2-Dioxetanvorstufe eine Verbindung der Formel:
wobei R&sub1; und R&sub2; gemeinsam sowie R&sub3; und R&sub4; gemeinsam zu spiroartig-kondensierten Alkylen- oder Arylringen verbunden sein können; und R&sub1; aus Alkyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Dialkyl- oder Arylamino-, Trialkyl- oder Arylsilyloxy- und Arylresten, einschließlich spiroartig-kondensierter Arylreste mit R&sub2;, gewählt wird; R&sub2; einen Arylrest darstellt, der R&sub1; einschließen kann, und mit einem R-oxyrest substituiert ist, wodurch ein instabiles Oxidzwischenprodukt der 1,2-Dioxetanverbindung erzeugt wird, wenn es durch ein Aktivierungsmittel zum Entfernen des Rests R aktiviert wird; R&sub3; und R&sub4; aus Aryl- und Alkylresten, die gemeinsam zu spiroartig-kondensierten polycyclischen Alkyl- und polycyclischen Arylrest verbunden sein können, gewählt werden; und der R-oxyrest einen Hydroxyl-, Alkyl- oder Arylcarboxylester, ein anorganisches Oxidsäuresalz, einen Alkyl- oder Arylsilyloxy- oder O-pyranosidylrest bedeutet, sein. Spezielle Beispiele für Verbindungen dieser Gruppe schließen [Methoxy(2-naphthyl)methylen]adamantan, [(6-tert-Butyldimethylsilyloxy-2-naphthyl)methoxymethylen]adamantan, [(6-tert-Butyldiphenylsilyloxy-2-naphthyl)methoxymethylen]adamantan, [(6-Acetoxy-2-naphthyl)methoxymethylen]adamantan, 2-tert-Butyl-dimethylsilyloxy-9H-fluoren-9-ylidenadamantan, 2-Hydroxy-9H-fluoren-9-ylidenadamantan, 3-(tert-Butyldimethylsilyloxy)-9H-xanthen-9-ylidenadamantan, 3-Hydroxy-9H-xanthen-9-ylidenadamantan, 3-Acetoxy-9H-xanthen-9-ylidenadamantan, 3-Phoshat-9H-xanthen-9-ylidenadamantanbis(tetraethylammonium)salz und [(3-tert-Butyldimethylsiloxyphenyl)methoxymethylen]adamantan ein. Alkendioxetanvorstufen dieses Typs regaieren mit molekularem Singulett-Sauerstoff der bei der Durchführung dieser Erfindung erzeugt wird, wobei sich stabile Dioxetane mit verhältnismäßig langen Halbwertszeiten ergeben. Entsprechend können durch die Verwendung von Dioxetanvorstufen dieses Typs als chemilumineszenzerzeugendes Substrat stabile Dioxetanerzeugnisse über einen vorbestimmten Zeitraum gelagert werden, wodurch für eme chemische Integration der Aktivität des erfindungsgemäßen Indikatorsystems über die Zeit gesorgt wird. Wenn gewünscht, kann die Chemilumineszenzaktivität des erzeugten Dioxetans durch die Zugabe eines Aktivierungsmittels, wie einer Säure, Base, einem Salz, Enzym oder anorganischen oder organischen Katalysator, welches das Dioxetan labil macht, getriggert werden, wobei sich angeregte Carbonylgruppen und die damit verknüpfte Lumineszenzaktivität ergeben, wie in der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr. 0 254 051 A2 beschrieben. Auf diese Weise kann die Gestaltung des Testverfahrens für einen besonderen, zu bestimmenden Analyten optimiert werden, indem das Zeitinterval der Dioxetananreicherung und der zeitliche Verlauf der Lumineszenzentladung überwacht werden.
Die Form, die das chemilumineszenzerzeugende Substrat in der erfindungsgemäßen Lumineszenzreaktion einnimmt, wird von der Art des betrachteten Testverfahrens abhängen. In den Testverfahren, wo das Substrat als Marker eingesetzt wird, kann das Substrat ein substituiertes Derivat von CLS, das an einen Liganden gebunden ist, wie beispielsweise ein Protein, Hormon, Hapten, Steroid, Lectin, eine Nukleinsäure, ein Stoffwechselprodukt, Antigen, Antikörper, eine Nucleinsäuresonde, Bakteriophage oder ein Virus, sein. Zum Beispiel kann ein Aminorest von CLS direkt oder mittels eines verbindenden Rests oder eines verbrückenden Seitenarm an den Liganden gebunden sein. Geeignete verbindende Reste, verbrückende Seitenarme und Verfahren zum Verbinden des Substrats mit dem Liganden sind für einen Fachmann naheliegend und schließen die in den US-Patenten Nrn. 4 380 580, 4 104 029 sowie in der UK-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr. 2 008 274 A beschriebenen Reste ein. In anderen Arten von Testverfahren braucht das Substrat nicht an den Liganden gebunden zu sein. In diesem Fall kann das Substrat frei in Lösung oder mittels herkömmlicher Verfahren an einer festen Phase oder Matrix immobilisiert vorliegen.
Gegenwärtig bevorzugte Oxidationsmittel zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung schließen Wasserstoffperoxid und Alkylhydroperoxide der Formel:
R-OOH
wobei R ein Wasserstoffatom oder ein kurzkettiger Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, ein. Die Aktivität des Oxidationsmittels nimmt im allgemeinen mit zunehmender Kettenlänge von R folgendermaßen ab: R = H » CH&sub3; > CH&sub3;CH&sub2; > CH&sub3;(CH&sub2;)&sub2;. Das gegenwärtig besonders bevorzugte Oxidationsmittel ist Wasserstoffperoxid (H&sub2;O&sub2;), aufgrund seiner in hohem Maß wirksamen Aktivität als Oxidationsmittel. In Testverfahrensformen, wobei ein chemilumineszenzerzeugendes Substrat zur Verwendung als Marker an einen Liganden gebunden ist, wie in Immunoassays, kann eine bekannte Menge des Oxidationsmittels dem Reaktionssystem zugegeben werden. In anderen Testverfahrensformen, insbesondere in denen, wo das erfindungsgemäße Reaktionssystem mit einem vorgelagerten Reaktionssystem verknüpft ist, wie einer oxidase-katalysierten Reaktion, wobei ein Oxidationsmittel, insbesondere Wasserstoffperoxid, erzeugt wird, kann das Oxidationsmittel im Reaktionssystem als Unkebannte vorhanden sein. In weiteren, anderen Testverfahrensformen kann das Oxidationsmittel an einen Liganden oder an eine feste Phase oder eine Matrix unter Verwendung herkömmlicher Verfahren gebunden sem.
Das erfindungsgemäße Indikatorsystem hängt vom Vorhandensein eines geeigneten Halogenidions ab. Wie hierin verwendet, kann das Halogenid Bromid, Chlorid oder Iodid sein. Die Auswahl und die Menge des in einer besonderen Anwendung eingesetzten Halogenids wird von verschiedenen Faktoren abhängen, wie die im Testsystem verwendete Haloperoxidase, dem pH-Wert des Reaktionsgemischs sowie der Stärke des erforderlichen Chemilumineszenzverhaltens. Es wurde festgestellt, daß je größer die Elekronegativität des im System eingesetzten Halogenids ist, desto größer muß die Halogenidkonzentration sein die zum Erreichen eines bestimmten Grads des Chemilumineszenzverhaltens erforderlich ist. Siehe R.C. Allen "Halide Dependence of Myeloperoxidase-Mediated Antimicrobial System of the Polymorphonuclear Leukocyte in the Phenomena of Electronic Excitation" Biochem. and Biophys. Res. Comm. 63 (3) (1975), 675 - 683. Die Aktivität des Halogenids im erfindungsgemäßen Indikatorsystem ist im allgemeinen Br&supmin; > Cl&supmin; > I&supmin; » F&supmin;, wobei das Fluoridion üblicherweise ein geringes oder kein Signal ergibt. Wenngleich die Gegenwart des Iodidions zur Erzeugung einer meßbaren Lumineszenz führen kann, begrenzt die bekannte Lumineszenzauslöschungswirkung des Iodids und seiner Oxidationsprodukte seine Eignung zur Verwendung in einigen Anwendungen, insbesondere wenn hohe Empfindlichkeitsgrade erforderlich sind. Die Wahl des Halogenids hängt weiterhin von der im Indikatorsystem vorhandenen Haloperoxidase ab. Wenn die Haloperoxidase MPO oder CPO ist, kann das Halogenid Bromid, Chlorid oder Iodid, vorzugsweise Bromid oder Chlorid sein. Wenn die Haloperoxidase EPO oder LPO ist, ist Chlorid als Cofaktor verhältnismäßig unwirksam, und demgemäß ist Bromid das bevorzugte Halogenid. Wenn die geeignete Haloperoxidase/Halogenid-Kombination verwendet wird, und die anderen Teilnehmer am Indikatorsystem nicht-geschwindigkeitsbegrenzend sind, wird die Beziehung der Halogenidkonzentration zur Chemilumineszenz durch die empirische Geschwindigkeitsgleichung
GeschwindigkeitCL = Imax = k[X]¹ (11)
wobei die Geschwindigkeit vCL der gemessene Spitzenwert des Verhaltens der Chemilumineszenzgeschwindigkeit (auch als maximale Intensität Imax bezeichnet) ist, k die Proportionalitäts- oder Geschwindigkeitkonstante bedeutet, und X&supmin; das untersuchte Halogenid darstellt (d.h. X&supmin;bedeutet Cl&supmin; oder Br&supmin;, wenn die Haloperoxidase MPO oder CPO ist; und X&supmin; bedeutet Br&supmin;, wenn die Haloperoxidase EPO oder LPO ist), beschrieben. Der Exponent "1" gibt an, daß, wenn die anderen Reaktanten in nicht-geschwindigkeitsbegrenzenden Konzentrationen vorhanden sind, die Umsetzung un Hinblick auf die Halogenidkonzentration näherungsweise erster Ordnung ist.
Nach einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung kann das Vorhandensein oder die Menge an MPO oder EPO in einer Testprobe bestimmt werden, und MPO und EPO können unterschieden werden (d.h. gesondert quantifiziert werden), indem die Br&supmin;-abhängigen MPO- und EPO-Lumineszenzaktivitäten der Probe gemeinsam mit dem erfindungsgemäßen Indikatorsystem bestimmt werden. Die Cl&supmin;-abhängige Lumineszenzaktivität der Probe, die im wesentlichen von EPO unabhängig ist, wird ebenfälls gemessen. Unter passenden Messbedingungen ist der MPO-Gehalt der Probe direkt proportional zur gemessenen Br&supmin;-abhängigen oder Cl&supmin;-abhängigen Lumineszenz, während der EPO-Gehalt der Probe der Br&supmin;-abhängigen abzüglich der Cl&supmin;-abhängigen Aktivität der Probe direkt proportional ist. Anders ausgedrückt gibt die Lumineszenzaktivität einer Testprobe unter den erfindungsgemäßen Reaktionsbedingungen und Verwendung von Br&supmin; als alleinigem Halogenid-Cofaktor quantitativ die Aktivität von sowohl MPO als auch EPO in der Testprobe wieder, wohingegen die Lumineszenzaktivität mittels Cl&supmin; als Cofaktor überwiegend die Aktivität von MPO wiedergibt. Indem man das Verhältnis der Cl&supmin;-abhängigen Lumineszenzaktivität der Probe zur Br&supmin;-abhängigen Aktivität bildet, erhält msn eine quantitative Messung, wobei sich das Verhältnis eins nähert, wenn die MPO-Aktivität in der Testprobe überwiegt, und die sehr Mein wird, wenn die EPO- Aktivität überwiegt. Durch Vergleich der gemessenen Werte mit denjenigen, welche aus Standardlösungen erhalten werden, die bekannte Mengen an MPO und EPO enthalten, erhält msn ein hochempfindliches Verfahren zur quantitativen Bestimmung des MPO- und EPO- Gehalts der Testprobe.
Da MPO ein Hauptbestandteil von polymorphkernigen Leukozyten (PMNLs) und Blutmonozyten ist, und EPO ein Hauptbestandteil von Eosinophilleukozyten ist, kann die Fähigkeit des halogenid-abhängigen Unterscheidung und quantitativen Bestimmung verwendet werden, um auf das Vorhandensein oder die Menge der PMNLs, Monozyten und/oder Eosinophilleukozyten in einer biologischen Probe, wie Blut oder Blutbestandteilen, Gewebebiopsieproben, Exudaten, ebenso wie Sekrete und Ausscheidungen (z.B. Urin, Sputum und Kot) oder ähnliche, hin zu untersuchen, wodurch wichtige diagnotische Informationen, die Entzündungsart betreffend, bereitgestellt werden. Die Menge der in den biologischen Flüssigkeiten vorhandenen Neutrophilen wird in natürlicher Weise durch Infektionen, wie Osteomyelitis, Otitis media, Salpingitis, Septikämie, Gonorrhö, Endokarditis, Pocken, Windpocken, Herpes und Rocky Mountain Fleckfieber; ischemische Nekrose aufgrund von Myokardinfarkt, Verbrennungen und Karzinomen; Stoffwechselstörungen, wie diabetische Azidose, Eklampsie, Urämie, Thyreotoxikose; Stressverhalten aufgrund von akuter Hämorrhagie, chirurgischen Eingriffen, übermäßiger körperlicher Betätigung, emotionalen Sorgen, des dritten Schwangerschaftsdrittels und der Geburt; sowie Entzündungserkrankungen, wie Polyarthritis, akute Gicht, Vaskulitis und Myositis; erhöht, und wird in natürlicher Weise durch Knochenmarkschwund aufgrund von Bestrahlung oder Zytostatika; Infektionen, wie Thypus, Tularämie, Brucellose, Hepatitis, Grippe, Masern, Mumps, Röteln und Pfeiffer'schem Drüsenfieber (Mononucleosis infectiosa); Hypersplenismus von Leber- und Speichererkrankungen; vaskuläre Collagenosen, wie systemische Lupus erythematodes; sowie Folsäure- oder Vitamin B&sub1;&sub2;- Mangel, verringert. Im Unterschied hierzu wird die Menge der Eosinophilen, die in den biologischen Flüssigkeiten vorhanden sind, in natürlicher Weise durch allergische Störungen, wie Asthma, Heuschnupfen, Lebensmittel- oder Arzneimittelüberempfindlichkeiten, Serumkrankheit und Quincke Ödem; parasitäre Plagen, wie Trichinose, Hakenwurm, Rundwurm und Amöbiasis; Hauterkrankungen, wie Ekzeme, Pemphigus, Psoriasis, Dermatitis und Herpes; neoplastische Erkrankungen, wie chronische myeloische Leukämie, Hodgkin Krankheit, Metastasen und Nekrosen von festen Tumoren; sowie durch vaskuläre Collagenose, Nebennierenrindenüberfunktion, Colitis ulcerosa, Knotenpolyarthritis, Post-Splenektomie, perniziöse Anämie, Scharlach und übermäßige körperliche Betätigung; erhöht, und wird in natürlicher Weise durch Stressverhalten aufgrund von Traumata, Schockzuständen, Verbrennungen, chirurgischen Eingriffen und mentalen Sorgen; sowie durch das Cushing Syndrom verringert. Dementsprechend kann die Unterscheidung und quantitative Bestimmung von MPO und EPO (und dadurch der PMNLs, Blutmonozyten und Eosinophilen) unter Verwendung des erfindungsgemäßen Indikatorsystems wertvolle diagnostische Informationen bereitstellen, wie bei der Diagnose von Bakterien(pyrogenen)-Infektionen gegenüber parasitären Plagen, und ähnlichem.
In ähnlicher Weise können CPO und LPO, MPO und LPO sowie CPO und EPO quantifiziert und unterschieden werden. Entsprechend können mit Testverfahren, die zwei verschiedene, durch Halogenid unterscheidbare Haloperoxidasen einsetzen, mehrfache Analytenbestimmungen ausgeführt werden.
Nach einem weiteren erfindungsgemäßen Gesichtspunkt kann das Vorhandensein und die Menge an Br&supmin; und Cl&supmin; in einer Testprobe bestimmt werden, und Br&supmin; und Cl&supmin; können voneinander unterschiedbar quantifiziert werden, indem bekannte Mengen an Haloperoxidasen verwendet werden, wobei die vereinigten MPO- (oder CPO-) abhängigen Lumineszenzaktivitäten der Probe bestimmt werden und wobei die EPO- (oder LPO-) abhängigen Aktivitäten der Probe bestimmt werden. Unter geeigneten Reaktionsbedingungen ist der Br&supmin;-Gehalt der Probe direkt proportional zu entweder der EPO- (oder LPO-) abhängigen Aktivität oder zur MPO- (oder CPO-) abhängigen Aktivität der Probe, wohingegen der Cl&supmin;-Gehalt der Probe direkt proportional zur MPO- (oder CPO-) abhängigen Aktivität abzüglich der EPO- (oder LPO-) abhängigen Aktrvitat ist. In entsprechender Weise zu den unterschiedlichen MPO- und EPO-Bestimmungen, kann ein Verhältnis der EPO- oder LPO-abhängigen Aktivität (Bü abhängig) zur MPO- oder CPO-abhängigen Aktivität (Cl&supmin;- und Br&supmin;-abhängig) als nützliches Maß für Chlorid und Bromid in der Testprobe gebildet werden.
In den Anwendungen, wo das Halogenid nicht der Analyt ist, wird das Halogenid im allgemeinen im Reaktionsgemisch in nicht-geschwindigkeitsbegrenzenden, optimalen Mengen bereitgestellt, im allgemeinen als ein Salz, wie Natriumhalogenid, Kaliumhalogenid usw. In anderen Anwendungen kann das Halogenid den Analyten darstellen, wie in der Bestimmung von Blut- oder Schweißchlorid oder Blutbromid in Verbindung mit der Therapie von Epilepsie.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zu bestimmende Analyten liegen üblicherweise in einem flüssigen Medium oder einer Probe vor. Die zu analysierende Probe kann eine natürlich vorkommende oder künstlich erzeugte Flüssigkeit sein, von der erwartet wird daß sie den Analyten enthält. In vielen Fällen wird die flüssige Probe eine biologische Flüssigkeit oder eine Flüssigkeit, die aus der Behandlung oder Verdünnung einer biologischen Flüssigkeit stammt, wie Serum, Plasma, Urin, Kot sowie amniotische, zerebrale und spinale Flüssigkeiten, sein. Feste Materialien, wie Nahrung, Kot oder Biopsiegewebe, und Gase können gemäß der vorliegenden Erfindung untersucht werden, indem sie in flüssige Form gebracht werden, wie durch Verdünnung mit einer Flüssigkeit, Suspension mit einer Flüssigkeit oder Extraktion in eine Flüssigkeit. Die Testverfahren werden vorzugsweise in wäßriger Lösung durchgeführt.
In deutlichem Unterschied zu Chemilumineszenzindikatorsystemen nach dem Stand der Technik insbesondere denjenigen, welche peroxidase- (z.B. Meerrettichperoxidase, Mikroperoxidase usw.) katalysierte Luminoloxidationen verwenden, funktioniert das erfindungsgemäß Indikatorsystem wirksam bei sauren pH-Werten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Indikatorsystem wahrend den in den vorstehenden Reaktionen (1) bis (8) angegebenen Indikatorreaktionen bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 3 bis etwa 8, stärker bevorzugt im Bereich von etwa 4 bis etwa 7 gehalten. Durch die Durchführung bei emem sauren pH-Wert erhält man eine hochempfindliche und haloperoxidase-spezifische Indikatorreaktion ohne die basen-katalysierte Untergrundchemilumineszenz, welche Peroxidase-Chemilumineszenzsysteme nach dem Stand der Technik geplagt hat. Dementsprechend kann das erfindungsgemäße Testsystem ferner eine geeignete Pufferlösung, beispielsweise Natriumacetat/Essigsäure-Pufferlösung, zum Beibehalten eines sauren pH-Werts während der Indikatorreaktionen umfassen. Jeder beliebige Puffer kann hierfür eingesetzt werden, solange er nicht das Reaktionssystem in anderer Weise beeinträchtigt.
Die Licht- oder Photonenemission aus dem erfindungsgemäßen Lumineszenzindikatorsystem wird ebenfalls durch Sekundärfaktoren, wie die Temperatur, die Konzentration der Reaktanten, die Mischgeschwindigkeit sowie das Verfahren zur Messung des emittierten Lichts, beeinflußt. Die genauen angewandten Reaktionsbedingungen werden im allgemeinen so gewählt, daß die Reaktionsparameter insgesamt optimiert werden, einschließlich der katalytischen Enyymaktivität, der Reaktionskinetik, jeglicher apparativer Begrenzungen, der Reaktionsempfindlichkeit und der Störung durch das Untergrundrauschen.
Die physikalischen Eigenschaften der Licht- (oder Photon-) emission, die sich aus der hierin beschriebenen Lumineszenzreaktion ergibt, hängt in erster Linie von der Art und den Eigenschaften des chemilumineszenzerzeugenden Substrats und in zweiter Linie von der Art und den Eigenschaften der Haloperoxidase, des Oxidationsmittels sowie des Halogenids ab. Wenn Luminol als chemilumineszenzerzeugendes Substrat eingesetzt wird, liegt die maximale spektrale Emission im Bereich von 430 bis 500 nm (blau-grünes Licht). Die im Testverfahren erzeugte Lichtemission kann durch einen beliebigen lichtempfindlichen Detektor mit geeigneter Empfindlichkeit für den Bereich des Spektrums, in dem das Lumineszenzsubstrat seine maximale spektrale Emission aufweist, ermittelt werden. Im allgemeinen sind Photozellen, Photodioden, Photowiderstände oder Dialkali-Photomultiplierröhren mit einer geeigneten Empfindlichkeit im Bereich von 350 bis 650 nm zur Verwendung bei der [)urchführung der vorliegenden Erfindung geeignet.
Die Intensität des zu einem beliebigen Zeitpunkt emittierten Lichts ist proportional zur Reaktionsgeschwindigkeit im Reaktionssystem und ist daher mit der Menge der Unbekannten im Reaktionssystem verknüpft. Die Geschwindigkeit (dhν/dt) oder die Intensität (I) des aus dem Reaktionssystem emittierten Lichts erhebt sich über den Untergrund, wenn die Reaktionsbestandteile und die Unbekannte gemischt werden, bis zu einem maximalen Wert (Imax) oder der Spitzenwert des Geschwindigkeit, und danach nimmt sie, so wie die Unbekannte verbraucht wird, bis zum Grad des Untergrundwerts ab. Dementsprechend kann Imax des Systems als ein relatives Maß für das Vorhandensein oder die Menge der Unbekannten im Reaktionsgemisch verwendet werden. Zusätzlich zu Imax können andere kinetische Ausdrücke des aus dem System emittierten Lichts verwendet werden, um das Vorhandensein oder die Menge der Unbekannten in der Probe direkt oder indirekt zu bestimmen. Zum Beispiel kann das insgesamt emittierte Licht (d.h. das Integral oder die Summe der Anzahl der innerhalb eines vorbestimmten Zeitintervalls emittierten Photonen), der Spitzenwert der emittierten Lichtintensität, der Spitzenwert der Beschleunigung (d.h. d²hν/(dt)² oder dv/dt oder dI/dt) der Lichtemission oder der höchste Wert der Geschwindigkeit oder der Beschleunigung der innerhalb eines vorbestimmten Zeitintervals gemessenen Lumineszenz als entscheidendes Maß verwendet werden. Demgemäß können die zur Messung des aus dem Testsystem emittierten Lichts eingesetzten Geräte zusätzlich geeignete mechanische oder elektronische Geräte umfassen, so wie diese gegebenenfalls zur Durchführung der Messung, der Ableitung oder Integration der Daten, der Datenspeicherung und Funktionsanalyse erforderlich sind.
Das erfindungsgemäße Haloperoxidase-Indikatorsystem kann in einer weiten Vielhahl von Testformen und Umgebungen zur Bestimmung des Vorhandensein oder der Menge eines Analyten in einer Probe oder zur Lokalisierung des Analyten eingesetzt werden. Zum Beispiel kann das Haloperoxidase-Indikatorreaktionssystem bei der Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge eines der Reaktanten im Testsystem, bei Immunoassays und Proteinbindungstestverfahren, in Stoffumsatztestverfahren, zum histologischen Färben, Aufspüren von Analyten, die einer Neuverteilung unterliegen oder in anderen, auf dem Fachgebiet bekannten Testformen eingesetzt werden.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das Haloperoxidasetestsystem verwendet, um das Vorhandensein oder die unbekannte Menge eines Oxidationsmittels, wie Wasserstoffperoxid, in einer Probe zu bestimmen. Im deutlichen Unterschied zur nichthalogenidabhängigen, peroxidase-katalysierten Luminoloxidation durch Wasserstoffperoxid, die im Hinblick auf die Wasserstoffperoxidkonzentration eine Reaktion erster Ordnung ist (siehe Dure et al. "Studies on the Bioluminescence of Balanoglossus bimeniensis Extracts" in J. Biol. Chem. 239 (7) (1964), 2351 - 2359), wie in Figur 3C gezeigt, ist das erfindungsgemäße Haloperoxidase-Lumineszenzindikatorsystem im Hinblick auf die Wasserstoffperoxidkonzentration eine Reaktion zweiter Ordnung, wie in Figur 3B gezeigt. Die Umsetzung kann durch die empirische Geschwindigkeitsgleichung:
Spitzenwert der GeschwindigkeitCL = Imax = k[H&sub2;O&sub2;]² (12)
wobei Imax oder der Spitzenwert der Geschwindigkeit den gemessenen Spitzenwert der Chemilumineszenzintensität (Geschwindigkeit) darstellt, k die Geschwindigkeits- oder Proportionalitätskonstante ist, und [H&sub2;O&sub2;] die Wasserstoffperoxidkonzentration bedeutet, wiedergegeben werden. Der Exponent "2" zeigt an, daß die Reaktion, wenn die anderen Reaktionsbestandteile nicht-geschwindigkeitsbegrenzend sind, im Hinblick auf die Wasserstoffperoxidkonzentration näherungsweise zweiter Ordnung ist. Demgemäß liefert das vorliegende Reaktionssystem ein hochempfindliches Lumineszenzverhalten, das dem Quadrat der Wasserstoffperoxidkonzentration proportional ist, was im Unterschied zu einem direkt proportionalen Verhalten steht, das man bei herkömmlichen peroxidase-katalysierten Systemen erhält.
In einigen Anwendungen ist es erwünscht, das Vorhandensein oder die Menge des natürlich in der Probe vorhandenen Oxidationsmittel, wie Wasserstoffperoxid, zu bestimmen. Zudem sind zahlreiche diagnostische Assaysysteme bekannt, die letztendlich auf der Bestimmung von Wasserstoffperoxid als Maß für die Aktivität von wasserstoffperoxid-erzeugenden oder -verbrauchenden Enzymen oder auf dem Vorhandensein oder der Menge eines Analytensubstrats eines wasserstoffperoxid-erzeugenden oder verbrauchenden Enzyms beruht. Zum Beispiel beruhen die Bestimmungen verschiedener Analyten, wie Glucose, Galaktose, Cholesterin und Harnsäure, auf der Wirkung spezifischer Oxidaseenzyme (z.B. Glucoseoxidase, Galaktoseoxidase, Cholesterinoxidase und Uricase), wobei Wasserstoffperoxid erzeugt wird, und dann der Bestimmung der Menge des erzeugten Wasserstoffperoxids. Wenn das Verhältnis des Produktperoxids zum Analytensubstrat ungefähr eins beträgt (d.h., wenn die Erzeugung von H&sub2;O&sub2; im Hinblick auf das Analytensubstrat erster Ordnung ist), wie beispielsweise im Fall der Glucose/Glucoseoxidase-Reaktion, und wenn die primäre enzymatische Reaktion nicht begrenzend ist, erfüllt das erfindungsgemäße Haloperoxidaseindikatorsystem die empirische Geschwindigkeitsgleichung:
Imax = k[Analytensubstrat]² (13)
wobei Imax und k die gleichen Bedeutungen wie vorstehend erwähnt besitzen. Der Gesamtsauerstoff ebenso wie PO&sub2; (Sauerstoffpartialdruck) können ebenfalls mittels dieser Methode gemessen werden. Sauerstoff ist ein Substrat für Oxidasen, z.B. Glucoseoxidasen, und als solche ist die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs quantitativ proportional zur Geschwindigkeit der Peroxiderzeugung. Wenn andere Reaktanten des Systems nicht-geschwindigkeitsbegrenzend sind, kann Sauerstoff unter Verwendung des Haloperoxid- Indikatorsystems als Lumineszenz quantifiziert werden.
Demgemäß können andere Reaktionssysteme mit dem erfindungsgemäßen Haloperoxidase-Indikatorsystem verknüpft werden, wie wenn ein zu bestimmender Analyt enzmatisch oder nichtenzymatisch umgesetzt wird, wodurch ein Produkt erzeugt wird, das in einem oder mehreren zusätzlichen enzymatischen oder nichtenzymatischen Schritten umgesetzt wird, um schließlich Wasserstoffperoxid oder andere Oxidationsmittel zu erzeugen oder zu verbrauchen, wobei das Vorhandensein oder die Menge dieser dann nach der vorliegenden Erfindung gemessen wird. Demgemäß ist das erfindungsgemäße Haloperoxidase-Indikatorsystem in dieser Ausführungsform für einen weiten Bereich von Analytenbestimmungen weit einsetzbar, in denen der Analyt in einer oder mehreren vorgelagerten Umsetzungen (oder Hilfsreaktionen), in denen Wasserstoffperoxid (oder ein anderes Oxidationsmittel) als ein Reaktionsprodukt erzeugt wird oder als Reaktant verbraucht wird, umgewandelt wird, und dann (he Menge des im Reaktionsgemisch vorhandenen Wasserstoffperoxids nach den hierin beschriebenen Verfahren als ein Maß für das Vorhandensein oder die Menge des ursprünglich in der Probe vorhandenen Analyten bestimmt wird. Verknüpfte erfindungsgemäße Reaktionen, die em Oxidationsmittel erzeugen, können nach dem folgenden Reaktionsweg ablaufen; Analyt Haloperoxidase/Halogenid
wobei OA das oxidierte Derivat des Analyten ist, und CLS sowie P wie vorstehend definiert smd. Der Analyt kann direkt oxidiert werden, wie durch das Einwirken einer Analytenoxidase. In einer anderen Ausführungsform kann der Analyt anderen vorgelagerten Umsetzungen unterworfen sein, wobei eines oder mehrere Reaktionsprodukte erzeugt werden, die gemäß Reaktion (14) oxidiert werden, wobei Wasserstoffperoxid erzeugt wird. In noch einer weiteren Ausführungsform kann der Analyt ein Enzym, wie eine Oxidase, sein, dessen Aktivität durch das erfindungsgemäße Indikatorsystem überwacht wird. Verknüpfte erfindungsgemäße Reaktionen, die ein Oxidationsmittel verbrauchen, können beispielsweise nach dem folgenden Reaktionsweg ablaufen: Analyt Haloperoxidase/Halogenid
wobei OA das oxidierte Derivat des Analyten ist. Wiederum können mit dem Analyten weitere vorgelagerte Umsetzungen zur Erzeugung eines oder mehrerer Reaktionsprodukte, die gemäß Reaktion (15) mit Wasserstoffperoxid reagieren und dieses verbrauchen, durchgeführt werden. Wo der Analyt in einer oder mehreren vorgelagerten Umsetzungen reagiert, wobei Wasserstoffperoxid verbraucht wird, wird typischerweise eine bekannte Menge Wasserstoffperoxid dem Reaktionsgemisch zugegeben, und der Verbrauch an Wasserstoffperoxid wird überwacht oder gemäß der Indikatorreaktion (8) gemessen.
Stellvertretende Beispiele von vorgelagerten Reaktionen, die Oxidationsmittel erzeugen und mit dem erfindungsgemäßen Indikatorsystem verknüpft sind, wodurch das Vorhandensein oder die Menge verschiedener Analyten folgendermaßen gemessen wird: Vorgelagerte Reaktionen die Wasserstoffperoxid erzeugen Analyt: Glucose Glucose Glucoseoxidase Glucon-δ-lacton Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Ethanol (und andere primäre Alkohole) primärer Alkohol Oxidase Aldehyd Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Cholesterin Cholesterin Oxidase Cholestenon Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Cholinesterase Acetylcholin Acetylcholinesterase Acetat + Cholin Cholinoxidase Cholin Betain Haloperoxidase/Halogenid Analyt; Harnsäure Urat Uricase Allantoin Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Milchsäure (Lactat) L-Lactat Lactatoxidase Pyruvat Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Brenztraubensäure (Pyruvat) Pyruvat Pyruvatoxidase Acetylphosphat Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Brenztraubensäure (alternativer Weg) oder NADH Pyruvat L-Lactat Lactatoxidase Pyruvat Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Milchsäure oder Lactatdehydrogenase L-Lactat Lactatdehydrogenase Pyruvat Pyruvatoxidase Acetylphosphat Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Serum Glutamin-pyruvat-transaminase (SGPT) oder Alanin-aminotransferase (ALT) L-Alanin α-Ketoglutarat Pyruvat L-Glutamat Pyruvatoxidase Acetylphosphat Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Serum Glutamin-oxalessigsäure-transaminase (SGOT) oder Aspartat-aminotransferase (AST) L-Aspartat α-Ketoglutarat Oxalacetat + L-Glutamat Oxalacetat Oxalacetatoxidase Pyruvat Pyruvatoxidase Acetylphosphat Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Kreatinkinase (CK) Kreatinphosphat Kreatin Glycerin Glycerinkinase Glycerin-3-phosphat Glycerin-3-phosphatoxidase Glycerin-3-PO&sub4; Dihydroxyacetonphosphat Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Kreatinin Kreatinin Kreatininase Kreatin Kreatinkinase Kreatinphosphat Phosphoenolpyruvat Pyruvatkinase Pyruvatoxidase Acetylphosphat Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Kreatinin (alternativer Weg) Kreatinin Kreatininase Kreatin Sarkosin Kreatinase Harnstoff Sarkosin Sarkosinoxidase Glycin + Formaldehyd Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Kreatinin (alternativer Weg) Kreatin Kreatininiminohydrolase N-Methylhydantoin 2-Oxalglutarat Glutamindehydrogenase L-Glutamat L-Lactat Lactatdehydrogenase Pyruvat Pyruvatoxidase Acetylphosphat Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Kreatin Kreatin Kreatinase Sarkosin + Harnstoff Sarkosin Sarkosinoxidase Glycin Formaldehyd Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Ammoniak α-Ketoglutarat Glutamindehydrogenase L-Glutamat L-Lactat Lactatdehydrogenase Pyruvat Pyruvat Pyruvatoxidase Acetylphosphat Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Harnstoff (Blutharnstoffstickstoff - BUN) Harnstoff Urease α-Ketoglutarat Glutamindehydrogenase L-Glutamat L-Lactat Lactatdehydrogenase Pyruvat Pyruvatoxidase Acetylphosphat Haloperoxidase/Halogenid
Im allgemeinen kann das erfindungsgemäße Indikatorsystem mit beliebigen enzymatischen Reaktionen verknüpft sein, die in einem oder mehrerer ihrer Reaktionsschritte ein Oxidationsmittel, wie Wasserstoffperoxid, das im Indikatorsystem wirksam ist, erzeugen. Stellvertretende Beispiele für solche Enzyme schließen Glycollatoxidase, Glucoseoxidase, Hexoseoxidase, Cholesterinoxidase, Arylalkoholoxidase, L-Gulonolactonoxidase, Galaktoseoxidase, Pyranoseoxidase, L-Sorboseoxidase, Pyridoxinoxidase, Alkoholoxidase L-2- Hydroxysäureoxidase, Ecdysonoxidase, Cholinoxidase, Aldehydoxidase, Xanthinoxidase, Pyruvatoxidase, Oxalatoxidase, Glyoxylatoxidase, D-Aspartatoxidase, L-Aminosäureoxidase, Aminoxidase, Pyridoxaminphosphatoxidase, D-Glutamatoxidase, Ethanolaminoxidase, Tyraminoxidase, Putrascinoxidase, Sarcosinoxidase, N-Methylaminosäureoxidase, N-Methyllysinoxidase, Hydroxylnicotinoxidase, Nitroethanoxidase, Acetylindoxyloxidase, Uratoxidase, Hydroxylaminaminoxidase und Sulfitoxidase ein, aber sind nicht auf diese begrenzt.
Stellvertretende Beispiele für vorgelagerte Reaktionen, die Oxidationsmittel verbrauchen und mit dem erfindungsgemäßen Indikatorsystem verknüpft sind, wodurch das Vorhandensein oder die Menge verschiedener Analyten folgendermaßen gemessen werden: Vorgelagerte Reaktionen, die Wasserstoffperoxid verbrauchen Analyt: NADH NADH-Peroxidase Haloperoxidase/Halogenid Analyt: NADPH NADPH-Peroxidase Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Fettsäuren (z.B. Palmitat) Fettsäure Fettsäureperoxidase Fettsäurealdehyd Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Ferrocytochrom c Ferrocytochrom c Cytochromperoxidase Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Katalase Katalase Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Peroxidase Donor Peroxidase oxidierter Donor Haloperoxidase/Halogenid Analyt: Glutathion Glutathion Glutathioninperoxidase oxidiertes Glutathionin Haloperoxidase/Halogenid
Das erfindungsgemäße Haloperoxidase-Indikatorsystem ist ebenfalls auf spezifische Bindungstestverfahren, wie Immunoassays, in denen eine Markersubstanz eingesetzt wird, die durch das erfindungsgemäße Testsystem bestimmbar ist, anwendbar. Spezifische Bindungstestverfahren schließen diejenigen Systeme ein, in welchen Haloperoxidase als ein Marker in homogenen oder heterogenen Testsystemen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, eingesetzt wird, wobei solche Systeme in den US-Patenten Nrn. 3 654 090, 3 817 837, 3 839 153, 3 850 752, 3 879 262 und 4 380 580 beschrieben werden, oder in denen das Lumineszenzsubstrat, das Oxidationsmittel oder das Halogenid als ein Marker in gleichwertigen, bekannten Systemen eingesetzt wird, wie diejenige, welche in den US-Patenten Nrn. 4 134 792, 4 238 195, 4 238 565, 4 273 866, 4 279 992, 4 372 745, 4 380 580 und 4 383 031 beschrieben werden.
Wenn der mit dem erfindungsgemäßen Indikatorsystem zu bestimmende Analyt in Verbindung mit immunologischen Testverfahren verwendet wird, kann er ein Vertreter eines immunologischen Paars, einschließlich eines Liganden und eines Ligandrezeptors, sein. Durch Verknüpfen eines Bestandteils des erfindungsgemäßen Indikatorsystems mit einem Vertreter eines immunologischen Paars bewirkt das Vorhandensein des Analyten im Reaktionsgemisch die Art oder die Menge des durch das Indikatorsystem erzeugten Lichts. Die Lichtemission kann dann qualitativ oder quantitativ mit dem Vorhandensein oder der Menge des in der Probe zu bestimmenden Analyten verknüpft werden. Das erfindungsgemäße Indikatorsystem kann in einem beliebigen, auf dem Fachgebiet bekannten, Immuntestverfahren mit direkter oder kompetitiver Bindung eingesetzt werden.
Bei den Direktbindungsverfahren kann eine Probe, von der erwartet wird, daß sie den Analyten (d.h. den Liganden) enthält, mit einem Konjugat in Kontakt gebracht werden, umfassend einen Bestandteil des Indikatorsystems und einen spezifischen Bindungspartner des hganden. Die Aktivität des Konjugats ist dann direkt verknüpft mit dem Ausmaß der Bindung zwischen dem Liganden in der Probe und dem spezifischen Bindungspartner im Konjugat. Um quantitative Ergebnisse zu erhalten, wird üblicherweise eine Menge des spezifischen Bindungspartnerkonjugats bereitgestellt, die im Überschuß zu der Menge ist, welche zum Binden aller Liganden, von denen man annimmt, daß sie in der Probe vorhanden sind, imstande ist.
Beim Verfahren mit kompetitiver Bindung kann die Probe mit einem spezifischen Bindungspartner des Liganden sowie mit einem Bestandteil des Indikatorsystems, der mit dem Liganden verknüpft ist, (oder einem Ligandanalogon) in Kontakt gebracht werden. Da ein beliebiger Ligand in der Probe mit dem Liganden- (oder dem Ligandanalogon-) konjugat um Bindungsstellen am spezifischen Bindungspartner konkurriert, schwankt die Chemilumineszenzaktivität des komplexierten spezifischen Bindungspartners umgekehrt zum Bindungsausmaß zwischen dem Liganden in der Probe und dem spezifischen Bindungspartner. Um quantitative Ergebnisse zu erhalten, beträgt die Menge des eingesetzten spezifischen Bindungspartners üblicherweise weniger als die Menge, welche zum Binden mit allen Liganden, von denen man annimmt, daß sie in der Probe vorhanden sind, sowie aller Liganden (oder Ligandanaloga), die mit dem Bestandteil des Indikatorsystems verknüpft sind, imstande ist.
Sowohl bei direkten als auch bei kompetitiven Testformen wird die durch das Indikatorsystem erzeugte Chemilumineszenz das Vorhandensein (qualitativ) oder die Menge (quantitativ) des Analyten in der Probe anzeigen. Qualitative Bestimmungen des Analyten können Vergleichen einer Kennlinie der Chemilumineszenzreaktion mit derjenigen einer Vergleichsreaktion, die analytenfrei ist, einschließen, wobei jeder Unterschied ein Anzeichen für das Vorhandensein des Analyten in der Probe ist. Eine quantitative Bestimmung des Analyten umfaßt typischerweise Vergleichen einer Kennlinie der Chemilumineszenzreaktion mit derjenigen einer Vergleichsreaktion, die bekannte Mengen des Analyten enthält. Wenn das Testverfahren einen Trennschritt einschließt, wobei der zwischen dem Analyten und seinem spezifischen Bindungspartner erzeugte Komplex vom Reaktionsgemisch abgetrennt wird, kann die qualitative oder quantitative Bestimmung entweder an den abgetrennten oder nicht-abgetrennten Bestandteilen des Testverfahrens durchgeführt werden.
Mit Vertreter eines immunologischen Paars ist gemeint, daß das Testverfahren zwei verschiedene Moleküle einschließt, wobei eines der Moleküle einen Oberflächenbereich oder einen Hohlraum aufweist, der spezifisch an einen besonderen räumlichen und/oder polaren Aufbau des anderen Moleküls bindet. Die Vertreter des immunologischen Paars oder der spezifischen Bindungspartner werden üblicherweise auf dem Fachgebiet als Ligand und Rezeptor (oder Antiligand) bezeichnet. Der Ligand kann eine beliebige organische Verbindung sein, für die ein Rezeptor in naturlicher Weise existiert oder hergestellt werden kann, typischerweise ein Antigen oder Hapten. Der Rezeptor (oder Antiligand) kann eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung sein, die imstande ist einen einzelnen Teil, z.B. das Epitop, des Liganden zu erkennen und an diesen spezifisch zu binden, und es kann sich um einen Antikörper, ein Enzym, ein Fab-Fragment, Lectin, eine Nukleinsäuresonde oder ähnliches handeln.
In einigen Ausführungsformen, wie in Sättigungsimmunoassays, kann ein Ligandanalogon eingesetzt werden, das mit dem Liganden um die Bindungsstellen auf dem Rezeptor konkurriert. Ligandanaloga sind typischerweise modifizierte Liganden, die Mittel besitzen, um das Analogon mit dem anderen Molekül, wie einem der Bestandteile des Indikatorsystems, zu verbinden.
Erfindungsgemäße immunologische Assays können auch eine feste Phase umfassen, um die Abtrennung des Analyten aus der Probe zu erleichtern. Eine geeignete feste Phase kann eine beliebige, poröse oder nicht-poröse Oberfläche sein, die eine kovalente oder nicht- kovalente Bindung eines Vertreters des immunologischen Paars auf ihrer Oberfläche gestattet. Viele geeignete feste Phasenmaterialien sind auf dem Fachgebiet bekannt, wie polymere Materialien wie Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen und ähnliche. Eine große Vielzahl funktioneller Gruppen kann verwendet werden, um die unreaktiven Oberflächen der festen Phasen für das kovalente Binden eines Vertreters des immunologischen Paars abzuändern, emschließlich Halogeniden, Epoxiden, Nicht-oxy-carbonyleinheiten, Mercaptane und ähnliche. Das Binden des Vertreters des immunologischen Paars kann direkt oder indirekt, beispielsweise durch das Vermitteln eines spezifischen Bindungspaars, erfolgen. Die feste Phase kann beschichtet oder unbeschichtet sein, um das Binden der notwendigen Bestandteile des Testverfahrens an die feste Phase zu unterstützen, wie mit einer Poly(aminosäure), z.B. Polylysin, oder um das nicht-spezifische Binden von Bestandteilen aus der Probe an der festen Phase zu verhindern. Typische feste Phasen schließen Behälterwände wie die Wände einer Platte für die Mikrotitration, Flügelräder, Kügelchen, Teilchen, magnetische Kügelchen, magnetische Teilchen, Gele, Pegelmeßstäbe, Filter saugfähige oder nicht-saugfähige Matrixmaterialien und ähnliche, ein. Die Art und die Anordnung der festen Phase im Raum, einschließlich Materialabänderungen und Anordnung, ist für die Erfindung nicht kritisch, solange die feste Phase ihre für die Durchführung des erfindungsgemäßen Testverfahrens notwendigen Eigenschaften beibehält.
Aus dem vorstehenden ist klar, daß das erfindungsgemäße Indikatorsystem nicht von einem bestimmten Testverfahren abhängt und in einer großen Vielzahl von herkömmlichen, homogenen und heterogenen Testverfahrensschemata, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, weitgehend anwendbar ist.
Nach noch einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung werden Reagenzien in Form emes Kits bereitgestellt, wodurch die Verwendung und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erleichtert und die Empfindlichkeit des Indikatorsystems des Testverfahrens verbessert wird. Erfindungsgemäße Kits umfassen eines oder mehrere der primären Reagenzien des Indikatorsystems, d.h. Haloperoxidase, Halogenid, Oxidationsmittel und Chemilumineszenzsubstrat, in einer vorbestimmten Form und Konzentration, die zur Verdünnung oder für die direkte Verwendung geeignet sind. Zur Verwendung in bestimmten Testverfahrenssystemen, wie in Immunoassays, können die Kits ferner andere Testverfahrensbestandteile, einschließlich Analytenrezeptoren, Ligandanaloga, Reagenzien der festen Phase und ähnliche, umfassen. Zudem können die erfindungsgemäßen Kits ferner Hilfsmaterialien, wie Puffer, Verdünnungsmittel, inerte Proteine, Stabilisatoren und ähnliche, wie sie zur Durchführung eines bestimmten Testverfahrens erforderlich sind, umfassen.
Das Vorstehende kann in Verbindung mit den folgenden stellvertretenden Beispielen besser verstanden werden, wobei diese zwecks der Veranschaulichung und nicht zur Begrenzung angegeben sind.
Die in den Verfahren der Beispiele eingesetzten Vorratslösungen der Reagenzien des Testverfahrens wurden, sofern in den Beispielen nichts anderes angemerkt ist, folgendermaßen hergestellt:
- Eine ungefähr 0,2 mM Vorratslösung von Luminol wurde hergestellt, indem 0,4 ml einer 0,5 M Luminollösung in Dimethylsulfoxid zu 1 l einer 50 mM Acetatpufferlösung (pH- Wert 5,0) gegeben wurden. Die tatsächliche Endkonzentration des Luminols (d.h. 0,17 mM) wurde durch Messen der Extinktion unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 7,6 mM&supmin;¹cm&supmin;¹ bei 347 nm bestimmt (J. Lee und H.H. Seliger, Photochem. Photobiol. 15 (1972), 227 - 237).
- Wasserstoffperoxidlösungen mit Standardkonzentration wurden durch Verdünnen einer 30%igen H&sub2;O&sub2;-Vorratslösung mit H&sub2;O hergestellt. Die tatsächliche Endkonzentration an Wasserstoffperoxid wurde mittels der Extinktion unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 43,6 M&supmin;¹cm&supmin;¹ bei 350 nm bestimmt (R.W. Nobel und Q.H. Gibson, J. Biol. Chem. 245 (1976), 2409 - 2413).
- Myeloperoxidase (MPO) und Eosinophilperoxidase (EPO) wurden aus Schweineleukozyten hergestellt. Chlorperoxidase (CPO, E.C. Nr. 1.11.1.10), Lactoperoxidase (LPO) und Meerrettichperoxidase (HRP)) wurden als gefriergetrocknete Pulver von Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA) erhalten. MPO, EPO, LPO und HRP wurden in enier 0,15 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7), die 0,5% Tween 80 enthielt, wieder als Lösung hergestellt, gegen die gleiche halogenidfreie Phosphatpufferlösung dialysiert, wodurch der restliche Gehalt an Halogenid entfernt wurde, steril abfiltriert und dann bis zur Verwendung bei 4ºC gelagert. CPO wurde in der gleichen Weise wieder als Lösung hergestellt und behandelt, aber ohne die Dialyse. Bei jeder Herstellung einer Haloperoxidase (XPO) wurde festgestellt, daß diese im wesentlichen von verunreinigenden Peroxidasen und anderem hämhaltigen Protein frei waren. Die tatsächliche Endkonzentration wurde durch Differenzextinktionsspektren der dithionit-reduzierten gegen die oxidierte Probe bestimmt, wobei Differenzextinktionskoeffizienten von 50 mM&supmin;¹cm&supmin;¹ bei 473 nm für MPO und 56 mM&supmin;¹cm&supmin;¹ bei 450 nm für EPO und LPO (R. Wever et al., FEBS Letters 123 (1981), 327 - 331) verwendet wurden. HRP wurde durch direkte Extinktion unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 90 mM&supmin;¹cm&supmin;¹ bei 403 nm quantitativ bestimmt (D. Keilin und E. Hartree, Biochem. J. 49 (1951), 88).
Sofern nichts anderes angegeben ist, hatten alle Reaktionsgemische ein Endvolumen von 1 ml in einer 50 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 5), und alle Messungen wurden bei Zimmertemperatur, ungefähr 22ºC, mittels eines Berthold CliniLumat LB952 Luminometers (Berthold Analytical Instruments, Inc., Nashua, New Hampshire, USA) durchgeführt.

Beispiel 1

Bestimmung von Wasserstoffperoxid

0,1 ml Standardlösungen, die Wasserstoffperoxidmengen im Bereich von 0,011 bis 1,407 µmol enthielten, wurden hergestellt, indem man eine wie vorstehend beschriebene H&sub2;O&sub2;-Vorratslösung verdünnte. Den Standard-Wasserstoffperoxidlösungen in den Polystyrolteströhrchen wurden 0,5 ml der Luminolvorratslösung zugegeben (85 µmol Luminol). Die Lumineszenzindikatorreaktion wurde durch Zugabe von 0,3 ml einer Haloperoxidase/Halogenid-Lösung, die MPO (78 µmol) und Chloridionen (100 µmol als NaCl) in 50 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 5) enthielt, zu jedem Teströhrchen gestartet, und die Chemilumineszenzgeschwindigkeit (relative Zahl je Sekunde) wurde für eine Dauer von 10 bis 60 Sekunden nach der Zugabe der Haloperoxidase/Halogenid-Lösung zur Wasserstoffperoxid/Luminol- Lösung bestimmt. Das Reaktionsendvolumen betrug 0,9 ml. Der Spitzenwert der Geschwindigkeit (vCL) ist in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1
Wie in Figur 2, einem Diagramm des Spitzenwerts der Chemilumineszenzgeschwindigkeit (vCL) als Funktion der Wasserstoffperoxidkonzentration gezeigt, ergibt sich für dieses Indikatorsystem eine hyperbolische Kurve. Eine Berechnung der Geschwindigkeitsgleichung vCL = k[H&sub2;O&sub2;]i für dieses Indikatorsystem ergibt k zu 300,8 1.000 Signale/sec/µmol Wasserstoffperoxid und i = 1,90 (wobei i die Ordnung der Reaktion im Hinblick auf Wasserstoffperoxid ist) mit einem Bestimmungskoeffizienten (r²) von 0,99. Die näherungsweise zweite Ordnung der Reaktion im Hinblick auf die Peroxidkonzentration wird auch durch den doppelt-reziproken Auftrag dieser Daten angezeigt. Zu beachten ist, daß das Standarddiagramm, das in Figur 3A wiedergegeben ist, nicht der Kinetik nach Michaelis- Menten folgt. Für eine Reaktion zweiter Ordnung ist jedoch die Quadratwurzel von v = c[H&sub2;O&sub2;]¹ (wobei c eine Proportionalitätskonstante bezüglich der Peroxidkonzentration zur Quadratwurzel der Geschwindigkeit ist) gleichwertig zur Gleichung v = k[H&sub2;O&sub2;]², und wie in Figur 3B gezeigt, wird eine nahezu geradlinige Beziehung erhalten, wenn der reziproke Wert der Quadratwurzel von vCL als Funktion der reziproken Wasserstoffperoxidkonzentration aufgetragen wird; d.h. das Chemilumineszenzverhalten entspricht im Hinblick auf die Wasserstoffperoxidkonzentration näherungsweise zweiter Ordnung, wenn die anderen Bestandteile des Indikatorsystems nicht-geschwindigkeitbegrenzend sind. Die reziproken Werte der Quadratwurzel von vCL und die reziproken Werte der Wasserstoffperoxidkonzentration wurden verwendet, um Km und das geschätzte Geschwindigkeitsmaximum vmax mittels des Verfahrens von G.N. Wilkensen, Biochem. J. 80 (1961), 324ff zu berechnen, wodurch sich ein Km von 2,82 ± 0,05 (SE) und ein vmax von 3.900 ± 1 (SE) 1.000 Signale/sec ergab, wobei SE den Standardfehler angibt.
Das vorstehende Verfahren wurde wiederholt, wobei die Chloridionen in der vorstehend beschriebenen Haloperoxidase/Halogenid-Lösung durch Bromidionen (5 µmol als NaBr) ersetzt wurden, und MPO in der Haloperoxidase/Halogenid-Lösung durch EPO (39 µmol) ersetzt wurde, wobei entweder Chlorid oder Bromid als Halogenid eingesetzt wurde. Zu Vergleichszwecken wurden zudem die Haloperoxidasen im Reaktionssystem durch Meerrettichperoxidase (HRP, 10 pmol), einer Nicht-Haloperoxidase, ersetzt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Wasserstoffperoxid als Variable
Die Reaktion erfolgte in einer 50 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 5,0), die 85 nmol Luminol enthielt, und das Endvolumen betrug 0,9 ml. Die Temperatur lag bei 22ºC. vmax und die Geschwindigkeit (v) sind in 1.000 Signalen/sec angegeben. * deutet an, daß die kinetischen Berechnungen auf der Quadratwurzel der Geschwindigkeit v beruhen.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, ist der Spitzenwert der Chemilumineszenzgeschwindigkeit (v) quantitativ proportional zum Quadrat der Wasserstoffperoxidkonzentration (i) für die MPO- und EPO-Indikatorreaktionssysteme; d.h. das Chemilumineszenzverhalten ist im Hinblick auf die Wasserstoffperoxidkonzentration näherungsweise zweiter Ordnung, wenn die anderen Bestandteile des Systems nicht-geschwindigkeitsbegrenzend sind, was in Tabelle 2 durch ein Sternchen (*) gekennzeichnet wird. Aus Tabelle 2 ist ebenfalls ersichtlich, daß das Chloridion als ein Halogenid-Cofaktor im EPO-Indikatorreaktionssystem wesentlich weniger wirksam ist. Wie ferner in Tabelle 2 gezeigt, ist das Chemilumineszenzverhalten für das Meerrettichperoxidase- (HRP-) System im Hinblick auf die Wasserstoffperoxidkonzentration nicht zweiter Ordnung, und die Berechnungen beruhen auf der Standardkinetik nach Michaelis-Menten. Dieses Ergebnis wird ferner in Figur 3C aufgeführt, wobei ein herkömmliches doppelt-reziprokes Diagramm zu einer nahezu geraden Linie führt, wodurch angezeigt wird, daß die Beziehung erster Ordnung ist (wodurch Dure et al., J. Biol. Chem. 239 (7) (1964), 2351ff bestätigt wird) und sich vom erfindungsgemäßen Haloperoxidase-Indikatorsystem unterscheidet.

Beispiel 2

Bestimmung von Chlorid

Die Abhängigkeit des Indikatorsystem von der Chloridkonzentration und die mögliche Verwendung dieser Abhängigkeit zur quantitativen Chloridbestimmung wurde bestimmt, indem das Grundverfahren des Beispiels 1 befolgt wurde, wobei 0,3 ml einer Luminollösung (50 nmol Luminol), 0,3 ml einer Halogenidlösung, die 0,2 bis 7,7 µmol an Chloridionen (als NaCl) für MPO, oder 0,2 bis 1.000 µmol an Chloridionen (als NaCl) für EPO und HRP, 0,1 ml MPO, EPO oder HRP in einer Acetatpufferlösung (pH-Wert 5,0) enthielt, verwendet wurden, und denen 0,3 ml von Standardlösungen, die Wasserstoffperoxidmengen im Bereich von 0,16 bis 6,30 µmol enthielten, zugegeben wurden, um die Indikatorreaktion zu triggern. Die Endkonzentration des Actetatpuffers im Reaktionsgemisch war 50 mM (pH-Wert 5,0). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Chlorid als primäre variable, Peroxid als sekundäre
Die Reaktion erfolgte in 1 ml einer 50 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 5,0), die 50 nmol Luminol enthielt. vmax und die Geschwindigkeit (v) sind in 1.000 Signalen/sec angegeben.
Aus den in Tabelle 3 angegebenen Ergebnissen ist einfach ersichtlich, daß das Vorhandensein von Chlorid im Reaktionsgemisch festgestellt werden kann, und daß die Menge an Chlorid mit dem erfindungsgemäßen Indikatorsystem unter Verwendung von MPO als Haloperoxidase einfach bestimmt werden kann. Wenn Chlorid als Halogenid-Cofaktor eingesetzt wird, ist das Indikatorsystem unter Verwendung von MPO um Größenordnungen wirksamer als das Indikatorsystem, bei dem EPO eingesetzt wird. Die Reaktion unter Verwendung von MPO ist näherungsweise erster Ordnung im Hinblick auf die Chloridkonzentration, und folgt, wie in Figur 4 gezeigt, der Standardkinetik nach Michaelis-Menten. Wenngleich die EPO- und HRP-Daten ebenfalls in Figur 3 berücksichtigt wurden, fielen diese Daten nicht in den Bereich des Diagramms. Wie ferner in Figur 3 gezeigt, sind sowohl MPO als auch FPO unter diesen Reaktionsbedingungen um Größenordnungen wirksamer als HRP, das durch das Vorhandensein von Chlorid tatsächlich gehemmt zu sein scheint, wie durch das negative Vorzeichen der Reaktionsordnung (-i) angezeigt wird.

Beispiel 3

Bestimmung von Bromid

Die Abhängigkeit des Indikatorsystem von der Bromidkonzentration und die mögliche Verwendung dieser Abhängigkeit zur quantitativen Bromidbestimmung wurde bestimmt, indem das Verfahren des Beispiels 2 befolgt wurde, wobei Enzym/Halogenid-Lösungen, die 0,015 bis 0,98 µmol an Bromidionen (als NaBr) für MPO, 0,015 bis 0,49 µmol an Bromidionen für EPO und 0,015 bis 1.000 µmol an Bromidionen für HRP anstelle der Chloridionen des Beispiels 2 enthielten, eingesetzt wurden. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 Bromid als primäre Variable, Peroxid als sekundäre Variable
Die Reaktion erfolgte in 1 ml einer 50 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 5,0), die 50 nmol Luminol enthielt. vmax und die Geschwindigkeit (v) sind in 1.000 Signalen/sec angegeben.
Wie in Tabelle 4 angegeben, kann das Vorhandensein von Bromid im Reaktionsgemisch festgestellt und die Menge an Bromid unter Verwendung entweder von MPO oder von EPO als Haloperoxidasebestandteil der Indikatorreaktion einfach bestimmt werden. In deutlichem Unterschied zu den Ergebnissen aus Beispiel 2 sind jedoch sowohl MPO als auch EPO in hohem Maß wirksam, wenn Bromid als Halogenid-Cofaktor eingesetzt wird. Die Fähigkeit von MPO sowohl Chlorid als auch Bromid als Halogenid-Cofaktor wirksam zu benutzen, während EPO lediglich in Gegenwart von Bromid am wirksamsten ist, kann zur differentiellen Analyse dieser Halogenide in einer Testprobe benutzt werden, ebenso wie für die differentielle quantitative Bestimmung von MPO und EPO oder ihren ursprünglichen Zellen (z.B. Neutrophilgranulozyten und Blutmonozyten für MPO, und Eosinophilgranulozyten für EPO). In ähnlicher Weise wie die Chloridabhängigkeit des MPO-Systems, ist die Reaktion des MPO- Systems und ebenso des EPO-Systems näherungsweise erster Ordnung im Hinblick auf die Bromidkonzentration. Figur 5 zeigt die Merkmale der Standardkinetik nach Michaelis-Menten für Bromid sowohl mit MPO (in Figur 5 durch die Großbuchstaben "M" angezeigt) als auch EPO (in Figur 5 durch "E" angezeigt), aber nicht für HRP (keine der Daten für HRP fallen in den Zeichenbereich von Figur 5). Unter den angewandten Reaktionsbedingungen zeigen sowohl MPO als auch EPO eine um vier Größenordnungen stärkere Chemilumineszenzaktivität als die Nicht-Haloperoxidase HRP.

Beispiel 4

Bestimmung von Haloperoxidase

Die Abhängigkeit des Indikatorsystem von der Haloperoxidasekonzentration und die mögliche Verwendung dieser Abhängigkeit zur quantitativen Haloperoxidasebestimmung wurde für die Haloperoxidasen MPO und CPO, die zur wirksamen Nutzung von sowohl Bromid als auch Chlorid als Halogenid-Cofaktoren imstande sind, bestimmt, indem das Verfahren des Beispiels 2 befolgt wurde, wobei eine Standard-Wasserstoffperoxidlösung, die 2,5 µmol Wasserstoffperoxid enthielt, verwendet wurde, um die Indikatorreaktion zu triggern, und wobei 0,3 ml einer Luminollösung, die 125 µmol Luminol enthielt, sowie Haloperoxidaselösungen (0,1 ml) und Halogenidlösungen (0,3 ml in einer 150 mM Acetatpufferlösung, pH-Wert 5,0) verwendet wurden, wobei diese MPO-Mengen im Bereich von 0,86 bis 220 pmol sowie 6,3; 25 oder 100 µmol Chlorid, bzw. MPO-Mengen im Bereich von 0,024 bis 220 pmol sowie 0,63; 2,5 oder 10 µmol Bromid, bzw. MPO-Mengen im Bereich von 13,8 bis 220 pmol sowie kein Halogenid (zur Kontrolle), und CPO-Mengen im Bereich von 2,7 bis 344 pmol sowie entweder 0; 6,3; 25 oder 100 µmol Chlorid oder 0,63; 2,5 oder 10,0 µmol Bromid enthielten. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 5 aufgeführt, worin vmax in 1.000 Signalen/10 sec angegeben ist. Tabelle 5 Haloperoxidase als primäre Variable, Halogenid als sekundäre Variable
Das Reaktionsgemisch enthielt entweder Myeloperoxidase (MPO) oder Chlorperoxidase (CPO) aus Pilzen in einer 50 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 5,0), Endvolumen 1 ml. Die Reaktion wurde durch Injizieren von 2,5 µmol H&sub2;O&sub2; gestartet. Vmax und v sind in 1.000 Signalen/10 sec (Anfang) angegeben. Die kinetischen Berechnungen nach Michaelis-Menten beruhen auf der Quadratwurzel der Geschwindigkeit v.
Wie in Tabelle 5 angegeben, kann das Vorhandensein oder die Menge an MPO oder CPO in der Testprobe einfach durch Messung der Lumineszenz der erfindungsgemäßen Indikatorreaktion in einem weiten Bereich der Enzymkonzentrationen bestimmt werden, wobei entweder Bromid oder Chlorid als Cofaktor eingesetzt wird. Das Lumineszenzverhalten ist im Hinblick auf sowohl die MPO- als auch CPO-Konzentrationen näherungsweise zweiter Ordnung. Unter den in diesem Beispiel angegebenen Bedingungen ist MPO wirksamer als CPO; jedoch sind weder MPO noch CPO wirksam in Abwesenheit des Halogenids, wie dort gezeigt wurde, wo weder Chlorid noch Bromid dem Indikatorreaktionsgemisch zugegeben wurde.
Das vorstehende Verfahren wurde für die bromid-abhängigen Haloperoxidasen EPO und LPO befolgt, wobei Haloperoxidase/Halogenid-Lösungen verwendet wurden, die EPO- Mengen im Bereich von 8,5 bis 272 pmol sowie 6,3; 25 oder 100 µmol Chlorid, bzw EPO- Mengen im Bereich von 0,066 bis 272 pmol sowie 0,63; 2,5 oder 10,0 µmol Bromid, bzw. EPO-Mengen im Bereich von 2,1 bis 272 pmol sowie kein Halogenid, und LPO-Mengen im Bereich von 4,0 bis 258 pmol sowie 6,3; 25 oder 100 µmol Chlorid, LPO-Mengen im Bereich von 2,0 bis 258 pmol sowie 0; 0,63; 2,5 oder 10,0 µmol Bromid enthielten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Tabelle 6 Haloperoxidase als primäre Variable, Halogenid als sekundäre Variable
Das Reaktionsgemisch enthielt entweder Eosinophilperoxidase (EPO) oder Lactoperoxidase (LPO) in einer 50 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 5,0), Endvolumen 1 ml. Die Reaktion wurde durch Injizieren von 2,5 µmol H&sub2;O&sub2; gestartet. Vmax und v sind in 1.000 Signalen/10 sec (Anfang) angegeben. Die kinetischen Berechnungen nach Michaelis-Menten beruhen auf der Quadratwurzel der Geschwindigkeit v.
Wiederum zeigt Tabelle 6, daß sowohl EPO als auch LPO quantitativ als eine Funktion der bromid-abhängigen Lumineszenz bestimmt werden können. Wenngleich unter Verwendung von Chlorid als Cofaktor eine geringe Lumineszenzaktivität erhalten wurde, wiesen sowohl EPO als auch LPO in Gegenwart von Bromid eine um Größenordnungen wirksamere Lumineszenzaktivität auf Unter den angewandten Reaktionsbedingungen zeigte EPO eine wirksamere Lumineszenzaktivität als LPO, unter Verwendung von entweder Bromid oder Chlorid als Cofaktor.

Beispiel 5

Abhängigkeit vom chemilumineszenzerzeugenden Substrat

Die Abhängigkeit der Indikatorreaktion von der Konzentration des chemilumineszenzerzeugenden Substrats wurde bestimmt, indem das Grundverfahren des Beispiels 1 befolgt wurde, wobei 0,3 ml von Luminollösungen eingesetzt wurden, die Luminolmengen im Bereich von 0,0018 bis 15,0 nmol enthielten, wie in Tabelle 7 gezeigt, und wobei 0,3 ml von Haloperoxidase/Halogenid-Lösungen eingesetzt wurden, die 10 pmol MPO, EPO oder HRP bzw. 100 µmol Chlorid, 10 µmol Bromid oder kein Halogenid in einer 150 mM Acetatpuffer- oder Phosphatpufferlösung enthielten, und Triggern der Lumineszenzreaktion durch Zugabe von 0,3 ml einer Wasserstoffperoxidlösung in Wasser, die 2,5 µmol Wasserstoffperoxid enthielt. Das Reaktionsendvolumen betrug 0,9 ml. Zudem wurde der pH-Wert des Reaktionsgemischs variiert, indem Acetatpufferlösungen (pH-Werte 4,9 oder 5,9) oder Phosphatpufferlösungen (pH-Werte 5,8 oder 7,0), alle in einer Endkonzentration von 50 mM, anstelle der Acetatpufferlösung (pH-Wert 5,0) des Beispiels 1 eingesetzt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7 Luminol (CLS) als primäre Variable, pH-Wert als sekundäre Variable
Das Reaktionsgemisch enthielt 100 µmol Cl&supmin;, 10 µmol Br&supmin; und kein Halogenid für Myeloperoxidase (MPO), Eosinophilperoxidase (EPO) bzw. Meerrettichperoxidase (HRP) in einer 50 mM Acetatpufferlösung (AB) oder Phosphatpufferlösung (PB). Die Reaktion wurde durch Injizieren von 2,5 µmol H&sub2;O&sub2; gestartet. Das Endvolumen betrug 0,9 ml. vmax und v sind in 1.000 Signalen/sec angegeben. * deutet an, daß die kinetischen Berechnungen auf der Quadratwurzel der Geschwindigkeit v beruhen.
Wie in Tabelle 7 gezeigt, wurde die Luminolkonzentration durch die MPO- und EPO- Lumineszenzindikatorsysteme über einen weiten Bereich an Luminolkonzentrationen bei pH- Werten im Bereich von 4,9 bis 7,0 quantitativ bestimmt. In deutlichem Unterschied hierzu konnte Luminol nicht wirksam quantitativ bestimmt werden, wenn die Nicht-Haloperoxidase HRP unter den stärker sauren Reaktionsbedingungen eingesetzt wurde. Die Lumineszenzreaktion ist in den MPO- und EPO-Indikatorreaktionen im Hinblick auf die Luminolkonzentration näherungsweise erster Ordnung, aber näherungsweise zweiter Ordnung im HRP-Reaktionssystem, was Dure et al., J. Biol. Chem. 239 (7) (1964), 2351ff bestätigt, wie durch die in Tabelle 7 vor den kinetischen Daten nach Michaelis-Menten angegebenen Sternchen (*) angezeigt wird. In Einklang mit dem in Figur 1 aufgeführten, vorgeschlagenen Reaktionsmechanismus der Haloperoxidase unterstreichen diese kinetischen Unterschiede die mechanistischen Unterschiede, welche die Haloperoxidasen von den Nicht-Haloperoxidasen trennen.

Beispiel 6

Abhängigkeit vom pH-Wert

Die Abhängigkeit des Indikatorsystems vom pH-Wert des Reaktionsgemischs wurde ferner bestimmt, indem das Verfahren des Beispiels 4 befolgt wurde, wobei eine Peroxidlösung, die 2,5 µmol Wasserstoffperoxid enthielt, verwendet wurde, um die Indikatorreaktion zu triggern, wobei Enzym/Halogenid-Lösungen, die 100 µmol Chlorid (als NaCl) und Enzymkonzentrationen im Bereich von 1,7 bis 68 pmol aufwiesen, wie in Tabelle 8 angegeben, verwendet wurden, sowie unter Verwendung von 50 mM Acetatpufferlösungen (pH-Werte 3,7; 5,0 oder 5,9) oder 50 mM Phosphatpufferlösungen (pH-Werte 5,8; 6,9 oder 8,2), um den pH- Wert der Indikatorreaktionslösungen während der Umsetzung und der Messung der Lumineszenz bei den angegebenen pH-Werten zu halten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 aufgeführt, gemessen in 1.000 Signalen/10 sec. Tabelle 8 pH-Wert als primäre Variable, Enzym mit 100 µmol Cl&supmin; als sekundäre Variable
Die Daten sind in 1.000 Signalen/10 sec angegeben; der Untergrund (dunkel) betrug 0,13 1.000 Signale/10 sec. Die Reaktion wurde durch Injizieren von 2,5 µmol H&sub2;O&sub2; gestartet.
Das vorstehende Verfähren wurde befolgt, wobei Enzym/Halogenid-Lösungen verwendet wurden, die 2,5 µmol Bromid (als NaBr) anstelle des vorstehend angegebenen Chlorids enthielten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angegeben, wiederum gemessen in 1.000 Signale/10 sec. Tabelle 9 pH-Wert als primäre Variable, Enzym mit 2,5 µmol Br&supmin; als sekundäre Variable
Die Daten sind in 1.000 Signalen/10 sec angegeben; der Untergrund (dunkel) betrug 0,13 1.000 Signale/10 sec. Die Reaktion wurde durch Injizieren von 2,5 µmol H&sub2;O&sub2; gestartet.
Sowohl MPO mit Chlorid oder Bromid als auch EPO mit Bromid katalysieren die Lumineszenz von Luminol wirksam im untersuchten sauren pH-Bereich, wie in den Tabellen 8 und 9 gezeigt. In der Tat sind die haloperoxidase-abhängigen Lumineszenzaktivitäten quantitativ und werden selbst bei einem pH-Wert von 8,2 verhältnismäßig gut gehalten. Die Empfindlichkeit des HRP-Systems nimmt mit dem pH-Wert zu. Bei höheren HRP-Konzentrationen wird jedoch eine hemmende Wirkung beobachtet. Im Unterschied zum haloperoxiddase-abhängigen Lumineszenzverhalten wird die HRP-Lumineszenz durch das Vorhandensein von Halogenid im wesentlichen nicht beeinflußt. Eine nicht-enzymatische, basen-katalysierte Lumineszenzaktivität wird bei den höheren pH-Werten, die untersucht wurden, beobachtet. Eine solche Aktivität begrenzt das Signal-Rausch-Verhältnis bei höheren pH-Werten, wo HRP am empfindlichsten ist, nachteilig.

Beispiel 7

Bestimmung von Glucoseoxidase

Die Verwendung des Indikatorsystems bei der Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge eines Analyten in einer Testprobe durch eine verknüpfte, vorgelagerte Reaktion wurde bestimmt, indem Testproben in der folgenden Weise auf ihre Glucosekonzentrationen hin analysiert wurden. 100 µl der Testproben, die Glucosemengen im Bereich von 0,0033 bis 4,44 µmol an Glucose enthielten, wie in Tabelle 10 angegeben, wurden durch Lösen der geeigneten Menge an Glucose in einer 50 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 5,4) hergestellt. Jede Testlösung wurde mit 300 µl Luminol (125 µmol) in wäßriger Lösung vereinigt und in ein Polystyrolteströhrchen gegeben. Zu jeder Testlösung wurden 300 µl einer Glucoseoxidaselösung in 100 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 5,4) gegeben, wobei die Mengen an Glucoseoxidase ("GOX", Typ XS, 150.000 Einheiten/g, G-7141 Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, USA) im Bereich von 2,3 bis 144 pmol (1 pmol entspricht 0,028 Einheiten, wobei 1 Einheit 1 µmol D-Glucose zu D-Gluconsäure und Wasserstoffperoxid je Minute bei 35ºC und einem pH-Wert von 5,1 oxidiert) betrugen, wie in Tabelle 10 angegeben. Die Testproben wurden unmittelbar darauf in das Luminometer gegeben, und man ließ sie für eine vorbestimmte Inkubationsdauer im Bereich von 8,5 bis 44,9 Minuten (Inkubationsdauer in Tabelle 10) bei Zimmertemperatur inkubieren. Am Ende der vorbestimmten Inkubationsdauer wurde die Lumineszenzreaktion durch Zugabe von 300 µl einer Lösung, die 30 pmol MPO und 50 µmol an Chloridionen (als NaCl) in einer 50 mM (Endkonzentration in 1 ml Reaktionsgemisch) Acetatpufferlösung (pH-Wert 5,4) enthielt, getriggert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 angegeben. Man beachte, daß das Lumineszenzverhalten im Hinblick auf die Glucosekonzentration näherungsweise zweiter Ordnung ist, und so wurde die Quadratwurzel der Chemilumineszenzgeschwindigkeit zur Berechnung herangezogen, wobei unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 1 vmax und Km für die jeweiligen Reaktionsbedingungen bestimmt wurden. In Tabelle 10 ist vmax in 1.000 Signalen/10 sec (Anfang) angegeben. Tabelle 10 Glucose als primäre Variable, Glucoseoxidase (GOX) als sekundäre Variable
Die Probe wurde mit GOX in einer Acetatpufferlösung (pH-Wert 5,4) für den angegeben Zeitraum inkubiert. Die Reaktion wurde durch Injizieren von 30 pmol MPO und 50 µmol Cl&supmin; gestartet. Das Endvolumen betrug 1 ml. Die Temperatur lag bei 22ºC. vmax und v sind in 1.000 Signalen/10 sec (Anfang) angegeben. Die kinetischen Berechnungen nach Michaelis- Menten beruhen auf der Quadratwurzel der Geschwindigkeit v.
Wie durch die Daten der Tabelle 10 angezeigt, stellt das erfindungsgemäße Indikatorsystem ein hochempfindliches Mittel zur Bestimmung der Glucosekonzentration in einer Testprobe über einen weiten Konzentrationsbereich der Glucose und der Glucoseoxidase bereit. Da die durch Glucoseoxidase katalysierte Oxidation der Glucose zur Erzeugung eines Moleküls Wasserstoffperoxid für jedes verbrauchte Glucosemolekül führt, und da die Erzeugung der Lumineszenz im Indikatorsystem dem Quadrat der Wasserstoffperoxidkonzentration, wie vorstehend beschrieben, proportional ist, ist die gemessene Lumineszenz dem Quadrat der Glucosekonzentration in der Testprobe proportional, wobei dieses verknüpfte Reaktionssystem verwendet wird (d.h. die Lumineszenzreaktion ist im Hinblick auf die Glucosekonzentration zweiter Ordnung). Dieses Ergebnis wird durch die in Tabelle 10 angegebenen Ergebnisse bestätigt.
Da die Oxidation eines Glucosemöleküls auch zum Verbrauch eines Moleküls Sauerstoff führt, kann die vorstehende Glucose/Glucoseoxidase-verknüpfte Reaktion oder andere Oxidasereaktionen zusammen mit dem Haloperoxidase/Halogenid-Lumineszenzidikator- System als ein hochempfindliches Testverfahren für Sauerstoff in einer Testprobe eingesetzt werden, indem bekannte, nicht-geschwindigkeitsbegrenzende Mengen an Oxidase und Substrat (z.B. Glucose) bereitgestellt werden, wodurch Sauerstoff als die unbekannte Variable im verknüpften Reaktionssystem verbleibt.
Das vorstehende Verfahren wurde befolgt, wobei Glucoseoxidase-Lösungen, die 77 pmol Glucoseoxidase enthielten, Glucoseprobelösungen, die 0,0016 bis 3,33 µmol Glucose enthielten (wie in Tabelle 11 angegeben), MPO/Chloridlösungen, die 1,9 bis 60 pmol MPO und 1,6 bis 50 µmol Chlorid enthielten (beide wie in Tabelle 11 angegeben) verwendet wurden, sowie Inkubationsdauern von etwa 22,8 bis etwa 25,8 Minuten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 aufgefürt, worin vmax in 1.000 Signalen/ 10 sec (Anfang) angegeben wird. Tabelle 11 Glucose als primäre Variable, Myeloperoxidase (MPO) als sekundäre Variable
Die angegebenen Mengen an MPO und Cl&supmin; wurden der Probe injiziert, gefolgt von Inkubation mit 77 pmol GOX in einer 50 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 5,4), die 125 nmol Luminol enthielt. Das Endvolumen betrug 1 ml. Die Temperatur lag bei 22ºC. vmax und v sind in 1.000 Signalen/10 sec (Anfang) angegeben. Die kinetischen Berechnungen nach Michaelis- Menten beruhen auf der Quadratwurzel der Geschwindigkeit v.
Die Ergebnisse aus Tabelle 11 belegen, daß das Indikatorsystem einen hohen Stabilitätsgrad bei den verknüpften Bestimmungen von Glucosekonzentrationen über einen weiten Bereich der MPO- und Chloridkonzentrationen aufweist.

Beispiel 8

Festphasen-Immunoassay für Salmonellen

Herstellung der γ-Globulinfraktion aus Antiseren von Kaninchen gegen Salmonellen

Die γ-Globulinfraktionen von Bacto Salmonella O-Antiseren (Poly A-I und Vi) und Bacto Salmonella H-Antiseren (Poly a-z) (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) wurden durch Ammoniumsulfidfällung hergestellt, wie in "Methods in Immunology, A Laboratory Text for Instruction and Research" von J. S. Garvey, N.E. Cremer und D.H. Sussdorf 3. Auflage (1977), 218 - 219, W.A. Benjamin, Inc., Reading Massachusetts, beschrieben. Das Verhältnis von O- zu H-Antiseren betrug 3 zu 1, und die Glubolinproteingesamtkonzentration der entstandenen Lösung betrug 30 mg/ml.

Kuppeln der Anti-Salmonellen-Antikörper an magnetische Teilchen

Die Globulinfraktion der Salmonellen O- und H-Antiseren wurde au magnetische Teilchen durch das Glutaraldehydverfahren von J.L. Guesdon und S. Avrameas (Immunochemistry 14 (1971), 443 - 447) gekuppelt. Zwei Quellen für magnetische Teilchen wurden untersucht:
1) die magnetischen, amin-endständigen Teilchen Bio-Mag 4100 mit einem Größenbereich von 0,5 bis 1,5 µm, 50 mg/ml Suspension (Advanced Magnetics, 61 Mooney Street, Cambridge, Massachusetts, USA), und
2) die magnetischen Teilchen Magnogel ACA 44 mit einem Größenbereich von 40 bis 80 µm, 100 mg/ml Suspension (IBF Biotechnics, Villeneuve la Garenne, Frankreich).

Biotinylierung der Anti-Salmonellen-Antikörper

2,0 mg affinitätsgereinigte Antikörper, die für das Salmonellen-Antigen CSA-1 der gewöhnlichen Struktur spezifisch sind (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, Maryland, USA), wurden in 1,0 ml einer 0,1 M Natriumhydrogencarbonatpufferlösung (pH- Wert 8,3) gelöst. Der Antikörperlösung wurden 0,5 mg Biotin-amidocaproat-N-hydroxysuccinimidester (BAC-NHS, Sigma Chemicals) in 100 µl Dimethylformamid (DMF) zugegeben und man ließ das Gemisch 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Das Gemisch wurde über Nacht gegen eine 0,05 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pH-Wert 7,2) dialysiert, wobei der Puffer zweimal ausgetauscht wurde, und dann bei 4ºC für die weitere Verwendung gelagert. Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung von gereinigtem Anti-Salmonellen-γ-Globulin von Hasen, das wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, wiederholt.

Biotinylierung der Bakteriophage

10 ml Bakteriophage φ27869-β&sub1; (American Type Culture Collection, Rockille, Maryland, USA), die ungefähr 10¹¹ bis 10¹² Plaque-erzeugende Einheiten/ml (PFU/ml) enthielt, wurde gegen eine 0,1 M Hydrogencarbonat-Kochsalzpufferlösung (pH-Wert 8,3) 16 Stunden bei 4ºC dialysiert, wobei der Puffer zweimal ausgetauscht wurde. Dem dialysierten Material wurden 75 mg BAC-NHS, das in 400 µl DMF gelöst war, zugegeben, und das Gemisch wurde auf einem Wipptisch 15 Minuten bei Zimmertemperatur bewegt. Die Suspension wurde dann mit 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 6,8), die 5 mM MgSO&sub4; und 80 mM NaCl enthielt, auf 20 ml aufgefüllt und anschließend gegen die Phosphatpufferlösung 16 Stunden dialysiert, wobei der Puffer dreimal ausgetauscht wurde. Das dialysierte Material wurde bei 4ºC für die weitere Verwendung aufbewahrt.

Herstellung von avidinisierter Glucoseoxidase

10 mg affinitäts-gereinigtes Avidin (Sigma Chemicals, Nr. A-9275) wurden in 0,5 ml emer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 6,8) gelöst, mit NaCl auf 290 mOsm eingestellt und mit 2 ml einer 1,25%igen Glutaraldehydlösung in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH- Wert 6,8) gemischt. Das Gemisch wurde auf einem Wipptisch über Nacht bei Zimmertemperatur bewegt, und dann gegen eme 0,15 M NaCl-Lösung 18 Stunden bei 4ºC dialysiert, wobei der Puffer zweimal ausgetauscht wurde. Zu 0,1 ml der dialysierten Lösung wurden 25 mg Glucoseoxidase, die in einer 0,15 M NaCl-Lösung gelöst war, und 200 µl einer 0,1 M Carbonat-Hydrogencarbonatpufferlösung (pH-Wert 9,5) gegeben Man ließ das Gemisch 2 Stunden bei Zimmertemperatur und dann bei 4ºC über Nacht reagieren.

Assayprotokoll

1,0 ml einer Lösung, welche die in Tabelle 13 angegebene Zahl an kolonienbildenen Einheiten (CFU) von Salmonella typhimurium, ATCC Nr. 14 028 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) enthielt, wurde 30 Minuten mit verschiedenen Verdünnungen von Bio-Mag-Teilchen, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, und die mit der Anti-Salmonellen-γ-Globulinfraktion beschichtet waren, inkubiert. Die Inkubationssuspension wurde in einen magnetischen Separator gegeben, um die Teilchen abzutrennen, und die Teilchen wurden zweimal mit einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,3) gewaschen, wodurch die ungebundenen Bakterien entfernt wurden. Die Teilchen wurden dann in einem kleinen (ungefähr 200 bis 500 µl) Volumen einer Waschlösung resuspendiert, und dann mit einer 1:200-Verdünnung der biotinylierten Vorrats-Anti-Salmonellen-γ-Globulinfraktion 30 Minuten bei 35ºC inkubiert. Die Kügelchen wurden wieder von der Lösung abgetrennt und zweimal wie vorstehend beschrieben gewaschen. Dann wurden die Teilchen in emem kleinen Volumen der Waschlösung resuspendiert. 500 µl einer 1:25-Verdünnung der vorstehend beschriebenen, avidinisierten Glucoseoxidaselösung wurde den Teilchen hinzugefügt, und das Gemisch wurde 30 Minuten bei 35ºC inkubiert. Die Teilchen wurden wieder abgetrennt, dreimal wie vorstehend beschrieben gewaschen und anschließend wieder in 600 µl einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 5,2), die 3,3 µmol D-Glucose und 3,0 nmol Luminol enthielt, suspendiert. Die Teilchen wurden dann in ein Luminometer (Berthold Modell 952) gegeben und im Dunkeln 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. 300 µl emer Lösung, die ein Gemisch aus MPO (ungefähr 10 pmol) und EPO (ungefähr 10 pmol) sowie Bromid (15 µmol, als NaBr) enthielt, wurden der Suspension zugegeben und vCL wurde 20 Sekunden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 aufgeführt. Tabelle 12 CFU von Salmonella typhimurium als primäre Variable, Anti-Salmonellen-beschichtete, magnetische Teilchen als sekundäre Variable
Einheiten: 1.000 Signale/20 sec (Anfang) ± Standardabweichung der Probe (δn-1).
Untergrund: Dunkelstrom 0,28 1.000 Signale/20 sec.
Das vorstehende Verfahren wurde befolgt, unter Verwendung einer 1: 2.000-Verdünnung des Vorrats an Magnogel ACA 44-Teilchen, die wie vorstehend beschrieben hergestellt und mit Anti-Salmonellen-Antikörpern beschichtet wurden, oder die als unbeschichtete Kontrolle verwendet wurden, wobei Testproben, die 10&sup5; CEU von S. typhimurium enthielten, oder keine davon (zur Kontrolle) enthielten, verwendet wurden, wobei 1:100 oder 1:1.000- Verdünnungen entweder der biotinylierten, affinitätsgereinigten Anti-Salmonellen-Antikörper, der biotinylierten Anti-Salmonellen-γ-Globulinfraktion oder der biotinylierten Bakteriophage φ27869-β&sub1;, als biotinylierte salmonellen-bindende Spezies eingesetzt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 aufgeführt, gemessen in 1.000 Signalen/10 sec (Anfang). Tabelle 13 Vergleich der Salmonellen-Phage mit den Anti-Salmonellen-Antikörpern
Einheiten: 1.000 Signale/10 sec (Anfang) ± δn-1 (Standardabweichung der Probe).
Untergrund: Dunkelstrom 0,12 1.000 Signale/10 sec.
Die experimentellen Daten der Tabellen 12 und 13 belegen die Empfindlichkeit des Indikatorsystems in Kombination mit liganden- (Anti-Salmonellen-) spezifischen Antikörpern als Verfahren zur Bestimmung von Bakterien. Das Haloperoxidase/Halogenid-Lumineszenzindikatorsystem kann im wesentlichen für ein beliebiges Ligand/Ligandbinder-Testverfahren angepaßt werden. In Tabelle 13 erfolgt die Bestimmung der Salmonellen über Antikörper- oder bakteriophagen-spezifische Mechanismen. Der biotinylierte Ligandenbinder ist über Avidin an die Glucoseoxidase gebunden. Inkubation mit einer nicht-geschwindigkeitsbegrenzenden Glucosekonzentration führt zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid im Verhältnis zur Glucoseoxidasekonzentration, und demgemäß im Verhältnis zu den in der Probe vorhandenen Salmonellen. Das Haloperoxidase/Halogenid-Indikatorsystem wird konstant gehalten und ist nicht-geschwindigkeitbegrenzend, und die festgestellte Lumineszenz ist dem Wasserstoffperoxid proportional, das über die beschriebene Beziehung zwischen dem gebundenen Liganden und dem Enzym erzeugt wurde.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge eines Analyten, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Peroxid, Halogenid, Haloperoxidaseenzym, Chemilumineszenzsubstrat für dieses Enzym oder eines Analyten, der Peroxid, Halogenid, Haloperoxidase oder Chemilumineszenzsubstrat in einer oder mehreren vorgelagerten Umsetzungen erzeugt oder verbraucht, in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie eine unbekannte Menge des Analyten enthält, wobei das Verfahren

a) Inkontaktbringen der Probe mit einer Testlösung, die eine bekannte, nicht- geschwindigkeitsbegrenzende Menge der anderen Vertreter dieser Gruppe umfaßt;

b) Halten des pH-Werts der Testlösung auf weniger als etwa 8;

c) Messen wenigstens einer Kennlinie des Lichts, das aus der Testlösung emittiert wird; und

d) Vergleichen der gemessenen Kennlinie des Lichts mit einer Standardlösung, die eine bekannte Menge des Analyten als Maß für das Vorhandensein oder die Menge des Analyten in der Probe enthält;

umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Testlösung eine homogene Testlösung ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Testlösung eine heterogene Testlösung ist, und das Reaktionssystem ferner eine unlösliche Phase, ein erstes spezifisches Bindemittel das auf der unlöslichen Phase immobilisiert ist und eine Bindungsspezifität für den Analyten besitzt, sowie ein zweites spezifisches Bindemittel, das entweder an die Haloperoxidase oder an eine Oxidase, die zur Bildung von Peroxid imstande ist, oder an das Chemilumineszenzsubstrat konjugiert ist, wobei das zweite spezifische Bindemittel eine Bindungsspezifität für den Analyten besitzt, umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, ferner umfassend Inkontaktbringen des ersten immobilisierten Bindemittels mit der Probe und mit dem zweiten spezifischen Bindemittel Abtrennen der löslichen Phase von der unlöslichen Phase und Messen der Kennlinie des Lichts in der löslichen oder der unlöslichen Phase.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner umfassend Einstellen des pH-Werts der Testlösung auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 3 bis etwa 8 vor dem Messen der Kennlinie des emittierten Lichts.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Analyt Peroxid ist oder einen Analyten darstellt, der Peroxid in einer oder mehreren vorgelagerten Reaktionen erzeugt oder verbraucht.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Peroxid in der Probe in einer oder mehreren vorgelagerten Reaktionen erzeugt wird, in denen das Peroxid ein Reaktionsprodukt ist und der Analyt ein Reaktant ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Peroxid in der Probe in einer oder mehreren vorgelagerten Reaktionen, in denen das Peroxid und der Analyt Reaktanten sind, verbraucht wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Analyt ein Halogenid oder einen Analyten, der imstande ist, Halogenid in einer oder mehreren vorgelagerten Reaktionen zu erzeugen oder zu verbrauchen, darstellt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Analyt Haloperoxidase ist.

11. Testbesteck zur Verwendung in einem Chemilumineszenz- oder Chemiluminometrietestverfahren, umfassend wenigstens drei der folgenden Bestandteile;

a) eine Haloperoxidase,

b) ein Peroxid,

c) ein Halogenid,

d) ein Chemilumineszenzsubstrat, und

e) eine Pufferlösung zum Halten des pH-Werts der Testlösung innerhalb des Bereichs von etwa 3 bis etwa 8.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder Testbesteck nach Anspruch 11, wobei das Peroxid Wasserstoffperoxid ist.

13. Verfahren oder Testbesteck nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Haloperoxidase Myeloperoxidase (MPO), Eosinophil-Peroxidase (EPO), Lactoperoxidase (LPO) oder Chlorperoxidase (CPO) ist.

14. Verfahren oder Testbesteck nach Anspruch 13, wobei die Haloperoxidase MPO oder CPO ist, und das Halogenid Bromid oder Chlorid ist.

15. Verfahren oder Testbesteck nach Anspruch 14, wobei die Probe eine biologische Flüssigkeit ist, und die Menge an MPO in der Probe als Maß der Menge an polymorphkernigen Leukozyten oder Blutmonozyten in der Probe bestimmt wird.

16. Verfahren oder Testbesteck nach Anspruch 13, wobei die Haloperoxidase EPO oder LPO ist, und das Halogenid Bromid ist.

17. Verfahren oder Testbesteck nach Anspruch 16, wobei die Probe eine biologische Flüssigkeit ist, und die Menge an EPO in der Probe als Maß der Menge von Eosinophilen in der Probe bestimmt wird.

18. Verfahren oder Testbesteck nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Halogenid Bromid oder Chlorid ist.

19. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Analyt Chlorid ist, und das Verfahren ferner umfaßt: Bestimmen der von MPO oder CPO abhängigen Kennlinien des Lichts, die aus dem Testsystem emittiert werden, abzüglich der von EPO oder LPO abhängigen Kennlinien des Lichts, die aus dem Testsystem emittiert werden, als Maß für das Vorhandensein oder die Menge an Chlorid in der Probe.

20. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Analyt Bromid ist, und das Verfahren ferner umfaßt: Bestimmen der von EPO oder LPO abhängigen Kennlinien des Lichts, die aus dem Testsystem emittiert werden, geteilt durch die von MPO oder CPO abhängigen Kennlinien des Lichts, die aus dem Testsystem emittiert werden, als Maß für das Vorhandensein oder die Menge an Bromid in der Probe.

21. Verfahren oder Testbesteck nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Chemilumineszenzsubstrat ein cyclisches Hydrazid oder eine Dioxetanvorstufe ist, die zur Reaktion mit Singulett-Sauerstoff imstande ist, wobei Dioxetan oder ein Dioxetanon erzeugt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das cyclische Hydrazid ein 2,3-Dihydro-1,4- phthalazindion, wie Luminol oder Isoluminol, ist.