ITBO20070112A1 - Metodo per incrementare l'emissione di luce da una reazione chemiluminescente - Google Patents
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Description
METODO PER INCREMENTARE L’EMISSIONE DI LUCE DA UNA
REAZIONE CHEMILUMINESCENTE
La presente invenzione concerne una reazione chemiluminescente utilizzata specialmente in saggi diagnostici, ed in particolare in saggi immunoenzimatici e relativi kit. La reazione chemiluminescente è quella tra il luminolo, una sorgente di perossido ed un'enzima perossidasi, specialmente la perossidasi del rafano (HRP), che catalizza l'ossidazione del luminolo da parte del perossido. Tale ossidazione è accompagnata dall'emissione di luce.
L’ossidazione chemiluminescente del luminolo catalizzata dalla perossidasi trova ampio impiego in saggi analitici di antigeni, anticorpi ed acidi nucleici, ed in particolare nei saggi per biotting, ad es. il Dot Blot, il Western Blot (proteine), il Southern e il Northern Blot (acidi nucleici).
E’ noto che l'ossidazione chemiluminescente del luminolo catalizzata dalla perossidasi può essere resa più rapida ed efficiente tramite l'aggiunta di un mediatore di elettroni, o intensificatore, come illustrato ad es. da L.J. Kricka, Clinical Chemistry 1991; 37:1472-1481; oppure da L.J. Kricka, J.C. Voyta and I. Bronstein in “Chemiluminescent Methods for Detecting and Quantitating Enzyme Activity", Methods Enzymol. 2000; 305:370-390. Numerosi composti sono stati utilizzati come mediatori elettronici. In particolare, la luciferina della lucciola, il 6-idrossibenzotriazolo, il p-iodofenolo, l’acido p-cumarico sono descritti da G.H.G. Thorpe and L.J. Kricka, in Methods Enzymol. 1986; 133:331; le ammine aromatiche in U.S. Pat. No. 4,279,950; le acetanilidi in Eur. Pat. Appi. No. 603,953 (1994); gli indofenoli e le fenotiazine N-sostituite e gli indofenoli in U.S. Pat. No. 5,171,668; gli acidi boronici sostituiti in U.S. Pat. No. 5,629,168. Si ritiene che in presenza di mediatore di elettroni l’ossidazione del luminolo catalizzata da perossidasi proceda come segue:
SCHEMA
dove HRP, HRP-I e HRP-II indicano l'enzima perossidasi rispettivamente nella forma nativa e nelle due forme ossidate; LH-, LH<.->, L, LO2<2->rappresentano rispettivamente l'anione luminolo, il radicale anione luminolo, il diazachinone e il luminolo perossido; E ed E<'>, rappresentano il mediatore di elettroni e il corrispondente radicale; infine si indica con AP<2->il dianione dell’acido 3-aminoftalico e con (AP<2->)* il suo stato eccitato. Secondo questo schema, la perossidasi HRP viene ossidata dal perossido a HRP-I. L'anione luminolo e l’intensificatore sono ossidati da HRP-I ai rispettivi radicali con conversione dell'enzima alla forma HRP-II. A sua volta, la forma HRP-II ossida un'altra molecola di anione luminolo o di mediatore di elettroni ai rispettivi radicali rigenerando contemporanemante la forma nativa dell’enzima HRP, che può così partecipare ad un altro ciclo ossidativo. Si ritiene quindi che l’aumento del segnale chemiluminescente sia dovuto alla più rapida generazione dell’intermedio chiave L<.->in presenza di mediatore di elettroni (vedi ad es. S.B. Vlasenko, A.A. Arefyev, A.D. Klimov, B.B. Kim, E.L. Gorovits, A.P. Osipov, E.M. Gavrilova, A.M. Yegorov, J. Biolumin. Chemilumin. 1989; 4:164-176; oppure B. Cercek, K. Roby, L. Cercek, J. Biolumin. Chemilumin.
1994; 9:273-277).
Le fasi successive della reazione chemiluminescente sono meno chiare. Il radicale anione luminolo L<.->è nstabile e può dismutare all'anione luminolo LH<->e diazachinone, L. Il diazachinone a sua volta è suscettibile all’attacco nucleofilico da parte dello ione perossido HO2<->sul carbonio carbonico (C=0), con formazione di luminolo perossido LO2<2->in forma aperta o ciclica (endoperossido). Infine il luminolo perossido collassa ad 3-amminoftalato, AP<2->, con espulsione dì azoto molecolare. Una parte dell’energia così prodotta viene catturata dall’amminoftalato con formazione dello stato eccitato (AP<2->)<*>e successiva emissione di luce blu (425 nm). L' efficienza di quest'ultimo processo corrisponde alla resa quantica di fluorescenza del 3-aminoftalato (circa il 30%). Anche se i dettagli esatti delle reazioni (7)-(9) non sono noti è ipotizzabile che la conversione del radicale anione luminolo, L<.->, a luminolo perossido, LO2<2->, implichi l'attacco nucleofilico dello ione perossido su un carbonio carbonilico (C=O) del luminolo (vedi ad es. G. Merenyi, J. Lind e T. E. Eriksen in “Nucleophilic Addition to Diazaquinones. Formation and Breakdowm of Tetrahedral Intermediates in relation to Luminol Chemiluminescence”, J. Am. Chem. Soc. 1986; 108:7716-7726.) D’altra parte, l'efficienza di questa reazione è determinante per la formazione di (AP<2->)<*>.
La ricerca di possibili catalizzatori di acilazione nucleofili, in grado di facilitare l’attacco dello ione perossido sul carbonio carbonilico (C=O) del luminolo, e quindi di aumentare la produzione di luce della reazione chemiluminescente ha condotto alla scoperta di un gruppo di composti con i requisiti richiesti. Tali composti, noti come catalizzatori di acilazione ipernucleofìli o HNAC, vedi ad es. E.F.V. Scriven, in “4-Dialkylaminopyridines: Super Acylation and Alkylation Catalysts’', Chem. Soc. Rev. 1983; 12:129-161, possiedono infatti la caratteristica di aumentare in maniera molto significativa l'emissione luminosa prodotta dall’ossidazione chemiluminescente del luminolo catalizzata dalla perossidasi e in presenza di mediatori di elettroni (intensificatoli elettroattivi). Peraltro, i composti trovati non agiscono in modo analogo agli intensificatori elettroattivi. Utilizzando i composti oggetto della presente invenzione al posto degli intensificatori elettroattivi, non si osserva infatti alcun effetto di intensificazione dell'emissione luminosa derivante dall'ossidazione del luminolo catalizzata dalla perossidasi.
Dal punto di vista strutturale, i composti della presente invenzione appartengono alla classe delle 4-aminopiridine. (A. Hassner, L.R. Krepski, V. Alexanian, in Aminopyridines as Acylation Catalysts for Tertiary Alcohols", Tetrahedron 1978; 34:2069-2076; G. Hoefle, W. E Steglich, H. Vorbrueggen, in “4-Dialkylaminopyridines as Highly Active Acylation Catalysts”, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1978; 17:569-583.
La presente invenzione prevede l’utilizzo, in composizioni chemiluminescenti, di un catalizzatore di acilazione ipemucleofilo (HNAC) appartenente alla classe delle 4-aminopiridine ed in particolare i composti definiti dalla seguente formule:
Formula (I)
dove:
R1e R2rappresentano, entrambi o ciascuno separatamente, idrogeno, metile, etile, propile, isopropile o Putite,
oppure
R1e R2assieme rappresentano -(CH2)4-, formando così un anello pirrolidinico con l’atomo di azoto,
oppure
R1e R2assieme rappresentano -(CH2)5-, formando così un anello piperidinico con l'atomo di azoto,
oppure
R1e R2assieme rappresentano -(CH2)2-CHCH3-(CH2)2-, formando così un anello 4-metilpiperidinico con l'atomo di azoto,
oppure
R1e R2assieme rappresentano -(CH2)2-O-(CH2)2- , formando così un anello morfolinico con l'atomo di azoto,
oppure
R1e R2assieme rappresentano -(CHCH3)-CH=CH-(CHCH3)-, formando cosi un anello 2,5-dimetil-2,5-diidro-1 H-pirrolico con l’atomo di azoto.
Formula (II)
dove:
X rappresenta idrogeno, metile, etile, propile, isopropile oppure butile, mentre R1e R2rappresentano, entrambi o ciascuno separatamente, idrogeno, metile, etile, propile, isopropile o butile,
oppure
X rappresenta NH2, oppure N(metile)2, oppure N(etile)2, oppure N(propile)2, oppure N(isopropile)2, oppure N(butile)2, mentre R1e R2rappresentano, entrambi o ciascuno separatamente, idrogeno, metile, etile, propile, isopropile, o butile.
Anche se le presente invenzione é relativa aH'utilizzo in generale, e per qualsiasi scopo, dell'aumento di emissione luminosa prodotta dalla reazione chemiluminescente con i reagenti sopraindicati, è tuttavia principalmente applicabile neH’ambito di un saggio. Con il termine di “saggio" si intende la rivelazione, la semiquantificazione e la quantificazione di un analita. Tipicamente l'esecuzione di un saggio richiede di rapportare l'emissione luminosa alla quantità di perossidasi impiegata, cosicché la perossidasi costituisce la sostanza determinata direttamente. Sebbene la presente invenzione sia utilizzabile per determinare la presenza o la quantità di uno qualsiasi dei partner di reazione (luminolo; perossidasi; ossidante; mediatore di elettroni; catalizzatore di acilazione ipernucleofilo), tale partner di reazione non è necessariamente esso stesso la sostanza da determinare. Ad esempio, l’ossidante può essere prodotto da una reazione precedente, o da una serie di reazioni precedenti. La perossidasi o il luminolo possono essere presenti in forma di coniugato ad un anticorpo, utilizzato in un saggio immunoenzimatico per determinare un antigene. Oppure la perossidasi o il luminolo possono essere presenti come coniugato ad un nucleotide, un oligonucleotide o una acido nucleico nei saggi di ibridazione. Pertanto la presente invenzione è applicabile a qualunque metodo di saggio diagnostico di una sostanza, la cui presenza o quantità è rapportabile alla presenza o alla quantità di un partner di reazione selezionato dal gruppo costituito da luminolo, un'enzima perossidasi, un ossidante, un intensificatore ed un catalizzatore di acilazione ipernucleofilo, che coreagiscono in una reazione chemiluminescente, la cui emissione di luce è rivelata o misurata cosicché la presenza o la quantità di sostanza da analizzare è rapportata alla produzione di luce.
La presente invenzione include inoltre un kit per l’esecuzione di un saggio comprendente il luminolo, un ossidante, un mediatore di elettroni e un catalizzatore di acilazione ipernucleofilo.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
I catalizzatori di acilazione ipernucleofìli (HNACs) della presente invenzione, rappresentati in generale dalle Formule (I) e (II), includono in particolare la 4-dietilaminopiridina, la 4-dimetilaminopiridina (DMAP), la 4-pirrolidinopiridina (PPY), la 4-piperidinopiridina, la 4-(4-metilpiperidin-1-il)piridina (MPP), la 4-morfolinopiridina (MORP), la 4-(2,5-dimetil-2,5-diidro-1H -pirrol-1-il)piridine, la N-dimetil-N'-piridin--ilimidoformamide e la N , N, N' , N'-tetrametil-N" -piridin-4-il -guanidina . Particolarmente preferiti sono il MORP, il PPY, il DMAP e il MPP. Tali composti sono particolarmente utili nei saggi chemiluminescenti che richiedono una elevato livello di emissione luminosa, come ad esempio i saggi di blotting, fra cui i Western, Southern e Northern blot, come pure i “dot blot” e i saggi di ibridazione degli acidi nucleici. La concentrazione del catalizzatore di acilazione ipernucleofilo è generalmente compresa nell’intevallo fra 0,001 e 20 mmoli/litro, preferibilmente tra 0,1 mmoli e 10 mmoli/litro.
I risultati migliori si ottengono a pH elevato, ed in particolare nell'intervallo di pH compreso fra 8,9 e 9,4. Tale intervallo è significativamente più alto dell'intervallo ottimale di pH in presenza di intensificatore, ma in assenza di catalizzatore di acilazione ipernucleofilo, che è generalmente compreso fra 8,4 e 8,6.
Il luminolo utilizzato deve essere di purezza adeguata e comunque appropriata per l’utilizzo in saggi luminescenti. Il luminolo può essere utilizzato sotto forma di sale sodico. Se l’analita da determinare è la perossidasi, la concentrazione di luminolo utilizzata è generalmente compresa fra 0,1 mmoli/litro e 50 mmoli/litro, preferibilmente fra 0,5 e 10 mmoli/litro.
L’ ossidante può essere una qualunque sostanza in grado di ossidare il luminolo con emissione di luce. Si preferisce una sorgente di perossido, quale il perossido di idrogeno o il perborato di sodio. La concentrazione di ossidante utilizzata nei saggi chemiluminescenti della perossidasi è compresa tra 0,1 e 100 mmoli/litro, preferibilmente tra 0,5 e 10 mmoli/litro.
L’enzima perossidasi è normalmente la perossidasi del rafano (HRP) di qualità appropriata per l'utilizzo in saggi luminescenti. Preferibilmente l'enzima HRP è un isoenzima basico, ad esempio il tipo Sigma VIA o IX. Può essere libero o coniugato ad un legante.
Il mediatore di elettroni (intensificatore elettroattivo) può essere una qualsiasi sostanza elettroattiva in grado di fungere da mediatore di elettroni fra ossidante e luminolo. In particolare possono essere utilizzati intensificatoli appartenenti alle seguenti classi di composti: benzotiazoli, fenoli, ammine aromatiche, fenotiazine N-alchilate, indofenoli, acidi arilboronici. I mediatori di elettroni preferiti sono: il p-iodofenolo, l’acido p-iodofenilboronico, i sali dell'acido del 3-(fenotiazin-10-il)propan-1 -solfonico o dell’acido 4 -(fenotiazin-10-il)butan-1 -solfonico. Anche i mediatori di elettroni devono essere di purezza adeguata e comunque appropriata per l'utilizzo in saggi luminescenti. In particolare non devono assolutamente contenere impurezze in grado di inibire la reazione chemiluminescente. La concentrazione di mediatore di elettroni utilizzato nei saggi chemiluminescenti della perossidasi è compresa tra 0,001 e 20 mmoli/litro, preferibilmente tra 0,1 e 10 mmoli/litro.
Le reazioni chemiluminescenti della presente invenzione sono applicabili alla rivelazione e alla quantificazione di analiti, utilizzando ad esempio la formazione di un legame di una proteina o un acido nucleico con una membrana e la perossidasi come tracciante. La reazione luminescente è iniziata aggiungendo alla membrana un substrato comprendente il luminolo, una sorgente di perossido, un mediatore di elettroni ed un catalizzatore di acilazione nucleolo. L’emissione di luce è prolungata e può essere misurata tramite film, fotocamera CDD o altra strumentazione. I saggi chemiluminescenti basati sulle soluzioni substrato della presente invenzione includono i Dot Blot e i Western Blot per le proteine e i Southern Blot e i Northern Blot per gli acidi nucleici.
Un altra importante applicazione del substrato chemiluminescente della presente invenzione è nei saggi immunoenzimatici ELISA, specialmente per gli analiti presenti in quantità estremamente ridotta, quali i marcatori tumorali, gli ormoni tiroidei, le proteine virali (HIV, HCV).
ESEMPI
I seguenti esempi intendono illustrare specifici aspetti dell'invenzione, ma a titolo non limitativo.
ESEMPIO 1
Effetto della N-dimetilaminopiridina (DMAP) sull'emissione chemiluminescente catalizzata da perossidasi del sistema luminolo/ p-iododofenolo Tutte le misure riportate sono state effettuate con un fluorometro Eclipse (Varian), in modalità Bio/Chemiluminescenza (lunghezza d’onda di emissione: 425 nm; fenditura di emissione: 20 nm).
Si prepara il seguente substrato chemiluminescente, comprendente:
- 3 mM luminolo, sale sodico
- 2 mM p-iodofenolo (mediatore di elettroni)
- 4 mM sodio perborato
- 5 mM 4-dimetilaminopiridina (HNAC)
- Tampone Tris 0,15 M, pH 9,0
Si prepara inoltre un substrato di controllo, di composizione identica al precedente, ma privo di 4-dimetilaminopiridina (DMAP). Successivamente, ad una cuvetta di polimetilmetacrilato contenente 2 mL di soluzione substrato, si aggiungono 10 pL di una soluzione di 0,5 μg/mL di perossidasi del rafano (HRP-Type VIA). Si mescola la soluzione per alcuni secondi con un vortex e si inizia a misurare il segnale luminescente per un periodo di 10 min. I risultati ottenuti sono riportati in Figura 1. Come si può osservare, il substrato contenente il catalizzatore ipernucleofilo di acilazione DMAP produce un segnale significativamente più intenso rispetto al substrato di controllo, che ne è privo.
ESEMPIO 2
Effetto di catalizzatori di acilazione ipernucleofili sull’emissione chemiluminescente del luminolo
Tutte le misure riportate sono state effettuate con un fluorometro Eclipse (Varian), in modalità Bio/Chemiluminescenza (lunghezza d’onda di emissione: 425 nm; fenditura di emissione: 5 nm). Si preparano i seguenti substrati chemiluminescenti, comprendenti:
- 5 mM luminolo, sale sodico
- 3 mM sodio 3-(fenotiazin-10-il)propan-1-solfonato
- 4 mM sodio perborato (ossidante)
- Catalizzatore Ipernucleofilo di Acilazione (HNAC):
Substrato A, nessuno;
Substrato B, 3 mM 4-pirrolidinopiridina (PPY)
Substrato C, 3 mM 4-dimetilaminopiridina (DMAP)
Substrato D, 3 mM 4-morfoiinopiridina (MORP)
- Tampone Tris 0,15 M, pH 9,0
Si prepara poi una serie di cuvette di polimetilmetacrilato, ciascuna contenente 2 mL di ciascuna soluzione substrato. Successivamente si aggiungono a ciascuna cuvetta 10 pL di una soluzione di 0,5 pg/mL di perossidasi del rafano (HRP-Type VIA). Si mescola la soluzione per alcuni secondi on un vortex e si misura il segnale luminescente per un perìodo di 10 min. I risultati ottenuti sono riportati in Figura 2. Come si può osservare, nell’intevallo temporale considerato il segnale chemiluminescente generato dai substrati contententi HNAC (Substrati B, C, e D) è da 6 a 12 volte più intenso rispetto al substrato A, che invece ne è privo.
ESEMPIO 3
Dipendenza dal pH dell’effetto di HNAC (MQRP. DMAP. PPY) sull'emissione chemiluminescente del luminolo
Le misure sono state effettuate con un fluorometro Eclipse (Varian), in modalità Bio/Chemiluminescenza (lunghezza d'onda di emissione: 425 nm; fenditura di emissione: 5 nm; Filtro di Emissione: aperto; Voltaggio Fotomoltiplicatore: medio). Si preparano quattro soluzioni in Tampone Tris 0,15 M, pH 9,2 con le seguenti composizioni:
- 5,0 mM sodio luminolo
- 4,0 mM perborato di sodio
- 3,0 mM di 3-(fenotiazin-10-il)propan-1-solfonato di sodio
- 3,0 mM di HNAC (DMAP, MORP o PPY)
Si prepara poi una serie di cuvette di polimetilmetacrilato, ciascuna contente 2 mL della soluzione substrato. A ogni cuvetta si aggiungono piccoli volumi di HCI 5 M o NaOH 5 M, in modo da aggiustare il pH nell'intervallo 8,0-10,0 e senza in nessun caso produrre variazioni significative nel volume totale. Successivamente si aggiungono a ciascuna cuvetta 10 pL di una soluzione di 2 pg/mL di perossidasi del rafano (HRP-Type VIA). Si mescola la soluzione per alcuni secondi con un vortex e si inizia a misurare il segnale luminescente. Per ogni reazione si registra l'integrale della luce prodotta nei primi 600 secondi. Dai risultati ottenuti, che sono riportati in Figura 3, si evince che in tutti i casi il segnale chemiluminescente raggiunge il valore massimo tra pH 8.9 e pH 9,4. In assenza di HNAC l'optimum di segnale si ottiene invece nell’ intervallo di pH compreso tra 8,4 e 8,6. Questa differenza di comportamento può essere attribuita alla maggior concentrazione di forma non protonata di HNAC (la specie ipemucleofila) presente nel substrato a valori di pH più elevati (La pK di MORP, DMAP e PPY sono rispettivamente 8,8, 9,7 e 9,9).
ESEMPIO 4
Substrato per la misura della perossidasi tramite chemiluminescenza Una Soluzione di Lavoro (Substrato per Chemiluminescenza) per la misura della Perossidasi può essere ottenuta mescolando in parti uguali le seguenti soluzioni:
Soluzione A:
- 10 mM Luminolo, sale sodico
- 6 mM Sodio 3-(fenotiazin-10-il)propan-1- solfonato
- 3 mM di HNAC (catalizzatore di acilazione ipernucleofilo)
- Tampone Tris circa 0,3 M, pH 9, 2-9, 8 (vedi nota)
Soluzione B:
- 8 mM Sodio Perborato
- Tampone Acetato 50 mM, pH 5,0
Pertanto la Soluzione di Lavoro (Substrato per Chemiluminescenza) contiene:
- 5,0 mM luminolo, sale sodico
3,0 mM di sodio 3-(fenotiazin-10-il)propano solfonato 3.0 mM di HNAC (catalizzatore di acilazione ipernucleofilo)
4.0 mM di sodio perborato
N.B. il pH del Tampone Tris 0,3 M della della soluzione A può essere aggiustato in modo tale che il pH della Soluzione di Lavoro risulti compreso fra 8,6 e 9,4.
ESEMPIO 5
Limite di Rivelabilità per la Perossidasi del Rafano Su un foglio di membrana di nitrocelllosa comunemente usata per il Western Blot, tagliato a misura di circa 2,5 x 5,0 cm sono stati creati degli spot con 2 pL di soluzioni a diversa concentrazione di Perossidasi del Rafano (HRP Type Vl-A) in Tampone Tris 0,1 M pH 7,4 contente BSA (albumina di siero bovina). Ciascuno spot è stato ripetuto in quadruplicato. In questo modo è stato creata sulla membrana una matrice di 3 x 7 spot. La membrana è stata lasciata asciugare all’aria e poi lavata due volte in tampone Tris 0,1 M pH 7,4. Una volta asciutta, la membrana è stata adagiata su un vetrino da microscopio e inserita in uno strumento per imaging NightOwl (Berthold Technologies). È stata poi preparata la Soluzione di Lavoro mescolando:
- 500 pL di soluzione A preparata come da Esempio 4 e utilizzando la 4-morfolinopiridina (MORP) come HNAC (catalizzatore ipernucleofilo di acilazione).
500 pL di soluzione B preparata come da Esempio 4
con cui è stata cosparsa la membrana. Dopo 5 minuti, il segnale è stato integrato per 300 secondi. Sono state effettuate letture di 10 secondi ogni 5 minuti per mezz’ora. I dati ottenuti sono riportati nella seguente Tabella:
N. Riga Perossidasi del Rafano Intensità del Segnale
( pg ) (media 3 spot)
1 19 3236
2 16 2804
3 12 2377
4 9 1309
5 6 718
6 3 350
7 0 198
Riportando i dati in un grafico, Figura 4, si ricava un limite di rivelabilità (LOD) per la Perossidasi del Rafano (HRP, Massa Molecolare = 44 000 dalton) di 1.8 pg (41 attomoli). D’altra parte, utilizzando un substrato chemiluminescente preparato come nell'Esempio 4, ma privo di HNAC si ottiene un LOD di 10 pg (230 attomoli). Analogamente, dalla curva doserisposta della Perossidasi del Rafano (L.J. Kricka, M. Cooper e Xiaoying Ji , “Synthesis and Characterization of 4-lodofenilboronic Acid: A New Enhancer for thè Horseradish Peroxidase-Catalyzed Chemiluminescent Oxidation of Luminol”, Anal. Biochem. 1996; 240:119-125) relativa ad un substrato chemiluminescente luminolo-perossido intensificato con acido piodofenilboronico ma privo di HNAC si ottiene un LOD di 509 attomoli. Pertanto il substrato chemiluminescente preparato come descritto nell’Esempio 4 e contenente HNAC, permette la determinazione della Perossidasi del Rafano con una sensibilità almeno 6 -12 volte maggiore rispetto ai corrispondenti substrati contenenti un mediatore di elettroni, ma privi di HNAC.
ESEMPIO 6
Saggio Western Blot sul Usato di Yersinia Enterocolitis
Il metodo di blotting utilizzato è quello descritto da H. Towbin e al. Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 4350-4353 (1979). Si sono separate per elettroforesi su gel di poliacrilamide al 12% di sodio dodecilsolfato (SDS) varie concentrazioni del lisato da Yersinia Enterocolitis. Il gel è stato poi trasferito su membrana di nitrocellulosa per Western Blot. I siti di legame non specifico sono stati bloccati con una soluzione al 5% di latte in polvere per 1 ora e poi lavati più volte con un tampone di lavaggio (20 mM Tris, 137 mM NaCI). I blot sono stati poi incubati con l'anticorpo primario (rabbit anti-YeEnt, diluizione 1:10 000) per un ora, poi lavati come sopra per rimuovere l’anticorpo non legato all’antigene. La membrana con il blot è stata incubata per 1 ora con l’anticorpo secondario marcato con HRP (goat anti-mouse HRP, Sigma A-6154, diluizione 1:3000), con successivo ulteriore lavaggio. La membrana è stata tagliata in due parti. Sono state preparate due soluzioni di lavoro secondo l' Esempio 4, con HNAC (4-morfolinopiridina) o privo di HNAC. Le soluzioni di lavoro sono state aggiunte alle membrane e lasciate in incubazione per cinque minuti. Il segnale chemiluminescente è stato acquisito con uno strumento per imaging NightOwl (Berthold Technologies) per 1 minuto. Figura 5 illustra l'intensità di segnale ottenuta utilizzando le due soluzioni. E’ evidente che la soluzione substrato contenente HNAC della presente invenzione mostra una luminosità e una sensibilità considerevolmente superiore alla soluzione priva di HNAC.
ESEMPIO 7
Saggio ELISA dell'α-fetoproteina (AFP)
Il saggio immunometrico è basato sulla reazione immunochimica tra anticopo di cattura, antigene (α-fetoproteina, AFP) e anticorpo marcato con HRP. Si preparano dei pozzetti con l'anticorpo di cattura incubando delle piastre per microtitolazione rivestite di streptavidina con una soluzione di anticorpo di cattura biotinilato. I pozzetti vengono poi lasciati incubare con i calibratori di fetoproteina (AFP) di un kit commerciale. A ciascun pozzetto si aggiungono 25 μL di ciascun calibratore AFP. Dopo un periodo di incubazione di un’ora, si lava la piastra con PBS-0.05% Tween®-20. Si aggiungono poi a ciascun pozzetto 200 μΙ_ di soluzione di anticorpo anti-AFP coniugato con HRP. I pozzetti sono incubati a temperatura ambiente per 1 ora, e successivamente lavati per allontanare l'eccesso di coniugato. Si preparano due soluzioni di lavoro secondo Γ Esempio 4, con HNAC (4-dimetilaminopiridina) o privo di HNAC. Si aggiungono le soluzioni di lavoro ai pozzetti e si lasciano in incubazione per dieci minuti. Il segnale chemiluminescente è stato acquisito con uno lettore di piastre Luminoskan Ascent (LabSystems) per 1 minuto. Figura 6 mostra la curva dose risposta dell'AFP per le due soluzioni di lavoro. Anche in questo caso è evidente che la soluzione contenente HNAC della presente invenzione mostra un segnale e conseguentemente una sensibilità nettamente superiore alla soluzione priva di HNAC.
Claims (20)
- RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per aumentare l’emissione luminosa prodotta dalla reazione chemiluminescente del luminolo, un enzima perossidasi, un ossidante e un mediatore di elettroni caratterizzato dal fatto di effettuare la suddetta reazione chemiluminescente in presenza di un catalizzatore di acilazione ipernucleofilo (HNAC).
- 2. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il suddetto catalizzatore di acilazione ipernucleofilo (HNAC) è selezionato dal gruppo che consiste dei composti rappresentati dalla Formula (I). Formula (I) dove: R1e R2rappresentano, entrambi o ciascuno separatamente, idrogeno, metile, etile, propile, isopropile o butile, oppure R1e R2assieme rappresentano -(CH2)4-, formando così un anello pirrolidinico con l’atomo di azoto, oppure R1e R2assieme rappresentano -(CH2)5-, formando così un anello piperidinico con l’atomo di azoto, oppure R1e R2assieme rappresentano -(CH2)2-CHCH3-(CH2)2-, formando cosi un anello 4-metilpiperidinico con l’atomo di azoto, oppure R1e R2assieme rappresentano -(CH2)2-O-(CH2)2- , formando così un anello morfolinico con l’atomo di azoto, oppure R1e R2assieme rappresentano -(CHCH3)-CH=CH-(CHCH3)-, formando così un anello 2,5-dimetil-2,5-diidro-1H-pirrolico con l'atomo di azoto.
- 3. Un metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che il catalizzatore di acilazione ipernucleofilo è selezionato dal gruppo che consiste di composti rappresentati dalla Formula (II). Formula (II) dove: X rappresenta idrogeno, metile, etile, propile, isopropile oppure butile, mentre R1e R2rappresentano, entrambi o ciascuno separatamente, idrogeno, metile, etile, propile, isopropile o butile, oppure X rappresenta NH2, oppure N(metile)2, oppure N(etile)2, oppure N(propile)2, oppure N(isopropile)2, oppure N(butile)2, mentre R1e R2rappresentano, entrambi o ciascuno separatamente, idrogeno, metile, etile, propile, isopropile, o butile.
- 4. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il catalizzatore di acilazione ipemucleofilo (HNAC) è la 4-dietilaminopiridina, la 4-dimetilaminopiridina (DMAP), la 4-pirrolidinopiridina (PPY), la 4-piperidinopiridina, la 4-(4-metilpiperidin-1-il)piridina (MPP), la 4-morfolinopiridina (MORP), la 4-(2,5-dimetil-2,5-diidro-1 H-pirrol-1 -il)piridine, la N ,N -dimetil-N'-piridin-4-ilimidoformamide e la N ,N,N',N' -tetrametil-N"-piridin-4-il-guanidina.
- 5. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l’enzima perossidasi è libero o coniugato ad un legando e che la presenza o la quantità di perossidasi è determinata dalla presenza o dalla quantità di emissione luminosa.
- 6. Un metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che la perossidasi è la perossidasi del rafano.
- 7. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'ossidante è il sodio perborato.
- 8. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto il mediatore di elettroni è il p-iodofenolo.
- 9. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il mediatore di elettroni è il sale sodico del 3-(fenotiazin-10-il)propan-1-solfonato.
- 10. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la reazione chemiluminescente è effettuata ad un pH compreso nell'intervallo fra 8.0 e 10.
- 11. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'enzima perossidasi è coniugato ad un legando e che la presenza o la quantità di perossidasi è determinata dalla presenza o dalla quantità di emissione di luce, la perossidasi è la perossidasi del afano, l’ossidante è una sorgente di perossido, il mediatore di elettroni è il p-iodofenolo e la reazione chemiluminescente è effettuata ad un pH compreso nell'intervallo fra 8.0 e 10.
- 12. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l’enzima perossidasi è coniugato ad un legando e che la presenza o la quantità di perossidasi è determinata dalla presenza o dalla quantità di emissione di luce, la perossidasi è la perossidasi del rafano, l’ossidante è una sorgente di perossido, il mediatore di elettroni è il sale sodico del 3-(fenotiazin-10-il)propan-1-solfonato e la reazione chemiluminescente è effettuata ad un pH compreso nell'intervallo fra 8.0 e 10.
- 13. Un metodo per un saggio diagnostico di una sostanza, caratterizzato dal fatto che la presenza o la quantità di detta sostanza è correlata alla presenza o alla quantità di un partner di reazione selezionato dal gruppo consistente in luminolo, un enzima perossidasi, un ossidante, un mediatore di elettroni, e un catalizzatore di acilazione ipemucleofilo (HNAC) che coreagiscono in una reazione chemiluminescente, l'emissione di luce è rivelata o misurata e la presenza o la quantità di sostanza da saggiare è correlata all'emissione di luce.
- 14. Un metodo per un saggio diagnostico di una sostanza secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che il catalizzatore di acilazione ipernucleofilo (HNAC) è un composto selezionato dal gruppo di composti rappresentati dalla formula (I): Formula (I) dove: R1e R2rappresentano, entrambi o ciascuno separatamente, idrogeno, metile, etile, propile, isopropile o butile, oppure R1e R2assieme rappresentano -(CH2)4-, formando cosi un anello pirrolidinico con l’atomo di azoto, oppure R1e R2assieme rappresentano -(CH2)5-, formando cosi un anello piperidinico con l’atomo di azoto, oppure R1e R2assieme rappresentano -(CH2)2-CHCH3-(CH2)2-, formando così un anello 4-metilpiperidinico con l’atomo di azoto, oppure R1e R2assieme rappresentano -(CH2)2-O-(CH2)2- , formando cosi un anello morfolinico con l’atomo di azoto, oppure R1e R2assieme rappresentano -(CHCH3)-CH=CH-(CHCH3)-, formando così un anello 2,5-dimetil-2,5-diidro-1 H-pirrolico con l’atomo di azoto.
- 15. Un metodo per un saggio diagnostico di una sostanza secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che il catalizzatore di acilazione ipernucleofilo (HNAC) è un composto selezionato dal gruppo di composti rappresentati dalla formula (II): Formula (II) dove: X rappresenta idrogeno, metile, etile, propiie, isopropile oppure butìle, mentre R1e R2rappresentano, entrambi o ciascuno separatamente, idrogeno, metile, etile, propile, isopropiie o butile, oppure X rappresenta NH2, oppure N(metile)2, oppure N(etile)2, oppure N(propile)2, oppure N(isopropile)2, oppure N(butile)2, mentre R1e R2rappresentano, entrambi o ciascuno separatamente, idrogeno, metile, etile, propile, isopropiie, o butile.
- 16. Un metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che la sostanza da analizzare è la perossidasi del rafano coniugata ad un legando, l’ossidante è il perborato di sodio e il mediatore di elettroni è il sale sodico del 3-(fenotiazin-10-il)propan-1-solfonato.
- 17. Un metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che il catalizzatore di acilazione ipemucleofilo (HNAC) è la 4-dietilaminopiridina, la 4-dimetilaminopiridina (DMAP), la 4-pirrolidinopiridina (PPY), la 4-piperidinopiridina, la 4-(4-metilpiperidin-1-il)piridina (MPP), la 4-morfolinopiridina (MORP), la 4-(2,5-dimetil-2,5-diidro-1 H- pirrol-1-il)piridine, la N,N-dimetil-N'-piridin-4-ilimidoformamide e la N,N ,N',N' -tetrametil-N" -piridin-4-ilguanidina.
- 18. Un metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che il catalizzatore di acilazione ipemucleofilo (HNAC) è la 4-dietilaminopiridina, la 4-dimetilaminopiridina (DMAP), la 4-pirrolidinopiridina (PPY), la 4-piperidinopiridina, la 4-(4-metilpiperidin-1-il)piridina (MPP), la 4-morfolinopiridina (MORP), la 4-(2,5-dimetil-2,5-diidro-1 H-pirrol-1 -il)piridine, la N,N -dimetil-N' -piridin-4-ilimidoformamide e la N, N,N',N' -tetrametil-N" -piridin-4- -guanidina.
- 19. Un metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che la sostanza da analizzare è la perossidasi del rafano coniugata ad un legando, l’ossidante è il perborato di sodio, il mediatore di elettroni è il p-iodofenolo e il catalizzatore di acilazione ipemucleofilo è la 4-dietilaminopiridina, la 4-dimetilaminopiridina (DMAP), la 4-pirrolidinopiridina (PPY), la 4-piperidinopiridina, la 4-(4-metilpiperidin-1 il)piridina (MPP), la 4-morfolinopiridina (MORP), la 4-(2,5-dimetil-2,5-diidro-1 H- pirrol-1 -il)piridine, la N,N- dimetil-N'-piridin-4-ilimidoformamide e la N,N,N',N'-tetrametil-N" -piridin -il-guanidina.
- 20. Un metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che la sostanza da analizzare è la perossidasi del rafano coniugata ad un legando, l’ossidante è il perborato di sodio, il mediatore di elettroni è il sale sodico del 3-(fenotiazin-10-il)propan-1-solfonato e il catalizzatore di acilazione ipernucleofilo è selezionato tra i seguenti composti: 4-dietilaminopiridina, 4-dimetilaminopiridina (DMAP), 4-pirrolidinopiridina (PPY), 4-piperidinopiridina, 4-(4-metilpiperidin-1-il)piridina (MPP), 4-morfolinopiridina (MORP), 4-(2,5-dimetil-2,5-diidro-1H-pirrol-1-il)piridine, N,N/-dimetil-N'-pi -4-ilimidoformamide e N,N ,N' ,N’ -tetrametil-N "-piridin-4-il-guanidina.
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