JPH03280898A - 核酸の定量法 - Google Patents
核酸の定量法Info
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- JPH03280898A JPH03280898A JP8098690A JP8098690A JPH03280898A JP H03280898 A JPH03280898 A JP H03280898A JP 8098690 A JP8098690 A JP 8098690A JP 8098690 A JP8098690 A JP 8098690A JP H03280898 A JPH03280898 A JP H03280898A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、臨床検査におけるＤＮＡプローブ分析におい
て、鉄含有生体分子であるミクロペルオキシグーゼで核
酸を標識し、該標識物質を触媒にして、過酸化水素とル
ミノールとを化学発光反応させ、発光量を測定すること
により、核酸の微量定量を行うものである。
て、鉄含有生体分子であるミクロペルオキシグーゼで核
酸を標識し、該標識物質を触媒にして、過酸化水素とル
ミノールとを化学発光反応させ、発光量を測定すること
により、核酸の微量定量を行うものである。
（従来の技術）
ルミノールを、アルカリ性水溶液中で過酸化水素と反応
させて発光させる際に、触媒として鉄含有主体分子を添
加すると発売強度が菩＋、＜増ナオることか知られてい
る。近年、このルミノール化学発光反応系は、ＤＮＡプ
ローブを用いた核酸の測定法等に利用され、高感度な測
定法として注目されている。
させて発光させる際に、触媒として鉄含有主体分子を添
加すると発売強度が菩＋、＜増ナオることか知られてい
る。近年、このルミノール化学発光反応系は、ＤＮＡプ
ローブを用いた核酸の測定法等に利用され、高感度な測
定法として注目されている。
化学発光反応においては、その反応にあずかる構成要素
として、（１）化学発光物質、（２）過酸化水素等の酸
化剤及び（３）触媒が必要である。従って化学発光反応
を生体分子の微量定量法に応用する場合、この３種のい
ずれかを最終検出シグナルとして用いることになる。化
学発光物質を最終検出シグナルとして用いる場合は、例
えばルミノールの誘導体である６−Ｎ−（４−アミノブ
チル）−エチル−２，３−ジヒドロ−１，４−フタルヒ
ドラジンジオン（ＡＢＥＩ）を１７−α−メチルテスト
ステロンや、１９−ノルテストステロン等に結合させ標
識化合物となし、イムノアッセイに用いられている。ま
た過酸化水素を最終検出シグナルとして用いる場合は、
過酸化水素を生じるような酵素反応、例えばグルコース
オキシダーゼ反応で生じた過酸化水素量を、ルミノール
と触媒との存在下で化学発光反応を行わせることにより
測定している。触媒を最終検出シグナルとして用いる場
合は、触媒を抗体や核酸に結合させて標識とし、これを
用いてイムノアッセイや、核酸ハイブリグイゼーション
アッセイが行われている。これらの測定法においては、
金属酵素であるペルオキシダーゼや鉄錯体であるヘミン
のような鉄含有生体分子が触媒として用いられている６ （発明が解決しようとする課題） 上記ルミノール化学発光分析において、鉄含有生体分子
を触媒とし、これを標識化して生体成分の定量に応用し
ようとするとき、より高感度にかつ、短時間に測定でき
ることが望ましい。現在最も好んで用いられているペル
オキシダーゼは、増感剤として、更にｐ−ヨードフェノ
ールの添加を必要とすること、発光時間が長く、かつ最
大の化学発光強度を与える反応時間が、ペルオキシダー
ゼの濃度によって変化するという重大な問題点を有して
いる。
として、（１）化学発光物質、（２）過酸化水素等の酸
化剤及び（３）触媒が必要である。従って化学発光反応
を生体分子の微量定量法に応用する場合、この３種のい
ずれかを最終検出シグナルとして用いることになる。化
学発光物質を最終検出シグナルとして用いる場合は、例
えばルミノールの誘導体である６−Ｎ−（４−アミノブ
チル）−エチル−２，３−ジヒドロ−１，４−フタルヒ
ドラジンジオン（ＡＢＥＩ）を１７−α−メチルテスト
ステロンや、１９−ノルテストステロン等に結合させ標
識化合物となし、イムノアッセイに用いられている。ま
た過酸化水素を最終検出シグナルとして用いる場合は、
過酸化水素を生じるような酵素反応、例えばグルコース
オキシダーゼ反応で生じた過酸化水素量を、ルミノール
と触媒との存在下で化学発光反応を行わせることにより
測定している。触媒を最終検出シグナルとして用いる場
合は、触媒を抗体や核酸に結合させて標識とし、これを
用いてイムノアッセイや、核酸ハイブリグイゼーション
アッセイが行われている。これらの測定法においては、
金属酵素であるペルオキシダーゼや鉄錯体であるヘミン
のような鉄含有生体分子が触媒として用いられている６ （発明が解決しようとする課題） 上記ルミノール化学発光分析において、鉄含有生体分子
を触媒とし、これを標識化して生体成分の定量に応用し
ようとするとき、より高感度にかつ、短時間に測定でき
ることが望ましい。現在最も好んで用いられているペル
オキシダーゼは、増感剤として、更にｐ−ヨードフェノ
ールの添加を必要とすること、発光時間が長く、かつ最
大の化学発光強度を与える反応時間が、ペルオキシダー
ゼの濃度によって変化するという重大な問題点を有して
いる。
この発明は、上記のような問題点を解決するためになさ
れたもので、上記ルミノールによる化学発光分析におい
て、鉄含有生体分子として、ミクロペルオキシダーゼを
核酸の標識に用い、増感剤を用いることなく、１分以内
に化学発光反応を終了せしめる分析法を提供するもので
ある。
れたもので、上記ルミノールによる化学発光分析におい
て、鉄含有生体分子として、ミクロペルオキシダーゼを
核酸の標識に用い、増感剤を用いることなく、１分以内
に化学発光反応を終了せしめる分析法を提供するもので
ある。
（課題を解決するための手段）
本発明は、ミクロペルオキシダーゼで核酸を標識し、該
標識物質を触媒として、過酸化水素とルミノールとを化
学発光反応させ、該発光量を測定することを特徴とする
核酸の定量法である。
標識物質を触媒として、過酸化水素とルミノールとを化
学発光反応させ、該発光量を測定することを特徴とする
核酸の定量法である。
本発明の化学発光量測定反応液系に用いるルミノール（
化学名＝５−アミノー２．３−ジヒドロフタラジオンー
１．４−ジオン）の濃度は、１．０Ｘ１０−’Ｍ〜１．
０Ｘ１０−”Ｍの範囲内が適当である。酸化剤として用
いる過酸化水素の濃度は１．０Ｘ１０−’Ｍ〜０．１Ｍ
の範囲内が適当である。緩衝液は、中性からアルカリ性
領域のものであれば特に限定はされないが、０．１Ｍホ
ウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８〜ｐＨ１ｏ）、
０、ＩＭ Ｆリス／塩酸緩衝液（ｐＨ７〜ｐＨ９）、０
．１Ｍ炭酸水素ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液（
ｐ）＋９．５〜ｐｉ（１１）を使用するのが特に好まし
い。
化学名＝５−アミノー２．３−ジヒドロフタラジオンー
１．４−ジオン）の濃度は、１．０Ｘ１０−’Ｍ〜１．
０Ｘ１０−”Ｍの範囲内が適当である。酸化剤として用
いる過酸化水素の濃度は１．０Ｘ１０−’Ｍ〜０．１Ｍ
の範囲内が適当である。緩衝液は、中性からアルカリ性
領域のものであれば特に限定はされないが、０．１Ｍホ
ウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８〜ｐＨ１ｏ）、
０、ＩＭ Ｆリス／塩酸緩衝液（ｐＨ７〜ｐＨ９）、０
．１Ｍ炭酸水素ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液（
ｐ）＋９．５〜ｐｉ（１１）を使用するのが特に好まし
い。
反応液系に用いる各成分の最も好ましい組成及び濃度は
、ルミノール５、ｌＸｌ０−’Ｍ、過酸化水素２．０Ｘ
ＩＯ−”Ｍ、Ｏ，ＬＭホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９，４）である。
、ルミノール５、ｌＸｌ０−’Ｍ、過酸化水素２．０Ｘ
ＩＯ−”Ｍ、Ｏ，ＬＭホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９，４）である。
次に核酸（以下ｒＤＮＡＪと称する）の定量法について
詳述する。
詳述する。
まず、目的とする２本鎖ＤＮＡを熱変性により１本鎖Ｄ
ＮＡとし、これにミクロペルオキシダーゼを標識してＤ
ＮＡプローブを作成する。１本鎖ＤＮＡへのミクロペル
オキシダーゼの標識は、それ自体既知の通常用いられる
方法により、グルタルアルデヒドを用いて、アルドール
縮合によりミクロペルオキシダーゼと１本鎖ＤＮＡを結
合させることができる。１本鎖ＤＮＡへのミクロペルオ
キシダーゼの結合量は、特に厳密に限定されないが、１
５０〜２００ｉ薫甚当りミクロペルオキシダーゼ１分子
が好ましい。それ以上になると、結合したミクロペルオ
キシダーゼがハイブリダイゼーションの妨げとなり、Ｄ
ＮＡ測定上好ましくない。
ＮＡとし、これにミクロペルオキシダーゼを標識してＤ
ＮＡプローブを作成する。１本鎖ＤＮＡへのミクロペル
オキシダーゼの標識は、それ自体既知の通常用いられる
方法により、グルタルアルデヒドを用いて、アルドール
縮合によりミクロペルオキシダーゼと１本鎖ＤＮＡを結
合させることができる。１本鎖ＤＮＡへのミクロペルオ
キシダーゼの結合量は、特に厳密に限定されないが、１
５０〜２００ｉ薫甚当りミクロペルオキシダーゼ１分子
が好ましい。それ以上になると、結合したミクロペルオ
キシダーゼがハイブリダイゼーションの妨げとなり、Ｄ
ＮＡ測定上好ましくない。
次に、被検ＤＮＡを熱変性させて１本鎖ＤＮＡとし、こ
のＤＮＡを含む溶液をニトロセルロース膜上にスポット
して、加熱処理により、被検１本鎖Ｄ Ｎ Ａをニトロ
セルロース膜上に結合させる。
のＤＮＡを含む溶液をニトロセルロース膜上にスポット
して、加熱処理により、被検１本鎖Ｄ Ｎ Ａをニトロ
セルロース膜上に結合させる。
次に上記したミクロペルオキシダーゼ標識ＤＮＡプロー
ブ溶液をスポット部分に重層し、ハイプリダーゼ−ジョ
ンを行う。ニトロセルロース膜を洗浄し、過剰に存在す
るＤＮＡプローブ等を除去した後、ニトロセルロース膜
を細断し、前記した反応液系に浸すことにより、ＤＮＡ
プローブに結合したミクロペルオキシダーゼが、ルミノ
ールと過酸化水素の化学発光反応の触媒となって光が放
圧される。この発光量は、ミクロペルオキシダーゼの濃
度によって変化し、またミクロペルオキシダーゼの量は
フィルター上のＤＮＡ量によって変化するので、発光量
を測定することにより、フィルター上のＤＮＡ濃度を定
量することができる。
ブ溶液をスポット部分に重層し、ハイプリダーゼ−ジョ
ンを行う。ニトロセルロース膜を洗浄し、過剰に存在す
るＤＮＡプローブ等を除去した後、ニトロセルロース膜
を細断し、前記した反応液系に浸すことにより、ＤＮＡ
プローブに結合したミクロペルオキシダーゼが、ルミノ
ールと過酸化水素の化学発光反応の触媒となって光が放
圧される。この発光量は、ミクロペルオキシダーゼの濃
度によって変化し、またミクロペルオキシダーゼの量は
フィルター上のＤＮＡ量によって変化するので、発光量
を測定することにより、フィルター上のＤＮＡ濃度を定
量することができる。
ＤＮＡの標識にミクロペルオキシダーゼを用いた場合に
、後記実施例において具体的に示す通り、高感度かつ発
光反応が早く、測定時間１分以内で十分微量ＤＮＡの測
定が可能である。ＤＮＡの定量範囲は、ＤＮＡプローブ
に標識されるミクロペルオキシダーゼの量にもよるが、
０、ｌｐｇ〜１１００ｐ位の核酸の定量は可能である。
、後記実施例において具体的に示す通り、高感度かつ発
光反応が早く、測定時間１分以内で十分微量ＤＮＡの測
定が可能である。ＤＮＡの定量範囲は、ＤＮＡプローブ
に標識されるミクロペルオキシダーゼの量にもよるが、
０、ｌｐｇ〜１１００ｐ位の核酸の定量は可能である。
なお、発光量は市販の蛍光光度計ＲＡＴＩＯ−１１（フ
ァーランド社製）等を用いて測定することができる。
ァーランド社製）等を用いて測定することができる。
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。し
かしながら、下記の実施例は本発明について具体的な認
識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによっ
て本発明の範囲は何ら限定されるものではない。
かしながら、下記の実施例は本発明について具体的な認
識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによっ
て本発明の範囲は何ら限定されるものではない。
なお、以下の実施例および比較例において、化学発光量
は蛍光光度計ＲＡＴＩＯ−ＩＩ（ファーランド社製）で
測定した。
は蛍光光度計ＲＡＴＩＯ−ＩＩ（ファーランド社製）で
測定した。
実施例１
０．１Ｍホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ９，
４）を用いて、５．ｌＸ１０−’Ｍルミノール及び２．
０Ｘ１０−”Ｍ過酸化水素を含む溶液を調製した。また
、１．１Ｘ１０−’Ｍか６１、ｌＸ１０−”Ｍのミクロ
ペルオキシダーゼ水溶液を調製した。
４）を用いて、５．ｌＸ１０−’Ｍルミノール及び２．
０Ｘ１０−”Ｍ過酸化水素を含む溶液を調製した。また
、１．１Ｘ１０−’Ｍか６１、ｌＸ１０−”Ｍのミクロ
ペルオキシダーゼ水溶液を調製した。
ガラスセルに、上記で調製したミクロペルオキシダーゼ
水溶液５０ｄおよびルミノールと過酸化水素を含む溶液
ＩＷＩＩ！を加えて、化学発光強度を測定した。
水溶液５０ｄおよびルミノールと過酸化水素を含む溶液
ＩＷＩＩ！を加えて、化学発光強度を測定した。
実施例２
０．１Ｍホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ９，
４）を用いて、５．ｌＸ１０−’Ｍルミノール及び２．
ＯＸｌｏ−２Ｍ過酸化水素を含む溶液を調製した。また
、１．０ＸＩＯ−”Ｍから１、ｌＸｌ０−’Ｍのミクロ
ペルオキシダーゼ水溶液を調製した。
４）を用いて、５．ｌＸ１０−’Ｍルミノール及び２．
ＯＸｌｏ−２Ｍ過酸化水素を含む溶液を調製した。また
、１．０ＸＩＯ−”Ｍから１、ｌＸｌ０−’Ｍのミクロ
ペルオキシダーゼ水溶液を調製した。
ガラスセルに、上記で調製したミクロペルオキシダーゼ
水溶液５０ｇおよびルミノールと過酸化水素を含む溶液
１−を加えて、化学発光強度を測定した。
水溶液５０ｇおよびルミノールと過酸化水素を含む溶液
１−を加えて、化学発光強度を測定した。
実施例３
熱変性して得た１本鎖ラムダＤＮＡ溶液（５ｐｇ／ＩＬ
ｌ）の２４をニトロセルロース膜上にスポットし、ニト
ロセルロース膜を、８０℃で２時間処理し、ミクロペル
オキシダーゼで標識した上記１本鎖ラムダＤＮＡ溶液４
６４をスポット部分に重層し、３７℃で１時間ハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、
ニトロセルロース膜を、５０％ホルムアミド、０．４％
ドデシル硫酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７，０の溶液で２
回洗浄し、洗浄後ニトロセルロース膜を５ｍｍ角に細断
した。この細断したニトロセルロース膜をガラスセルに
セットし、１−の５．ｌＸ１０１４Ｍのルミノールと２
．０ｘｌＯ−”Ｍの過酸化水素を含むホウ酸／水酸化ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ９，４）を加え、化学発光強度を
測定した。
ｌ）の２４をニトロセルロース膜上にスポットし、ニト
ロセルロース膜を、８０℃で２時間処理し、ミクロペル
オキシダーゼで標識した上記１本鎖ラムダＤＮＡ溶液４
６４をスポット部分に重層し、３７℃で１時間ハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、
ニトロセルロース膜を、５０％ホルムアミド、０．４％
ドデシル硫酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７，０の溶液で２
回洗浄し、洗浄後ニトロセルロース膜を５ｍｍ角に細断
した。この細断したニトロセルロース膜をガラスセルに
セットし、１−の５．ｌＸ１０１４Ｍのルミノールと２
．０ｘｌＯ−”Ｍの過酸化水素を含むホウ酸／水酸化ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ９，４）を加え、化学発光強度を
測定した。
比較例１
０１Ｍトリス／塩酸緩衝溶液（ｐＨ８、５）を用いて、
２．０Ｘ１０−’Ｍルミノール、８．０×１０−’Ｍ過
酸化水素及び２．ＯＸ １０−’Ｍ ｐ−ヨードフェノ
ールを含む溶液を調製した。また、１．０Ｘ１０−”Ｍ
から５．ＯＸｌｏ−８Ｍのペルオキシダーゼ水溶液を調
製した。
２．０Ｘ１０−’Ｍルミノール、８．０×１０−’Ｍ過
酸化水素及び２．ＯＸ １０−’Ｍ ｐ−ヨードフェノ
ールを含む溶液を調製した。また、１．０Ｘ１０−”Ｍ
から５．ＯＸｌｏ−８Ｍのペルオキシダーゼ水溶液を調
製した。
ガラスセルに、上記で調製したペルオキシダーゼ水溶液
５０４並びにルミノール、過酸化水素及びｐ−ヨードフ
ェノールを含む溶液１−を加えて、化学発光強度を測定
した。
５０４並びにルミノール、過酸化水素及びｐ−ヨードフ
ェノールを含む溶液１−を加えて、化学発光強度を測定
した。
比−較例２
０．１Ｍ）リス／塩酸緩衝溶液（ｐＨ８，５）を用いて
、２．０Ｘ１０−’Ｍルミノール、８．０×１０−’Ｍ
過酸化水素及び２． ＯＸ １０−’Ｍ ｐ −ヨード
フェノールを含む溶液を調製した。また、５．０Ｘ１０
−’Ｍから１．０Ｘ１０−’Ｍのペルオキシダーゼ水溶
液を調製した。
、２．０Ｘ１０−’Ｍルミノール、８．０×１０−’Ｍ
過酸化水素及び２． ＯＸ １０−’Ｍ ｐ −ヨード
フェノールを含む溶液を調製した。また、５．０Ｘ１０
−’Ｍから１．０Ｘ１０−’Ｍのペルオキシダーゼ水溶
液を調製した。
ガラスセルに、上記で調製したペルオキシダーゼ水溶液
５０４並びにルミノール、過酸化水素及びｐ−ヨードフ
ェノールを含む溶液１１ｎＩを加えて、化学発光強度を
測定した。
５０４並びにルミノール、過酸化水素及びｐ−ヨードフ
ェノールを含む溶液１１ｎＩを加えて、化学発光強度を
測定した。
比較例３
ニトロセルロース上にＤＮＡをドツト−プロティングし
ない条件で、実施例３と同様な操作を行い、ブランクの
化学発光強度の測定を行った。
ない条件で、実施例３と同様な操作を行い、ブランクの
化学発光強度の測定を行った。
以下、上記実施例及び比較例について、ルミノール化学
発光反応に触媒としてミクロペルオキシダーゼを用いた
検討結果及びＤＮＡプローブの標識物質にミクロペルオ
キシダーゼを用いた場合の測定結果を示して、本発明の
詳細な説明する。
発光反応に触媒としてミクロペルオキシダーゼを用いた
検討結果及びＤＮＡプローブの標識物質にミクロペルオ
キシダーゼを用いた場合の測定結果を示して、本発明の
詳細な説明する。
（１）ミクロペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼの
測定 ルミノール化学発光反応により、ミクロペルオキシダー
ゼ及びペルオキシダーゼの測定を実施例１及び比較例１
について行い、化学発光応答曲線について比較実験を行
った。第１図に実施例１により得られた化学発光応答曲
線及び第２図に比較例１により得られた化学発光応答曲
線を示した。
測定 ルミノール化学発光反応により、ミクロペルオキシダー
ゼ及びペルオキシダーゼの測定を実施例１及び比較例１
について行い、化学発光応答曲線について比較実験を行
った。第１図に実施例１により得られた化学発光応答曲
線及び第２図に比較例１により得られた化学発光応答曲
線を示した。
いずれも横軸は反応時間、縦軸は化学発光強度である。
第１図から明らかなように、ミクロペルオキシダーゼを
触媒に用いた場合、ルミノール化学発光反応は１分以内
に終了し、ミクロペルオキシダーゼ濃度が変化しても最
大化学発光強度を与える反応時間は一定である。しかし
ながら、第２図から明らかなように、ペルオキシダーゼ
をルミノール化学発光反応の触媒に用いた場合、化学発
光反応時間は大幅に増加し、また、最大化学発光強度を
あたえる反応時間はペルオキシダーゼの濃度によって変
化した。
触媒に用いた場合、ルミノール化学発光反応は１分以内
に終了し、ミクロペルオキシダーゼ濃度が変化しても最
大化学発光強度を与える反応時間は一定である。しかし
ながら、第２図から明らかなように、ペルオキシダーゼ
をルミノール化学発光反応の触媒に用いた場合、化学発
光反応時間は大幅に増加し、また、最大化学発光強度を
あたえる反応時間はペルオキシダーゼの濃度によって変
化した。
（２）ミクロペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ
検量線 種々の濃度のミクロペルオキシダーゼ及びペルオキシダ
ーゼの測定を実施例２及び比較例２について行い、検量
線を作成し、検出感度について比較実験を行った。第３
図に実施例２及び比較例２から得られた検量線を示した
。第３図において、検量線Ａは実施例２、検量線Ｂは比
較例２の検量線である。横軸はミクロペルオキシダーゼ
及びペルオキシダーゼ濃度、縦軸は最大化学発光強度で
ある。
検量線 種々の濃度のミクロペルオキシダーゼ及びペルオキシダ
ーゼの測定を実施例２及び比較例２について行い、検量
線を作成し、検出感度について比較実験を行った。第３
図に実施例２及び比較例２から得られた検量線を示した
。第３図において、検量線Ａは実施例２、検量線Ｂは比
較例２の検量線である。横軸はミクロペルオキシダーゼ
及びペルオキシダーゼ濃度、縦軸は最大化学発光強度で
ある。
第３図から明らかなように、ミクロペルオキシダーゼの
定量下限濃度は１．０Ｘ１０−”Ｍであり、一方、ペル
オキシダーゼの定量下限濃度は５．０Ｘ１０””Ｍであ
る。したがって、ミクロペルオキシダーゼの定量下限濃
度はペルオキシダーゼの定量下１１ｆｆ＋１度の怪、す
なわちミクロペルオキシダーゼの検出感度はペルオキシ
ダーゼの検出感度と比較して２倍向上した。
定量下限濃度は１．０Ｘ１０−”Ｍであり、一方、ペル
オキシダーゼの定量下限濃度は５．０Ｘ１０””Ｍであ
る。したがって、ミクロペルオキシダーゼの定量下限濃
度はペルオキシダーゼの定量下１１ｆｆ＋１度の怪、す
なわちミクロペルオキシダーゼの検出感度はペルオキシ
ダーゼの検出感度と比較して２倍向上した。
以上の結論を要約すると、ＤＮＡの標識物質としてミク
ロペルオキシダーゼを用いてＤＮＡを測定した方が、ペ
ルオキシダーゼを標識物質に用い、かつ、増感剤として
ｐ−ヨードフェノールを使用してＤＮＡを測定した場合
より、より高感度な測定が可能となる。また、ペルオキ
シダーゼの場合、ペルオキシダーゼ濃度により、最大化
学発光強度を示す反応時間が異なることがら、自動♂１
ノ定には適さない。
ロペルオキシダーゼを用いてＤＮＡを測定した方が、ペ
ルオキシダーゼを標識物質に用い、かつ、増感剤として
ｐ−ヨードフェノールを使用してＤＮＡを測定した場合
より、より高感度な測定が可能となる。また、ペルオキ
シダーゼの場合、ペルオキシダーゼ濃度により、最大化
学発光強度を示す反応時間が異なることがら、自動♂１
ノ定には適さない。
（３）ＤＮＡの測定
ミクロペルオキシダーゼをＤＮＡに標識し、ドットード
ットハイブリゼイション法によりＤＮＡの測定を行った
。
ットハイブリゼイション法によりＤＮＡの測定を行った
。
第４図に実施例３及び比較例３から得られた化学発光応
答曲線を示した。化学発光曲線Ａは実施例３、化学発光
曲線Ｂは比較例３の化学発光応答曲線である。
答曲線を示した。化学発光曲線Ａは実施例３、化学発光
曲線Ｂは比較例３の化学発光応答曲線である。
第４図から明らかなように、ブランクの化学発光応答曲
線と比較して、ニトロセルロース上にＤＮＡ（１０ｐｇ
）が存在すると、化学発光曲線は変化し、反応開始直後
にミクロペルオキシダーゼが触媒として作用した際のル
ミノール化学発光が発現する。この化学発光強度を利用
することにより、ＤＮＡの測定ができる。
線と比較して、ニトロセルロース上にＤＮＡ（１０ｐｇ
）が存在すると、化学発光曲線は変化し、反応開始直後
にミクロペルオキシダーゼが触媒として作用した際のル
ミノール化学発光が発現する。この化学発光強度を利用
することにより、ＤＮＡの測定ができる。
第１図は、ミクロペルオキシダーゼの化学発光応答曲線
を示し、第２図は、ペルオキシダーゼの化学発光応答曲
線を示し、第３図は、ミクロペルオキシダーゼ及びペル
オキシダーゼの量と化学発光強度との関係を示し、第４
図は、ＤＮＡを標識したミクロペルオキシダーゼの化学
発光応答曲線を示す。 第 図
を示し、第２図は、ペルオキシダーゼの化学発光応答曲
線を示し、第３図は、ミクロペルオキシダーゼ及びペル
オキシダーゼの量と化学発光強度との関係を示し、第４
図は、ＤＮＡを標識したミクロペルオキシダーゼの化学
発光応答曲線を示す。 第 図
Claims (1)
- ミクロペルオキシダーゼで核酸を標識し、該標識物質を
触媒として、過酸化水素とルミノールとを化学発光反応
させ、該発光量を測定することを特徴とする核酸の定量
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8098690A JPH03280898A (ja) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | 核酸の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8098690A JPH03280898A (ja) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | 核酸の定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03280898A true JPH03280898A (ja) | 1991-12-11 |
Family
ID=13733825
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8098690A Pending JPH03280898A (ja) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | 核酸の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03280898A (ja) |
-
1990
- 1990-03-30 JP JP8098690A patent/JPH03280898A/ja active Pending
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