JPH10267850A - ルミノール等の化学発光増強物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】保存安定性が良好で、しかもその取扱いや管
理、廃液処理が容易なルミノールの発光増強試薬であっ
て、ルシフェリンやｐ−ヨードフェノール等の増強剤を
必要とせず、単独で高感度の発光測定が可能な化合物を
提供する。 【解決手段】チオ尿素骨格及びアルキル基を有し、酸化
剤共存及びアルカリ性条件下でルミノール等の発光を増
強するチオ尿素誘導体等。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ルミノール又はイ
ソルミノールの発光における新規な発光増強物質、該物
質の使用に関し、更には、ルミノール又はイソルミノー
ル等をラベルとして使用する免疫測定や核酸測定等の親
和結合を利用する種々の測定における該物質の使用等に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒ
ドロ−１，４−フタラジンジオン）やイソルミノール等
（以下、本明細書においては、特に断らない限りルミノ
ールやイソルミノール、更にはこれらの誘導体を包含し
てルミノール等と記載する）は、弱アルカリ性条件下、
過酸化水素等の酸化剤と反応して発光（化学発光）を生
じる。該発光は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、マイク
ロペルオキシダーゼ（ｍ−ＰＯＤ）等の酵素やフェリシ
アン化カリウムといった適当な触媒の存在下で検出可能
なレベルまで高められ、更にはルシフェリンやｐ−ヨー
ドフェノールによりその継続性が高められることが知ら
れている。

【０００３】近年になって、光学的に検出可能な物質
や、光学的に検出可能な反応生成物を生ずる反応を触媒
する酵素をラベルとする免疫測定や核酸測定が実施され
るようになり、前記ルミノール等の化学発光反応を利用
することも提案されている。即ち、前記触媒であるペル
オキシダーゼ等の酵素をラベルとして使用し、ルミノー
ル等の発光を検出しようというものである。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】これまでに報告された
ルミノール等の発光を利用する免疫測定等においては、
ルミノール等と過酸化水素等の酸化剤に加え、検出可能
なシグナルを得るためにペルオキシダーゼ、ｍ−ＰＯＤ
又はフェリシアン化カリウムという、適当な発光触媒が
必要であった。このうち、ペルオキシダーゼ等の酵素
は、試薬の調製が面倒で長期に渡る保存安定性が悪いと
いう課題がある。またフェリシアン化カリウムには、取
扱いが面倒で管理・廃液処理が面倒であるという課題が
ある。また、高感度検出を行う場合は、ルミノール等の
発光強度を更に高め、かつ、その継続性を高める必要が
あるため、前記試薬に加えてルシフェリンやｐ−ヨード
フェノール等の増強剤を用いなければならないが、結果
的に試薬点数が増加してその管理や測定操作が煩雑にな
るという課題に加え、特にルシフェリンは大量に調製す
ることが困難である等、試薬供給上のコスト的課題もあ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ルミノー
ル等の発光強度を増強する発光増強物質をスクリーニン
グする過程において、ペルオキシダーゼ等の従来知られ
たルミノール等の化学発光触媒やｐ−ヨードフェノール
等の発行増強剤とは異なる作用機作により発光を増強す
る発光増強物質を見い出し、本発明を完成するに至っ
た。

【０００６】即ち本発明は、チオ尿素骨格及びアルキル
基を有し、酸化剤共存及びアルカリ性条件下でルミノー
ル等の発光を増強するチオ尿素誘導体である。また本発
明は、チオ尿素骨格及びアルキル基を有し、酸化剤共存
及びアルカリ性条件下でルミノール等の発光を増強する
チオ尿素誘導体を使用する、ルミノール又はイソルミノ
ールの発光を増強する方法である。更に本発明は、チオ
尿素骨格及びアルキル基を有し、酸化剤共存及びアルカ
リ性条件下でルミノール等の発光を増強するチオ尿素誘
導体を含むルミノール又はイソルミノールの発光増強剤
である。そして本発明は、少なくともルミノール等、標
的物質及び標的物質に特異的に結合する特異結合物質を
含む複合体を形成した後、該複合体をアルカリ性条件下
で、酸化剤共存及びアルカリ性条件下でルミノール等の
発光を増強するチオ尿素誘導体及び酸化剤と接触させる
ことを特徴とする、前記標的物質の測定法である。以
下、本発明を詳細に説明する。

【０００７】本発明のチオ尿素誘導体は、ペルオキシダ
ーゼ、ｍ−ＰＯＤ、フェリシアン化カリウム等の、従来
知られたルミノール等の発光触媒とは異なる作用機作に
よりルミノール等の発光を増強する効果を有する。その
一方で、本発明のチオ尿素誘導体は、前記発光触媒非存
在下であっても、過酸化水素等の酸化剤が存在すればル
ミノール等の発光を増強することから、ルシフェリンや
ｐ−ヨードフェノール等の従来知られたルミノール等の
発光増強物質とも異なるものと考えられる。また、本発
明のチオ尿素誘導体は、ルミノールに限らず、例えばＮ
−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール
（ＡＢＥＩ）や２，３−ジヒドロ−６−イソチオシアナ
ト−１，４−フタラジンジオン等のルミノール誘導体、
更には４−（５’，６’−ジメトキシベンゾチアゾリ
ル）−Ｎ−フェニル−フタリルヒドラジド等のルミノー
ルのラベル化体の発光増強効果を有する。

【０００８】本発明のチオ尿素誘導体は、例えばアミノ
チアゾール誘導体を出発材料として、イソチオシアネー
ト（ＲＣＮＳ）を反応することにより容易かつ安価に合
成することができる。なお、本発明のチオ尿素化合物に
は、誘導体化等された種々の化合物が包含されるが、そ
れらは本発明の開示に基づき、適宜合成することが可能
である。その一例として図１から図７に示したような化
合物中、後の実施例で示すようにＳ／Ｎ比が１以上のも
のが例示できるが、中でも図８に示した１８種類の化合
物はルミノール等の発光増強効果が強く、特に好まし
い。これらは、最終濃度で１０μＭ以上で発光増強効果
を認めることができるが、１ｍＭ以上使用することが好
ましい。

【０００９】本発明のチオ尿素誘導体は、ｐＨ７．０ア
ルカリ性条件下でそのルミノール等の発光増強効果を発
揮する。該増強効果を十分に発揮させるためにはｐＨ
９．０以上、特にｐＨ１０以上の強アルカリ性条件下で
使用することが好ましい。また該増強効果を発揮するた
めには適当な酸化剤が必要であるが、酸化剤は特に限定
されず、例えば過酸化水素やペルオキシダーゼ等、従来
からルミノールの発光反応に使用されているもの等を用
いることができる。酸化剤の濃度は、過酸化水素であれ
ば最終濃度で１０ｍＭ以上、好ましくは１００ｍＭ以上
である。

【００１０】本発明のチオ尿素誘導体を用いてルミノー
ル等の発光を増強するには、酸化剤共存及びアルカリ性
条件下でチオ尿素誘導体をルミノール等と接触させれば
良い。この際、例えば長時間に渡ってルミノールからの
発光強度を測定する必要がある場合等には、後に示すよ
うに西洋ワサビペルオキシダーゼ等を添加することもで
きる。なお、ルミノール等の発光を測定することによ
り、例えば未知濃度のルミノール等を含有する試料につ
いてルミノール等の定量を実施したり、或いは例えば過
酸化水素等、未知濃度の酸化剤を含有する試料について
酸化剤の定量を実施したり、更には、例えば本発明のチ
オ尿素誘導体を未知濃度で含有する試料について、その
定量を実施することも可能になる。

【００１１】本発明のチオ尿素誘導体を用いれば、酸化
剤共存及びアルカリ性条件下でルミノール等の発光を増
強することができる。従って、これを利用することでル
ミノール等の発光増強剤を提供できる。該発光増強剤
は、過酸化水素等を含む酸化剤等から構成される試薬セ
ットの一部であっても良い。また更には、ルミノール等
や酸化剤の測定用として提供することもできる。

【００１２】本発明のチオ尿素誘導体を用いるルミノー
ル等の発光増強方法は、親和結合を利用する種々の測定
において利用することができる。具体的には、前記従来
の測定法におけるラベルとして、ルミノール等や本発明
のチオ尿素誘導体を使用すること及びルミノール等の測
定を酸化剤共存及びアルカリ性条件下で実施する以外は
それらと同様に実施することができる。親和結合を利用
する種々の測定としては、抗原（免疫原性を有する物
質）と抗体の免疫結合を利用する免疫測定、ホルモン
（リガンド）とレセプターの結合を利用するリガンド結
合、ＤＮＡ同士やＤＮＡとＲＮＡの核酸結合を利用する
核酸測定等を例示できる。このような測定を行なう場合
は、測定しようとする標的物質に対する特異結合物質を
ルミノール等又は本発明のチオ尿素誘導体でラベルする
こと以外に、標的物質に対する特異結合物質と結合する
物質をラベルすることが例示できる。

【００１３】蛋白質をルミノール等でラベルする際に
は、その発光機能が損なわれないように注意することが
好ましい。ルミノールは、そのアミノ基が置換されると
発光機能が低下することから、好ましくは発光機能低下
の恐れが少なく、かつ、ラベル化のために利用可能な官
能基を有するＡＢＥＩを使用することが好ましい。ＡＢ
ＥＩを用いる場合は、グルタルアルデヒド法やジアゾ法
などは（例えば化学発光イムノアッセイ（ソフトサイエ
ンス）参照）に従うことが例示できる。また例えばルミ
ノールイソシアナートは、直接反応させることのみで蛋
白質等をラベルすることが可能である。また更に、ルミ
ノールのラベル化体として市販されている４−（５’，
６’−ジメトキシベンゾチアゾリル）−Ｎ−フェニル−
フタリルヒドラジドを利用することも可能である。

【００１４】例えば免疫測定について一例の述べれば、
不溶性担体等に固定化した抗体とルミノール等を結合し
た抗体を使用し、これら抗体と測定されるべき標的物質
で複合体を形成させ、後に複合体中のルミノール等又は
複合体を形成していないルミノール等の発光を本発明の
チオ尿素誘導体で増強しつつ測定することができる。こ
の例は、免疫測定法における、いわゆるサンドイッチ法
について示したものであるが、いわゆる競合法であって
も良い。核酸測定の場合は、前記抗体に代えて核酸（オ
リゴヌクレオチド）を使用すれば良い。

【００１５】上記した測定以外にも、例えば液体クロマ
トグラフィーにおけるプレラベル法やポストラベル法に
利用することができる。即ち、前記したような標的物質
に対する特異結合物質等をルミノール等又はチオ尿素誘
導体でラベルしておき、試料を液体クロマトグラフィー
における流路形に導入した後、カラムで分離する前又は
カラムで分離した後で、かつ、発光強度を測定するため
の検出器に至る以前で酸化剤等、ルミノールの発光に必
要な試薬を流路に投入すれば良い。

【００１６】本発明者らの知見によれば、ルミノール等
をラベルとして用い、本発明のチオ尿素誘導体及び過酸
化水素によりその発光を増強した場合、１０ｆｍｏｌ／
５０μＬという、従来のルミノール、ＨＲＰ及び過酸化
水素を用いた場合に比較して約１００程度高感度の測定
を実施可能である。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明す
るために実施例を記載するが、本発明はこれら実施例に
限定されるものではない。なお、ルミノールの発光増強
効果等については、発光強度自体の比較が困難であるこ
とから、コントロールにより得られた発光測定結果との
比率（Ｓ／Ｎ比）で示してある。

【００１８】以下の実験においては、下記の各試薬を使
用した。

【００１９】（１）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）；市販品（東洋紡（株）製、２５０Ｕ／ｍｇ）） （２）ルミノール；市販のルミノールナトリウム（和光
純薬工業（株）製） （３）Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミ
ノール（ＡＢＥＩ）；市販品（シグマ製） （４）２，３−ジヒドロ−６−イソチオシアナト−１，
４−フタラジンジオン（ルミノールイソチオシアナー
ト）；市販品（東京化成工業製） （５）４−（５’，６’−ジメトキシベンゾチアゾリ
ル）−Ｎ−フェニル−フタリルヒドラジド；市販品（同
仁（株）製） （６）ｐ−ヨードフェノール；市販品（アルドリッチ
製） （７）過酸化水素水（３０％）；市販品（和光純薬工業
（株）製） （８）ジメチルスルホキシド（５×１０^-7Ｍ）；市販品
（和光純薬工業（株）製） （９）ｍ−ＰＯＤ；市販品（シグマ製） （１０）フェリシアン化カリウム（ヘキサシアノ鉄３カ
リウム）；市販品（和光純薬工業（株）製） （１１）２、２’−アジノ−（３ーエチルベンズチアゾ
リンスルホン酸−６）（ＡＢＴＳ）；市販品（ベーリン
ガーマンハイム製） また、実験で用いた各緩衝液等は、特に断らない限り下
記のように調製した溶液又はこれら溶液に基づき調製し
た。

【００２０】（１）０．０１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１
０．０）；グリシン０．３ｇを蒸留水に溶解して４００
ｍＬとした後、５Ｎ ＮａＯＨを加えてｐＨを１０．０
とした。

【００２１】（２）クエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）；ク
エン酸３．１５２１ｇ及びリン酸水素二ナトリウム９．
１３２６ｇを蒸留水に溶解し、５００ｍＬとした。

【００２２】（３）０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）；リン酸二水素カリウム６．８０４５ｇ、リン酸二
カリウム１７．４１８ｇ及び塩化ナトリウム２７．０ｇ
を蒸留水に溶解し、３Ｌとした。

【００２３】（４）ＨＲＰ溶液；ＨＲＰ０．０１９２ｇ
を蒸留水に溶解し、２０ｍＬとして２４μＭの貯蔵液と
した。使用時には蒸留水を加えて種々濃度のＨＲＰ溶液
とした。

【００２４】（５）０．１ｍＭ ｍ−ＰＯＤ溶液；ｍ−
ＰＯＤ０．０１９１６ｇを蒸留水に溶解し、１００ｍＬ
とした。

【００２５】（６）１０ｍＭフェリシアン化カリウム溶
液；フェリシアン化カリウム０．０３３０ｇを蒸留水に
溶解し、１０ｍＬとした。

【００２６】（７）１０ｍＭ ｐ−ヨードフェノール溶
液；ｐ−ヨードフェノール０．０２１９ｇをＤＭＳＯに
溶解し、１０ｍＬとした。

【００２７】（８）ルミノール溶液；ルミノールナトリ
ウム０．０１９９１ｇをグリシン緩衝液に溶解し、２０
ｍＬとして５ｍＭにした。使用時にはグリシン緩衝液を
加えて種々の濃度とした。

【００２８】（９）ＡＢＥＩ溶液；ＡＢＥＩ ０．０２
７７１ｇに３０μＬの１Ｎ ＮａＯＨを加え、グリシン
緩衝液に溶解して２０ｍＬとし、５ｍＭにした。使用時
にはグリシン緩衝液を加えて種々の濃度とした。

【００２９】（１０）ルミノールイソチオシアナート溶
液；ルミノールイソチオシアナート０．０２１９２ｇに
３０μＬの１Ｎ ＮａＯＨを加え、グリシン緩衝液に溶
解して２０ｍＬとし、５ｍＭにした。使用時にはグリシ
ン緩衝液を加えて種々の濃度とした。

【００３０】（１１）５００ｍＭ過酸化水素溶液（ｐＨ
１０．０）；３０％過酸化水素溶液５．６５ｍＬに、ｐ
Ｈを８．８に調製した以外は前記同様のグリシン緩衝液
を加えて５Ｍにした。使用時にはグリシン緩衝液（ｐＨ
１０．０）を加えて種々の濃度とした。

【００３１】実施例１ 図１から図７に示すチオ尿素誘導体から、ルミノールの
発光を増強する効果を有する化合物をスクリーニングし
た。

【００３２】まず、図１から図７に示したチオ尿素誘導
体をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液に溶解して
１ｍＭ溶液を得た。該溶液の１０μＬに、５×１０^-4Ｍ
に調製したルミノール溶液を５０μＬ加えた後、４８ｎ
Ｍに調製したＨＲＰ溶液を５０μＬ加えた。更に５００
ｍＭ過酸化水素溶液を５０μＬ加え、市販のルミネッセ
ンスリーダー（アロカ（株）製、ＢＬＲ−２０１）を用
いて前記過酸化水素添加後１５秒から１０秒間に渡って
発光強度を測定した。

【００３３】表１に、チオ尿素誘導体を含まないＤＭＳ
Ｏ溶液について測定した結果（Ｎ）と得られた結果
（Ｓ）の比率（Ｓ／Ｎ）を示す。

【００３４】

【表１】

【００３５】表１に示したように、図１から図７に示し
たチオ尿素誘導体中、１６、２１、２２、３２、３４、
３５、３６、４５、５４、６８、７０、７１、７２、７
３、７５、７７、７９及び８１の番号を付与した１８種
類のチオ尿素誘導体はＳ／Ｎ比３０以上を示し、ルミノ
ールの発光を効果的に増強する特に好適な物質であるこ
とが示された。

【００３６】次に前記１８種類のチオ尿素誘導体につい
て、ルミノール発光の増強効果を再確認するために、同
様の操作を各誘導体について繰り返した。表２に結果
（平均値）を示す。

【００３７】

【表２】

【００３８】表２によれば、前記１８種類のチオ尿素誘
導体の発光増強効果は有効なものであることが理解でき
る。中でも２１の番号を付したチオ尿素誘導体；２−
（３−メチルチオウレイド−チアゾールは、再確認の結
果、これらの中でも特に強い発光増強効果を有すること
が確認された。

【００３９】参考のため、前記１８種類のチオ尿素誘導
体の構造式を図８に示す。これら１８種類のチオ尿素誘
導体は、チオ尿素骨格を有し、かつ、簡単なアルキル基
を有している点で共通しており、該構造がルミノール発
光の増強効果を発揮することが分かる。

【００４０】実施例２ 実施例１において最も強いルミノールの発光増強効果を
示した、図２中で２１の番号を付したチオ尿素誘導体
（以下、誘導体２１と記載する）の至適濃度を調べるた
めに、以下の実験を行った。

【００４１】誘導体２１を含むＤＭＳＯ溶液１０μＬ
に、５×１０^-7又は２．５×１０^-5Ｍに調製したルミノ
ール溶液を５０μＬ加えた後、４８ｎＭに調製したＨＲ
Ｐ溶液を５０μＬ加えた。更に５００ｍＭ過酸化水素溶
液を５０μＬ加え、市販のルミネッセンスリーダー（ア
ロカ（株）製、ＢＬＲ−２０１）を用いて前記過酸化水
素添加後１５秒から１０秒間に渡って発光強度を測定し
た。なお、前記ＤＭＳＯ溶液は、誘導体２１の最終濃度
が１μＭ〜１０ｍＭとなるように調製した。

【００４２】図９に、ルミノール溶液に代えてグリシン
緩衝液を添加した場合の測定結果（Ｎ）と得られた結果
（Ｓ）の比率（Ｓ／Ｎ）を示す。図中、縦軸はＳ／Ｎ
比、横軸は誘導体２１の濃度を示し、白四角は５×１０
^-7Ｍのルミノール溶液を用いた場合、白丸は５×１０^-5
Ｍのルミノール溶液を用いた場合の結果である。

【００４３】図９から、誘導体２１はルミノール濃度に
係わらず、最終濃度１ｍＭ以上で一定の発光増強効果
（一定のＳ／Ｎ比）を与えること、即ち誘導体２１の至
適濃度が１ｍＭ以上であることが分かる。

【００４４】実施例３ 酸化剤（過酸化水素）の至適濃度を調べるために、以下
の実験を行った。

【００４５】誘導体２１を含むＤＭＳＯ溶液１０μＬ
に、５×１０^-7又は５×１０^-5Ｍに調製したルミノール
溶液を５０μＬ加えた後、４８ｎＭに調製したＨＲＰ溶
液を５０μＬ加えた。更に最終濃度が５μＭ〜５００ｍ
Ｍとなるように過酸化水素溶液を５０μＬ加え、市販の
ルミネッセンスリーダー（アロカ（株）製、ＢＬＲ−２
０１）を用いて前記過酸化水素添加後１５秒から１０秒
間に渡って発光強度を測定した。なお、前記ＤＭＳＯ溶
液は、誘導体２１の最終濃度が至適濃度（１ｍＭ）とな
るように調製した。

【００４６】図１０に、ルミノール溶液に代えてグリシ
ン緩衝液を添加した場合の測定結果（Ｎ）と得られた結
果（Ｓ）の比率（Ｓ／Ｎ）を示す。図中、縦軸はＳ／Ｎ
比、横軸は過酸化水素の濃度を示し、白丸は濃度が５×
１０^-7Ｍのルミノール溶液を用いた場合、白三角は、５
×１０^-5Ｍのルミノール溶液を用いた場合の結果であ
る。

【００４７】図１０から、誘導体２１のルミノール発光
増強効果は酸化剤（過酸化水素）存在下で認められる
が、特に過酸化水素の最終濃度が５０ｍＭ以上となると
一定の発光増強効果（一定のＳ／Ｎ比）を与えること、
即ち過酸化水素の至適濃度が５０ｍＭ以上であることが
分かる。

【００４８】実施例４ ルミノールの発光触媒（ＨＲＰ）の至適濃度を調べるた
めに、以下の実験を行った。

【００４９】誘導体２１を含むＤＭＳＯ溶液１０μＬ
に、５×１０^-5又は５×１０^-4Ｍに調製したルミノール
溶液を５０μＬ加えた後、最終濃度が４．８ｐＭ〜２４
μＭとなるように調製したＨＲＰ溶液を５０μＬ加え
た。更に、最終濃度が５００ｍＭとなるように過酸化水
素溶液を５０μＬ加え、市販のルミネッセンスリーダー
（アロカ（株）製、ＢＬＲ−２０１）を用いて前記過酸
化水素添加後１５秒から１０秒間に渡って発光強度を測
定した。なお、前記ＤＭＳＯ溶液は、誘導体２１の最終
濃度が１ｍＭとなるように調製した。

【００５０】図１１に、ルミノール溶液に代えてグリシ
ン緩衝液（ｐＨ１０）を添加した場合の測定結果（Ｎ）
と得られた結果（Ｓ）の比率（Ｓ／Ｎ）を示す。図中、
縦軸はＳ／Ｎ比、横軸はＨＲＰの濃度を示し、白丸は誘
導体２１添加かつ濃度が５×１０^-4Ｍのルミノール溶液
を用いた場合、白三角は誘導体２１添加かつ５×１０ ^-6
Ｍのルミノール溶液を用いた場合、バツ（×）は誘導体
２１を添加せずかつ濃度が５×１０^-4Ｍのルミノール溶
液を用いた場合、白四角は誘導体２１を添加せずかつ５
×１０^-6Ｍのルミノール溶液を用いた場合の結果であ
る。

【００５１】図１１によれば、誘導体２１は、低濃度Ｈ
ＲＰ存在下ではＨＲＰ濃度に係わらず、一定の発光増強
効果、即ち一定のＳ／Ｎ比を与えることが分かる。ま
た、ＨＲＰ濃度の上昇に伴い、Ｓ／Ｎ比が低下している
ことから、誘導体２１の発光増強効果とＨＲＰの発光触
媒効果は、互いに干渉する、異なる作用機作によるもの
と推測できる。

【００５２】なお、４．８μＭ及び２４μＭという高濃
度ＨＲＰ条件下においてＳ／Ｎ比がに乱れが生じている
のは、上記の干渉に加え、高濃度ＨＲＰが褐色を呈して
いることと関係があると考えられる。

【００５３】実施例５ 誘導体２１のルミノール発光増強効果の作用機作がＨＲ
Ｐの触媒効果と異なることを確認するために、以下の実
験を行った。

【００５４】常温下、ＡＢＴＳにクエン酸緩衝液を２５
ｍＬ加え、更に３０％過酸化水素を１２μＬ加えた。こ
の溶液の２００μＬにリン酸緩衝液で溶解したＨＲＰを
２０μＬ加えたところ、１０分後には緑色を呈したが、
ＨＲＰ溶液に代えて誘導体２１を含むリン酸緩衝液を１
０μＬ加えた場合、呈色は見られなかった。なお、ＨＲ
Ｐの最終濃度は２．５×１０^-6Ｍであり、誘導体２１の
最終濃度は１×１０^-3Ｍである。

【００５５】実施例４及び５の結果から、誘導体２１が
ＨＲＰの触媒効果とは異なる作用機作によりルミノール
の発光を増強することが分かる。

【００５６】実施例６ ＨＲＰと同様にルミノールの発光触媒効果を有すること
が知られているｍ−ＰＯＤを用いて下記の実験を行っ
た。

【００５７】誘導体２１を含むＤＭＳＯ溶液１０μＬを
ルミノール溶液５０μＬに加えた後１×１０^-4Ｍのｍ−
ＰＯＤ溶液を５０μＬ加えた。更に、最終濃度が５００
ｍＭとなるように調製した過酸化水素溶液を５０μＬ加
え、市販のルミネッセンスリーダー（アロカ（株）製、
ＢＬＲ−２０１）を用いて前記過酸化水素添加後１５秒
から１０秒間に渡って発光強度を測定した。なお、前記
ＤＭＳＯ溶液は誘導体２１の最終濃度が１ｍＭとなるよ
うに、ルミノール溶液は、最終濃度が５×１０^-11 Ｍ〜
５×１０^-5Ｍとなるように調製した。また、誘導体２１
を含まないＤＭＳＯ溶液又はｍ−ＰＯＤを含まない溶液
についても、同様の操作を行った。

【００５８】図１２に、ルミノール溶液に代えてグリシ
ン緩衝液を添加した場合の測定結果（Ｎ）と得られた結
果（Ｓ）の比率（Ｓ／Ｎ）を示す。図中、縦軸はＳ／Ｎ
比、横軸はルミノールの濃度を示し、白丸は誘導体２１
及びｍ−ＰＯＤを添加した場合、白四角はｍ−ＰＯＤの
みを添加した場合、そして白三角は誘導体２１のみを添
加した場合の結果を示す。

【００５９】図１２からは、ｍ−ＰＯＤと誘導体２１の
効果に相乗効果は認められず、誘導体２１のみを添加し
た場合の発光増強効果が最も良好であり、これに比べて
ｍ−ＰＯＤ共存下ではＳ／Ｎ比が低下していることか
ら、誘導体２１の発光増強効果とｍ−ＰＯＤの発光触媒
効果は、互いに干渉する、異なる作用機作によるものと
推測できる。

【００６０】実施例７ ＨＲＰやｍ−ＰＯＤと同様にルミノールの発光触媒効果
を有することが知られているフェリシアン化カリウムを
用いて下記の実験を行った。

【００６１】ｍ−ＰＯＤ溶液に代えて、フェリシアン化
カリウム溶液１×１０^-3Ｍを用いた以外は実施例６と同
様の操作を行った。

【００６２】図１３に、ルミノール溶液に代えてグリシ
ン緩衝液を添加した場合の測定結果（Ｎ）と得られた結
果（Ｓ）の比率（Ｓ／Ｎ）を示す。図中、縦軸はＳ／Ｎ
比、横軸はルミノールの濃度を示し、白三角は誘導体２
１及びフェリシアン化カリウムを添加した場合、白丸は
フェリシアン化カリウムのみを添加した場合、そして白
四角は誘導体２１のみを添加した場合の結果を示す。

【００６３】図１３からは、フェリシアン化カリウムと
誘導体２１の効果に相乗効果は認められず、誘導体２１
のみを添加した場合の発光増強効果が最も良好であり、
これに比べてフェリシアン化カリウム共存下ではＳ／Ｎ
比が低下していることから、誘導体２１の発光増強効果
とフェリシアン化カリウムの発光触媒効果は、互いに干
渉する、異なる作用機作によるものと推測できる。

【００６４】実施例８ 従来からＨＲＰのルミノール発光触媒作用を増強する効
果が知られている、ｐ−ヨードフェノールを用いて下記
の実験を行った。

【００６５】誘導体２１を含むＤＭＳＯ溶液１０μＬを
ルミノール溶液５０μＬに加えた後、ＨＲＰ溶液及びｐ
−ヨードフェノール溶液を５０μＬ加えた。更に、最終
濃度が５００ｍＭとなるように調製した過酸化水素溶液
を５０μＬ加え、市販のルミネッセンスリーダー（アロ
カ（株）製、ＢＬＲ−２０１）を用いて前記過酸化水素
添加後１５秒から１０秒間に渡って発光強度を測定し
た。なお、前記ＤＭＳＯ溶液は誘導体２１の最終濃度が
１ｍＭとなるように、ルミノール溶液は最終濃度が５×
１０^-11 Ｍ〜５×１０^-5Ｍとなるように調製した。ま
た、誘導体２１を含まないＤＭＳＯ溶液についても、同
様の操作を行った。

【００６６】図１４に、ルミノール溶液に代えてグリシ
ン緩衝液を添加した場合の測定結果（Ｎ）と得られた結
果（Ｓ）の比率（Ｓ／Ｎ）を示す。図中、縦軸はＳ／Ｎ
比、横軸はルミノールの濃度を示し、白丸はｐ−ヨード
フェノールのみを添加した場合、そして白三角は誘導体
２１及びｐ−ヨードフェノールを添加した場合の結果を
示す。

【００６７】図１４からは、ｐ−ヨードフェノールのＨ
ＲＰ触媒効果の増強効果は誘導体２１の共存に影響され
ないことが分かる。

【００６８】実施例９ 誘導体２１のルミノール発光増強効果における至適ｐＨ
を調べるために以下の実験を実験を行った。

【００６９】誘導体２１を含むＤＭＳＯ溶液１０μＬ
に、５×１０^-7又は５×１０^-5Ｍとなるように調製した
ルミノール溶液を５０μＬ加えた後、最終濃度が５００
ｍＭとなるように調製した過酸化水素溶液を５０μＬ加
え、市販のルミネッセンスリーダー（アロカ（株）製、
ＢＬＲ−２０１）を用いて前記過酸化水素添加後１５秒
から１０秒間に渡って発光強度を測定した。なお、前記
ＤＭＳＯ溶液は、誘導体２１の最終濃度が１ｍＭとなる
ように調製した。また、ルミノール溶液及び過酸化水素
溶液は、ｐＨ６〜１１のグリシン緩衝液を用いて調製し
た。

【００７０】図１５に、ルミノール溶液に代えてｐＨ６
〜１１のグリシン緩衝液を添加した場合の測定結果
（Ｎ）と得られた結果（Ｓ）の比率（Ｓ／Ｎ）を示す。
図中、縦軸はＳ／Ｎ比、横軸はｐＨを示し、白丸は５×
１０^-7Ｍのルミノール溶液を用いた場合、白三角は５×
１０^-5Ｍのルミノール溶液を用いた場合の結果である。

【００７１】図１５から、誘導体２１のルミノール発光
増強効果はアルカリ性条件下で認められるが、特にｐＨ
１０以上の強アルカリ性条件下で一定の発光増強効果
（一定のＳ／Ｎ比）を与えること、即ち誘導体２１の至
適ｐＨが１０以上であることが分かる。

【００７２】実施例１０ 誘導体２１のルミノール発光増強効果における界面活性
剤の影響を調べるために以下の実験を行った。界面活性
剤は、ミセル形成による発光増強作用を有することが知
られている。

【００７３】５×１０^-6Ｍとなるように調製したルミノ
ール溶液５０μＬに水で０．２ｗ／ｖ％に調製した界面
活性剤溶液（ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ８
０、シクロデキストリン）を５０μＬ加えた後、誘導体
２１を含むＤＭＳＯ溶液１０μＬを加えた。過酸化水素
溶液を５０μＬ加え、市販のルミネッセンスリーダー
（アロカ（株）製、ＢＬＲ−２０１）を用いて前記過酸
化水素添加後１５秒から１０秒間に渡って発光強度を測
定した。なお、前記ＤＭＳＯ溶液は、誘導体２１の最終
濃度が１ｍＭとなるように調製した。

【００７４】その結果、Ｓ／Ｎ比は、界面活性剤に代え
て水を使用した場合と変化が無いか、或いは界面活性剤
の共存によりわずかながら悪化した。

【００７５】

【表３】

【００７６】前記３種類以外の界面活性剤（合計１９種
類；表３）についても同様の結果であった。

【００７７】実施例１１ 誘導体２１を用いるルミノール定量における定量性を調
べるために以下の実験を行った。

【００７８】誘導体２１を含むＤＭＳＯ溶液１０μＬを
ルミノール溶液５０μＬに加えた後、最終濃度が５００
ｍＭとなるように調製した過酸化水素溶液を５０μＬ加
え、市販のルミネッセンスリーダー（アロカ（株）製、
ＢＬＲ−２０１）を用いて前記過酸化水素添加後１５秒
から１０秒間に渡って発光強度を測定した。なお、前記
ＤＭＳＯ溶液は誘導体２１の最終濃度が１ｍＭとなるよ
うに、ルミノール溶液は最終濃度が５×１０^-11 Ｍ〜５
×１０^-5Ｍとなるように調製した。また、誘導体２１を
含まないＤＭＳＯ溶液を用いた場合、最終濃度が４８ｎ
Ｍとなるように調製したＨＲＰ溶液を５０μＬ加えた場
合、ｐＨ８．８に調製したグリシン緩衝液を使用した場
合、そして最終濃度が１０ｍＭとなるように調製したｐ
−ヨードフェノール溶液を１０μＬ加えた場合について
も、同様の操作を行った。

【００７９】図１６に、ルミノール溶液に代えてグリシ
ン緩衝液を添加した場合の測定結果（Ｎ）と得られた結
果（Ｓ）の比率（Ｓ／Ｎ）を示す。図中、縦軸はＳ／Ｎ
比、横軸はルミノールの濃度を示し、白丸は誘導体２１
を添加せずＨＲＰのみを添加した場合（ｐＨ８．８）、
白三角はＨＲＰとｐ−ヨードフェノールを添加した場合
（ｐＨ８．８）、白四角は誘導体２１及びＨＲＰを添加
した場合（ｐＨ８．８）、そしてバツ（×）は誘導体２
１のみを添加した場合（ｐＨ１０．０）の結果を示す。

【００８０】図１６からは、至適ｐＨであるｐＨ１０で
は、誘導体２１のみを添加した場合が最も直線性が良好
であった。この場合の検出下限界は１０ｆｍｏｌ／５０
μＬであり、ＨＲＰのみを添加した場合と比べて約１０
０倍、検出感度を向上できることが分かる。

【００８１】実施例１２ 実施例１０の結果に基づき、ルミノールをラベルとする
測定法への応用可能性を実証するため、以下の実験を行
った。実験には、ルミノールと比較して蛋白質等との反
応性が向上したルミノール誘導体（ＡＢＥＩ及びルミノ
ールイソシアナート）及びルミノールのラベル化剤であ
る、４−（５’，６’−ジメトキシベンゾチアゾリル）
−Ｎ−フェニル−フタリルヒドラジドを使用した。参考
のため、ルミノール、ＡＢＥＩ及びルミノールイソシア
ナートの構造を図１７に示す。

【００８２】誘導体２１を含むＤＭＳＯ溶液１０μＬを
ルミノール（ルミノール誘導体）溶液５０μＬに加えた
後、最終濃度が５００ｍＭとなるように調製した過酸化
水素溶液を５０μＬ加え、市販のルミネッセンスリーダ
ー（アロカ（株）製、ＢＬＲ−２０１）を用いて前記過
酸化水素添加後１５秒から１０秒間に渡って発光強度を
測定した。なお、前記ＤＭＳＯ溶液は誘導体２１の最終
濃度が１ｍＭとなるように、ルミノール（ルミノール誘
導体）溶液は最終濃度が５×１０^-11 Ｍ〜５×１０^-5Ｍ
となるように調製した。また、グリシン緩衝液のｐＨは
全てｐＨ１０．０とした。

【００８３】図１８及び図１９に、ルミノール（ルミノ
ール誘導体）溶液に代えてグリシン緩衝液を添加した場
合の測定結果（Ｎ）と得られた結果（Ｓ）の比率（Ｓ／
Ｎ）を示す。図１８及び図１９中、縦軸はＳ／Ｎ比、横
軸はルミノールの濃度を示す。図１８中、白四角はルミ
ノールの場合、白丸はルミノールイソチオシアナートの
場合、そして白三角はＡＢＥＩの場合を示す。また図１
９中、白丸はルミノールの場合、白四角はＡＢＥＩの場
合、そして白三角は４−（５’，６’−ジメトキシベン
ゾチアゾリル）−Ｎ−フェニル−フタリルヒドラジドの
場合をそれぞれ示す。

【００８４】図１８からは、ルミノールと比較してルミ
ノール誘導体では１／１０〜１／１００程度検出感度が
低下するが、ＨＲＰを用いた場合と同等の感度を得られ
るうえ、直線性が良好であることが分かる。また図１９
からは、ルミノールのラベル化体である４−（５’，
６’−ジメトキシベンゾチアゾリル）−Ｎ−フェニル−
フタリルヒドラジドではルミノールと同等の検出感度を
得られることが分かる。 実施例１３ 誘導体２１による、ルミノール又はルミノール誘導体発
光量の経時的変化を調べるために以下の実験を行った。

【００８５】誘導体２１を含むＤＭＳＯ溶液１０μＬ
を、最終濃度が５×１０^-7Ｍとなるように調製したルミ
ノール（ルミノール誘導体）溶液５０μＬに加えた後、
最終濃度が５００ｍＭとなるように調製した過酸化水素
溶液を５０μＬ加え、市販のルミネッセンスリーダー
（アロカ（株）製、ＢＬＲ−２０１）を用いて前記過酸
化水素添加後３００秒間に渡って発光強度を測定した。
なお、前記ＤＭＳＯ溶液は誘導体２１の最終濃度が１ｍ
Ｍとなるように調製した。また、グリシン緩衝液のｐＨ
は全てｐＨ１０．０とした。

【００８６】比較のため、ルミノール（ルミノール誘導
体）溶液に代えてグリシン緩衝液を加えた場合及び、誘
導体２１に代えて最終濃度４８０ｎＭのＨＲＰと最終濃
度１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールを加えた場合につい
ても同様の操作を行った。

【００８７】図２０に測定結果を示す。図２０では、縦
軸にＳ／Ｎ比ではなく発光の絶対量を、横軸に時間
（秒）を示す。図中、ａはルミノール（ルミノール誘導
体）を添加していない場合、ｃは誘導体２１とルミノー
ルを加えた場合、ｅは誘導体２１と４−（５’，６’−
ジメトキシベンゾチアゾリル）−Ｎ−フェニル−フタリ
ルヒドラジドを加えた場合、ｄは誘導体２１とＡＢＥＩ
を加えた場合、そしてｂは誘導体２１に代えてＨＲＰと
ｐ−ヨードフェノールを加えた場合の結果である。図２
０からは、ＨＲＰとｐ−ヨードフェノールを加えた場
合、約１０秒後での発光強度は大きく、かつ、発光の経
時的減衰率が大きいのに対し、誘導体２１を使用した場
合には経時的減衰率が小さいことが分かる。

【００８８】実施例１４ 誘導体２１による、ルミノール発光量の経時的変化にお
けるＨＲＰの効果を調べるために以下の実験を行った。

【００８９】誘導体２１を含むＤＭＳＯ溶液１０μＬを
最終濃度が４８０ｎＭとなるように調製したＨＲＰ溶液
５０μＬに加え、更に最終濃度が５×１０^-7Ｍとなるよ
うに調製したルミノール溶液５０μＬに加えた後、最終
濃度が５００ｍＭとなるように調製した過酸化水素溶液
を５０μＬ加え、市販のルミネッセンスリーダー（アロ
カ（株）製、ＢＬＲ−２０１）を用いて前記過酸化水素
添加後８００秒間に渡って発光強度を測定した。なお、
前記ＤＭＳＯ溶液は誘導体２１の最終濃度が１ｍＭとな
るように調製した。また、ルミノール及び過酸化水素を
溶解するグリシン緩衝液のｐＨは、一部を除きｐＨ１
０．０とした。

【００９０】比較のため、ルミノール溶液に代えてグリ
シン緩衝液を加えた場合、誘導体２１に代えて最終濃度
１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールを加えた場合について
も同様の操作を行った。

【００９１】図２１に、測定結果を示す。図２１では、
縦軸にＳ／Ｎ比ではなく発光の絶対量を、横軸に時間
（秒）を示す。図中、ｆはルミノールを添加していない
場合（ｐＨ１０．０）、ｂは誘導体２１とルミノールを
加えた場合（ｐＨ１０．０）、ｃはＨＲＰとルミノール
を加えた場合（ｐＨ８．８）、ａはＨＲＰとルミノール
を加えた場合（ルミノールを溶解したグリシン緩衝液の
ｐＨは１０．０であり、過酸化水素を溶解したグリシン
緩衝液のｐＨは８．８である）、ｄは誘導体２１、ＨＲ
Ｐ及びルミノールを加えた場合（ｐＨ１０．０）、そし
てｅはｐ−ヨードフェノール、ＨＲＰ及びルミノールを
加えた場合（ｐＨ８．８）の結果である。

【００９２】図２１からは、ＨＲＰ及び誘導体共存下で
は、いったん発光強度が減少するが、約６００秒後には
過酸化水素添加直後よりも大きな発光強度を示すことが
分かる。また、ｐ−ヨードフェノールはＨＲＰ共存下で
過酸化水素添加直後の発光強度を大きく増強するが、誘
導体２１は単独でもルミノール発光の増強効果を有する
が、その効果は単に強度の増強に止まらず、過酸化水素
添加後８００秒においても発光強度の減衰を防止し得る
ことが分かる。

【００９３】

【発明の効果】本発明のチオ尿素誘導体は、単独でルミ
ノール等の発光を増強する効果を発揮する。その増強効
果は、ルミノールの定量性でいえば、従来知られた方法
（ＨＲＰによる触媒効果）に比較して約１００倍と実用
上十分な感度を得ることができる。

【００９４】該化合物は特に困難な操作を必要とせず、
低コストで合成することが可能なうえ、非常に安定であ
ることから、例えば大量製造し長期間保存することもで
き、かつ、使用後は特に面倒な処理を施すことなく廃棄
することも可能である。

【００９５】この結果、本発明のチオ尿素誘導体を用い
てルミノール等の発光を増強しようとする場合には、一
操作毎に試薬を調製するというような煩雑さを解消する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例１でスクリーニングに供された化
合物の一部を示すものである。

【図２】図２は実施例１でスクリーニングに供された化
合物の一部を示すものである。

【図３】図３は実施例１でスクリーニングに供された化
合物の一部を示すものである。

【図４】図４は実施例１でスクリーニングに供された化
合物の一部を示すものである。

【図５】図５は実施例１でスクリーニングに供された化
合物の一部を示すものである。

【図６】図６は実施例１でスクリーニングに供された化
合物の一部を示すものである。

【図７】図７は実施例１でスクリーニングに供された化
合物の一部を示すものである。

【図８】図８は、実施例１で再確認に供された化合物を
示すものである。

【図９】図９は、実施例２における誘導体２１の至適濃
度の検討結果を示す図である。

【図１０】図１０は実施例３における過酸化水素の至適
濃度の検討結果を示す図である。

【図１１】図１１は、実施例４におけるＨＲＰ効果の検
討結果を示す図である。

【図１２】図１２は、実施例６におけるｍ−ＰＯＤを用
いた検討結果を示す図である。

【図１３】図１３は、実施例７におけるフェリシアン化
カリウムを用いた検討結果を示す図である。

【図１４】図１４は、実施例８におけるｐ−ヨードフェ
ノールを用いた検討結果を示す図である。

【図１５】図１５は、実施例９における至適ｐＨの検討
結果を示す図である。

【図１６】図１６は、実施例１１における検討結果（ル
ミノールの検量線）を示す図である。

【図１７】図１７は、ルミノール誘導体の構造を示す図
である。

【図１８】図１８は、実施例１２における検討結果（ル
ミノール誘導体の検量線）を示す図である。

【図１９】図１９は、実施例１２における検討結果（ル
ミノール誘導体の検量線）を示す図である。

【図２０】図２０は、実施例１３における検討結果を示
す図である。

【図２１】図２１は、実施例１４における検討結果を示
す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/533 Ｇ０１Ｎ 33/533

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】チオ尿素骨格及びアルキル基を有し、酸化
   剤共存及びアルカリ性条件下でルミノール等の発光を増
   強するチオ尿素誘導体。
2. 【請求項２】前記酸化剤が過酸化水素である、請求項１
   のチオ尿素誘導体。
3. 【請求項３】チオ尿素骨格及びアルキル基を有し、酸化
   剤共存及びアルカリ性条件下でルミノール等の発光を増
   強するチオ尿素誘導体を使用する、ルミノール等の発光
   を増強する方法。
4. 【請求項４】前記酸化剤が過酸化水素である、請求項３
   の方法。
5. 【請求項５】チオ尿素骨格及びアルキル基を有し、酸化
   剤共存及びアルカリ性条件下でルミノール等の発光を増
   強するチオ尿素誘導体を含むルミノール等の発光増強
   剤。
6. 【請求項６】前記酸化剤が過酸化水素である、請求項５
   の発光増強剤。
7. 【請求項７】少なくともルミノール等、標的物質及び標
   的物質に特異的に結合する特異結合物質を含む複合体を
   形成した後、該複合体をアルカリ性条件下で、酸化剤共
   存及びアルカリ性条件下でルミノール等の発光を増強す
   るチオ尿素誘導体及び酸化剤と接触させることを特徴と
   する、前記標的物質の測定法。
8. 【請求項８】前記酸化剤が過酸化水素である、請求項７
   の測定法。
9. 【請求項９】前記標的物質が免疫原性を有する物質であ
   る、請求項７の測定法。
10. 【請求項１０】前記標的物質が核酸である、請求項７の
    測定法。
11. 【請求項１１】ルミノール等でラベルした特異結合物質
    を使用する、請求項７の測定法。
12. 【請求項１２】ルミノール等でラベルした、特異結合物
    質に対して結合する物質を使用する請求項７の測定法。
13. 【請求項１３】液体クロマトグラフィーにおけるプレラ
    ベル法又はポストラベル法であることを特徴とする請求
    項７の測定法。