FR2468125A1 - Conjugue destine a des dosages immunologiques par chimioluminescence - Google Patents

Abstract

L'invention a trait au domaine des méthodes immunologiques de dosage. Elle concerne un conjugué destiné à être utilisé dans le dosage qualitatif et quantitatif d'anticorps et d'antigènes dans des liquides corporels par des méthodes immunologiques et des méthodes immunologiques par chimioluminescence utilisant ce conjugué. Le conjugué de l'invention est capable de réagir avec un antigène ou un anticorps ou les deux et comprend un marqueur apte à catalyser une réaction de chimioluminescence. Il peut s'agir d'un anticorps ou d'un antigène auquel est lié un marqueur consistant en une métalloporphyrine et il est de préférence formé d'une immunoglobuline à laquelle de l'hémoglobine est liée.

Description

La présente invention concerne le domaine technique des épreuves

immunologiques pour la détection qualitative et quantitative d'anticorps et d'antigènes (y compris des haptènes) ainsi que d'autres substances présentes en petites quantités dans des liquides corporels. L'invention a plus particulièrement trait à des dosages immunologiques par chimioluminescence et à un conjugué nouveau

destiné à être utilisé dans ces épreuves.

Divers systèmes analytiques ont été mis au point pour la détection et le dosage quantitatif d'anticorps, d'antigènes et d'autres substances présentes en petites quantités dans des liquides corporels. Les plus sensibles sont des épreuves immunologiques qui exploitent le fait qu'un anticorps se lie spécifiquement à son antigène et que la réaction obéit à la loi d'action de masse,

Ab + Ag - AbAg.

Plusieurs épreuves immunologiques qui sont classées d'après leurs caractéristiques de -liaison sont utilisées couramment. Les plus ordinaires utilisent la liaison compétitive et la liaison à double site ou liaison "sandwich". Quelle que soit la technique, on doit utiliser un conjugué marqué en vue de la détection. Les indicateurs utilisés le plus couramment sont des radio-isotopes et la

méthode est appelée épreuve radio-immunologique (RIA).

D'autres méthodes utilisant des indicateurs différents comprennent l'épreuve enzymo-immunologique (EIA) et

l'épreuve fluoro-immunologique (FIA).

Les épreuves radio-immunologiques utilisant comme indicateurs les isotopes radio-actifs 125, 14C ou H, dominent actuellement la majeure partie du marché par suite de leurs sensibilités extrêmement grandes, c'est-à-dire de leur aptitude à détecter la présence de 10-15 moles ou moins d'antigène ou d'anticorps. Malgré leur grande sensibilité, les épreuves du type RIA présentent les inconvénients suivants: (1) les compteurs bêta et gamma que nécessite le dispositif d'affichage sont onéreux et exigent un entretien coûteux par des personnes très qualifiées, (2) le personnel de surveillance doit être très entraîné et doit être autorisé par le gouvernement à manipuler des radio-isotopes, (3) à

cause de la radio-activité, les épreuves radio-

immunologiques sont effectivement prohibées dans de nombreux

pays étrangers aux Etats-Unis d'Amérique, (4) la haute radio-

activité nécessaire à la production d'un signal convenable requiert l'utilisation d'isotopes à courte période, ce qui nécessite donc le renouvellement fréquent de la synthèse de composés marqués et (5) les courtes périodes signifient que le rapport du signal à la concentration de l'indicateur varie continuellement et rapidement, ce qui nécessite un

réétalonnage fréquent pour chaque épreuve.

Les épreuves enzymo-immunologiques nécessitent l'utilisation de matières biologiques complexes dont l'activité naturelle est maintenue. Les modes opératoires eux-mêmes prennent du temps à cause de la nature lente de la réaction sur laquelle porte la mesure et ils ne donnent pas

toujours les grandes sensibilités désirées.

Les systèmes fluorescents ont des limites de sensibilité légèrement inférieures à celles de systèmes radio-immunologiques et nécessitent de longues périodes d'incubation. Un autre inconvénient est que les blancs

donnent souvent des valeurs élevées et variables.

La chimioluminescence désigne la lumière produite comme résultat direct d'un processus chimique. Elle implique la transformation de l'énergie libre d'une réaction chimique en énergie lumineuse. La réaction chimique doit libérer suffisamment d'énergie pour occuper un état énergétique excité; le processus réactionnel doit favoriser la formation du produit à l'état excité; et le produit à l'état excité doit être capable d'émettre lui-même un photon pour transmettre son énergie à une autre molécule qui est

capable d'une émission.

Une réaction chimioluminescente très efficace

bien connue est l'oxydation du luminol (5-amino-2,3-dihydro-

phtalazine-1,4-dione) en solution basique. L'oxydant utilisé le plus fréquemment est le peroxyde d'hydrogène en présence d'un catalyseur tel que Fe(CN)6 3, Cu(II) et Co(II). D'autres oxydants comprennent un perborate, -un hypochlorite, l'iode,

un permanganate et l'oxygène.

Le principe de la chimioluminescence a été exploité dans des épreuves immunologiques. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 104 029 fait connaître une

méthode de recherche de composés doués d'activité pharma-

cologique, immunologique et biochimique dans des fluides biologiques, méthode dans laquelle un ligand est marqué avec une substance chimioluminescente telle que le luminol. En outre, il est connu que le fer et en particulier les composés de fer de la protoporphyrine réagissent avec le luminol en présence de peroxyde d'hydrogène ou de perborate de sodium et d'une base pour produire une substance excitée qui émet de la lumière avec une grande efficacité (voir Ewetz et Thore, Factors Affecting the Specificity of the Luminol Reaction with Hematin Compounds, Analytical Biochemistry, 71, 564-570

(1976).

La présente invention propose une épreuve immunologique rapide, sensible et objective pour la détection

d'antigènes ou d'anticorps. Elle supprime les dangers radio-

isotopiques et la nécessité d'un personnel très expérimenté.

Elle élimine ensuite la nécessité de moyens spéciaux liée à la manipulation d'isotopes. En outre, elle n'utilise qu'un appareillage simple et permet une lecture rapide avec une

grande sensibilité (détection possible jusqu'à 10-15 moles).

L'invention propose un réactif immunologique marqué à longue période dont le prix de revient est relativement bas et que l'on peut se procurer facilement. En raison de sa réactivité universelle, on peut l'appliquer à de nombreuses méthodes

analytiques différentes.

L'invention a trait à un conjugué destiné à être utilisé dans une méthode d'analyse immunologique, qui peut être détecté par chimioluminescence. Le conjugué comprend un composé doué d'activité immunologique auquel est attaché un indicateur consistant en une métalloporphyrine. On peut utiliser tout anticorps ou tout partenaire de liaison pour un anticorps, comprenant des antigènes et des haptènes. Des anticorps élaborés dans des espèces animales telles que des chèvres et des lapins sont particulièrement convenables. Des antigènes tels que des hormones et des protéines du plasma

sanguin ainsi que des haptènes conviennent. Une iamnuno-

globuline, et en particulier l'immunoglobuline IgG, est particulièrement utile en raison de sa disponibilité et du fait qu'elle se comporte à la fois comme antigène et comme anticorps. Des antigènes qui contiennent naturellement une porphyrine combinée au fer telle que l'hémoglobine, la myoglobine et le cytochrome C, peuvent être utilisés comme

conjugué entier.

Du fait que l'indicateur se comporte comme un catalyseur plutôt que comme un corps réactionnel, chaque indicateur produit plusieurs photons, tandis qu'un

indicateur du type du luminol n'en produirait qu'un seul.

Cela offre deux avantages, à savoir une plus grande

sensibilité et une émission prolongée.

L'indicateur du type métalloporphyrine peut être une molécule renfermant une métalloporphyrine et en particulier une protéine contenant une porphyrine qui renferme du fer. Il peut s'agir de porphyrine combinée au fer proprement dite telle que l'hémine. L'hémoglobine, la

myoglobine, le cytochrome C et la catalase conviennent.

L'indicateur du type métalloporphyrine est lié à

l'antigène ou à l'anticorps par des substances bifonction-

nelles de liaison connues telles que le chlorure cyanurique,

le chlorure d'acrylyle et le glutaraldéhyde.

Le conjugué est utile dans diverses épreuves d'immunité pour déterminer la concentration d'un corps inconnu dans une substance à analyser. De telles épreuves utilisent un réactif, une substance à analyser et un conjugué. Dans une épreuve compétitive, le réactif qui est généralement lié à une phase solide telle qu'un "Nylon" ou un polystyrène doit être un partenaire de liaison pour le conjugué. La substance à analyser peut être un partenaire de liaison pour le conjugué ou pour le réactif, mais non pour les deux. Dans une épreuve du type "sandwich", le conjugué et le réactif ne peuvent pas être des partenaires de liaison l'un pour l'autre. Tous deux sont des partenaires de liaison pour la substance à analyser. Les réactions de liaison peuvent être illustrées graphiquement comme suit: A. Epreuve compétitive Réactif Substance Conjugué (phase solide) à analyser

-Ab+Ag-

marqueur (1) -Ab + Abs + Ag-marqueur-- + s

Abs+Ag-

marqueur

-Ab-Ag-

,marqueur (2) -Ab + Ags + Ag-marqueur---> + 3 -Ab-Ags I B. Epreuve à double site ou sandwich

3+ Ab'-marqueur- -Ab+ Ag + -Ab'-

marqueur Ainsi, dans une épreuve compétitive, la quantité de conjugué qui peut réagir avec le réactif est d'autant plus faible que la quantité de corps inconnu (Abs ou Ags) dans la substance à analyser est plus grande. C'est le contraire qui est vrai dans une épreuve à double site. A mesure que la quantité de corps inconnu dans la substance à analyser augmente, la quantité de conjugué qui réagit avec le réactif augmente

également.

Pour déterminer la quantité de corps inconnu dans la substance à analyser, on sépare le réactif des corps réactionnels restants. C'est pour la commodité de la séparation que le réactif est généralement lié à une phase solide. Après la séparation, qui comprend un lavage correct destiné à s'assurer qu'il ne reste pas de conjugué n'ayant

pas réagi, le réactif est mélangé avec un corps chimio-

luminescent. On donne la préférence au luminol à cause de son efficacité. D'autres substances chimioluminescentes qui

peuvent être utilisées comprennent le tétra-bis-(diméthyl-

amino)-éthylène, la luciférine, la lucigénine (nitrate de diméthyldiacridinium) et le chlorure d'oxalyle. Le perborate de sodium constitue un oxydant apprécié. Toutefois,

on peut utiliser d'autres catalyseurs connus.

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Le composant métallique du marqueur dans le

conjugué est capable de catalyser la réaction de chimio-

luminescence. La quantité d'émission de lumière enregistrée d'une manière classique permet un dosage quantitatif du conjugué qui est lié au réactif et, par conséquent, la détermination de la quantité de corps inconnu dans la

substance à analyser.

La mise en pratique de l'invention est illustrée

par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif.

EXEMPLE 1

Epreuve compétitive de dosage d'une immunoglobuline humaine G A. Préparation du réactif (phase solide) On hydrolyse partiellement de la toile de "Nylon" par traitement dans de l'acide chlorhydrique 2 N à 370 pendant environ 18 heures. On lave le "Nylon" pour le débarrasser de l'acide avec une solution de Na2CO3 0,01 M, à pH 10, puis on le lave avec de l'eau. On place le "Nylon" dans

une solution de 400 mg de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-

carbodiimide dans l'eau, à pH 3,7. On maintient le pH entre 3,5 et 3,8. On poursuit la réaction d'activation à la température ambiante jusqu'à ce que la consommation d'acide ait cessé. On lave rapidement le "Nylon" deux fois avec de

l'acide chlorhydrique dilué (pH 3,4 à 3,8).

Une immunoglobuline humaine, dissoute dans du chlorure de sodium 50 mM, à pH 3,4, à la concentration de mg de protéine par ml, est ajoutée au "Nylon" activé lavé et le pH est progressivement élevé à 7 en 60 minutes. On laisse la réaction de fixation se poursuivre pendant minutes à pH 7. On ajuste le pH à une valeur de 7,2 à 7,4

et on fait incuber la composition pendant 4 heures.

On lave le "Nylon" conformément à la séquence suivante: NaCl 2 M, deux fois; eau; tampon au phosphate mM, pH 7,35, contenant du chlorure de sodium 0,3 M, 0,2 % de sérum-albumine de boeuf et 0,1 % de "Tween 80", deux fois; solution saline tamponnée au phosphate, deux fois; et eau. Le réactif "Nylon"-immunoglobuline lavé est séché à l'air et utilisé en morceaux de 1 cm2 comme phase solide dans

des épreuves d'immunité.

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B. Préparation du conjugué Un conjugué ferroporphyrine-anticorps est préparé comme suit: un sérum anti-humain de chèvre est partiellement purifié par précipitation au sulfate d'ammonium et dialysé vis-à-vis d'une solution physiologique de sel. On ajoute 30 mg de bicarbonate de sodium et 2 ml d'eau à 2 ml de cette solution (100 mg de protéine). Une solution de chlorure cyanurique dans le dioxanne, à une concentration de 4 mg/ml, est ajoutée à la solution de globuline sous agitation rapide. Au bout de 2 minutes, on ajoute une solution de 100 mg d'hémoglobine dans 4 ml d'eau et on laisse la réaction de liaison se poursuivre pendant

18 heures à 25 C.

Lorsque la réaction est terminée, on charge le

mélange sur une colonne (1,5 x 100 cm) de gel de polyacryl-

amide "Bio-Gel P-200" (particules de 74 à 149 pm) et on effectue l'élution avec un tampon au phosphate 0,002 N (pH 7,0) contenant du chlorure de sodium 0,05 M et 0,02 % d'azoture de sodium. On peut ainsi éliminer du conjugué la totalité de l'hémoglobine n'ayant pas réagi. Les fractions renfermant une activité en hémoglobine et en anticorps sont

rassemblées et utilisées comme conjugué.

C. Préparation de corps réactionnels chimioluminescents Les mesures par lecture de la chimioluminescence

sont effectuées sur un photomètre "Chem-Glo" Aminco.

Les solutions suivantes sont utilisées pour les analyses de chimioluminescence: Solution-mère de luminol On ajoute 4 ml d'hydroxyde de sodium décinormal à

2,00 mg de luminol et 32 mg de glucose. Lorsque la disso-

lution du luminol est terminée, on ajuste le volume de la solution à 100 ml avec de l'eau. On conserve la solution à 4 . Solution de luminol de travail Chaque jour ouvrable, on complète à 100 ml avec de l'eau un volume de 1,00 ml de la solution ci-dessus et de

ml d'hydroxyde de sodium décinormal.

Solution de perborate Chaque jour ouvrable, on dissout 77 mg de

perborate de sodium dans 100 ml d'eau.

Les analyses de chimioluminescence ont été effectuées comme suit: On place dans une cuve 0,5 ml de la solution à analyser, préparée dans la solution-mère de luminol indiquée ci-dessus. On place la cuve dans le compartiment à échantillon de l'appareil de mesure "Chem-Glo". On y introduit ensuite 0,1 ml de la solution de perborate. On prend comme sortie lumineuse l'écart maximal du stylet sur l'enregistreur. Dans la plupart des cas, on utilise une

moyenne des résultats de trois injections d'échantillons.

D. Méthode d'analyse On effectue une épreuve immunologique avec la phase solide "Nylon"-immunoglobuline humaine et le conjugué ferroporphyrineanticorps. On fait incuber des disques de "Nylon" (surface = 1 cm 2) avec 0,4 ml de conjugué à diverses dilutions plus 0,1 ml de solution saline tamponnée au phosphate ou 0,4 ml de conjugué à diverses dilutions plus 0, 1 ml d'une solution d'immunoglobuline humaine. Toutes les dilutions de conjugué et d'immunoglobuline humaine sont

préparées avec la solution de sel tamponnée au phosphate.

Après incubation pendant 60 minutes à la température ambiante, on aspire les solutions et on lave les disques de "Nylon" successivement avec 4,5 ml de solution à 0,5 % de sérum-albumine de boeuf et 0,05 % de "Tween 20", du chlorure de sodium 2 M à pH 9,0, la solution de sérum-albumine de boeuf et de "Tween 20", et deux fois avec un tampon au

phosphate 0,01 M, pH 6,1.

Après lavage, on élue des disques individuels avec une solution de luminol de travail. A cette fin, on ajoute 3,0 ml de solution de luminol de travail à chaque tube et on soumet le tube et son contenu à l'action des ultrasons pendant 5 minutes. On introduit une portion aliquote de 500 pi de la solution dans une fiole qu'on place dans un instrument convenable tel qu'un photomètre "Chem-Glo" Aminco, on la fait réagir avec une solution de perborate de sodium et on enregistre l'information lumineuse qui en résulte. E. Résultats Les résultats obtenus sont reproduits sur le tableau I. L'inhibition de la fixation du conjugué sur la phase "Nylon"-immunoglobuline humaine insoluble s'observe dans une large plage de concentrations du conjugué et de

concentrations d'immunoglobuline en compétition.

TABLEAU I

Désignation de Concentration Immunoglobuline Intensité la feuille de du conjugué soluble ajoutée lumineuse "Nylon" (mg/ml) (pg) relative

A 0,1 0 4300

B 0,1 0,1 2885

C 0,04 0 1995

D 0,04 0,1 1245

E 0,04 100,0 202

F 0,02 0 1490

G 0,02 0,1 364

H 0,01 0 1125

I 0,01 0,1 182

J 0,000 0 52

EXEMPLE 2

Préparation de conjugués hémoglobine-anticorps

On a préparé une série de conjugués hémoglobine-

anticorps comme indiqué sur le tableau II.

TABLEAU II

Etape d'activation Exemple Volume, Chlorure

ml cyanuri-

que, mg

II-A 4 4

B 4 8

C 4 4

D 4 4

E 4 8

F 4 2

G 4 1

H 10 4

I 10 4

J 10 2

K 20 4

L 4 4

Temps, Tempé-

s rature, oC o o Etape de liaison Hémoglobine, mg Composition du produit Hémoglobinea

Immuno-

globuline 0,83 0,65 0,63 0,74 produits insolubles 0,49 0,19 1,34 1,07 0, 90 1,05 1,73 a Rapport molaire, déterminé à partir de la quantité d'hémoglobine libre et de la quantité d'hémoglobine dans la fraction oligomérique comme indiqué par analyse

sur colonne de filtration sur gel comme dans l'exemple 1.

Des conjugués ont été testés et ont présenté tant des propriétés de catalyse de la chimioluminescence que des propriétés immunologiques. Des résultats semblables à ceux de l'exemple 1 ont été obtenus dans l'épreuve immunologique avec les conjugués II-C et II-L et l'anticorps lié au "Nylon" de

l'exemple 1.

EXEMPLE 3

Dosage compétitif d'immunoglobulines dans du sérum humain Une immunoglobuline humaine liée au "Nylon", telle que préparée dans l'exemple 1, et de l'hémoglobine conjuguée à une anti-immunoglobuline (exemple II-C) ont été soumises à l'incubation en présence et en l'absence de sérum humain. On a observé une réduction de l'information lumineuse

en présence de sérum humain.

EXEMPLE 4

Dosage direct de l'hémoglobine humaine Un anticorps anti-hémoglobine humaine est partiellement purifié par précipitation au sulfate d'ammonium et dissous à 12 pg de protéine par ml de carbonate de sodium 0,05 M de pH 9,6. L'anticorps est fixé par adsorption sur des tubes en polystyrène ("Falcon" NO 2054) pendant 1 heure à 370C. Les tubes porteurs de l'anticorps,

formant la phase solide, sont traités avec de la sérum-

albumine de boeuf à 0,5 % pendant 30 minutes à 370C et lavés deux fois avec de la sérum-albumine de boeuf à 0,2 % contenant 0,5 % de "Tween" en solution saline tamponnée. On fait incuber les tubes porteurs de l'anticorps en l'absence et en présence d'hémoglobine humaine pendant 30 minutes à la température ambiante et on les lave trois fois avec la solution saline tamponnée d'albumine et de "Tween", puis on

mesure la chimioluminescence comme dans l'exemple 1.

L'émission de lumière est plus grande lorsque de l'hémo-

globine est ajoutée aux tubes et elle est proportionnelle à

la quantité d'hémoglobine présente.

EXEMPLE 5

Dosage immunologique de la myoglobine L'anticorps relatif à la myoglobine est adsorbé sur du polystyrène et des dosages immunologiques sont effectués comme dans l'exemple 4 en donnant des résultats similaires.

EXEMPLE 6

Dosage de la gonadotrophine chorionique par la méthode à double site (sandwich) A. Préparation du réactif

On utilise un anticorps de chèvre anti-

gonadotrophine chorionique humaine (GCH) lié à des perles de "Nylon": L'hydrolyse partielle du "Nylon" est effectuée pendant 2 heures avec de l'acide chlorhydrique normal. Les perles sont lavées et des groupes carboxyle additionnels sont introduits par réaction des perles avec un excès d'anhydride maléique à un pH constant de valeur comprise entre 8 et 9 pendant 1 heure. On lave les perles et on active les groupes carboxyle avec 2 g de carbodiimide hydrosoluble à un pH constant de 4,5 à 5,2 pendant 30 minutes. Le carbodiimide en excès est éliminé et l'anticorps anti-GCH de chèvre est lié aux perles pendant 3 heures à la température ambiante, puis pendant 18 heures à 4 C. Les perles portant les anticorps sont traitées avec de la sérum-albumine de boeuf à 0,2 % en solution saline tamponnée, lavées et conservées dans de la sérum-albumine de boeuf en solution saline tamponnée à 4 C

avant l'utilisation.

B. Préparation du conjugué

On prépare un peptide contenant de la ferro-

porphyrine, dérivé du cytochrome C, par digestion du cytochrome C par la pepsine, suivie d'une précipitation par un acide et d'une dialyse. Ce peptide donne un plus fort rendement de chimioluminescence par molécule de porphyrine que le cytochrome C lui-même. L'anticorps anti-GCH de chèvre est partiellement purifé par précipitation au sulfate d'ammonium et digestion avec de la pepsine pour produire des fragments (Fab')2 qui sont purifiés par filtration sur gel sur une colonne de "Sephadex G-75". Des groupes thiol sont fixés sur le fragment d'anticorps au moyen de thiolactone de N-acétylhomocystéine et le fragment d'anticorps thiolé est séparé de l'excès de réactif d'introduction des groupes thiol par filtration sur une colonne de gel de "Sephadex G-25". Le peptide contenant de la ferroporphyrine est activé en vue de la conjugaison avec le fragment d'anticorps thiolé par

introduction de groupements maléimide au moyen de l'ester m-

maléimidobenzoylique du N-hydroxysuccinimide, suivie d'une filtration sur "Sephadex G-25". On prépare le conjugué en mélangeant le fragment thiolé d'anticorps et le peptide renfermant la maléimido-ferroporphyrine pendant 1 heure à la température ambiante, l'opération étant suivie d'une

filtration sur colonne de gel de "Sephadex-G-75".

On effectue des dosages immunologiques en utilisant l'anticorps anti-GCH lié à des perles de "Nylon" et la ferroporphyrine conjuguée aux fragments d'anticorps

dérivés de l'anticorps anti-GCH.

C. Méthode de dosage Des perles de "Nylon" conjuguées avec l'anticorps anti-IgG humaine sont placées dans des tubes de verre et soumises à l'incubation pendant 30 minutes à 370C avec 2,5 unites internationales de gonadotrophine

chorionique humaine dans une solution à 0,2 % de sérum-

albumine de boeuf dans du sérum physiologique tamponné au phosphate ou dans ce sérum tamponné seul. Les solutions sont ensuite aspirées et les perles sont lavées avec une solution de HEPES 0,05 M et NaCl 0,15 M, de pH 7,2, puis on les fait incuber pendant 30 minutes à 37 C avec différentes dilutions du conjugué dans un tampon de HEPES 0,05 M et NaCl 0,15 M, de pH 7,2. Après incubation à 37 C pendant 30 minutes, on lave les perles une fois de plus, puis on les élue avec 0,5 ml de dodécylsulfate de sodium à 0,1 % pendant 5 minutes. On ajoute du luminol et on mesure l'émission de lumière comme dans

l'exemple 1. Le tableau VI indique des résultats représen-

tatifs de cette épreuve "sandwich" à double anticorps de

dosage d'un antigène.

TABLEAU VI

Tube GCH ajoutée Dilution du Sensibilité conjugué lumineuse relative

1 + 1:5 61,1

2 + 1:10 39,0

3 + 1:25 16,1

4 + 1:50 3,25

+ 1:100 2,40

6 + - 1,21

7 - 1:5 19,5

8 - 1:10 4,81

9 - 1:25 3,56

- 1:50 2,34

11 - 1:100 2,21

12 - - 1,63

Ces résultats font apparaître l'accroissement de la chimioluminescence indiquant une accentuation de la fixation du conjugué en présence de gonadotrophine chorionique humaine dans une large plage de dilutions du conjugué.

Claims (9)

REVENDICATIONS

1. Conjugué destiné à être utilisé dans une méthode de dosage immunologique dans laquelle ce conjugué peut être détecté par chimioluminescence, caractérisé en ce qu'il comprend un composé doué d'activité immunologique

auquel est lié un marqueur du type d'une métalloporphyrine.

2. Conjugué destiné à être utilisé dans une méthode de dosage immunologique dans laquelle ce conjugué peut être détecté par chimioluminescence, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps ou un partenaire de liaison d'un anticorps auquel un marqueur du type d'une métalloporphyrine

est lié.

3. Conjugué destiné à être utilisé dans une méthode de dosage immunologique dans laquelle ce conjugué peut être détecté par chimioluminescence, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps auquel est lié un marqueur

consistant en porphyrine combinée au fer.

4. Conjugué destiné à être utilisé dans une méthode de dosage immunologique dans laquelle ce conjugué peut être détecté par chimioluminescence, caractérisé en ce qu'il comprend un antigène auquel est lié un marqueur

consistant en une porphyrine combinée au fer.

5. Conjugué destiné à être utilisé dans une méthode de dosage immunologique dans laquelle ce conjugué peut être détecté par chimioluminescence, caractérisé en ce qu'il comprend une protéine à laquelle est lié un marqueur

consistant en une métalloporphyrine.

6. Conjugué suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la protéine est une immunoglobuline ou

une hormone.

7. Conjugué suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le marqueur est une porphyrine combinée au fer, de préférence dérivée d'hémoglobine ou de myoglobine ou dérivée du cytochrome C.

8. Conjugué destiné à être utilisé dans le dosage qualitatif et quantitatif d'anticorps et d'antigènes dans des liquides corporels par des méthodes immunologiques, capable de réagir avec un antigène ou avec un anticorps ou avec les deux et comportant un marqueur capable de catalyser une réaction de chimioluminescence, caractérisé en ce qu'il comprend un antigène ou un anticorps auquel est lié un

marqueur consistant en une métalloporphyrine.

9. Conjugué destiné à être utilisé dans le dosage qualitatif et quantitatif d'anticorps et d'antigènes dans des liquides corporels par des méthodes immunologiques, capable de réagir avec un antigène ou un anticorps ou avec les deux et comportant un marqueur capable de catalyser une réaction de chimioluminescence, caractérisé en ce qu'il comprend une immunoglobuline à laquelle est liée une porphyrine combinée

au fer, dérivée de l'hémoglobine.