JPH06100597B2 - 改良発光分析 - Google Patents

改良発光分析

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JPH06100597B2
JPH06100597B2 JP61046464A JP4646486A JPH06100597B2 JP H06100597 B2 JPH06100597 B2 JP H06100597B2 JP 61046464 A JP61046464 A JP 61046464A JP 4646486 A JP4646486 A JP 4646486A JP H06100597 B2 JPH06100597 B2 JP H06100597B2
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Description

【発明の詳細な説明】 ＜発明の背景＞ 臨床、診断分野での通常の非放射線分析には臨床上意味
のある物質（以下リガンドという）の分光分析や螢光分
析がある。かかる方法は高感度にして特異的であり、光
学特性の変化即ち分析液中の特定のリガンドの存在によ
つてもたらされる分析液の光伝播性や螢光特性の変化の
測定によるものである。
分光分析では測定されるリガンドとリガンドに特異的な
試薬系との分析液中での相互作用により分析液中の光伝
播性が検知しうる程度に変化する。光伝播性の変化は分
析液中に既知強度の光線を通したとき特定の波長帯内で
分析液によつて吸収され又は散乱された光の量に係わ
る。分析液の光伝播性の変化は分析液に既知強度の単色
光を通して入射光の強度に対する透過又は散乱光の強度
の比を測定して求められる。ほとんどすべてのリガンド
が特定波長のエネルギーを吸収するか又は分析液中で分
析液の光伝播性に検知しうる変化を与えるという事実に
より多くの分光分析法が提案されてきた。分析液の光伝
播性の変化を測定する分光分析法にはたとえば分析液の
色変化即ち比色分析及び分析液の濁り度変化即ち濁度分
析又は比濁分析がある。比色分析では分析液の光伝播性
の変化は一般に分析液の吸光度で示され、測定すべきリ
ガンドとリガンドに特異的な試薬系との相互作用に基づ
く分析液の色の変化に依存する。分析液の吸光度は分析
液中のリガンドの濃度に関連する。比色分析は分析液中
の測定すべき特定リガンドと相互作用しうる色原体試薬
系を利用し、分析液の光伝播性、特に色に検知しうる変
化を生じさせるものである。リガンド測定に有用な多く
の色原体試薬系が知られている。比濁分析の原理は分析
液に光を通したとき特定物質により散乱又はブロツクさ
れた光の量を測定するものである。濁度分析では測定す
べきリガンドとそのリガンドに特異的な試薬との相互作
用により分析液中に粒状懸濁物を生成させる。既知強度
の光線を分析液に通すとこの生成懸濁物が入射光を散乱
又はブロツクして透過光の強度を減ずる。濁度分析での
光伝播性の変化は分析液を通過した光強度の減少で示さ
れ、懸濁物が散乱又はブロツクした入射光量に係り、存
在する粒子の数と断面積に依存する。比濁分析（ネフエ
ロメトリツクアセイ）は濁度分析と類似しており、リガ
ンドとそれに対し特異的な試薬系で粒子懸濁物をつく
る。比濁分析では分析液の光伝播性の変化は懸濁物によ
り散乱又はブロツクされた入射光量に係るが、濁度分析
と異なり、分析液を透過した光の強度を測定し、散乱又
はブロツク光を分析液への入射光に対する角度で測定す
る。それ故比濁分析では、光伝播性の変化は分析液に入
射した光の強度と入射光に対する角度で散乱した光の強
度の数で示される。濁度及び比濁分析は血液、尿、脊髄
液等の分析で蛋白等のリガンド測定に用いられるが、特
に有効な色原体試薬系がないため比色分析ができないと
きに有用である。ユー及びクリマン著、フオトエレクト
リツク・ケミカル・アナリシス、Vo lII:ネフエロメト
リー（ニユーヨーク、Wiley and Sons,Inc.,）1929参
照。
螢光分析では主に分析液中のリガンドを化学的又は免液
学的に螢光錯体又はコンジユゲートに変えて分析液の螢
光特性に検知しうる変化を生ぜしめる。螢光特性の変化
は生じた螢光錯体又はコンジユゲートをフルオレサーの
励起波長帯内の波長の単色光で励起し、フルオレサーの
放出波長帯内の波長での放出光の強度を測定することに
よつて測定される。放出光の螢光強度はリガンドの濃度
に関連する。しかし分析液によつて放出されるフルオレ
センスの強度は測定すべきリガンドがサンプル中に存在
する蛋白質やリン酸塩等の非螢光干渉物と錯体をつくつ
たり又は測定すべきリガンドを含むサンプルがフイルタ
ーとして作用するに足る色を持ち放出されたフルオレセ
ンスの強度を減少する場合には阻害される。螢光分析の
感度と特異性を最大にするためにこれらの阻害因子があ
る場合は、分析前に非螢光干渉物又は色生成性物質を除
去するかサンプルの第２部分に加えた内部標準を用いて
これらの因子の存在を補償し内部標準を含む部分を用い
て完全な分析法を行なうことによつてこれら因子を打破
しなければならない。
本出願人による米国特許第4,495,293号（1985,1,22発
行）には分析液によつて放出されたフルオレセンスの強
度が測定すべきリガンドとリガンド存在下に分析液の光
伝播性に変化を生じうる試薬系との相互作用で生じた光
伝播性の変化に関連している螢光分析法が開示されてい
る。
＜発明の要約＞ 本発明はリガンドを含有すると思われるサンプル中のリ
ガンドの存在又は量を測定する改良法を提供する。
本発明方法は、ａ）（ｉ）サンプル、（ii）有効量の発
光（ルミネツセント）試薬、及び（iii）測定すべきリ
ガンドの存在下に発光試薬によつて放出された光の放出
波長と重複する波長帯内で分析液の光伝播性に変化をも
たらしうる試薬系の有効量からなる分析液をつくり;b）
発光試薬を活性化し；次いでｃ） 分析液によつて放
出された光の強度をサンプル中のリガンドの濃度の尺度
として測定することからなる。
本発明はまたリガンドを含有すると思われるサンプル中
のリガンドの存在又は量を測定するに有用な新規試薬組
成物に関する。この試薬組成物はリガンドを含有する溶
液の光伝播性に変化をもたらしうる試薬系の有効量と発
光試薬の有効量この発光試薬はそれとリガンドを含む溶
液の光伝播性の変化に関連した波長帯内に放光波長を持
つ）からなる。
＜発明の具体的説明＞ 前記したように、本発明方法に従い、まずサンプルと有
効量の発光試薬と有効量の試薬系を組合せて生化学的サ
ンプル中のリガンドを測定する。発光試薬を次に活性化
し、サンプル中のリガンドの濃度の指標として分析液に
よつて放出した光の強度を測定する。分析液によつて放
出した光の強度はリガンドと試薬系の相互作用で生じた
分析液の光伝播性の変化に比例する。ここで「分析液の
光伝播性の変化」とは既知強度の光線が分析液を通つた
とき特定の波長帯内で分析液によつて吸収又は分散され
る光の量であり、分析液の色又は濁度の変化に依存す
る。特に、光伝播性の変化は、特定波長帯内で分析液に
よつて吸収又は散乱される光の量の変化に相当し、リガ
ンドとそれに対し特異的な試薬系との相互作用によつて
実質上もたらされる。
この光伝播性の変化は、既知強度を持つ単色光を分析液
に通し、透過した又は散乱した光の強度と入射光の強度
の比を測定することによつて求められる。光伝播性の変
化、即ち、特定波長内で分析液によつて吸収又は散乱し
た光の量は分析液中のリガンドの濃度に比例する。リガ
ンド、試薬系及び発光試薬を含む分析液では、発光試薬
の放出波長帯と重複する波長帯内で、リガンドと試薬系
の相互作用で生ずる光伝播性の変化は、また分析液によ
つて放出した光の強度の比例変化をもたらすことが判つ
た。従つて、本発明方法によれば、分析液によつて放出
した発光光（ルミネスセントライト）の強度は分析液中
のリガンド濃度に比例する。本発明方法によれば、測定
すべきリガンドと、試薬系と発光試薬を含む分析液によ
つて放出した発光光の強度は、試薬系と発光試薬だけを
含む分析液によつて放出した発光光の強度と比較したと
き、リガンドと試薬系の相互作用によつて生じた光伝播
性の変化に完全に基づく。分析液中の発光試薬と他の成
分、即ち測定すべきリガンド又は試薬系との間には、化
学的にも免疫学的にも、反応は起こらない。従つて、分
析液によつて放出した発光光の強度は発光試薬と分析液
中に存在しうる色原体物質又は懸濁粒子間の分子間距離
には依存しない。
本発明方法によつて測定しうるリガンドの例には、比色
分析的に、濁度分析的又は比濁分析的に測定しうる臨床
的に意味のある物質がある。即ち、リガンドは試薬系と
の相互作用により分析液中のリガンド濃度に関連した光
伝播性の変化を生じうるものである。かかるリガンドの
代表例には、グルコース、尿酸、コレステロール、クレ
アチン、ラクテート、ラクテートデハイドロゲナーゼ
（LDH）、トリグリセリド、イムノグロブリン、コリン
ステラーゼ、血清グルタメート オキサラクテート ト
ランスアミナーゼ（SGOT）、血清グルタメート ピブレ
ート トランスアミナーゼ（SGPT）、クレアチン ホス
ホキナーゼ（CPK）、エタノール、全蛋白、アルブミ
ン、カルシウム、ビリルビン、血尿窒素（BUN）、アン
モニア、マグネシウム、リン、塩化物等がある。
「発光試薬」とは試薬系及びリガンドを含有する溶液の
光伝播特性に関連した発光特性を持つ化合物又は組成物
である。特に発光試薬に伴う放出波長帯はリガンドと試
薬系の相互作用で生ずる分析液の光伝播性の変化に伴な
う波長帯内にある必要がある。また発光試薬と測定すべ
きリガンド又は試薬系の間には化学的又は免疫学的結合
はない。他の配慮は試薬系のpHに関する。発光試薬は試
薬系が測定すべきリガンドと相互作用するに有効なpH範
囲内で発光する必要がある。比色分析において、発光試
薬に伴う放出波長帯は少くとも１部はリガンドと色源体
試薬系の相互作用に伴なう吸収波長帯内にある必要があ
る。濁度又は比濁分析において発光試薬に伴う放出波長
帯は少なくとも１部はリガンドを及び濁度又は比濁分析
試薬を含む分析液の濁度を測定する波長帯内にある必要
がある。
本発明では種々の発光試薬を用いうる。たとえば化学発
光試薬、リン発光試薬又は生物発光試薬等を用いうる。
いづれの試薬を用いるかは測定すべきリガンドと用いる
色源体試薬に主に依存する。代表的な発光試薬には、た
とえば、アンスラセン、トリフエニルベンゼン、ジフエ
ニル−ナフタレン、ペリレン、クリセン、アクリジニウ
ム、トランス−アゾジカルボキシレート、オキザレー
ト、ルミノール、ロフイン、ルシゲニン、ルシフエリ
ン、ピロガロール、腔腸発色団がある。
これらの発光試験は、過酸化水素、フエリシアンカリ、
過マンガン酸カリ、金属イオン等の化合物類を用いた
り、ルシフエラーゼやパーオキシダーゼ等の生化学触媒
を用いたり、温度、pHの変化、放射線照射（Ｘ線等）を
用いることによつて光発生を誘発しうる。
本発明で用いる用語「試薬系」とはリガンドの存在下に
発光試薬の放出波長帯と重複する帯に変化をもたらす１
又は２以上の試薬を含む化学系をいう。本発明に有効な
試薬系は測定すべきリガンドと、測定すべき光伝播性の
変化が分析液の色又は濁度の変化によるかどうかに依存
する。比色分析、即ち分析値の色の変化が分析液の光伝
播性の変化に関連する場合には、色原体試薬系が試薬系
として用いられる。濁度、即ち粒状懸濁物によつてブロ
ツク又は散乱した光の量、が分析液の光伝播性の変化に
関連する場合は、濁度分析試薬系又は比濁分析試薬系が
それぞれ用いられる。
用語「色原体試薬」とは特定の反応シーケンスで測定す
べきリガンドと反応して分析液の光伝播性、特に比色分
析的性質に、発光試薬の励起及び／又は放出波長帯内で
検知しうる変化をもたらす１又は２以上の試薬を含む化
学系をいう。添加順序が特定の反応シーケンスによつて
限定されないかぎり、色原体系を含む種々の試薬を個別
に又は組合せて分析液に加えうる。リガンドの比色測定
に用いたかかる色原体試薬は公知である。たとえばヘン
リー等著、クリニカル ケミストリー、プリンシプルス
アンド テクニツクス；ニユーヨーク、ホーバー メ
デイカル デイビジヨン、Haper ＆ Row（1964）；テイ
ーツ著、フアンダメンタル オブ クリニカル ケミス
トリー、W.B.Sauders社（1970）参照。種々の分析キツ
トと試薬系が市販されており、本発明で用いうる。一般
に、これらの比色分析法はリガンドが色生成性試薬を含
有する試薬系と反応して分析液に検知しうる色変化をも
たらす。代表的な色原体試薬系の例には、終点と動的測
定を含むオキシダーゼ反応系及びNADH/NAD反応系があ
る。たとえばオキシダーゼ反応系はリガンドと反応する
酸化性酸素を利用して過酸化水素を放出しこれがパーオ
キシダーゼの存在下に染料と反応してサンプル中のリガ
ンド量の尺度として分析液の比色性に変化をもたらす。
NADH/NAD反応系はNADのNADHへの還元又はNADHのNADへの
酸化及びその線の染料系との反応による、サンプル中の
リガンド濃度の尺度としての分析液の比色性の変化を利
用するものである。「有効量の試薬系」とは、リガンド
の存在下に分析液の比色性に検知しうる変化を生ずるに
十分な試薬の量をいう。かかる有効量は当業者が適宜容
易に確認しうる。
次に色原体試薬系のいくつかと本発明方法に従つて利用
しうる反応シーケンスを例示する。
以下の略号は次の意味をもつ： DHBS…3,5−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンナトリ
ウム スルホネート AAP……４−アミノアンチピリン HRPO…山葵パーオキシダーゼ NAD……酸化ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド NADH…還元ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド LDH……ラクテート デヒドロゲナーゼ SGOT…血清グルタミツクオキザル酢酸トランスアミナー
ゼ SGPT…血清グルタミツク ピブリツク トランスアミナ
ーゼ CPK……クレアチン ホスホキナーゼ INT……２−（ｐ−ヨードフエニル）−３−（ｐ−ニト
ロフエニル）−５−フエニルテトラゾリウムクロリド ATP……アデノシン トリホスフエート ADP……アデノシン ジホスフエート EGTA…エチレングリコール−ビス（β−アミノエチレン
エーテル）−N,N′−テトラ酢酸 尚、次の反応シーケンスのいくつかでは生成物の特定構
造が不確実であるので、分析液の色を生じ、分光分析で
測定される反応シーケンスの生成物を、特にことわらな
い限り、「色原体」（クロモゲン）として一般的に示
す。
NADH/NAD系を示す反応シーケンス11〜16で、分析液の色
を生ずる生成物はホルムアジンである。血尿窒素の分析
を示す反応シーケンスでの分析液の色を生ずる生成物は
インドフエノールである。クロリドの分析を示す反応シ
ーケンス24での分析液の色を生ずる生成物はチオシアン
化第二鉄である。
1.リガンド：グルコース 色原体試薬系：グルコース オキシターゼ DHBS AAP HRPO 反応シーケンス： 2.リガンド：尿酸 色原体試薬系：ユリカーゼ DHBS AAP HRPO 反応シーケンス： 3.リガンド：コレステロール（コレステロールとコレス
テロールエステル） 色原体試薬系：コレステロール エステラーゼ コレステロール オキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応シーケンス： 4.リガンド：クレアチニン 色原体試薬系：クレアチニナーゼ クレアチナーゼ サルコシン オキシターゼ DHBS AAP HRPO 反応シーケンス： 5.リガンド：乳酸塩（ラクテート） 色原体試薬系:NAD LDH ピルベート オキシターゼ DHBS AAP HRPO 反応シーケンス： 6.リガンド：トリグリセリド 色原体試薬系：リパーゼ グリセロール ホスフエート オキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応シーケンス： 7.リガンド：コリンエステラーゼ 色原体試薬系：アセチルコリンエステラーゼ コリンオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応シーケンス： 8.リガンド:SGOT 色原体試薬系：アスパレート α−ケトグルタレート オキザロアセテートデカルボキシラーゼ ピルベート オキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応シーケンス： 9.リガンド:SGPT 色原体試薬系:L−アラニン α−ケトグルタレート ピルベート オキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応シーケンス： 10.リガンド:CPK 色原体試薬系：クレアチン ホスフエート クレアチナーゼ サルコシン オキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応シーケンス： 10.リガンド：エタノール 色原体試薬系:NAD アルコール デヒドロゲナーゼ INT ジアホラーゼ 反応シーケンス： 12.リガンド:SGOT 色原体試薬系：アスパラテート α−ケトグルタレート NAD グルタメート デヒドロゲナーゼ ジアスホラーゼ INT 反応シーケンス： 13.リガンド:SGPT 色原体試薬系:L−アラニン α−ケトグルタレート NAD グルタレート デヒドロゲナーゼ ジアホラーゼ INT 反応シーケンス： 14.リガンド：グルコース 色原体試薬系:ATP ヘキソキナーゼ NAD グルコース−６−ホスフエートデヒドロゲナーゼ INT ジアホラーゼ 反応シーケンス： 15.リガンド:CPK 色原体試薬系：クレアチン ホスフエート ADP グルコース ヘキソキナーゼ NAD グルコース−６−ホスフエートデヒドロゲナーゼ INT ジアホラーゼ 反応シーケンス： 16.リガンド:LDH 色原体試薬系:L−ラクテート NAD INT ジアホラーゼ 反応シーケンス： 17.リガンド：全蛋白 色原体試薬系：酒石酸銅 酒石酸ナトリウム 酢酸クチウム 反応シーケンス： 蛋白質＋酒石酸銅＋酒石酸ナトリウム＋水酸化リチウム
→色原体 18.リガンド：アルブミン 色原体試薬系：プロモクレオゾール グリーン 反応シーケンス： アルブミン＋プロモクレオゾルグリーン→色原体 19.リガンド：カルシウム 色原体試薬系:o−クレゾールフタレインコンプレキソン ８−キノリノールサルフエート 反応シーケンス： カルシウム＋ｏ−クレゾールフタレイン＋８−キノリノ
ールサルフエート→色原体 20.リガンド：ビリルビン 色原体試薬系:2,4−ジクロロアニリンのジアゾニウム塩
メタノール スルフアミン酸 反応シーケンス： 21.リガンド：血尿窒素（尿素） 色原体試薬系：ウレアーゼ 次亜塩素酸ナトリウム フエノール 水酸化ナトリウム ニトロプルシドナトリウム 反応シーケンス： 2NH3＋2NaClO→2NH2Cl＋2NaOH 2NH2Cl＋２フエノール＋2NaOH →2p−アノフエノール＋2NaCl＋2H2O 2p−アミノフエノール＋２フエノール＋O2 →２ヨードフエノール＋2H2O 22.リガンド：マグネシウム 色原体試薬系：塩化カリウム カルマガイド シアン化カリウム 水酸化カルウム EGTA 反応シーケンス： 23.リガンド：リン 色原体試薬系：モリブテン酸 硫酸 触媒 反応シーケンス： 24.リガンド：クロリド 色原体試薬系：尿素 チオシアン酸カリウム 塩化第二水銀 過塩素酸第二水銀 過塩素酸第二鉄 反応シーケンス： 2Cl-＋Hg（SCN）２→HgCl2＋2SCN- 2SCN-＋Fe++→Fe（SCN）３ 本発明において「濁度分析試薬系」とは、測定すべきリ
ガンドと相互作用して発光試薬の放出波長帯と重複する
波長帯内で分析液の光伝播性、特に濁度に検知しうる変
化を生ぜしめる１又は２以上の試薬を含有する化学系を
いう。本発明では、添加順序が特定の反応シーケンスに
よつて制限されない限り濁度分析試薬系を含有する種々
の試薬を分析液中に個別に又は任意の組合せで加えう
る。種々の濁度分析試薬系が周知である。濁度分析試薬
系を用いる最も重要な分析の１つにヒトのイムノグロブ
リンの濁度分析による測定がある。この分析法の原理は
測定すべきイムノグロブリンに特異的な抗血清からなる
濁度分析試薬系とイムノグロブリンの反応による粒状懸
濁物からなる錯体生成にある。抗血清−イムノグロブリ
ン錯体の形成による粒状懸濁物が分析液の濁度変化をも
たらす。それ故、ヒトイムノグロブリンを越える過剰の
抗血清が分析液中で用いられると、サンプル中のイムノ
グロブリン濃度が増加するにつれ、懸濁物を透過する光
が減少する。
本発明において「比濁分析試薬系」とは、測定すべきリ
ガンドと相互作用して発光試薬の放出波長帯と重複する
波長帯内で分析液の光伝播性；特に濁度に検知しうる変
化をもたらす１又は２以上の試薬を含有する化学系であ
る。比濁分析は、濁度分析と異なり、入射光に対する角
度での測定するものであるが、それ以外は濁度分析と同
じ原理による。多くの濁度（タービデイメトリツク）分
析及び比濁（ネフエロメトリツク）分析が知られてお
り、かかる分析で用いる試薬系は当業者が適宜容易に確
認しうる。
本発明の好ましい方法において、まず分析液をたとえば
後記するような周知の分析装置等のリードセル中に入れ
る。特定波長での放出強度を測定してこの強度を既知の
標準物と対比する。測定すべきリガンドの既知量を含有
する標準物と実質上同様に、未知サンプルに対し本発明
方法を行なうことにより未知サンプル中のリガンド量の
定性的又は定量的測定を行ないうる。
本発明方法で測定しうるリガンドの濃度は用いるルミノ
メータ等の装置や試薬系によつて異なるがリガンドを0.
01〜0.1mMといつた低濃度で含むサンプルを測定でき
る。
分析液のpHは一般に用いる試薬系で異なる。試薬系のpH
はその系のpH範囲で光を放出する発光試薬を選ぶ因子と
なる。
あるリガンドと発光試薬でわずかであり意味のない程度
の量のリガンドと発光試薬の蛋白への非特異的結合が起
こりうる。蛋白干渉が因子である場合には分析液の蛋白
濃度を限界過、ゲル過、沈澱、透析等の前処理で最
小にしておくべきである。またリガンド又は用いた発光
試験の蛋白への非特異的結合はTriton Ｘ−100等の界
面活性剤を分析液に加えて最小化することもできる。
本発明方法は通常約15゜〜40℃、好ましくは約25゜〜40
℃で行なわれる。また実質上一定の温度で行なうことが
好ましい。
次の例は例示のためのものであり、本発明を限定するも
のではない。
例 グルコース分析 使用前に次の溶液を組合せてグルコース作用試薬をつく
つた： 0.2MグリシンpH 7.7の100ml、60mMアデノシントリホス
フエートの1ml、10mMDルシフエリンの1ml、0.1Mリン酸
カリウム中グルコースオキシターゼを2000 4/含有す
る溶液pH 5の4ml、HRPO 400I.U./mlと４−アミノアンチ
ピレン1mg/mlを含有する溶液の4ml、3,5−ジクロロ−２
−ヒドロキシベンゼンスルホネート5.3mg/mlを含有する
溶液の4ml。
上記作用試薬の3mlに、グルコース標準液25μを加え
た。この溶液を室温で３分間培養すると終点色形成に達
した。ここでルシフエラーゼ溶液100μを加えて化学
発光反応を励起した。このキユベツトを急速に混合し、
パーキン エルマー フルオリメータに入れ、励起ラン
プを消して547±14nm放出での発光シグナルのピークを
測定した。次にピーク高さを記録紙上にグルコース濃度
ごとにとつた。グルコース濃度 チヤート単位 0mg/dl 41 100mg/dl 21 300mg/dl 9.5 500mg/dl 5.5 この例の反応スキームは次のとおりである。
グルコース反応 化学発光反応 上記の例から本発明方法が広範な分析系に適用できるこ
とは明白である。既知色原体試薬系を用い発光手段によ
つて未知リガンドの測定を可能にすると共に、本発明に
より色原体試薬系を用いる分析の適用性（linearity）
が増大する。特に、本発明方法により高い吸収値での分
析の適用性が増大する。装置上の制約により比色分析の
適用性が2.0以上の吸収値を持つ色原体濃度でかなり低
下することはよく知られている。本発明方法を用いれば
2.0以上の吸収値を持つ色原体濃度をもたらす試薬系と
リガンドの濃度を用いる分析の適用性が拡大される。
前記したように、本発明の新規試薬組成物は分析液中の
リガンド濃度を測定する。この試薬組成物は、リガンド
に特異的な有効量の試薬系、即ち測定すべきリガンドを
含有する溶液の光伝播性に変化をもたらしうる試薬系、
及びこの試薬系を含有する溶液の光伝播性の変化に伴な
う波長帯の重複する放出波長帯を持つ発光試薬の有効
量、及び測定すべきリガンドからなる。本発明方法に従
つてリガンドを測定するに有用な試薬組成物を生成する
に必要な発光試薬の有効量は分析液の光伝播性の測定を
干渉しないことが判つた。従つて、測定すべきリガンド
とリガンドに特異的な本発明の試薬組成物を含有する分
析液は分光測光的にまたはルミネスセンスによりその中
のリガンド濃度を測定できる。
本発明をグルコース分析系を例に説明したがこれが本発
明をいささかも限定するものでないことは明白である。
本発明は前記反応スキームに示したような種々のリガン
ドを例に示したような発光反応スキームと組合せて色原
体試薬系を利用することにより分析しうる。また例に示
したルシフエリンは当然として、それを前記したような
発光化合物で置きかえて同等の効果を得ることは当業者
の適宜行なえることである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/542 Ａ 8310−2Ｊ

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）ｉ）リガンドを含有すると思われるサ
    ンプル； ii）発光試薬の有効量； iii）測定すべきリガンドの存在下に発光試薬により生
    じた光の放出波長帯と重複する波長帯内で分析液の光伝
    播性に変化をもたらすことのできる試薬系の有効量を組
    合せて分析液をつくり； ｂ） 発光試薬を活性化し；そして ｃ） サンプル中のリガンドの存在又は量の尺度として
    分析液が放出した光の強度を測定することを特徴とする リガンドを含有すると思われるサンプル中のリガンドの
    外部光源の使用を必要としない測定法。
  2. 【請求項２】該試薬系が色原体試薬系又は濁度分析試薬
    系である特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】該試薬系が色原体試薬系である特許請求の
    範囲第２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】発光試薬が化学ルミネスセントである特許
    請求の範囲第１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】発光試薬がホスホレスセントである特許請
    求の範囲第１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】発光試薬がバイオルミネスセントである特
    許請求の範囲第１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】分析液の光伝播性の変化に伴なう吸収波長
    帯が発光試薬によって生じた光の放出波長と重複する特
    許請求の範囲第３項に記載の方法。
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