ES2205001T3 - Procedimiento analitico quimioluminiscente. - Google Patents
Procedimiento analitico quimioluminiscente.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN METODO ANALITICO QUIMILUMINISCENTE EL CUAL COMPRENDE USAR UN CATALIZADOR ADECUADO EN LA REACCION CON LUMINOL O UN LUMINOL SUSTITUIDO Y UN PERBORATO EN UN SOLVENTE ACUOSO Y DETECTAR Y MEDIR LA LUMINISCENCIA PRODUCIDA POR LA REACCION.EN EL METODO, EL SOLVENTE ACUOSO COMPRENDE UN AGENTE QUELANTE NO LUMINISCENTE PARA LA QUELACION DE UN ATOMO DE BORO DEFIECIENTE EN ELECTRONES EN EL PERBORATO.
Description
Procedimiento analítico quimioluminiscente.
Esta invención se refiere al campo de la química
analítica y de diagnóstico para la detección de una serie de
analitos en fluidos biológicos. En particular, se refiere a una
composición generadora de señal útil en ensayos quimioluminiscentes,
a kits de ensayo que la contiene y a procedimientos analíticos en
los cuales se pueden usar la composición y los kits de ensayo.
Los ensayos luminiscentes y luminométricos son
aquellos que producen una emisión de luz como resultado de la
presencia de un analito de interés. La emisión de luz generalmente
es de duración suficiente para ser medida o detectada y permitir
por ello la determinación del analito.
Hay varios tipos principales de ensayos en los
que se puede usar una señal quimioluminiscente con ventaja para
determinar un analito:
- 1.
- Ensayos donde un compuesto quimioluminiscente se usa para marcar directamente ligandos de unión específicos tales como proteínas, oligonucleótidos, antígenos, haptenos, hormonas, ácidos nucleicos y otros compuestos de interés biológico. La quimioluminiscencia se puede detectar añadiendo una peroxidasa y un oxidante al ligando marcado.
- 2.
- Ensayos donde se usan catalizadores o cofactores de reacciones luminiscentes como marcadores para ligandos de unión específicos. Por ejemplo, la peroxidasa se puede conjugar con ligandos y usarse para proporcionar una señal quimioluminiscente.
- 3.
- Ensayos donde se usan reacciones quimioluminiscentes para determinar los productos formados por acción de una enzima marcador que no sea peroxidasa en sustratos adecuados. Un ejemplo de este tipo de ensayo es la determinación de un ligando de unión específico de glucosa oxidasa marcada mediante generación de peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa.
- 4.
- Ensayos que no sean inmunoensayos para determinar un catalizador tal como peroxidasa o un oxidante tal como peróxido de hidrógeno generado como resultado de un analito no inmunoreactivo.
Se proporcionan detalles adicionales de tales
ensayos en la extensa bibliografía tales como la patente de Estados
Unidos número 4.729.950 (Kricka et al) y publicaciones allí
mencionadas.
Habitualmente la fuente del peróxido de hidrógeno
implicado en la reacción luminiscente es un perborato, y el sustrato
para la acción peroxidativa es un
2,3-dihidro-1,4-ftalazinadiona
tal como el luminol. Se observa un bajo nivel de emisión espontánea
de luz cuando se mezcla el luminol con una sal de perborato en
disolución acuosa. Dicha emisión de luz "de fondo" no es
deseable en sistemas químicos (tales como ensayos
quimioluminiscentes) en donde la luz de la oxidación controlada de
luminol se mide para determinar el punto final de la reacción. Por
tanto cuando se diseñan inmunoensayos enzimáticos es importante que
tal emisión de luz "de fondo" se reduzca tanto como sea
posible.
Según la presente invención, los autores
proporcionan un procedimiento analítico quimioluminiscente que
comprende el uso de un catalizador adecuado, tal como una enzima
peroxidasa, en una reacción con luminol o un luminol sustituido y un
perborato en un disolvente acuoso y la deteccción y medición de la
luminiscencia producida por la reacción, que se caracteriza por que
el disolvente acuoso comprende un agente quelante no luminiscente
para quelación de un átomo de boro deficiente de electrones en el
perborato.
Además según la presente invención los autores
proporcionan un reactivo útil en un procedimiento analítico
quimioluminiscente que comprende iones perborato en un disolvente
acuoso que se caracteriza por que el disolvente acuoso comprende
también un agente quelante no luminiscente para quelación de átomos
de boro deficientes de electrones en los iones perborato.
Además según la presente invención los autores
proporcionan un kit útil en un procedimiento analítico
quimioluminiscente que comprende un primer reactivo que comprende
luminol o un luminol sustituido en disolución acuosa y un segundo
reactivo que comprende iones perborato en disolución acuosa que se
caracteriza por que el segundo reactivo también comprende un agente
quelante no luminiscente para quelación de átomos de boro
deficientes de electrones en los iones perborato.
El primer y segundo reactivos del kit de la
presente invención puede proporcionarse conjunta o separadamente,
siendo mezclado en última instancia antes de usarse o añadido
simultáneamente o secuencialmente a los otros compuestos de la
reacción luminiscente. Los autores han demostrado a través del
análisis de las disoluciones de luminol-perborato
por espectroscopia de fluorescencia, que una proporción de las
moléculas implicadas coexisten en disolución en forma de complejo.
Un mecanismo probable para la formación del complejo es por
quelación del átomo de boro del perborato deficiente en electrones
por el luminol. Los autores creen que el complejo formado no es
estable y que contribuye a la luminiscencia de fondo por
descomposición con la emisión de luz.
Los autores han encontrado ahora que la
luminiscencia de fondo de las disoluciones de
luminol-perborato se puede reducir por adición de un
agente quelante no luminiscente de geometría molecular apropiada,
por ejemplo un agente quelante no luminiscente para quelación de un
átomo de boro deficiente en electrones en un ion perborato. Los
autores creen que el agente quelante añadido compite con el luminol
por la unión del perborato, minimizando por tanto la formación del
complejo inestable luminol-perborato.
El mecanismo por el que se cree que la invención
reduce la luminiscencia de fondo usando dos agentes quelantes
preferidos se muestra después en los esquemas de interacción 1 y 2
propuestos. En el esquema 1 el agente quelante es glicina, mientras
que en el esquema 2 el agente quelante es ácido sulfosalicílico
(abreviadamente en inglés SSA). En ambos esquemas de interacción el
luminol forma un complejo inestable con perborato uniéndose
libremente a través de los átomos de nitrógeno y oxígeno por el
átomo de boro deficiente de electrones del ion perborato. En
presencia del agente quelante (glicina en el esquema 1 o SSA en el
esquema 2) se forma un complejo alternativo porque los agentes
quelantes tienen geometrías moleculares apropiadas para reemplazar
al luminol del complejo. Por ello los autores creen que la
luminiscencia de fondo se puede reducir sustancialmente.
La presente invención se puede aplicar a
cualquier procedimiento analítico quimioluminiscente sin ninguna
limitación particular en tanto que se use y se haga reaccionar un
catalizador adecuado tal como una enzima peroxidasa con luminol o un
luminol sustituido y perborato en un disolvente acuoso, y la
luminiscencia sea entonces detectada y medida. Preferiblemente el
catalizador es una enzima peroxidasa que es bien conocida como
sustancia marcadora y que se ha usado ampliamente en procedimientos
de ensayo basados en reacciones inmunológicas y técnicas de
hibridación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la peroxidasa se puede
unir a una diana usando un reactivo de unión específico de diana, la
diana de unión a peroxidasa se aísla y se hace reaccionar con
luminol y perborato en un disolvente acuoso. Se prefieren el luminol
o el luminol sustituido y el perborato en disolución acuosa como
reactivo de señal.
El término "reactivo de unión específico de
diana" como se usa aquí significa una sustancia que se puede unir
específicamente a una diana para ser analizada. La diana puede
incluir un péptido activo fisiológicamente, una hormona, un ácido
nucleico y sustancias similares. Cuando la diana para analizar es
capaz de actuar como un antígeno, un anticuerpo (incluyendo
anticuerpos policlonales y monoclonales, fragmentos de anticuerpos y
similares) puede convertir un reactivo de unión específico de diana.
Cuando la diana para analizar es un ácido nucleico, su ácido
nucleico complementario (cadena sencilla) o fragmento de ácido
nucleico puede ser un reactivo de unión específico de diana.
Se pueden usar como agentes quelantes en la
invención agentes quelantes no luminiscentes que tengan geometrías
moleculares apropiadas, es decir cualesquiera agentes quelantes no
luminiscentes para quelación de un átomo de boro deficiente en
electrones en un ion perborato. Son agentes quelantes adecuados
compuestos que tienen una denticidad de al menos dos. Los
reordenamientos de unión preferidos son bidentados siendo preferido
especialmente con el tamaño de anillo quelado de cinco o seis
miembros. Se prefiere que para la unión con estos sistemas al menos
un grupo de ligando lleve una carga electronegativa. Los ligandos
polidentados o macrocíclicos reducen la probabilidad del perborato
para desunirse y hacer entonces sistemas favorecidos. Los agentes
quelantes preferidos son glicina y ácido sulfosalicílico
(abreviadamente en inglés SSA) pero se pueden emplear otros. La
concentración adecuada del agente quelante presente en un reactivo
de señal típico está en el intervalo de 4 a 15 mmoles/l, pero esta
concentración depende hasta cierto punto de los otros componentes
del reactivo de señal. De modo adecuado, el agente quelante está
presente en un exceso estequiométrico sobre el perborato y el
luminol en el reactivo de señal. En un reactivo de señal típico el
agente quelante estará presente en una cantidad molar entre 2 y 10
veces las cantidades molares de luminol y perborato presentes
allí.
El disolvente acuoso usado en el procedimiento
analítico de la invención y por tanto presente en el reactivo de
señal generalmente es agua o un tampón. Tampones adecuados incluyen
aquellos tampones usados habitualmente en reacciones bioquímicas que
incluyen en particular tampón fosfato y tampón borato. Se puede
mencionar que en presencia de tampón borato y peróxido de hidrógeno
se pueden formar los complejos mencionados en los esquemas de
reacción 1 y 2 (J Flanagan et al, J Chem Soc., Dalton Trans, 1651,
1989: B N Chernyshov, Russian J. Inorg. Chem, 35(9), 1333,
1990). Adecuadamente el tampón tiene un pH en el intervalo de 5 a 12
y preferiblemente en el intervalo de 7 a 11. Los valores de pH por
debajo de 5 están fuera de este intervalo de pH óptimo para las
enzimas peroxidasa, de modo que la luminiscencia emitida es menor.
Los valores de pH por encima de 12 están también fuera del intervalo
óptimo de pH para las enzimas, pero en este caso resulta una
luminiscencia más fuerte que no se basa en la actividad de la
peroxidasa, es decir, que da lugar a luminiscencia no
específica.
El catalizador preferido es una enzima
peroxidasa, pero se pueden usar otros catalizadores, incluyendo
porfirinas tales como MP11 (microperoxidasa). La enzima peroxidasa
usada como sustancia de marcaje es adecuadamente una isoenzima
básica de rábano (peroxidasa de rábano o abreviadamente en inglés
HRP). Las isoenzimas adecuadas de peroxidasa de rábano incluyen la
Tipo VI y la Tipo IX, disponibles comercialmente en Sigma Chemical,
Poole, Dorset, prefiriéndose la Tipo VI para uso en esta
invención.
La unión entre el reactivo de unión específico de
diana y la enzima peroxidasa (es decir, el marcaje del agente de
unión con la enzima) puede llevarse cabo mediante cualquier manera
adecuada. El agente de unión y el marcaje de peroxidasa pueden
unirse juntos directamente mediante procedimientos descritos en M.
Brinkley, Bioconj. Chem., 3, página 2, (1992) o técnicas similares.
Alternativamente se puede proporcionar el agente de unión específico
de diana con un primer grupo químico tal como un grupo biotinilo
seguido por reacción con peroxidasa que contiene un segundo grupo
químico, reactivo con el primer grupo, tal como un residuo de
avidina o estreptoavidina, de tal modo que el agente de unión se
marca indirectamente.
El luminol para uso en esta invención es
adecuadamente luminol de sodio. El perborato usado preferiblemente
es perborato de sodio. Está presente en forma de una fuente de
peróxido de hidrógeno, un sustrato para la enzima peroxidasa.
Preferiblemente el agente señal contiene un
compuesto que puede potenciar la reacción quimioluminiscente tal
como aquel descrito en la USP 4842997 y USP 5279940. En la presente
invención se puede usar cualquier potenciador que pueda facilitar la
transferencia de electrones desde el peróxido de hidrógeno (derivado
del perborato) vía peroxidasa a luminol y puede exhibir una acción
potenciada. Potenciadores adecuados incluyen
4-yodofenol, 4-bromofenol,
4-clorofenol, 4-fenilfenol,
2-cloro-fenilfenol,
6-hidiroxibenzotiazol,
4-[4'-(2'-metil)tiazolil]fenol,
4-[2'-[4'-metil)tiazolil]fenol,
4-(2'-benzotiazolil)fenol,
3-(10-fenotiazil)-n-propilsulfanota
y 3-cloro, 4-hidroxiacetanilida.
Cuando se lleva a cabo la reacción entre el luminol y el peróxido
de hidrógeno por la peroxidasa en presencia de un potenciador
adecuado, el potenciador aumenta la velocidad de oxidación de la
enzima.
Además del agente quelante no luminiscente
incluido en el reactivo de señal para competir con el luminol, se
pueden incluir también otros agentes quelantes para retirar iones
metálicos no requeridos y para otros propósitos.
La invención se ilustra mediante los siguientes
ejemplos, cuyos resultados se muestran gráficamente en las figuras 1
y 2 de los dibujos que se acompañan, siendo los dibujos:
Figura 1: una gráfica del porcentaje de
luminiscencia control, luminiscencia de fondo y relación
señal-ruido que muestra el efecto de la adición de
glicina a la reacción quimiolumniscente
peroxidasa/luminol/perborato potenciada en el ejemplo 1; y
Figura 2: una gráfica de la emisión de luz en
unidades de luz arbitrarias frente a la concentración de hormona
estimulante del tiroides (TSH) que muestra el efecto de la adición
de glicina en la curva de respuesta del inmunoensayo de TSH
quimioluminiscente en el ejemplo 2.
\newpage
Se añadió glicina a luminol perborato de sodio a
pH 8,5 en un tampón borato que contenía citrato y
3-cloro, 4-hidroxiacetanilida (un
potenciador quimioluminiscente):
| Producto químico | Concentración |
| (mmoles por litro en agua) | |
| Ácido bórico | 57,5 |
| Tetraborato de sodio | 17,5 |
| Perborato de sodio | 2,00 |
| Citrato de tri-sodio | 4,65 |
| Ácido cítrico | 2,15 |
| Cloruro potásico | 100,0 |
| 3-cloro,4-hidroxiacetanilida | 0,15 |
| Luminol de sodio | 1,00 |
| Glicina | 0 a 15,00 |
Al aumentar la concentración de glicina, se
observó una reducción de la quimioluminiscencia de fondo. A
concentraciones de glicina por encima de 4 mmoles/l, la salida de
luz de fondo se estabilizó en aproximadamente un 40% de su nivel
inicial. La luminiscencia catalizada por la adición de
aproximadamente 100 atomoles (10-16 moles) de
peroxidasa de rábano a 250 microlitros de la formación
quimioluminiscente no fue afectada por la presencia de glicina,
produciendo esta última un aumento útil de la relación
señal-ruido (véase Figura 1).
La luminiscencia se midió en pocillos de
microtitulación usando un "Armelite" como analizador de marca
comercial registrada, Johnson & Johnson Clinical Diagnostics
Limited (J & JCDL), Amersham, UK.
La formulación quimioluminiscente del ejemplo 1,
que contiene tanto cero como 5 moles de glicina por litro, se
sustituyó por el reactivo comercial quimioluminiscente en el kit de
inmunoensayo ultrasensible TSH-30 "Armelite"
(TSH es hormona humana estimulante del tiroides), disponible en J
& JCDL, Amersham, UK. Los siguientes resultados se obtuvieron
usando el protocolo de ensayo publicado:
* La sensibilidad del ensayo se define como la
concentración de TSH equivalente a dos desviaciones estándar
(obtenidas a partir de 20 determinaciones duplicadas del patrón
cero) sobre una señal de luz de cero.
Con la glicina, se observó una señal disminuida
del patrón cero debido a una reducción de la quimioluminiscencia de
fondo no específica. Consecuentemente, hubo una relación más alta
entre el primer y segundo patrones (relación "B"/"A").
Asumiendo una característica lineal de la respuesta a la dosis entre
dos patrones, los análisis estadísticos demostraron que el límite
de detección más bajo para TSH (sensibilidad del ensayo) mejoró
desde 0,0023 a 0,0014 miliunidades internacionales por litro con
presencia de glicina. Esto implica una mayor capacidad del ensayo
para resolver bajos niveles de TSH - una ventaja significativa en
este tipo de ensayo.
Otros parámetros de realización del ensayo no se
vieron afectados por la adición de glicina (véase la figura 2).
Claims (8)
1. Un procedimiento analítico quimioluminiscente
que comprende el uso de un catalizador adecuado en una reacción con
luminol o un luminol sustituido y un perborato en un disolvente
acuoso y la detección y medida de la luminiscencia producida por la
reacción, caracterizado porque el disolvente acuoso comprende
un agente quelante no luminiscente presente en una cantidad molar
entre 2 y 10 veces la cantidad molar de luminol o un luminol
sustituido y entre 2 y 10 veces la cantidad molar de perborato para
quelación de un átomo de boro deficiente en electrones en el
perborato.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el catalizador es una enzima
peroxidasa.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, caracterizado porque el agente quelante
no luminiscente es un compuesto que tiene una denticidad de al menos
dos.
4. Un procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque el tamaño del anillo quelato es de cinco
o de seis miembros.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque el agente quelante no luminiscente es
glicina o ácido sulfosalicílico.
6. Un reactivo que comprende iones perborato en
un disolvente acuoso caracterizado porque el disolvente
acuoso también comprende un agente delante no luminiscente presente
en una cantidad molar entre 2 y 10 veces la concentración molar de
luminol o un luminol sustituido y entre 2 y 10 veces la cantidad
molar de perborato para quelación de átomos de boro deficientes en
electrones en los iones perborato.
7. Un reactivo según la reivindicación 6,
caracterizado porque el agente quelante no luminiscente es
glicina o ácido sulfosalicílico.
8. Un kit útil en un procedimiento analítico
quimioluminiscente que comprende en una o más partes un primer
reactivo que comprende luminol o un luminol sustituido en
disolución acuosa y un segundo reactivo que comprende iones
perborato en disolución acuosa caracterizado porque el
segundo reactivo también comprende un agente quelante no
luminiscente presente en una cantidad molar entre 2 y 10 veces la
cantidad molar de luminol o un luminol sustituido y entre 2 y 10
veces la cantidad molar de perborato para quelación de átomos de
boro deficientes en electrones en los iones perborato.
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