KR101940612B1

KR101940612B1 - 혈흔 탐지용 조성물

Info

Publication number: KR101940612B1
Application number: KR1020170076900A
Authority: KR
Inventors: 임승; 임시근
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2017-06-16
Publication date: 2019-01-23
Also published as: KR20180137338A; EP3415503A1; US10782234B2; US20180364170A1

Abstract

본 발명에 따른 혈흔 탐지용 조성물은 3-아미노프탈하이드라자이드(3-aminophthalhydrazide), 글리신, 수산화나트륨 및 제이인산나트륨·7수화물을 포함한다.

Description

혈흔 탐지용 조성물{COMPOSITION FOR DETECTING BLOOD STRAIN}

본 발명은 혈흔 탐지용 조성물에 관한 것이다.

사건현장에서 눈에 보이지 않는 혈흔이나 피의자, 피해자, 특정 물체 또는 차량 등에서 혈흔을 찾아내는 일은 매우 중요하며, 적절한 방법으로 채취하고 보존하는 것은 사건을 재구성하고 나아가 피의자를 밝히는데 중요한 역할을 하게 된다.

혈흔인지 아닌지를 구별하고, 눈에 보이지 않는 혈흔을 찾기 위해 다양한 시약들이 개발되었고 현장에서 활용되고 있지만, 가장 대표적인 시약은 루미놀이라고 할 수 있다.

혈흔과 반응 시 루미놀의 화학적 발광에 대한 1951년 그로드스키(Grodsky)와 1966년 웨버(Weber)의 연구논문 발표 이후, 발광강도를 높이고 오류반응을 낮추기 위한 다양한 제조법들이 연구되었다.

블루스타 포렌식(Bluestar forensic, 이하, "블루스타"라 함)은 기존 루미놀 시약들이 가지고 있던 약한 발광강도, 짧은 발광시간 등을 획기적으로 개선시킨 제품이다. 개발자들은 과산화수소 대신에 산화제로 카바마이드퍼옥사이드를 첨가하여 루미놀 시약의 보관성을 높였다고 발표하였다. 현재, 블루스타는 제조가 간편하고 혈흔 DNA를 파괴하지 않는다는 장점 때문에 대부분의 범죄수사기관에서 사용되고 있다.

블루스타는 완제품 형태로 수입되어, 단위부피 당 제조단가가 매우 높아 현장 활용에 문제가 있다.

대한민국 등록특허공보 제10-0679386호(2007년 01월 30일 등록) 대한민국 공개특허공보 제10-2014-0117378호(2014년 10월 7일 공개) 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0132246호(2012년 12월 5일 공개)

본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 혈흔에 대한 발광강도, 반응 후 발광지속시간을 높인 새로운 형태의 루미놀 시약을 제조하고, 제조비용을 낮추는데 있다.

본 발명에 따른 혈흔 탐지용 조성물은, 3-아미노프탈하이드라자이드(3-aminophthalhydrazide), pH 조절제로서 글리신, 알칼리 물질로서 수산화나트륨 및 pH 안정화제로서 제이인산나트륨·7수화물을 포함한다.

상기 혈흔 탐지용 조성물은, 수소이온농도(pH)가 12.0 이하일 수 있고, 구체적으로, 수소이온농도(pH)가 11.9 이상 내지 12.0 이하일 수 있다. 더욱 구체적으로, 수소이온농도(pH)가 11.3 이상 내지 11.7 이하일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 혈흔 탐지용 조성물은, 과산화수소 및 황산마그네슘·7수화물을 더 포함할 수 있다.

다른 일 실시예에서, 상기 혈흔 탐지용 조성물은, 과붕산나트륨·1수화물을 더 포함할 수 있고, 이 때, 상기 과산화수소 및 황산마그네슘·7수화물의 농도는 0% 일 수 있다.

본 발명에 따른 혈흔 탐지용 조성물은, 1:10,000 배로 희석된 혈흔에 대한 민감도가 높고, 발광강도가 강하여 촬영 시 암실이 필요하지 않은 장점이 있다.

본 발명에 따른 혈흔 탐지용 조성물은, 혈액 DNA를 파괴하지 않으므로, DNA 신원 확인에도 특별한 영향을 주지 않는 장점이 있다.

본 발명에 따른 혈흔 탐지용 조성물은, 안정성이 우수하므로, 시약 제조 후 7일 이상 사용할 수 있으며, 특히, 단위부피당 제조단가가 블루스타 대비 약 10배 낮은 장점이 있다.

도 1은 과산화수소 첨가에 의한 수산화나트륨 수용액의 pH 변화를 보여주는 그래프이다.
도 2는 글리신의 첨가에 의한 수산화나트륨 수용액의 pH 변화를 보여주는 그래프이다.
도 3은 과붕산나트륨 첨가에 의한 수산화나트륨 수용액의 pH 변화를 보여주는 그래프이다.
도 4는 글리신 농도에 따른 루미놀 시약의 혈흔 민감도 변화를 보여주는 이미지이다.
도 5는 황산마그네슘·7수화물 첨가에 의한 루미놀 시약의 보관 중 pH 변화를 보여주는 그래프이다.
도 6은 규산 나트륨 첨가에 의한 루미놀 시약의 보관 중 pH 변화를 보여주는 그래프이다.
도 7은 삼인산 칼륨 첨가에 의한 루미놀 시약의 보관 중 pH 변화를 보여주는 그래프이다.
도 8은 HEIDA(n-(2-hydroxyethyl)iminodiacetic acd) 첨가에 의한 루미놀 시약의 보관 중 pH 변화를 보여주는 그래프이다.
도 9는 과붕산나트륨과 황상마그네슘·7수화물의 첨가에 의한 루미놀 시약의 보관 중 pH 변화를 보여주는 그래프이다.
도 10은 HEIDA를 L-MS1.0 제형에 첨가한 후 보관하면서 pH 변화를 확인한 결과에 관한 그래프이다.
도 11은 제이인산나트륨·7수화물의 첨가에 의한 L-SPB 시약의 pH 변화에 관한 그래프이다.
도 12a 내지 도 12d는 루미놀 시약의 보관에 따른 혈흔 민감도 변화에 관한 이미지이다.
도 13a 및 도 13b는 L-MS1.0에 HEIDA 첨가에 따른 루미놀 시약의 민감도 변화에 관한 이미지이다.
도 14a 내지 도 14c는 과산화수소 대신 과붕산나트륨을 산화제로 사용하여 제조한 루미놀 시약의 혈흔 민감도 및 보관 기간에 따른 민감도 변화에 관한 이미지이다.
도 15a 내지 도 15c는 L-MS0.3 및 L-SPB에 각각 제이인산나트륨·7수화물을 첨가한 후 보관하면서 희석 혈흔에 관한 민감도를 관찰한 이미지이다.
도 16a 내지 도 16d는 혈액 반응에 따른 루미놀 시약의 pH 변화에 관한 그래프이다.
도 17a 는 1/10 희석 혈액에 혈액 탐지 시약들이 혼합된 시료들이 혈액 DNA 분해에 미치는 영향에 관한 이미지이다.
도 17b 는 1/100 희석 혈액에 혈액 탐지 시약들이 혼합된 시료들이 혈액 DNA 분해에 미치는 영향에 관한 이미지이다.
도 18은 혈액 탐지 시약들이 DNA 프로필에 미치는 영향에 관한 이미지이다.

이하, 도면 및 실험예를 참고하여, 본 발명에 대해 보다 상세하게 설명하기로 한다.

발명자들은 과산화수소 안정화제 첨가가 루미놀 시약의 민감도, 보관 시 민감도 변화, 혈흔 특이성, 발광지속력에 미치는 영향을 확인하였고, 산화제로서 과산화수소 대신 과붕산나트륨의 사용 가능성을 확인하였다.

루미놀의 혈흔 민감도 및 발광강도는 제조된 시약의 pH에 의존한다. 탄산나트륨 보다는 수산화나트륨을 사용해서 제조하는 것이 좋겠지만 강알칼리 수용액은 혈흔 DNA에 영향을 줄 수 있기 때문에 pH를 보정할 필요성이 있다.

발명자들은 글리신을 첨가하여 pH를 보정하였고, 글리신 첨가는 혈흔 민감도 및 발광강도에 영향을 주지 않았다. 첨가량은 제조 시 루미놀 시약 pH 보다는 혈흔 반응 후에 시약의 pH 변화를 기준으로 판단하는 것이 바람직하다.

루미놀 시약을 제조할 때 과산화수소 안정화제를 첨가하지 않으면 제조된 시약에서 약한 발광이 지속적으로 관찰되는데 이는 알칼리 수용액에서 과산화수소의 분해에 의한 루미놀의 산화로 추정된다. 루미놀 시약을 제조할 때 황산마그네슘·7수화물의 첨가는 과산화수소의 안정화를 높여줘 이런 현상이 발생되지 않았다. 또한 황산마그네슘·7수화물의 첨가는, 혈흔에 대한 민감도에도 영향을 주지 않았고, 0.1 g/L 이상 첨가 시 시약의 pH를 안정화시키고 보관기간을 상당히 늘려줬다. 삼인산칼륨과 규산나트륨도 이와 비슷한 경향을 나타냈지만, 제조 시에 과량 사용해야 한다는 단점과 황산마그네슘·7수화물 보다 효과적이지 못하다는 점 때문에 실제 시약 제조 시에 사용하기에는 부적합할 수 있다.

HEIDA 경우에는 소량 첨가에 의해서 루미놀 시약의 pH를 안정화시켰지만, 시약의 pH를 떨어뜨리고 혈흔 민감도에 영향을 주므로 다른 안정화제처럼 단독적으론 사용이 어려울 수 있다.

블루스타의 경우에는 보관 중 시약의 pH가 변화하지 않았지만 3일 이내에 혈흔 반응성이 완전히 사라져 버렸기 때문에 루미놀 시약들과는 다른 반응기작을 갖는 것으로 추정된다.

시약 제조 후 보관 중 혈흔 민감도 변화를 통해서 보관기간은 시약의 pH 변화와 밀접한 관계를 갖는다는 사실을 알 수 있었다. 시약의 pH 변화는 과산화수소의 분해에 관련된 것으로 판단되므로 결국 과산화수소 안정화제 첨가가 시약의 혈흔 민감도 및 보관기간에 직접적인 연관을 갖는 것으로 생각된다.

과산화수소 안정화제의 첨가가 루미놀 시약들의 혈흔 특이성에는 별다른 영향을 주진 않았다. 일부 채소류들에서 관찰되는 약한 발광은 과산화효소에 의한 기작으로 추정되며 금속염이나 표백제에서 강한 발광은 금속이온들이나 차아염소산나트륨에 의한 과산화수소의 급격한 분해에 의한 결과로 추정된다.

제조법이 바뀌더라도 시약이 물질과 반응하는 기작이 동일하므로 발광강도에서 차이가 있을 뿐 혈흔 특이성에서 큰 차이를 나타내지 않음을 알 수 있었다.

혈흔과 반응 후 발광지속시간은 사진촬영 등 현장 조사에 있어 매우 중요한 요소이다. 황산마그네슘을 안정화제로 첨가하여 제조한 루미놀 시약은 블루스타보다 평균 20초 정도 발광지속시간이 길었지만, 동일한 시약에 HEIDA를 첨가해 제조한 루미놀 시약의 발광강도 낮아지고, 발광지속시간도 짧아졌다.

이런 결과를 통해, 혈흔 반응 시에 발광강도를 높이는 제조법 개발을 통해서도 발광지속시간을 늘릴 수 있다는 사실을 알 수 있었다. 예비 실험을 통해 pH가 혈흔 DNA의 파과와 밀접한 관련성이 있음을 확인했다. 혈흔 DNA 파괴를 유발하는 정확한 pH 범위는 알려지지 않았지만 선행 연구결과에 따라 pH 12.2 이하로 판단된다.

블루스타의 경우 혈액 반응 후 pH 상승폭이 크지 않은 반면 루미놀 시약들의 pH 상승폭은 0.6 정도로 다소 높았지만 pH 12.0 이하이므로 DNA에 큰 영향을 주지 않을 것으로 추정된다. 이에 반해 산화제로 과붕산나트륨을 사용할 경우 pH 상승폭이 과산화수소를 사용했을 때보다 훨씬 낮았는데 과붕산나트륨이 과산화수소보다 루미놀 시약의 pH에 영향을 적게 준다는 결과(도 1, 도 3)와 일치한다. 결국, 시약 제조 시에 글리신 첨가량을 줄인다면 혈흔에 대한 발광강도를 높일 수 있을 것으로 판단된다.

반응에 사용된 혈액양이 증가할수록 시약과 혈액 반응 후 혼합액의 pH 변화는 더욱 커진다. pH 변화를 억제하기 위해서는 루미놀 시약을 제조할 때 산화제로서 과산화수소 대신 과붕산나트륨의 사용이 바람직하다. 또한, 반응 후 pH 변화를 최대한 낮추기 위해서는 제이인산나트륨 첨가가 바람직하다.

실험재료 및 기구

수산화나트륨(sodium hydroxide, NaOH), 삼인산칼륨(potassium phosphate tribasic, K₃PO₄), 황산마그네슘·7수화물(magnesium sulfate heptahydrate, MgSO₄ _·7H₂O), 규산나트륨(sodium silicate, Na₂SiO₃), 탄산나트륨(sodium carbonate, Na₂CO₃)는 덕산화학(Korea)에서 구입하였다.

과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂), 글리신(glycine), 과붕산나트륨 1수화물(sodium perborate monohydrate, NaBO₃ ?H ₂O, SPB), 제이인산나트륨·7수화물(sodium phosphate dibasic, Na₂HPO₄ _·7H₂O, SPD)은 ACROS(Sigma, USA)에서 구입하였다.

루미놀(3-aminophthalhydrazide, luminol)은 삼천화학(korea) 제품을 사용하였다.

블루스타는 아이디테크사의 블루스타 포렌식(Sirchie finger print laboratories, Inc, USA)을 구입하여 사용하였다.

기타, 페이퍼 디스크(paper disc 10mm, ADVATEC), 볼텍스 믹서(voltex mixer, KMC-1300V, Vision), 정밀저울(HS300A, 한성계기공업), pH meter(pH-200L, iSTEK)가 실험에 사용되었다.

실험방법

실험에 사용한 모든 혈액은 지원자의 동의를 얻어 채취한 것으로 EDTA 튜브에 넣고, 4℃로 설정된 냉장고에 보관하면서 사용하였고, 채취 후 30일 이상 경과하면 폐기하였다.

( 희석혈액 샘플 제조 )

희석 배수는 전체 부피에서 혈액이 차지하는 비율로, 혈액 1mL에 증류수 9 mL을 첨가하여 1:10의 혈액 희석액을 제조하였다. 1:10배 혈액 희석액 1 mL을 9 mL 증류수에 가해 1:100배 혈액 희석액을 제조하였다. 동일한 방법으로 1:1,000, 1:10,000배, 1:100,000배까지 혈액 희석액을 제조하였다. 마이크로 피펫으로 페이퍼 디스크에 혈액 희석액을 100㎕씩 떨어뜨린 후 실온에서 8시간 이상 건조하여 희석혈액 샘플을 제조하여 실험에 사용하였다.

( 시약의 제조 )

ㆍ 비교예 1: Bluestar forensic

멸균된 증류수 125 mL에 블루스타 베이지색 1정와 블루스타 하얀색 1정을 혼합하였다.

ㆍ 비교예 2: 경찰청 사용 제조법으로 제조된 루미놀 시약

루미놀 1 g/L, 탄산나트륨 50 g/L, 30 %(w/v) 과산화수소 150 mL, 증류수 1 L

ㆍ 실시예 1 내지 6: 루미놀 제조법(L형: Weber법 변형)으로 제조된 루미놀 시약

기본 조성: 루미놀 1 g/L, 수산화나트륨 3 g/L, 글리신 1g/L, 과산화수소 10 ml/L, 증류수 1 L

상기 기본 조성에 다음과 같이 과산화수소 안정화제를 첨가하여 실시예 1 내지 6을 제조하였다

< 실시예 1>

L-MS0.3: L형, 황산마그네슘·7수화물 0.3 g/L

< 실시예 2 >

L-MS1.0: L형, 황산마그네슘·7수화물 1.0 g/L

< 실시예 3 >

L-PPT2: L형, 제3인산칼륨 2.0 g/L

< 실시예 4 >

L-PPT10: L형, 제3인산칼륨 10 g/L

<실시예 5 >

L-SS2: L형, 규산나트륨 2.0 g/L

< 실시예 6 >

L-SS10: L형, 규산나트륨 10 g/L

ㆍ 실시예 7: 루미놀 제조법(L-SPB형)으로 제조된 루미놀 시약

루미놀 1 g/L, 수산화나트륨 3 g/L, 글리신 2g/L, 과붕산나트륨·1수화물 10 g/L

( pH 측정 )

제조 시에 첨가한 시약들이 루미놀 시약의 pH에 미치는 영향을 확인하고, 제조한 시약들의 최종 pH를 확인하기 위해 pH-200L(Istek, Korea)를 사용하였다. 완제품 형태로 판매되는 블루스타의 pH 역시 시약을 제조한 후 동일 장비를 사용하여 측정하였다.

( 촬영 조건 )

루미놀 시약의 발광강도 및 발광지속시간을 확인하기 위해서 암실을 이용하였다. 상기 방법으로 제조된 각각의 희석 혈흔 샘플에 루미놀 시약을 100 ㎕ 떨어뜨린 후 관찰·촬영하였다. 동일조건에서 발광강도를 비교하기 위해 Cannon EOS70D 카메라의 촬영 조건을 ISO 400, F11, S30''로 고정하였다.

산화제 첨가에 의한 수산화나트륨 수용액의 pH 변화

루미놀을 용해시키고 혈흔과 반응 시 강한 화학적 발광을 일으키기 위해서는 루미놀 시약의 pH가 중요한 역할을 하므로, 수산화나트륨과 과산화수소, 과붕산나트륨에 의한 수용액의 pH 변화를 확인하였다.

과산화수소 첨가에 따른 pH 변화를 확인하기 위해, 수산화나트륨 농도를 0.2 ~ 5.0 g/L로 제조한 후 30%(w/v) 과산화수소를 일정량 첨가하면서 수용액의 pH 변화를 측정하였다.

과붕산나트륨의 경우, 수산화나트륨 1.0, 2.0, 3.0 g/L 수용액을 제조한 후 과붕산나트륨을 0 ~ 10.0 g/L까지 1.0 g/L씩 높여 첨가하면서 수용액의 pH의 변화를 측정하였다.

시약의 pH에 가장 큰 영향을 미치는 것은 수산화나트륨이며, 0.2 g/L이상 첨가에 의해서 pH 12.0 정도의 알칼리수용액이 제조되었다.

도 1에 보이듯이, 산화제로 사용되는 과산화수소 역시 루미놀 시약의 pH에 영향을 주긴 하지만 그 영향이 수산화나트륨에 비해 작다. 즉, 첨가되는 수산화나트륨의 양이 증가할수록 시약의 pH를 보정하기 위해서 첨가되어야 하는 과산화수소의 양은 기하급수적으로 증가해야 한다. 시약 제조 시에 pH를 보정해 줄 수 있는 물질을 첨가하지 않는다면 3 g/L 이상의 수산화나트륨을 첨가해 루미놀 시약을 제조하는 것은 바람직하지 않다고 판단된다.

루미놀 시약 제조 시에 첨가한 글리신이 미치는 영향을 확인하고자, 수산화나트륨 1.0, 3.0 g/L 수용액을 제조한 후 글리신을 0.2 g/L 단위로 첨가하면서 수용액의 pH 변화를 관찰·기록하였다.

차아염소산나트륨에 의한 루미놀 시약의 발광강도를 낮춰줄 수 있다고 보고된 아미노산인 글리신을 루미놀 시약의 pH 보정제로 사용하였다. 수산화나트륨, 과산화수소와 마찬가지로 글리신 첨가는 루미놀 시약의 pH를 변화시켰다(도 2). 수산화나트륨 농도 1.0 g/L에서는 글리신 1.0 ~ 2.0 g/L 첨가에 의해서 용액의 pH가 급격히 낮아지는 지점이 존재했으므로 루미놀 시약 제조 시에는 주의를 요하며, 최종 pH에 맞게 첨가량 조절이 필요할 것이라 생각된다.

과산화수소 대신 과붕산나트륨을 산화제로 사용할 경우에도 첨가량이 증가함에 따라 수산화나트륨 수용액의 pH가 변화됨을 알 수 있었다. 도 3에 보이듯이 루미놀 시약의 pH를 원하는 수준(pH 11.4 ~ 11.6)으로 맞추기 위해서는 과산화수소에 비해 많은 양을 첨가해야 함을 알 수 있었다. 즉, 루미놀 시약 제조 시에 산화제로 과붕산나트륨을 사용할 경우에는 시약의 pH 조절을 위해서는 과붕산나트륨보다 글리신 첨가량을 늘려야 할 것으로 판단된다.

글리신 첨가가 루미놀 시약의 혈흔민감도에 미치는 영향

상기 기술한 L-MS1.0 제형에 글리신을 0 g/L, 1.0 g/L, 2.0 g/L, 3.0 g/L 농도로 첨가하여 시약을 제조한 후 희석 혈흔 1:10 ~ 1:10,000 배 샘플을 이용하여 혈흔에 대한 민감도를 측정하였다.

글리신 첨가량이 증가할수록 시약의 pH가 낮아지므로 pH가 주는 영향을 배제시키기 위해 수산화나트륨(10%, w/v) 수용액을 이용하여 루미놀 시약의 pH를 11.4로 동일하게 맞춰서 사용하였다.

각각의 루미놀 시약들을 1:10배 ~ 1:10,000배 희석혈흔 샘플에 반응시킨 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4를 참고하면, 글리신 양에 상관없이 동일한 pH 조건이라면 희석 혈흔에 대한 민감도는 유사함을 알 수 있었다. 물론, pH를 보정하지 않을 경우에는 글리신 첨가량이 증가할수록 루미놀 시약의 pH는 낮아지므로 희석혈흔에 대한 민감도가 떨어질 가능성이 있다.

과산화수소 안정화제 첨가에 따른 보관 중 루미놀 시약의 pH 변화

시중에서 판매되고 있는 대부분의 액상 과산화수소에는 분해를 억제하기 위해 인산염이 함유되어 있지만 중성 pH에서 효과를 나타낼 뿐 알칼리 수용액에서는 과산화수소의 분해를 막아주진 못한다. 루미놀 시약을 제조할 때 첨가한 과산화수소가 점차적으로 분해되면 시약의 혈흔에 대한 발광강도 및 민감도가 현저히 떨어질 수 있고 나아가 pH가 상승하므로 혈액 DNA 분석에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.

과산화수소의 분해를 늦추고 루미놀 시약의 보관기간을 늘리기 위해서, 탄산나트륨 대신 강알칼리 물질인 수산화나트륨을 사용해서 루미놀 시약을 제조했다.

알칼리 조건에서 과산화수소는 불안정하므로 과산화수소 안정화제로 상업적으로 시판되고 있는 황산마그네슘 7수화물(magnesium sulfate heptahydrate, MS), 삼인산화칼륨(potassium phosphate tribasic), 규산나트륨(sodium silicate), HEIDA(n-(2-hydroxyethyl) iminodiacetic acid)를 선별하여 사용했다.

시약을 제조할 때 과산화수소 안정화제를 일정 농도로 첨가한 후 시약을 냉장고(2 )에 보관하면서 시간 경과에 따른 시약의 pH 변화를 측정·기록하였다.

황산마그네슘·7수화물은 마그네슘 2가 양이온이 포함되어 있음에도 불구하고 루미놀 시약의 오류반응을 유발하지 않았다. 도 5에 보이듯이 0.1 g/L을 첨가한 후 과산화수소 분해가 억제되어 시약의 pH는 안정되었고, 11일 보관 후에도 제조 당시 pH인 11.40 수준이었다. 황산마그네슘 첨가 농도를 높일 경우에도 보관 중 루미놀 시약의 pH를 일정하게 유지시켜줬지만, 시약 제조 시 용해되지 않은 황산마그네슘의 양이 증가했고 시약의 pH가 다소 낮아졌다.

루미놀 시약의 pH가 낮아질수록 혈흔에 대한 민감도가 감소하므로 황산마그네슘의 적정 첨가량은 0.1 ~ 0.5 g/L로 판단하였다. 과산화수소 안정화제를 첨가하지 않고 제조한 루미놀 시약의 경우에는 11일 보관 후 pH가 12.0 이상으로 높아졌는데, 시약 제조 시에 첨가한 물질 중 시약의 pH에 영향을 줄 수 있는 인자는 과산화수소가 유일하므로 pH의 상승은 과산화수소 분해에 의한 결과라고 추정된다.

과산화수소 안정화제로 규산나트륨을 첨가했을 경우에는 첨가량 0.5 g/L 이하에서는 과산화수소 분해를 오히려 촉진시키는 결과를 나타냈지만 그 이상의 농도에서는 첨가한 양에 비례하여 과산화수소 분해를 억제해 주었다(도 6).

규산나트륨을 10.0 g/L 첨가하여 제조한 루미놀 시약을 11일 보관했을 때 pH는 11.8 이상이므로 루미놀 시약을 제조할 때 과산화수소 안정화제로 규산나트륨의 사용은 효과적이지 않다고 판단하였다.

삼인산칼륨을 과산화수소 안정화제로 루미놀 시약에 5.0 g/L 이하로 첨가했을 때는 안정화제를 첨가하지 않고 제조한 시약과 시간경과에 따라 유사한 형태의 pH 변화를 나타냈다. 10.0 g/L로 첨가하여 제조했을 경우에는 보관 중 루미놀 시약의 pH가 증가하는 속도가 다소 늦춰지긴 했지만, 8일 보관 후에는 제조 당시 pH 11.40보다 0.47 높아졌다(도 7). 삼인산칼륨을 루미놀 시약의 과산화수소 안정화제로 사용하기에는 효과적이지 않다는 사실을 알 수 있었다.

도 8은 루미놀 시약에 과산화수소 안정화제로 HEIDA를 첨가했을 때 보관 중 시약의 pH 변화를 보여준다. HEIDA 농도가 1.0 g/L에서 3.0 g/L로 높아질수록 용액의 pH가 안정화되었다. 알칼리 수용액에서 황산마그네슘 수준의 억제를 위해서는 2.0 g/L 이상 첨가되어야 한다. 그렇지만, 첨가량을 높일 경우에는 제조한 루미놀 시약의 pH가 감소해 혈흔 민감도 및 발광강도 등에 영향을 줄 수 있으므로 사용에 제약이 따른다.

과붕산나트륨을 산화제로 사용해 제조한 루미놀 시약의 경우에는 안정화제로 황산마그네슘·7수화물만을 농도별로 첨가하여 동일한 실험을 하였다. L-MS1.0제형에 HEIDA를 2.0 g/L 추가하였을 때 시간 경과에 따른 pH 변화 역시 관찰하였다.

한편, L-MS1.0 제형에 HEIDA를 2.0 g/L 첨가한 후 보관하면서 pH 변화를 확인한 결과를 도 9에 나타냈다. 그림에서 알 수 있듯이 루미놀 시약의 pH 변화는 아주 거의 일어나지 않았다. 루미놀 시약에서 과산화수소 안정화를 위해 황산마그네슘과 HEIDA를 동시에 사용할 수 있다는 사실을 이 결과를 통해 확인할 수 있었다.

도 10은 산화제로 과산화수소 대신 과붕산나트륨을 사용하고 과산화수소 안정화제인 황산마그네슘을 0.5 g/L, 1.0 g/L 첨가해 제조한 루미놀 시약의 보관기간에 따른 pH 변화를 보여준다.

황산마그네슘 첨가량에 상관없이 보관기간이 길어짐에 따라 pH가 약간 감소하는 경향을 나타내며 루미놀 시약이 점차 짙은 갈색으로 변색되는데 혈흔민감도 변화 역시 동반하므로 이에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다. 블루스타의 경우 보관기간 동안 pH 변화가 관찰되지 않았다.

제이인산나트륨 첨가에 따른 루미놀 시약의 pH 변화

혈액과 반응 후 루미놀 시약의 pH변화를 최소화시키기 위해서, 알칼리 pH 완충액 제조 시에 사용되는 제이인산나트륨을 L-SPB제형에 0 ~ 10 g/L까지 첨가한 후 루미놀 시약의 pH 변화를 관찰하였다.

도 11은 제이인산나트륨 첨가에 따른 루미놀 시약의 pH 변화를 보여주는 것으로, 10 g/L이하 첨가한 조건에서 급격한 시약의 pH 변화는 발생하지 않았다. 루미놀 시약 제조 시에 pH 보정을 위해 제이인산나트륨을 사용할 수 있다고 판단된다.

보관 기간에 따른 루미놀 시약의 희석혈흔에 대한 민감도 변화

루미놀 시약은 보관 시 혈흔 민감도가 급속히 떨어지므로 제조 후 보관 사용이 거의 불가능하므로 필요할 때마다 새로 제조해야 한다. 이에 반해 블루스타는 제조 후 일정기간 보관 사용할 수 있다고 알려져 있다. 그렇지만 보관기간에 따른 혈흔 민감도 및 발광강도 변화에 대한 객관적 자료가 없기 때문에 본 실험에서는 보관 중 루미놀 시약들의 혈흔 민감도 및 발광강도 변화를 관찰하였다.

과산화수소 안정화제를 첨가하여 제조한 루미놀 시약의 시간경과에 따른 혈흔에 대한 민감도 변화를 확인하였다. 또한, 과산화수소 대신 산화제로 과붕산나트륨을 첨가하여 제조(L-SPB형)한 후 시간경과에 따른 혈흔민감도 변화 역시 관찰하였다.

혈흔 민감도를 측정하기 위해 1:10 ~ 1:10,000배의 희석혈액 샘플을 이용하였다. 사용된 모든 희석혈흔 샘플은 혈액 100 ㎕를 마이크로 피펫으로 페이터 디스크에 떨어뜨린 후 상온에서 건조시킨 것이다.

과산화수소 안정화제를 첨가해 제조한 6종류의 루미놀 시약과 블루스타, 경찰청에서 사용하는 루미놀 제형, L-SPB 제형을 사용하였다. 또한, 제이인산나트륨을 5 g/L 첨가해 제조한 L-MS1.0, L-SPB를 5일 동안 보관하면서 제조 당시 민감도 및 보관에 따른 민감도 변화를 관찰하였다.

도 12a, 도 12b, 도 12c, 도 12d 는 루미놀 시약들의 보관 중 민감도 변화를 기록한 것이다.

블루스타의 pH(11.4 ~ 11.8)는 제조 후부터 일정하게 유지되었지만, 제조 후 보관 시 혈흔 민감도는 현저히 줄어들었고 9일 후에는 혈흔과 전혀 반응하지 않았다. 제조 당시 1:10,000배 정도의 희석혈흔에 대한 민감도를 갖고 있었다. 1990년대부터 경찰청에서 사용하던 루미놀 시약은 제조 당시 희석혈흔에 대한 민감도는 1:1,000배였지만 발광강도가 약해 암실에서만 사진촬영이 가능한 정도였고 3일 후에는 혈흔과 전혀 반응하지 않았다. 결과를 토대로 경찰청 사용 루미놀 시약은 제조 후 1일 이내, 블루스타의 경우 1 ~ 2일 보관하면서 사용이 가능하다고 판단하였다.

L형은 제조 당시에 혈흔 민감도가 1:10,000배였지만, 9일 경과 후에는 발광강도가 다소 떨어졌고 14일 후에는 혈흔 민감도가 1:1,000배로 10배 감소되었다. 과산화수소 안정화제가 첨가된 6가지 제형들은 제조 당시 혈흔에 대한 민감도는 1:10,000배로 L형과 모두 동일하였다.

L-MS0.3과 L-MS1.0은 14일 보관 후에도 제조 당시와 동일한 수준의 발광강도 및 혈흔 민감도를 나타냈다. L-PPT2와 L-PPT10은 L형에 비해 혈흔 민감도가 더 빨리 떨어지는 경향을 보였다. 제조 후 9일이 경과했을 때 혈흔 민감도는 1:1,000배였지만 발광강도는 상당히 낮았다.

보관 중 pH변화가 적었던 L-PPT10가 L-PPT2에 비해 혈흔 민감도는 더 빠른 속도로 떨어지는 것으로 미루어 삼인산칼륨은 루미놀 시약에 어떤 영향을 주며 과산화수소 안정화제로 사용하는 것이 바람직하지 않다는 사실을 알 수 있었다.

과산화수소 안정화제로 규산나트륨을 첨가해 제조한 L-SS2, L-SS10제형의 경우 보관 중 시약의 pH 변화와 유사한 결과를 나타냈다. L-SS2는 L형과 비슷한 수준의 혈흔 민감도, 발광강도를 보여줬지만 L-SS10은 14일 후에도 혈흔 민감도는 1:10,000배를 유지하였다.

본 실험을 통해, 보관 중 시약의 pH 변화는 루미놀 시약의 발광강도와 보관 중 혈흔 민감도 변화와 밀접한 관련성이 있다는 사실을 확인할 수 있었다(도 5, 도 6, 도 7). 제조 후 루미놀 시약의 보관 안정성을 높이기 위해서는 과산화수소 안정화가 선행되어야 할 것으로 판단된다.

L-MS1.0에 HEIDA 첨가에 따른 루미놀 시약의 민감도 변화

HEIDA가 발광강도 및 보관 중 혈흔 민감도에 미치는 영향을 확인하기 위해 L-MS1.0제형을 이용하였다. L-MS1.0 제형에 HEIDA 2.0 g/L를 넣고 루미놀 시약을 제조한 후 실험에 사용하였다.

도 13a 에 보이듯이 HEIDA첨가에 의해 혈흔 민감도가 다소 떨어졌다. 동일한 pH 조건에서 실험한 결과이므로 HEIDA는 루미놀 시약의 민감도에 부정적인 영향을 주는 과산화수소 안정화제로 판단된다.

도 8에 보이듯이, LMS1.0에 HEIDA를 첨가해 제조한 루미놀 시약은 30일 보관 중에 pH변화가 거의 관찰되지 않았다. 도 13b는 동일 시약을 냉장 보관했을 때 희석혈흔에 대한 민감도 변화를 보여준다. 28일 보관했음에도 불구하고 희석혈흔에 대한 민감도 및 발광강도는 일정하게 유지되었다. 즉, 루미놀 시약 제조 시에 HEIDA 첨가는 제조 상시 루미놀 시약의 혈흔민감도를 다소 떨어뜨리지만 시약 보관 시 민감도 변화에 영향을 주지 않는 것으로 판단되었다.

L- SPB형의 보관기간에 따른 민감도 변화

도 14a, 도 14b, 도 14c는 산화제로 과산화수소대신 과붕산나트륨을 사용해서 제조한 루미놀 시약의 혈흔 민감도 및 보관 기간에 따른 민감도 변화를 보여준다. 결과에서 알 수 있듯이, 황산마그네슘 첨가는 혈흔 민감도에 영향을 주지 않았다. 제조 당시에는 과붕산나트륨을 사용한 루미놀 시약이 과산화수소를 사용한 루미놀 시약보다 혈흔 민감도가 다소 높았지만, 시간의 경과에 따라 혈흔 민감도는 약간 감소되었다.

도 15a, 도 15b, 도 15c는 L-MS0.3, L-SPB과 동일 제조법에 제이인산나트륨을 5 g/L 함량으로 첨가한 후 5일 동안 보관하면서 희석혈흔에 대한 민감도 변화를 관찰한 것이다. 4가지 제조법 모두 혈흔민감도가 1:10,000배로 유사했고 보관에 따른 혈흔민감도 변화는 크지 않았다. 이런 결과를 통해 제이인산나트륨 첨가에 의한 루미놀 시약의 pH 감소가 시약의 혈흔민감도에 미치는 영향이 적다는 점과 제이인산나트륨 첨가가 알칼리 조건에서 과산화수소 또는 과붕산나트륨 안정성에 별다른 영향은 주지 않는다는 사실을 알 수 있었다.

시약의 특이성

루미놀 시약은 혈액 속 헤모글로빈 내의 철 성분과 반응하므로 인간 혈액에 대한 특이성이 떨어진다. 또한 산화제 등 범죄 현장에 존재할 수 있는 다양한 물질들과 반응할 수 있기 때문에 사용 시 주의를 요하는 시약 중 하나이다.

루미놀은 혈액에만 반응하는 시약이 아니고 화학적 산화제 등 루미놀을 산화시킬 수 있는 다수의 물질과 반응하여 발광할 수 있다. 표 1은 다양한 루미놀 시약들의 채소, 금속염, 표백제 성분 간의 반응여부를 확인한 것이다. 결과에서 알 수 있듯이, 발광강도에서 차이가 날 뿐 반응을 일으키는 물질의 종류는 모두 동일하였다.

본 실험에서는 루미놀과 오류 반응을 일으킬 가능성이 높은 채소 11종, 금속염 4종, 표백제 1종을 선정한 후 실제 반응 여부를 확인하였다.

각각의 물질들은 신선한 상태로 E-tube에 담은 후 제조한 각각의 루미놀 시약을 500 ㎕씩 분주하였다. 육안으로 관찰되는 발광 여부와 발광강도를 이용해 특이성 검사를 행하였다.

특이성 검사에 사용한 루미놀 시약은 블루스타, 경찰청에서 사용하는 루미놀, L-MS1.0, L-MS1.0+HEIDA 였다. 실험에 사용된 물질들은 다음과 같다.

ㆍ 채소류: 오이, 양파, 양배추, 호박, 새송이 버섯, 완두콩, 무, 마늘, 당근, 감자, 고구마

ㆍ 금속염: 망간황산염(MnSO₄), 구리황산염(CuSO₄), 철황산염(FeSO₄), 마그네슘황산염(MgSO₄)

ㆍ 표백제(차아염소산나트륨, NaOCl 4%(w/v) 이상)

채소류와 반응한 루미놀 시약들에서는 강도가 약하지만 장시간 지속되는 발광을 관찰할 수 있었다. 무의 경우에는 발광강도가 비교적 높고 장시간 지속되므로 현장에서 주의가 필요할 것이다.

금속염들의 경우에서는 채소류와는 반대 경향을 나타냈고, 발광강도는 매우 강했지만 반응 후 짧은 순간 사라졌다.

망간염의 경우에는 루미놀 시약과 반응하여 갈색 침전물이 생성되었지만 발광반응은 관찰되지 않았다. 치아염소산나트륨을 함유하고 있는 표백제는 금속염 이상의 발광강도를 보여주었지만 반응이 오래 지속되진 못했다.

제조법에 따른 발광지속력

각각의 제조법에 의해 만들어진 루미놀 시약들의 혈흔에 대한 발광지속력을 비교하기 위해 1:100배 희석혈액 샘플을 이용하였다. 희석혈액 샘플에 루미놀 시약을 300 ㎕씩 가하고 육안으로 발광이 관찰되는 시간을 4회 측정하였다.

평균 발광시간과 편차를 통해 발광지속력을 확인하였다. 실험에 사용한 제조법은 블루스타, 경찰청에서 사용하는 루미놀, L형, L-MS1.0, L-MS1.0+HEIDA였다.

기존 루미놀 시약에 비해 블루스타 및 과산화수소 안정화제가 첨가된 제형들이 혈흔 민감도 및 발광강도가 우수하다는 것은 상기 실험결과들을 통해 알 수 있었다. 표 2는 희석 혈흔과 루미놀 시약을 반응시킨 후 육안으로 관찰되는 발광시간을 4회에 걸쳐 측정한 값이다.

경찰청에서 사용하는 루미놀 시약의 평균 발광지속시간은 42초, 블루스타는 297초, L-MS1.0은 321초, L-MS1.0+HEIDA는 285초였다. HEIDA를 과산화수소 안정화제로 첨가할 경우에 루미놀 시약의 혈흔 민감도가 다소 떨어진다는 결과와 유사한 결과를 나타냈다.

혈액 반응 후 루미놀 시약의 pH 변화

각각의 제조법으로 만들어진 루미놀 시약들의 혈액 반응 후 pH 변화를 확인하기 위해서 1:5배, 1:10배, 1:100배로 희석된 혈액을 사용하였다. 루미놀 시약 100 mL에 1:10배, 1:100배로 희석된 혈액을 2mL 첨가하여 10분 동안 교반하였고 4회에 걸쳐 pH 변화를 측정하였다.

실험에 사용한 루미놀 시약은 블루스타, 경찰청에서 사용하는 루미놀, L형, L-MS1.0, L-MS1.0+HEIDA였다. 과산화수소 대신 과붕산나트륨을 산화제로 사용한 L-SPB형의 경우에는 1:5배, 1:10배 희석 혈액 2mL을 루미놀 시약 100mL에 떨어뜨린 후 동일한 방법으로 실험하였다.

제이인산나트륨 첨가에 따른 혈액과 루미놀 시약의 pH 변화를 확인하고자, 1:5배로 희석된 혈액 5 mL과 루미놀 시약 5 mL을 섞은 후 5일 동안 시간에 따른 용액의 pH 변화를 측정하였다.

도 16a, 도 16b 는 블루스타, 경찰청에서 사용하는 루미놀, L형, L-MS1.0, L-MS1.0+HEIDA 100 mL에 혈액 희석액을 2 mL을 섞었을 때 시간 경과에 따라 루미놀 시약의 pH의 변화를 보여준다. 반응 전 블루스타의 pH는 11.67였고 반응 10분 후 pH는 11.81로 pH가 0.14정도 높아진 반면, L형, L-MS1.0, L-MS1.0+HEIDA형은 반응 후 0.6정도 증가했고 pH 11.9 ~ 12.0로 측정되었다.

웨버법과 블루스타에 의한 혈액 DNA 파괴가 최소화 된다는 선행 연구결과에 따라 pH 12.2 이하는 혈액 DNA 분석에 영향을 주지 않을 것이다.

10배 혈액 희석액과 섞었을 때와는 달리 100배 혈액 희석액을 섞었을 때는 모든 루미놀 시약들에서 pH 변화폭이 매우 낮았고 pH 0.1 이하로 변화됨을 알 수 있었다. 이는 혈액과 반응에 의해 분해되는 과산화수소량이 적기 때문에 발생된 결과로 추정된다.

도 16c는 L-SPB제형 100 mL에 혈액 희석액(1:5, 1:10) 2mL을 섞은 후 10분 동안 시약의 pH 변화를 보여준다. 1:5배 혈액 희석액과 반응 시 pH는 0.28, 1:10 혈액 희석액과 반응 시 pH 0.24 상승하여 과산화수소를 산화제로 사용한 루미놀 시약보다 pH 상승폭이 다소 낮았다.

산화제로 과붕산나트륨을 사용하면 루미놀 시약을 제조할 때 pH를 좀 더 높일 수 있기 때문에, 혈흔에 대한 발광강도 및 혈흔민감도를 좀 더 높일 수 있을 것으로 추정된다.

도 16d는 1:5배로 희석한 혈액과 각각의 제조법으로 제조한 루미놀 시약을 동일한 양(1:1) 섞은 후 5일 동안 보관하면서 시간에 따라 혼합액의 pH 변화를 기록한 것이다.

블루스타는 제조 당시 11.62, 혈액과 반응 10분 후 12.12, 5일 후 12.40로 0.78 변화를 보였고, L-MS0.3은 제조 당시 11.22, 반응 10분 후 12.06, 5일 후 12.43으로 1.21, L-MS0.3에 제이인산나트륨을 첨가한 L-MS+SPD는 제조 당시 11.18, 반응 10분 후 11.98, 5일 후 12.21로 1.03의 변화를 나타냈다.

L-SPB는 제조 당시 pH는 11.49, 반응 10분 후 12.08, 5일 후 12.28로 0.79의 변화를 보였다. L-SPB에 제이인산나트륨을 첨가한 L-SPB+SPD는 제조 당시 pH 11.39, 반응 10분 후 11.74, 5일 후 11.91로 0.52의 pH변화를 나타냈다.

본 실험 결과를 통해 루미놀 시약 제조 시에 제이인산나트륨 첨가에 의해 혈액 반응 후 pH 변화가 다소 낮아진다는 사실을 확인할 수 있었다. L-MS의 경우에는 제이인산나트륨 첨가와 상관없이 블루스타에 비해 혈액 반응 후 pH 상승폭이 크다는 점을 알 수 있었지만, L-SPB는 제이인산나트륨을 첨가하지 않았을 경우 블루스타와 매우 비슷한 pH 변화 양상을 나타냈다.

L-SPB에 제이인산나트륨을 5 g/L 첨가했을 경우에는 5일 후 pH 변화가 0.52로 블루스타에 비해 0.2 이상 낮아졌기 때문에 제이인산나트륨 첨가에 따른 DNA파괴에 대한 연구가 추가로 필요할 것으로 판단된다.

혈액 반응 후 혼합액의 최종 pH는 루미놀 시약의 pH로 쉽게 제어할 수 없기 때문에 제조할 때 시약의 pH를 항상 고려해야 하며, 혈흔민감도에 영향을 주지 않는 범위에서 제이인산나트륨과 같은 pH 안정화제의 첨가는 필수 요소로 판단된다.

본 발명에 따른 혈흔 탐지용 조성물이 혈액 DNA에 미치는 영향을 관찰하였다. 상세하게는, (i) 본 발명에 따른 혈흔 탐지용 조성물에 포함된 화학 물질이 DNA 추출 효율에 미치는 영향, (ii) 채취 후 보존 과정에서 혈액 DNA의 분해에 미치는 영향 (iii) STR 증폭(PCR)을 통해 DNA 프로필에 미치는 영향에 대한 연구를 수행하였다.

대조 시약으로는, 블루스타(Blustar forensic kit)가 사용되었다.

혈액 시료 및 혈흔 탐지 시약

혈액은 3명의 지원자로부터 제공받았다. 블루스타는 Sirchie사 (Youngsville, USA)로부터 구매하여 사용자 지침서대로 제조하여 사용하였다.

혈흔 탐지 시약A(이하, '블러드플레어A'라 함)과 혈흔 탐지 시약B(이하, '블러드플레어B'라 함)를 다음과 같이 제조하여 사용하였다.

· 블러드플레어 A

빈 용기에 증류수 1L와 수산화나트륨 3g을 넣고 완전히 용해시킨 뒤, 루미놀 1g을 더 넣고 완전히 용해시켰다. 이후, 글리신 1g과 제이인산나트륨·7수화물 5g, 황산마그네슘 0.3g을 첨가하고 용해시켜 보관용액을 제조하였다. 보관용액 100 mL당 과산화수소 1 mL를 넣고 교반하였다.

· 블러드플레어 B

빈 용기에 증류수 1L와 수산화나트륨 3g을 넣고 완전히 용해시킨 뒤, 루미놀 1g을 더 넣고 완전히 용해시켰다. 이후, 글리신 2g과 제이인산나트륨·7수화물 5g을 넣고 용해시켜 보관용액을 제조하였다. 보관용액 100 mL당 과붕산나트륨·1수화물 1g을 넣고 교반하였다.

DNA 추출 효율에 미치는 영향

대표적인 DNA 추출 방법인 컬럼 방식과 비드 방식을 각각 사용하여 혈흔 탐지 시약들이 DNA 추출에 미치는 영향을 알아보았다.

QIAmp DNA micro kit(Qiagen, Valencia, CA)가 컬럼으로 추출하는 방식에 사용되었고, QIAsymphony DNA Investigator Kit(Qiagen)가 비드로 추출하는 방식에 사용되었다. 각 키트는, 사용자 지침서대로 사용되었다.

하기에서와 같이 시료들을 제작하였다. 이 때, 증류수, 블루스타, 블러드플레어A, 블러드플레어B는 각각 동일 부피로 혈액 원액과 혼합되었다. 각각의 시료들로부터 DNA를 추출하였으며, 추출된 DNA는 NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 분광 광도계로 5회 반복 정량하여 평균을 계산하였다.

(i) 혈액 원액(N=2) 25㎕와 증류수의 혼합물

(ii) 혈액 원액(N=2) 25㎕와 블루스타

(iii) 혈액 원액(N=2) 25㎕와 블러드플레어A

(iv) 혈액 원액(N=2) 25㎕와 블러드플레어B

하기 표 3에는 실험 결과가 정리되어 있으며, 하기 표 3을 참조하면, 각 시료들로부터 분리된 DNA의 농도는 모두 유사하였고, 본 연구에 사용된 모든 혈흔 탐지 시약들이 DNA 추출에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.

혈액 DNA 분해에 미치는 영향

일반적으로 DNA의 농도가 낮을수록 환경의 영향에 민감하기 때문에 혈액 원액(N=3)을 증류수로 1/10 및 1/100 희석하였다. 다음과 같이 희석혈액 10 ㎕를 사용하여 시료들을 제작하였다. 이 때, 증류수, 블루스타, 블러드플레어A, 블러드플레어B는 각각 동일 부피로 희석혈액 10㎕와 혼합되었다.

(i) 1/10 희석혈액 10㎕와 증류수의 혼합물

(ii) 1/10 희석혈액 10㎕와 블루스타의 혼합물

(iii) 1/10 희석혈액 10㎕와 블러드플레어A 의 혼합물

(iv) 1/10 희석혈액 10㎕와 블러드플레어B 의 혼합물

(v) 1/100 희석혈액 10㎕와 증류수의 혼합물

(vi) 1/100 희석혈액 10㎕와 블루스타의 혼합물

(vii) 1/100 희석혈액 10㎕와 블러드플레어A 의 혼합물

(viii) 1/100 희석혈액 10㎕와 블러드플레어B 의 혼합물

각 시료들을 상온에서 0일, 1일, 3일 및 7일간 반응(incubation)시켰다. 반응 시간은 수사기관 등의 증거물 채취로부터 DNA 프로필 분석 이전까지 시료가 보관되는 기간을 고려하였다.

QIAmp DNA micro kit를 사용하여 모든 시료들로부터 DNA를 추출하였다. 추출 키트에 포함된 버퍼 AE 50㎕로 용리(elution) 하였다.

DNA 분해 정도를 측정하고자 실시간 정량 분석 키트인 QuantifilerTM Trio Quantification kit(Thermo Fisher Scientific) 및 ABI 7500 RT-PCR(Thermo Fisher Scientific) 장비를 사용하였다. 기존의 정량 분석 키트는 전체 인간 DNA(Total Human DNA) 타겟 부위가 단일 유전자이고, 증폭 크기는 62bp(Quantifiler Human kit) 혹은 140bp(Quantifiler Duo kit)인 반면, QuantifilerTM Trio Quantification kit는 2가지의 전체 인간 DNA 타겟 부위를 갖고 있어 증폭 크기 214bp의 큰 타겟 부위(Large Autosomal, LA)와 80bp의 작은 타겟 부위(Small Autosomal, SA)를 동시에 정량할 수 있다.

분해지수(Degradation Index, DI) 계산은 전체 인간 DNA(total human DNA)의 큰 타겟 부위(Large Autosomal, LA) DNA 농도를 작은 타겟 부위(Small Autosomal, SA) DNA 농도로 나누어 계산하였다. 사용자 지침서에 의하면 분해지수가 1 보다 작으면 DNA가 분해되지 않은 것, 10보다 크면 심각한 분해가 진행된 것으로 기준을 제시하고 있다.

실험 결과, 혈흔 탐지 시약들 사이의 차이는 있었지만 유의한 수준은 아니었으며, 모두 분해지수 1 미만의 수치를 보였다(도 17a 및 도 17b). 즉, 사용자 지침서에서 제시된 기준으로 보면, 본 연구에 사용된 모든 혈흔 탐지 시약이 DNA 분해에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.

증폭 및 모세관 전기영동

혈액 DNA 분해에 미치는 영향을 알아보기 위해, 제작하였던 시료들 중 1/10 희석혈액을 혈흔 탐지 시약과 7일간 반응시킨 시료들로부터 분리된 DNA를 선별하였고, 10㎕를 주형으로 Identifier Plus kit(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 증폭하였다.

선별 기준은 혈흔 탐지 시약과 가장 오랜 기간 반응시킨 시료를 우선으로 하였다. 1/100 희석혈액은 전반적인 DNA의 농도가 낮았고, 농도만을 비교하였을 때 시료들 간의 오차(variation)가 관찰되어 제외하였다. 하지만 1/100 희석 혈액의 분해지수는 LA DNA 농도와 SA DNA 농도의 비를 계산한 값이기 때문에 두드러진 오차가 관찰되지 않아 위 실험 결과에서는 포함하여 제시하였다.

모든 실험 과정은 사용자 지침서대로 수행하였고, 증폭은 GeneAmp PCR System 9700(Thermo Fisher Scientific), 모세관 전기영동은 3500xL Genetic Analyzer(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 데이터 분석은 GeneMapper ID-X v1.4 Software (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 RFU(relative fluorescent units) 100 기준으로 수행하였다.

3명의 혈액시료에서 DNA 프로필의 검출률을 계산한 결과, 블루스타, 블러드플레어A 및 블러드플레어B 모두 100%의 검출률을 보였다(도 18 참고).

일반적으로 습도, 열, 미생물 등 다양한 환경의 노출에 의하여 분해된 DNA는 절편화(fragmentation)를 유도하고, 평균 증폭산물의 크기를 감소시키며, 분해의 정도가 심할수록 길이가 긴 증폭산물은 증폭 량이 감소(혹은 불검출)한다. 이를 ski slope effect 라고 하며, 현장 증거물의 STR 분석 과정에서 종종 관찰된다. 비록 DNA 프로필의 검출률은 100% 이지만 혈흔 탐지 시약에 의한 분해에 의한 ski slope effect 현상을 보이는지 관찰하였으며, 본 연구에 사용된 모든 시약에서 ski slope effect가 관찰되지 않았다.

이상 본 발명자에 의해서 이루어진 발명을 상기 실시 예에 따라 구체적으로 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시 예에 한정되는 것은 아니고 그 요지를 이탈하지 않는 범위에서 여러 가지로 변경 가능한 것은 물론이다.

Claims

3-아미노프탈하이드라자이드(3-aminophthalhydrazide);
글리신;
수산화나트륨; 및
제이인산나트륨·7수화물;
을 포함하는 혈흔 탐지용 조성물.
제1 항에 있어서,
황산마그네슘·7수화물; 및
과산화수소;
를 더 포함하는 혈흔 탐지용 조성물.
제1 항에 있어서,
과붕산나트륨·1수화물;
을 더 포함하는 혈흔 탐지용 조성물.
제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서,
수소이온농도(pH)가 12.0 이하인 혈흔 탐지용 조성물.
제4 항에 있어서,
수소이온농도(pH)가 11.3 이상 내지 11.7 이하인 혈흔 탐지용 조성물.