CN105352920A - 一种利用1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物作为荧光探针检测铜离子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物作为荧光探针检测铜离子的方法，属于光分析检测技术领域。本发明通过实验考察研究了1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物与多种金属离子的识别作用，发现探针分子ESN对铜离子具有很好的选择性识别作用，且羟基与水的溶解性使得探针分子能够在水溶液中实现对铜离子的荧光识别，并在生理pH值条件下达到较好的结果，该方法绿色，对铜离子选择性专一，灵敏度也比较高，且在较短反应时间内起到荧光淬灭作用，该探针分子能够成功应用于生物活细胞内的铜离子检测。

Description

一种利用1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物作为荧光探针检测铜离子的方法

技术领域

本发明属于光分析检测技术领域，具体涉及一种利用1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物作为荧光探针检测铜离子的方法。

背景技术

生命体内的一些生命活动是生命科学、医学和化学领域中人们非常关注的研究对象，特别是一些金属微量元素在生命过程中的代谢过程，微量金属元素与人类的一些疾病或多或少存在一定的联系，以往由于缺乏一定的技术手段，人们很难去深入研究这些问题，但是近年来随着激光共聚焦显微镜扫描技术的出现，为离子荧光化学传感器的研究提供了更有利的手段，也为人们研究生命细胞内的离子存在提供了可能。

蒽醌类化合物是各种天然醌类化合物中数量最多的一类化合物。很久以前，蒽醌类化合物被用作天然染料，后来发现它们具有许多药用价值而受到重视。例如，它们具有抗菌消炎、抗病毒、抗癌、保肝利胆、明目、促智、抗衰老、抗诱变和防紫外线的作用。另外，蒽醌类化合物还具有止血活血、促睡眠作用、降血脂作用和增加免疫功能等作用，然而并没有关于蒽醌类化合物作为荧光探针用于检测铜离子的相关报道。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种选择性专一、灵敏度较高且响应时间较短的利用1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物作为荧光探针检测铜离子的方法。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种利用1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物作为荧光探针检测铜离子的方法，其特征在于该1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物的结构式为：，具体步骤为：（1）在多个10mL的比色管中分别加入1mL磷酸盐缓冲溶液，再分别加入0.01mL摩尔浓度为1.0×10^-3mol/L的1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲的DMF-H₂O溶液，然后分别加入不同浓度的铜离子溶液，用去离子水定容至10mL，摇匀后测定各溶液的荧光强度，确定荧光强度与铜离子浓度的定量关系并制作标准曲线；（2）在10mL的比色管中加入1mL磷酸盐缓冲溶液，再加入0.01mL摩尔浓度为1.0×10^-3mol/L的1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲的DMF-H₂O溶液，然后加入待测溶液，用去离子水定容至10mL，摇匀后测定待测溶液的荧光强度，根据荧光强度与铜离子浓度的定量关系确定待测溶液中铜离子的浓度。

进一步限定，所述的磷酸盐缓冲溶液为pH=7.2的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄体系。

进一步限定，所述的DMF-H₂O溶剂中DMF与H₂O的体积比为1:99。

进一步限定，摇匀混合作用至少25min后测定溶液的荧光强度。

进一步限定，所述的荧光强度测定条件为激发狭缝5nm，发射狭缝10nm，激发波长488nm，发射波长577nm。

本发明通过实验考察研究了1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物与多种金属离子的识别作用，发现探针分子ESN对铜离子具有很好的选择性识别作用，且羟基与水的溶解性使得探针分子能够在水溶液中实现对铜离子的荧光识别，并在生理pH值条件下达到较好的结果，该方法绿色，对铜离子选择性专一，灵敏度也比较高，且在较短反应时间内起到荧光淬灭作用，该探针分子能够成功应用于生物活细胞内的铜离子检测。

附图说明

图1是本发明实施例1空白样品加入铜离子后混合体系的荧光强度△F随混合体系pH的变化曲线；

图2是本发明实施例1空白样品加入铜离子后混合体系的荧光强度△F随混合作用时间的变化曲线；

图3是本发明实施例2中不同浓度的铜离子溶液的荧光吸收光谱图；

图4是本发明实施例2中不同浓度的铜离子溶液的荧光吸收强度的线性回归曲线；

图5是本发明实施例3中不同金属离子加入探针分子标配溶液的荧光吸收光谱图；

图6是本发明实施例4中不同金属离子与铜离子共存时对混合体系荧光强度的影响；

图7是本发明实施例5中荧光淬灭的变化值随铜离子与ESN配比的变化曲线；

图8是本发明实施例6中MDCK细胞的激光共聚焦显微镜照片；

图9是本发明实施例6中MDCK细胞加入探针分子ESN和铜离子后的激光共聚焦显微镜照片。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

实验条件的优化

1、探针分子浓度的选择

增加探针分子的浓度能增大吸光度和荧光强度，利于提高测定金属离子的选择性和标准曲线的线性范围。但当浓度太高时，空白的荧光强度也会随着探针分子浓度的增加而增大，浓度太低则加入离子淬灭后难以检出荧光吸收峰，考虑到方法的灵敏度和线性范围，探针的浓度选择为1.0×10^-5mol/L。

2、缓冲溶液的选择

在10mL的比色管中加入1mL磷酸盐缓冲溶液，再加入0.01mL摩尔浓度为1.0×10^-3mol/L的1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲的DMF-H₂O溶液，然后用去离子水定容至10mL配制成空白样品。

在不同的缓冲体系如KCl-HCl、HAc-NaAc、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、NaHCO₃-Na₂CO₃下调整不同的pH值来考察空白样品的荧光光谱，荧光强度测定条件为激发狭缝5nm，发射狭缝10nm，激发波长488nm，发现随着pH值的增加探针分子ESN的荧光发射峰的强度逐渐降低，当pH到9.0以后荧光强度迅速降到150，继续增大碱性至pH为10则检测不到荧光强度。荧光强度降低值△F=F₀-F（F₀为不加铜离子时混合体系的荧光强度，F为加入铜离子后混合体系的荧光强度）随混合体系pH的变化情况如图1所示，由图可见，混合体系的荧光强度在6.0-8.0范围内比较稳定，荧光强度变化的倍率较大，考虑到将要考察探针分子在生物细胞内的应用，所以实验选择了生理条件的pH即pH=7.2的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄体系作为测定介质的缓冲溶液。

3、溶剂的选择

本实验希望实现在细胞内荧光探针对离子的识别作用，因此考察时没有选择纯有机溶剂，而是选择了水溶液体系对比，如DMF-H₂O、THF-H₂O、二噁烷-H₂O和乙醇-H₂O，实验结果发现在DMF-H₂O（DMF与H₂O的体积比为1:99）中能够有效检测探针分子的荧光强度，而在其它水溶液体系中化合物ESN易溶出，所以实验选择了DMF-H₂O体系。

4、混合作用时间的选择

实验结果表明，空白样品的荧光随时间缓慢降低，但加入铜离子以后，其荧光强度淬灭迅速，在15min后即趋于稳定，到25min后荧光强度变化很小（如图2），故选择测试在加入试剂混合作用25min后进行测定。

实施例2

在多个10mL的比色管中分别加入1mL磷酸盐缓冲溶液，再分别加入0.01mL摩尔浓度为1.0×10^-3mol/L的1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲的DMF-H₂O（DMF与H₂O的体积比为1:99）溶液，然后分别加入不同浓度的铜离子溶液（[Cu²⁺](×10^-6mol/L)：0.3、0.5、0.7、1、2、3、4、5、7、9、10），用去离子水定容至10mL，摇匀混合作用25min后测定各溶液的荧光强度，荧光强度测定条件为激发狭缝5nm，发射狭缝10nm，激发波长488nm，发射波长577nm，测定过程中溶液由淡红色变成兰紫色，图3是不同浓度的铜离子溶液的荧光吸收光谱图，从图中可以看出488nm处的荧光吸收峰红移在518nm处出现一个新的荧光吸收峰，同时荧光吸收光谱中577nm处荧光吸收峰随铜离子浓度的增加而逐渐减小，确定荧光强度与铜离子浓度的定量关系并制作标准曲线（如图4），其中检测限（LOD）由方程式LOD=KS_o/S给出，K=3，S_o为空白测定的标准偏差（n=6），S是工作曲线的灵敏度，有关分析参数列于表1。由表1和图4可知该检测方法具有很好的线性关系和较高的分析灵敏度，该检测方法的最低检测下限是1×10^-8mol/L。

表1不同浓度铜离子的分析参数

实施例3

在多个10mL的比色管中分别加入1mL磷酸盐缓冲溶液，再分别加入0.01mL摩尔浓度为1.0×10^-3mol/L的1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲的DMF-H₂O溶液，然后分别加入摩尔浓度均为1.0×10^-3mol/L的不同金属离子的标配溶液（Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Ni³⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Ag²⁺、Hg²⁺等不同离子），用去离子水定容至10mL，摇匀后测定各溶液的荧光强度（如图5），结果表明当同样浓度的各种金属离子分别与探针分子ESN作用时，只有Cu²⁺的加入使混合体系在577nm处荧光强度降低发生荧光淬灭，而其它金属离子与探针分子作用时，相比较于空白样品，其荧光强度没有明显变化。表明探针分子ESN对铜离子的识别具有很好的选择性。

实施例4

本实施例进一步考察了ESN对铜离子传感的荧光选择性，尝试了环境水样中可能存在的各种金属离子与铜离子共存时对体系荧光强度的影响。在图6中，标记为none的组分为仅含1.0×10^-5mol/L铜离子时体系的荧光强度，其余为同等浓度铜离子与各种不同浓度倍数的其它金属离子共存时体系的荧光强度，由左至右金属离子浓度为铜离子浓度的倍数分别如下：K⁺(100倍)、Na⁺(100倍)、Ca²⁺(100倍)、Mg²⁺(100倍)、Ni³⁺(100倍)、Mn²⁺(20倍)、Zn²⁺(20倍)、Ba²⁺(20倍)、Fe³⁺(10倍)、Co²⁺(20倍)、Cd²⁺(20倍)、Pb²⁺(50倍)、Ag²⁺(10倍)和Hg²⁺(5倍)。由图可知，ESN对铜离子的响应除略受Ag⁺和Hg²⁺的影响外，基本不受其它共存金属离子的干扰，具有良好的选择性。

实施例5

缩氨基硫脲基团可以与重金属汞离子发生配合作用，使探针分子的荧光发生淬灭，氮原子易与铜离子配位，缩氨基硫脲基团中有C=N和C=S双键，而羟基蒽醌与缩氨基硫脲基团可以形成大的共轭体系，质子可以在分子内转移形成荧光吸收峰。而体系加入铜离子后，与C=N键上的氮原子络合配位，氧原子和氮原子、硫原子与铜离子都有一定的络合作用，阻断了质子在共轭体系内的传递，使得蒽醌化合物的荧光强度减弱，发生荧光淬灭，当铜离子浓度与探针分子浓度达到1:1时，荧光淬灭的强度达到一个稳定值。

Cu²⁺与ESN的络合作用

从实验数据我们可以看出，当加入铜离子浓度与探针分子ESN浓度逐渐达到1:1时，荧光淬灭的变化值达到稳定（如图7）。

实施例6

本实施例将探针分子ESN用于动物肾上皮细胞MDCK（正常细胞）中铜离子的检测，将MDCK细胞株解冻后置于培养皿中培养24-48h，分别置于六孔培养皿中，每孔内容有3mLDMEM培养液，配制摩尔浓度为50μM的硝酸铜溶液和摩尔浓度为100μM的探针分子ESN溶液。取一定的量的硝酸铜溶液分别置于培养板的各孔中，与细胞溶液混合均匀后，置于恒温箱中培养12h后，分别用PBS（phosphate-bufferedsaline）冲洗培养皿里的细胞，冲洗干净后，加入新鲜的培养液，然后加入处理好的探针分子ESN溶液，放入恒温箱中0.5h后，取出培养皿，再用新鲜PBS冲洗干净后立即进行聚焦激光扫描显微镜的检测。图8是MDCK细胞的激光共聚焦显微镜照片，其中A为暗场MDCK细胞荧光图，B为亮场MDCK细胞荧光图，从激光共聚焦显微镜照片可知MDCK细胞自身没有荧光，探针分子ESN进入细胞后仪器可检测出细胞的荧光，而在加入铜离子后细胞的荧光被铜离子迅速淬灭减弱，聚焦激光显微镜能够清楚地捕捉到这个过程（如图9，其中A为加入探针分子ESN的激光共聚焦显微镜照片，B为继续加入铜离子后的激光共聚焦显微镜照片）。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (5)

1.一种利用1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物作为荧光探针检测铜离子的方法，其特征在于该1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物的结构式为：，具体检测步骤为：（1）在多个10mL的比色管中分别加入1mL磷酸盐缓冲溶液，再分别加入0.01mL摩尔浓度为1.0×10^-3mol/L的1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲的DMF-H₂O溶液，然后分别加入不同浓度的铜离子溶液，用去离子水定容至10mL，摇匀后测定各溶液的荧光强度，确定荧光强度与铜离子浓度的定量关系并制作标准曲线；（2）在10mL的比色管中加入1mL磷酸盐缓冲溶液，再加入0.01mL摩尔浓度为1.0×10^-3mol/L的1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲的DMF-H₂O溶液，然后加入待测溶液，用去离子水定容至10mL，摇匀后测定待测溶液的荧光强度，根据荧光强度与铜离子浓度的定量关系确定待测溶液中铜离子的浓度。

2.根据权利要求1所述的利用1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物作为荧光探针检测铜离子的方法，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲溶液为pH=7.2的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄体系。

3.根据权利要求1所述的利用1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物作为荧光探针检测铜离子的方法，其特征在于：所述的DMF-H₂O溶剂中DMF与H₂O的体积比为1:99。

4.根据权利要求1所述的利用1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物作为荧光探针检测铜离子的方法，其特征在于：摇匀混合作用至少25min后测定溶液的荧光强度。

5.根据权利要求1所述的利用1,4-二羟基-9,10-蒽醌缩氨基硫脲化合物作为荧光探针检测铜离子的方法，其特征在于：所述的荧光强度测定条件为激发狭缝5nm，发射狭缝10nm，激发波长488nm，发射波长577nm。