CN102219789A - 一种罗丹明b的色酮酰腙衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种罗丹明b的色酮酰腙衍生物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种罗丹明B的色酮酰腙化合物及其制备方法与其作为荧光探针的应用。其中所述衍生物的化学结构如式(I)所示。本发明的罗丹明B色酮酰腙衍生物能选择性的与二价铜离子作用，由无色变为红色，具有荧光增强效应，可实现裸眼辨别检测，也可通过紫外吸收和荧光光度法进行分析，不仅可用于水溶液中铜离子的检测，更重的是可以用于细胞内铜离子的检测。

Description

一种罗丹明B的色酮酰腙衍生物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种以罗丹明B为母体的色酮酰腙衍生物，尤其涉及一种罗丹明B的色酮酰腙衍生物及其制备方法与与其作为荧光探针在细胞成像中的应用。
背景技术
罗丹明B具有较大摩尔消光系数和较高量子产率，修饰后常常用于荧光探针研究，并用作标记生物分子。近几年利用荧光增强效应检测活体细胞中金属离子的研究得到不断发展。
二价铜离子是一种广泛存在于环境和生命体中的重金属离子，是人体所必需的微量元素。适量铜离子的存在能维持如细胞色素氧化酶，锌，铜超氧化物歧化酶，赖氨酰氧化酶等重要蛋白质的正常功能。人体细胞中铜离子代谢平衡的破坏，可能导致如Menkes综合症，Wilson病，肌萎缩性侧索硬化症和老年痴呆症等疾病。而且一般肿瘤细胞中具有较高含量的铜离子，所以定量检测铜离子对于阐明其生理病理作用以及研发抗肿瘤药物都极其重要。
然而，近期的检索发现，能同时作为荧光探针高选择性和高灵敏度地用于活体细胞中铜离子的检测的罗丹明B的色酮酰腙衍生物还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明目的是提供一种新的罗丹明B的色酮酰腙化合物，以及合成方法，和其作为荧光探针在检测活体细胞中二价铜离子的应用。
本发明所述罗丹明B的色酮酰腙化合物，其化学结构如式(I)所示：
Figure DEST_PATH_GDA0000067243410000011
上述罗丹明B的色酮酰腙衍生物的制备方法，其特征是：将罗丹明B与质量百分比为80-85％的水合肼反应，得到罗丹明B酰肼，然后将其与6-甲氧基-4-氧代-4H-3-甲酰基-苯并吡喃反应，得到罗丹明B的色酮酰腙衍生物。
本发明所述罗丹明B的色酮酰腙衍生物作为荧光探针在检测水溶液或活体细胞中二价铜离子的应用。
配制罗丹明B的色酮酰腙衍生物的HEPES/乙腈缓冲液(20mM HEPES，pH＝72，3∶7，体积比)的溶液，分别定量加入微升级的CuCl2·2H2O，CdCl2·2.5H2O，AgNO3， CoCl2·6H2O，NiCl2·6H2O，FeCl3·6H2O，HgCl2，ZnCl2，NaCl，KCl，CaCl2，MgSO4，AlCl3的水溶液。分别进行紫外可见分光光度法和荧光分光光度法测试，显示罗丹明B的色酮酰腙衍生物对二价铜离子具有较好的选择性，加入铜离子前后对照显示荧光增强40倍，具有较强荧光增强效应(见图3)。
进一步的，在不加入铜离子和加入铜离子的活HeLa细胞中分别加入罗丹明B的色酮酰腙衍生物，相同条件处理下，荧光成像显示罗丹明B的色酮酰腙衍生物能较好地渗透进细胞内。加入铜离子的活HeLa细胞内显较强荧光，不加入铜离子的HeLa细胞不显荧光。
本发明成功的制备了能同时作为荧光探针高选择性和高灵敏度地用于水溶液或活体细胞中铜离子的检测的罗丹明B的色酮酰腙衍生物，实验证明该衍生物能选择性的与二价铜离子作用，由无色变为红色，具有荧光增强效应，可实现裸眼辨别检测，也可通过紫外吸收和荧光光度法进行分析。不仅可用于水溶液中铜离子的检测，更重的是可以用于细胞内铜离子的检测。
附图说明
图1为罗丹明B的色酮酰腙衍生物的单晶结构图。
图2为罗丹明B的色酮酰腙衍生物的HEPES/乙腈缓冲液(20mM HEPES，pH＝72，3∶7，体积比)的溶液加入不同金属离子的紫外吸收图谱。
图3为罗丹明B的色酮酰腙衍生物的HEPES/乙腈缓冲液(20mM HEPES，pH＝72，3∶7，体积比)的溶液加入不同金属离子的荧光激发和发射图谱。
图4为罗丹明B的色酮酰腙衍生物的核磁共振氢谱。
图5为罗丹明B的色酮酰腙衍生物在HeLa细胞内荧光成像，其中：(a)加入10μM的罗丹明B的色酮酰腙衍生物的HeLa细胞在37℃培养5小时的图像；(b)为(a)的明场像图；(c)为(a)和(b)的叠加图；(d)加入50μM铜离子的HeLa细胞在培养基中37℃培养2小时，然后用罗丹明B的色酮酰腙衍生物同(a)相同条件处理后的图像；(e)为(d)的明场像图；(f)为(d)和(e)的叠加图。
具体实施方式
实施例1由罗丹明B合成罗丹明B的色酮酰腙衍生物。
将1g罗丹明B(1)(2.1mmol)，2.7g 80％(质量百分比)水合肼(43mmol)加入12mL无水乙醇中，加热至回流，继续反应3小时左右，反应完全后降温、减压浓缩除去溶剂，残留物中加入40mL水，40mL乙酸乙酯，振荡萃取后，水相继续用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压浓缩除去溶剂得到土黄色罗丹明B酰肼(2)0.95g，熔点：166-170℃收率：97％。
核磁共振氢谱测定：1HNMR(CDCl3，400MHz)，δ(ppm)：1.17(t，12H，NCH2CH3，J＝7.0Hz)，3.34(q，8H，NCH2CH3，J＝7.0Hz)，3.62(bs，2H，NH2)，6.29(d，2H，Xanthene-H，，J＝8.7Hz)，6.42(s，2H，Xanthene-H)，6.46(s，2H，Xanthene-H，，J＝8.7Hz)，7.10(dd，1H，Ar-H，J＝8.5，3.9Hz)，7.44-7.46(m，2H，Ar-H)，7.94(dd，1H，Ar-H，J＝8.7，3.7Hz)。
将608mg罗丹明B酰肼(2)(1.3mmol)加入10mL无水乙醇中，溶解后将300mg 6- 甲氧基-4-氧代-4H-3-甲酰基-苯并吡喃(3)(1.4mmol)加入反应液中。加热至回流继续反应1h左右，反应完全，降至室温，过滤，滤饼用冷乙醇洗涤，得灰黄色固体产品即罗丹明B的色酮酰腙衍生物(4)735mg，熔点：254-258℃收率：85％。
红外光谱测定：IR(KBr)，υ：3075，3037，2967，2929，2894，2868，1693，1613，1515，1484，1306，1213，1115，823，784，713cm-1。
核磁共振氢谱测定：1HNMR(CDCl3，400MHz)，δ(ppm)：1.15(t，12H，NCH2CH3，J＝7.0Hz)，3.32(q，8H，NCH2CH3，J＝7.0Hz)，3.84(s，3H，OCH3)，625(dd，2H，Xanthene-H，J＝8.9，2.5Hz)，6.47(d，2H，Xanthene-H，J＝2.4Hz)，6.51(d，2H，Xanthene-H，J＝8.8Hz)，7.11(d，1H，Ar-H，J＝6.8Hz)，7.19(dd，1H，Chromone-H，J＝9.1，3.0Hz)，7.33(d，1H，Chromone-H，J＝9.1Hz)，7.44-7.51(m，2H，Ar-H)，7.52(d，1H，Chromone-H，J＝3.0Hz)，7.99(d，1H，Ar-H，J＝7.2Hz)，8.42(s，1H，N＝CH)，8.74(s，1H，Chromone-H)。
核磁共振碳谱测定：13C NMR(CDCl3，100MHz)，δ(ppm)：175.4，165.0，157.1，153.7，1532，152.1，150.9，148.9，140.1，133.5，128.9，128.3，127.9，124.8，123.9，123.7，123.4，119.6，119.0，107.9，105.6，105.0，98.1，65.9，55.9，44.3，12.6；HRESIMS calcd for[M+H]+C39H39N4O5 +：643.2915，found：6432917。
上述由罗丹明B合成罗丹明B的色酮酰腙衍生物的反应过程如下式所示：
Figure DEST_PATH_GDA0000067243410000031
实施例2检测罗丹明B的色酮酰腙衍生物对不同金属离子的选择性和响应能力。
用微量注射器分别向盛有25mL配置好的罗丹明B的色酮酰腙衍生物的HEPES/乙腈缓冲液(20mM HEPES，pH＝72，3∶7，体积比)的溶液中加入30当量Na+，Mg2+，Al3+，K+，Ca2+，Fe3+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，Ag+，Cd2+，and Hg2+离子水溶液(如CuCl2·2H2O，CdCl2·2.5H2O，AgNO3，CoCl2·6H2O，NiCl2·6H2O，FeCl3·6H2O，HgCl2，ZnCl2，NaCl，KCl，CaCl2，MgSO4，AlCl3)，分别进行紫外可见分光光度法和荧光分光光度法测试，检测罗丹明B的色酮酰腙衍生物对不同金属离子的选择性和响应能力。
结果显示罗丹明B的色酮酰腙衍生物对二价铜离子具有较好的选择性，加入铜离子前后对照显示荧光增强40倍，具有较强荧光增强效应(见图3)。
实施例3罗丹明B的色酮酰腙衍生物细胞内荧光成像测试。
实验组一：加入10μM的罗丹明B的色酮酰腙衍生物的HeLa细胞在37℃培养五小时；
实验组二：加入50μM铜离子的HeLa细胞在培养基中37℃培养两小时，然后用罗丹明B的色酮酰腙衍生物，再同实验组一所述条件进行同步处理。
荧光成像显示：罗丹明B的色酮酰腙衍生物能较好地渗透进细胞内。实验组一的HeLa细胞内不显荧光，实验组二的HeLa细胞内显示较强荧光(见图5)，提示罗丹明B的色酮酰腙衍生物能选择性的与二价铜离子作用，可以用于细胞内铜离子的检测。

Claims (3)

1.一种罗丹明B的色酮酰腙化合物，其化学结构如式(I)所示：
Figure FDA0000054349320000011
2.权利要求1所述罗丹明B的色酮酰腙衍生物的制备方法，其特征是：将罗丹明B与质量百分比为80-85％的水合肼反应，得到罗丹明B酰肼，然后将其与6-甲氧基-4-氧代-4H-3-甲酰基-苯并吡喃反应，得到罗丹明B的色酮酰腙衍生物。
3.权利要求1所述罗丹明B的色酮酰腙衍生物作为荧光探针在检测水溶液或活体细胞中二价铜离子的应用。
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