CN111116534B - 一种小分子探针cmsh以及制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小分子探针CMSH以及制备方法及应用，该探针母体为香豆素，该小分子探针可实现紫外与荧光精确检测ClO‑，可以用于检测溶液、活细胞以及斑马鱼中外源性的ClO‑，本发明合成方法简单，操作方便，不需要苛刻的条件，而且合成产率和纯度都很高，因此在ClO‑检测方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及荧光成像分子探针领域，尤其是涉及一种基于香豆素荧光成像技术检测ClO-的探针，具体涉及一种分子探针CMSH、其制备方法及应用。
背景技术
在目前为止所设计的分析方法中，荧光成像是检测离子的重要方法。然而，这种方法对样品的要求和工作环境上都有一定的局限性。此外，大多数探针的选择性和灵敏度都存在一定的限制，开发一种高选择性和灵敏性的探针是一种技术的挑战。为了深入了解深层荧光成像的相关信息，开发ClO-荧光成像成为了一种选择。但是，由于荧光强度大小存在差异，使得荧光成像的最大成像效果不是很理想，这种成像效果难以满足对生物体内进行观察的效果。例如，过量ClO-也可能导致一些副作用，在少量ClO-存在下，通过荧光成像难以检测到 ClO-。因此，开发一种监测ClO-浓度变化的有效方法非常重要。
最近，已经设计和合成了许多能够特异性鉴定ClO-的荧光探针，包括一些可以靶向亚细胞器的探针。然而大多数构建的ClO-探针是荧光增强或淬灭。与这种单发射波长变化的探头相比，比率型探头具有双波长发射特性，受环境因素的影响较小，响应范围广，精度高，可以实现半定量分析，已得到广泛应用。但是由于水溶性差与固有的毒性，目前报道的比率型探针限制了它们在生物中的应用。鉴于此，探究一种新的ClO-识别的探针具有深远的意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种高选择性和高灵敏度的ClO-识别荧光探针。
为实现上述目的，本发明提供一种小分子探针CMSH，所述分子探针分子式为C40H30N4O4，其结构式为：
本发明还提供上述小分子探针CMSH的制备方法，具体包括如下步骤：
向含7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-亚甲基-3-甲醛的无水乙醇溶液制备混合溶液的体积摩尔浓度为0.05-0.1mol/L，加入2-羟基苯甲酰肼，混合反应，过滤后用乙醇洗涤得到产物，所述7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-亚甲基-3-甲醛和2-羟基苯甲酰肼的摩尔比为：1：1-2。
作为本发明的进一步改进，所述7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-亚甲基-3-甲醛和2-羟基苯甲酰肼的摩尔比为1:1
本发明还提供上述小分子探针CMSH检测、识别环境中或生物样品中ClO-的应用。
作为本发明的一种应用范围，所述小分子探针CMSH利用荧光成像检测正常细胞和细菌中外源性的ClO-的应用。
作为本发明的一种应用范围，所述小分子探针CMSH利用荧光成像检测斑马鱼体内外源性的ClO-的应用。
作为本发明的一种应用方式,通过紫外分光光度法，在波长348nm、456nm 处测定ClO离子溶液的吸光度,通过计算A 348nm/A 535nm的吸光度比率来测定ClO-离子的浓度。
作为本发明的一种应用方式,通过荧光分光光度法，以350nm为激发波长，在470nm、532nm的波长处测定ClO-离子溶液的荧光强度，通过计算F470/F532 的荧光发射强度比率来测定ClO-离子的浓度。
本发明具有如下优点：本发明的小分子探针对ClO-的荧光反应具有特异性，以两个不同发射波长处荧光强度的比值F470/F532为信号参量，提高了检测的特异性与灵敏度，实现荧光技术精确检测ClO-，并且具有有良好的生物相容性，可以检测活细胞和斑马鱼体内ClO-。因此在ClO-检测方面具有良好的应用前景。同时，本发明的合成方法简单、操作方便，不需要苛刻的条件。
附图说明
图1a为小分子探针对ClO-的理论结合图，图1b为实施例1中合成小分子探针的路线图；
图2a为实施例2中小分子探针对ClO-识别的紫外光谱图,2b为小分子探针对ClO-识别的荧光光谱图；
图3a为实施例2中的小分子探针对不同浓度ClO-识别的紫外光谱图，3b 为小分子探针对不同浓度ClO-识别的荧光光谱图，3c为小分子探针A348/A456 比值随着不同浓度ClO-的变化，3d为小分子探针F470/F532比值随着不同浓度 ClO-的变化；
图4a为实施例3中小分子探针基于时间变化对ClO-识别的荧光光谱图,4b 为实施例3中小分子探针基于不同pH对ClO-识别的荧光光谱图；
图5为实施例3中验证小分子探针对ClO-选择性；
图6为实施例4中小分子探针在正常细胞中检测外源性的ClO-；
图7为实施例4中小分子探针在大肠杆菌中检测外源性的ClO-；
图8为实施例6中小分子探针在斑马鱼中检测外源性的ClO-；
图9为小分子探针结合ClO-前后的密度泛函理论计算图；
图10为小分子探针小分子探针的质谱图；
图11为小分子探针小分子探针的核磁氢谱图；
图12为小分子探针小分子探针的核磁碳谱图；
图13为实施例6中的CMSH的探针对MRC-5细胞的毒性测试结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明的范围。
实施例1合成小分子探针
向7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-亚甲基-3-甲醛的(500mg，2.04mmol)的无水乙醇(EtOH，30mL)溶液中加入2-羟基苯甲酰肼(310mg，2.04mmol)。在室温下搅拌反应混合物20小时后，将反应混合物通过布氏漏斗过滤，并将滤饼用乙醇洗涤，得到657mg CMSH为橙色固体，产率：85％，通过质谱、核磁可以确定该产物即为目标小分子探针，如图10-12所示。
合成小分子探针的路线图和对ClO-结合模式图如图1所示，图1表示合成小分子探针的路线图，其中EtOH为乙醇。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ11.96(s,2H),8.51(s,1H),8.39(s,1H),7.90(d, J＝7.6Hz,1H),7.66(d,J＝8.9Hz,1H),7.44(t,J＝7.6Hz,1H),6.96(d,J＝8.0Hz, 1H),6.94(d,J＝7.5Hz,1H),6.77(d,J＝7.6Hz,1H),6.58(s,1H),3.47(q,J＝6.7 Hz,4H),1.14(t,J＝6.7Hz,6H)；
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HRMS(ESI)m/z[M+1]+:Calcd for C21H22N3O4,380.1605,found,380.1603.
实施例2小分子探针对ClO-响应的紫外和荧光光谱
制备1mL小分子探针(10μM)的EtOH/H2O(v/v,1:19)溶液。1mM的ClO-溶液滴加到探针溶液中。
如图2(a)所示，加入ClO-(16当量)后，CMSH溶液的绿色立即变为无色，这可以通过肉眼用比色法将ClO-区分出来，荧光从绿色变为蓝色。为了检查 CMSH对ClO-的响应，进行了光谱滴定。如图3b所示，CMSH在456nm处显示明显的吸收带，在532nm处显示预期的发射带。随着ClO-浓度的增加，CMSH 在532nm处的荧光强度逐渐减弱，并在470nm处出现新的蓝移发射带。同时，当ClO-的浓度增加到16当量时，最大吸收波长从456nm变化到348nm，表明 CMSH的大π共轭物被ClO-破坏。此外，作用后的体系在(F470/F532)的比率值高达9.2倍，表明CMSH可用作ClO-的比率型荧光探针。
在相应系数的吸光度比(A348/A456)和ClO-浓度之间进行了线性校正，其测定范围为0-80μM，如图3c所示，通过绘制曲线，其计算公式为 y＝0.011x+0.001(y表示ClO-浓度，x为读取的吸光度)，校正系数较高(R2＝ 0.9728)，表明CMSH可以用于定量检测ClO-浓度。此外，通过在0至80μM 的ClO-浓度下绘制相应的荧光强度比值(F470/F532)对ClO-浓度，如图3c所示，通过绘制曲线，其计算公式为y＝0.031x-0.055(y表示ClO-浓度，x为读取的吸光度),可以获得良好的线性关系(R2＝0.9716)。此外，CMSH可以响应低浓度的ClO-，检测限为128nM，与以前报道的ClO-比率式荧光探针相当。
实施例3验证小分子探针对ClO-响应的时间动力学研究和不同pH值条件下的荧光强度变化，
实验结果见图4(a、b)可以看出小分子探针对ClO-离子有很快的响应，且 CMSH结合ClO-离子荧光增强并达到值的时间在40s以内。在pH为2-8之间，探针以及探针与CMSH离子的复合物荧光都能够保持好现有的荧光强度。
实施例4验证小分子探针对ClO-选择性
将5μM CMSH用各种生物学相关的ROS处理，包括各种分析物(80μM)。如图5a所示，仅添加80μM ClO-会导致CMSH出现明显的颜色和荧光变化，这可以用肉眼观察到。但是，其他分析物(O2-，Cl-，NO2-，AcO-，CO3 2-，1O2， NO-，ONOO-，SO4 2-，OH-，S2O3 2-，Cys，GSH和H2O2)的荧光强度变化大小忽略不计。为了进一步了解CMSH对ClO-的选择性高于其他分析物，我们比较了CMSH对其他干扰物的荧光比率(F470/F532)差异。如图5b所示，该探针对ClO-的响应比其他分析物的荧光强得多。基于CMSH中C＝N基团的裂解氧化，探针从溶液的颜色和对ClO-的荧光响应中表现出明显的色差，从而产生了蓝移发光的二乙氨基香豆素醛。在可见光和365nm紫外灯下，CMSH溶液的绿色仅在存在ClO-的情况下变为无色，荧光从绿色变为蓝色，通过裸眼和CMSH的荧光在存在其他分析物时可以很好地区分。其他分析物如图5c所示，在裸眼观察中并不能感受到荧光的明显差异。这些结果表明，CMSH可以识别ClO-，对其他生物分析物具有良好的选择性，在其他生物环境中具有潜在的检测ClO-的潜力。
实施例5中小分子探针识别ClO-理论计算研究
为了进一步了解探针的分子结构，荧光和吸收光谱的传感机理，对ClO-配位前后的CMSH的理论计算利用密度泛函理论(DFT)方法对离子进行了电子跃迁。如图9所示，提出了分子轨道图的CMSH和CMSH-ClO-配合物，CMSH 的基态电子云主要位于香豆素结构部分，当转移并分散到水杨酸结构部分时为激发态，表明探针结构中发生了分子内电荷转移(ICT)作用。如图9所示， CMSH的能级从HOMO(0.20102eV)到LUMO(0.08544eV)的水平为0.11558eV。然而，当ClO-离子与CMSH作用后，电子处于基态时电子云分布于整个香豆素结构中，而且处于激发态时电子云结构也是基本处于均匀分布，表明ClO-被阻断了分子探针中的ICT效应。此时反应后结构的能级为0.08992V。因此，与ClO-离子反应后整个分子结构的能量差降低了，从而导致从绿色到蓝色荧光信号的显着发射迁移。
实施例6小分子探针的在正常细胞中成像效果
通过MTT分析进行了CMSH的细胞毒性研究，结果显示，即使将80μM CMSH标准化24小时，仍有约80％的细胞仍然存活，结果如图13所示，这表明 CMSH具有较低的细胞毒性，可以进一步使用用于细胞成像实验。随后，为了证明该探针检测活细胞中外源性ClO-的能力，我们以对照组和治疗组进行了成像分析。如图6所示，在与5μM CMSH孵育20分钟后，MRC-5细胞呈现出清晰的细胞形态，其中绿色通道中的绿色荧光和蓝色通道中的非荧光。此外，将MRC-5细胞与5μM CMSH一起孵育，并分别用20μM，40μM和80μM ClO-进一步处理20 分钟，绿色荧光逐渐消失，蓝色荧光逐渐突出。随着ClO-浓度的增加，来自MRC-5 细胞的蓝色荧光变得更强，原始的绿色荧光逐渐消失。通过将蓝色通道图像与绿色通道图像介导，比例图像(蓝色/绿色)(图6d,6h,6l和6q)通过将蓝色通道图像(图6b，6f，6j和6o)与绿色通道图像(图6c，6g，6k和6p)来记录，这是加入ClO-后蓝色通道的突出运动。细胞成像结果表明，CMSH具有良好的细胞通透性，可以作为活细胞中ClO-的比例荧光成像。
实施例7小分子探针的在大肠杆菌中成像效果
采用CMSH通过荧光成像通过生物成像在大肠杆菌中检测ClO-。如图7所示，仅用5μM CMSH染色的大肠杆菌在大肠杆菌的绿色通道中显示出明显的荧光，而蓝色通道则没有荧光。分别添加20μM，40μM和80μM ClO-20分钟，绿色荧光中的大肠杆菌荧光逐渐消失，蓝色荧光逐渐突出，大肠杆菌的杆状形状从缩放区域中的荧光图案清晰可见。通过将蓝色通道图像(图7b,7f,7j和7o)与绿色通道图像(图7c,7g,7k和7p)来记录比例图像(F蓝色/F绿色)(图7d,7h,7l和7q)，这是添加ClO-后蓝色通道的显着运动。这些结果证明CMSH可用于追踪大肠杆菌中的ClO-，这将是研究细菌中ClO-的生物转化的潜在工具。
实施例8小分子探针的在斑马鱼中成像效果
在图8中，斑马鱼在胚胎培养基中培养，并与游离探针CMSH(5μM)孵育20分钟以使CMSH渗透到斑马鱼的整个组织中，它们在斑马鱼腹部区域显示出可见的绿色荧光，这表明该探针能够穿透斑马鱼组织并发出荧光。用CMSH 预处理斑马鱼时，蓝色通道几乎没有发现荧光。此外，斑马鱼用CMSH预处理并用PBS洗涤三次，然后分别与20μM，40μM和80μM ClO-孵育20分钟，显示出明显的变化，绿色荧光逐渐消失，在斑马鱼的头和腹部蓝色荧光越来越突出。通过将蓝色通道图像(图8b，8f，8j和8o)与绿色通道图像(图8c，8g， 8k和8p)记录比例图像(F蓝色/F绿色)(图8d，8h，8l和8q)。其中加入 ClO-后蓝色通道有突出运动。这些结果表明CMSH具有较高的组织穿透能力，并且可以实现通过比例荧光显示斑马鱼中ClO-的可视化。
本发明所述的小分子探针可通过荧光光谱技术检测溶液中的ClO-。
本发明具有如下优点：通过本发明所述制备方法合成小分子探针，还可以实现紫外和荧光光谱法精确传感ClO-，并且可以快速、准确的检测细菌、正常细胞以及斑马鱼体内中外源性的ClO-。因此在ClO-检测方面具有良好的应用前景。同时，本发明的合成方法简单、操作方便，不需要苛刻的条件。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种小分子探针CMSH检测、识别环境中或生物样品中CIO-的应用，其特征在于：所述分子探针分子式为C2lH21N3O4，其结构式为：
在pH为2-8之间，探针以及探针与CMSH离子的复合物荧光都能够保持好现有的荧光强度。
2.根据权利要求1所述的小分子探针CMSH检测、识别环境中或生物样品中CIO-的应用，其特征在于，所述小分子探针CMSH利用荧光成像检测正常细胞和细菌中外源性的ClO-的应用。
3.根据权利要求2所述的小分子探针CMSH检测、识别环境中或生物样品中CIO-的应用，其特征在于，所述小分子探针CMSH利用荧光成像检测斑马鱼体内外源性的ClO-的应用。
4.根据权利要求1所述的小分子探针CMSH测定CIO-的检测方法，其特征在于，通过紫外分光光度法，在波长348nm、456nm处测定CIO离子溶液的吸光度，通过计算A348nm/A535nm的吸光度比率来测定CIO-离子的浓度。
5.根据权利要求1所述的小分子探针CMSH测定CIO-的检测方法，其特征在于，通过荧光分光光度法，以350nm为激发波长，在470nm、532nm的波长处测定C1O-离子溶液的荧光强度，通过计算F470/F532的荧光发射强度比率来测定CIO-离子的浓度。
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| "香豆素类OCl-/CN-/Cys比率荧光探针的合成及光谱性能研究";杨月婷;《湖南大学硕士学位论文》;20130215;第2章 * |
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