CN113004238B - 一种多功能小分子荧光探针、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多功能小分子荧光探针、制备方法及应用。该多功能小分子荧光探针以7‑（二乙氨基）‑2‑氧代‑2H‑亚甲基‑3‑甲醛（CM）荧光小分子和（E）‑6‑（肼基亚甲基）萘‑2‑醇（HN）为基础合成，其中二者连接部分C=N键易被次氯酸氧化后导致HN基团脱落，探针荧光由黄色转为蓝色。同时，HN基团上羟基（‑OH）受pH影响容易去质子化而成‑O‑，探针荧光由黄色变成红色。所以，该小分子探针可实现荧光比率式、精确和快速地检测次氯酸（次氯酸根离子）或pH（OH‑）变化。本发明在次氯酸(次氯酸根离子)及pH（OH‑）检测方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于荧光成像分子探针领域，具体涉及一种多功能小分子荧光探针、制备方法及应用。
背景技术
荧光检测技术是利用光谱学方法将物质结构本身特性反应出来的一种技术，荧光成像也是检测各种离子的一种简单有效的方法。然而，这种方法对样品的要求和工作环境上都有一定的限制性。而且，大多数已报道探针在选择性和灵敏度方面都存在一定的局限，并且容易受到其他离子的干扰，误差较大。因此，开发一种高选择性和灵敏性的探针是一种技术的挑战。
活性氧（ROS）（含羟基自由基，单线态氧，一氧化氮，过氧化氢，超氧化物等）在各项生命过程中都发挥至关重要的作用。其中，次氯酸（HClO）在维持免疫系统的正常功效方面起着至关重要的作用。次氯酸主要是通过髓过氧化物酶（MPO）的作用，由Cl-和H2O2的过氧化而产生的。一般而言，HClO水平高低会对活生物体产生复杂的影响。一方面，如果含量低，它有助于杀死生物体中的入侵细菌或病原体。另一方面，已有很多证据表明过量的HClO会损害宿主组织，引起DNA损伤以及许多疾病，如动脉硬化，类风湿性关节炎和环境污染。因此，为了更好地了解次氯酸在各种疾病中的作用，我们必须开发高效灵敏的探针来感知生物系统中HClO水平的变化，而这其中基于荧光探针的检测分析就是非常有效的方法之一。
同样，pH在几乎所有生物过程中也都起着至关重要的作用。细胞需要保持良好的酸碱平衡，以便所有细胞内过程得以顺利进行。pH太高或太低都会导致细胞功能障碍，并导致癌症和传染病。鉴于此，对我们来说快速而灵敏地监测pH值的变化也很重要。多年来，诸如微电极，pH感应荧光蛋白，基于荧光的pH探针之类的各种pH传感设备也正在快速发展，其中荧光pH探针由于其简单性而变得越来越流行，易于使用，成本效益低，灵敏度和选择性高。先前，已有一些pH探针实现了在不同环境下灵敏和选择性地检测pH的变化。
尽管如此，目前这类次氯酸或pH探针多少存在以下问题：复杂的设计合成步骤，灵敏度和/或特异性不足，水溶性低，检测限高，对应用潜力的探索不足，而且大部分报道的探针通常都是单功能的即只能对一种离子实施检测。这些不足之处限制了它们的使用和应用，因此需要开发新的HClO 或pH探针或多功能探针来应对当前的挑战。此外，大多已开发的HClO或pH探针都依赖于荧光团的荧光增强或猝灭，与基于单个发射波长变化的那些探针相比，比率式荧光探针能够发射双波长的荧光，而不受其他环境因素的影响。鉴于此，本研究发明了一种多功能、高选择性和高灵敏度的比率式、次氯酸及pH识别荧光探针。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种多功能小分子荧光探针、制备方法及应用。
本发明的第一方面，提供一种多功能小分子荧光探针，所述小分子荧光探针分子式为C25H23N3O3，其结构式为：
本发明的第二方面，提供如上所述的多功能小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述小分子荧光探针为7-（二乙氨基）-2-氧代-2H-亚甲基-3-甲醛与（E）-6-（肼基亚甲基）萘-2-醇在溶剂中反应合成得到。
优选的，所述溶剂为乙醇。
优选的，所述方法包括以下步骤：所述7-（二乙氨基）-2-氧代-2H-亚甲基-3-甲醛溶解于乙醇中，然后加入（E）-6-（肼基亚甲基）萘-2-醇，搅拌下反应，生成产物：生成产物后将反应体系过滤并用乙醇洗涤，干燥后得到所述的小分子荧光探针。
本发明的第三方面，提供如上所述的多功能小分子荧光探针用于检测、识别环境中或生物样品中次氯酸或次氯酸根离子的应用。
本发明的第四方面，提供一种检测、识别环境中或生物样品中次氯酸或次氯酸根离子的方法，包括以下步骤：
将如上所述的小分子荧光探针与待测试样混合；
在476和570 nm处测定混合溶液的荧光比值。
优选的，所述的生物样品为细胞或活体动物。
本发明的第五方面，提供如上所述的多功能小分子荧光探针用于检测、识别环境中或生物样品中pH的应用。
本发明的第六方面，提供一种检测、识别环境中或生物样品中pH的方法，包括以下步骤：
将如上所述的小分子荧光探针与待测试样混合；
在606 和 570 nm处测定混合溶液的荧光比值。
优选的，所述的生物样品为细胞或活体动物。
本发明的有益效果如下：本发明的小分子荧光探针以香豆素CM荧光小分子和（E）-6-（肼基亚甲基）萘-2-醇（HN）为基础合成，其中二者连接部分C=N键易被次氯酸氧化后导致HN基团脱落，从而生成CM衍生物，与此同时探针荧光也由黄色转为蓝色。此外，HN基团上羟基（-OH）受pH影响容易去质子化而成氧离子，同时探针荧光由黄色变成红色。所以，该小分子探针可实现荧光比率式、精确和快速地检测次氯酸（次氯酸根离子）或pH（OH-）变化，可用于检测溶液、活细胞以及斑马鱼中外源性的次氯酸（次氯酸根离子）或pH（OH-）变化。由于采用比率式检测，因而实验结果不易受周围环境的影响，而且该探针具有多功能性可一个探针实现对两种不同离子的检测，因此在次氯酸(次氯酸根离子)或pH(OH-)检测方面具有良好的应用前景。同时，本发明的合成方法简单、操作方便，不需要苛刻的条件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1为实施例1中小分子荧光探针合成化学式；
图2为实施例1合成的小分子荧光探针的质谱；
图3为实施例1合成的小分子荧光探针的碳谱；
图4为实施例2中小分子荧光探针对次氯酸和pH识别的紫外和荧光光谱；
图5为实施例3中小分子荧光探针对次氯酸的选择性和竞争性检测；
图6为实施例4中小分子荧光探针对pH检测的信号稳定性和重复性；
图7为实施例5中小分子荧光探针对次氯酸根和氢氧根离子识别的密度泛函理论计算；
图8为实施例6中小分子荧光探针在癌细胞中检测外源性的次氯酸和pH；
图9为实施例7中小分子荧光探针在斑马鱼中检测外源性的次氯酸和pH。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：合成小分子荧光探针
合成小分子荧光探针的路线图如图1所示，其中EtOH为乙醇，RT为室温。
以下为本实施例合成小分子荧光探针的具体过程：将7-（二乙氨基）-2-氧代-2H-亚甲基-3-甲醛(500 mg, 2.04 mmol)溶解在30 mL乙醇溶液中，并在室温下加入（E）-6-（肼基亚甲基）萘-2-醇（HN）(379mg, 2.04 mmol)搅拌，室温搅拌反应20 h，将反应混合物通过布氏漏斗过滤，并将滤饼用乙醇洗涤，得到目标分子探针CMHN，为黄色固体。通过质谱、核磁以及光谱学方法可以确定该产物即为目标小分子荧光探针，其质谱、核磁如图2-3所示。
实施例2 ：小分子荧光探针对次氯酸和pH响应的紫外和荧光光谱
制备0.5 mL小分子荧光探针（10.0 µM）的H2O (含1% EtOH)溶液。0-20 µM次氯酸溶液滴加到探针溶液中，如图4(a)所示，在探针溶液中加入次氯酸后，在480 nm左右处的吸收带逐渐减弱，410 nm处左右有新的微弱吸收峰。
在荧光滴定实验中，制备3 mL小分子探针（5 µM ）的H2O (含1% 乙醇)溶液。0-20µM次氯酸溶液滴加到探针溶液中，以400 nm为激发波长测量探针从420 nm到750 nm的荧光值，实验结果见图4(b)。可观察到探针的荧光发射随次氯酸浓度增加而变化，原始的570nm发射峰强度渐渐减小而新的476 nm发射峰强度逐渐增加。
制备0.5 mL小分子荧光探针（10.0 µM）的H2O (含1% EtOH)溶液。改变探针溶液pH值从6.6增加到8.4，结果如图4(c)所示。改变探针溶液pH后，在480 nm左右处的吸收带逐渐减弱并红移到520 nm左右，280处左右也出现有新的吸收峰，吸收强度随着pH增加也随之增加。
在荧光滴定实验中，制备3 mL小分子探针（5 µM ）的H2O (含1% 乙醇)溶液。改变探针溶液pH值从6.6增加到8.4，以400 nm为激发波长测量探针从500 nm到700 nm的荧光值，实验结果见图4(d)。可观察到探针的荧光发射随溶液pH增加而变化，原始的570nm 发射峰强度渐渐减小而红移到新的606 nm处，其发射峰强度随pH增加而逐渐增加。
实施例3 ：验证小分子荧光探针对次氯酸的线性反应速度、特异选择性及抗干扰性
制备5 mL分子探针（5 µM）的H2O (含1% 乙醇)溶液。通过将相应的盐溶于去离子水制备各种干扰介质溶液（图5中A-N 依次为ClO-，F-, Cl-, NO2 -, ClO4 -, HCO3 -, H2PO4 -,SO4 2-, S2O3 2-, CO3 2-, H2O2, GSH, Cys ，20 µM）。随后，将同等当量的次氯酸溶液和这些干扰介质分别加入到探针溶液中。通过荧光光谱进行检测，取荧光发射波长比值（F476/F570）进行对比。图5（c）结果显示这些干扰介质对探针的荧光比值都没有产生和次氯酸那样明显的变化，属于ROS系列的NO2 -, H2O2产生了微乎其微的影响，但与次氯酸相比仍微不足道。由此可以判定该探针对于次氯酸具有很强的选择性而且可以用荧光比值（F476/F570）对次氯酸进行定量检测。图5（d）研究了探针对于次氯酸检测的抗干扰性，结果显示即便在其他干扰离子同时存在的情况下，探针依然能非常有效的识别次氯酸根离子。图5（b）研究了探针溶液对于次氯酸的响应速度，结果显示在80 S 以内，荧光比值就已经达到稳定的平衡值，这表明探针对于次氯酸响应是极其迅速的。图5（a）则分别对荧光光谱比值变化与添加次氯酸浓度做了线性模拟，结果显示荧光F476/F570比值与次氯酸浓度（0-10 µM）有很好的线性响应关系，揭示该探针可实现比值式检测次氯酸水平。
实施例4 ：小分子荧光探针的对pH的响应特性
图6（a）显示了探针荧光比值（F606/F570）对pH变化响应情况，结果表明随着pH从6.5增加到8.5，上述荧光比值也随之增加，pH 8.5时荧光比值比pH 6.5时有3倍以上的增加，同时图6（b）表明在pH 6.8-8.2左右，荧光比值与pH值有很好的线性响应关系，因此可用该荧光比值对pH值进行定量检测。图6（c）则显示上述荧光比值信号在不同pH下的稳定性，结果显示该比值较为稳定，没有明显的荧光漂泊/衰弱等现象。最后图6（d）则研究了荧光比值对pH测量的可逆性，同样结果表明该荧光比值在多个周期内对pH变化有很好的可逆响应。这些结果表明该荧光探针在检测pH时有很好的线性响应，信号稳定性和检测可逆性。
实施例5：小分子荧光探针对次氯酸根和氢氧根离子识别的密度泛函理论计算
在探针单独存在下和结合次氯酸根或氢氧根离子后荧光从无到有的一个变化过程，其中具体产生变化的原因通过计算结合前后分子荧光探针的能级跃迁，计算两者跃迁时所需的能量是否有差别，从本质上来解释这种情况。实验结果见图7。
如图7所示，在探针单独存在下，分子探针的最高占据轨道（HOMO）的能量为-5.3599 ev，最低空轨道（LUMO）的能量为-2.1749 ev，而两者的能量差为：3.1850 ev。探针在结合次氯酸根离子后的HOMO值为-5.9388 ev,以及LUMO值为-2.2847 ev ，其中两个轨道的能级差为：3.6541 ev；探针在结合氢氧根离子后的HOMO值为-1.4614 ev,以及LUMO值为-0.1213 ev ，其中两个轨道的能级差为：31.5827 ev，由此可见探针结合次氯酸根离子后能级差变大，而结合氢氧根离子后能级变小，这与其荧光光谱表现的蓝移和红移相互对应。
实施例6：小分子荧光探针的在癌细胞中成像效果
在癌细胞成像体系中，设立对照组（单独探针处理细胞）和实验组（探针处理后再加入不同浓度的次氯酸根离子或pH处理），最后通过荧光成像系统中的蓝、绿和红色通道进行拍照记录。实验结果见图8。
如图8所示，在无次氯酸根离子或高pH存在情况下，探针单独处理的癌细胞中只有绿和红色荧光出现，整体显示偏黄色。而随着次氯酸根离子的添加，探针在细胞中出现蓝色荧光，同时绿色荧光减弱，红色荧光消失，整体显示蓝色荧光。当改变探针溶液pH到8.4时，探针溶液蓝色和绿色荧光几乎消失，而只显示红色荧光，这些结果说明探针可以成像检测癌细胞体内外源性的次氯酸根离子或pH（OH-）变化。
实施例7：小分子荧光探针的在斑马鱼中成像效果
在斑马鱼成像体系中，设立对照组（单独探针处理斑马鱼）和实验组（探针处理后再加入不同浓度的次氯酸根离子或高pH处理），最后通过荧光成像系统中的蓝色、绿色及红色通道分别进行拍照记录，实验结果如图9所示。
图9中结果显示，在无次氯酸根离子或高pH存在情况下，探针单独处理的斑马鱼中只有绿色和红色荧光出现，整体表现为黄色荧光。随着次氯酸根离子的添加，斑马鱼中探针出现蓝色荧光，而且红色荧光消失，同时绿色荧光逐渐减弱，整体表现为蓝色荧光。当探针溶液pH调高到8.4时，探针溶液蓝色和绿色荧光几乎消失，而只显示红色荧光，这些结果同样说明探针可以检测斑马鱼中外源性的次氯酸根离子或pH（OH-）。
本发明所述的多功能小分子荧光探针可通过荧光光谱技术检测溶液中的次氯酸（次氯酸根）或pH（OH-）离子。
该小分子荧光探针在次氯酸或次氯酸根离子存在下，荧光发射峰（570 nm 蓝移到476 nm）均发生显著的蓝移；而在pH（OH-）离子存在下，荧光发射峰（570 nm 红移到606 nm）均发生显著的红移；从而可以根据荧光发射峰的比值（F476 /F570和F606/F570）变化来分别实现对次氯酸（次氯酸根）和pH（OH-）离子的定量检测。
本发明具有如下优点：通过本发明所述制备方法合成多功能小分子荧光探针，还可以实现荧光光谱法精确传感次氯酸（次氯酸根）或pH（OH-）离子，并且可以快速、准确的成像检测癌细胞和斑马鱼体内中的次氯酸（次氯酸根）或pH（OH-）离子。因此该探针在次氯酸（次氯酸根）或pH（OH-）离子检测方面具有良好的应用前景。同时，本发明的合成方法简单、操作方便，不需要苛刻的条件。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (8)
1.一种多功能小分子荧光探针，其特征在于：所述小分子荧光探针分子式为C25H23N3O3，其结构式为：
2.如权利要求1所述的多功能小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述小分子荧光探针为式Ⅰ所示化合物与（E）-6-（肼基亚甲基）萘-2-醇在溶剂中反应合成得到；
式Ⅰ。
3.根据权利要求2所述的多功能小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述溶剂为乙醇。
4.根据权利要求2所述的多功能小分子荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：所述的式Ⅰ所示化合物溶解于乙醇中，然后加入（E）-6-（肼基亚甲基）萘-2-醇，搅拌下反应，生成产物：生成产物后将反应体系过滤并用乙醇洗涤，干燥后得到所述的小分子荧光探针。
5.如权利要求1所述的多功能小分子荧光探针用于检测、识别环境中次氯酸或次氯酸根离子的应用，所述应用为非疾病治疗或诊断目的。
6.一种检测、识别环境中次氯酸或次氯酸根离子的方法，其特征在于包括以下步骤：
将如权利要求1所述的小分子荧光探针与待测试样混合；
在476和570 nm处测定混合溶液的荧光比值；
所述方法为非疾病治疗或诊断目的。
7.如权利要求1所述的多功能小分子荧光探针用于检测、识别环境中pH的应用，其特征在于：将如权利要求1所述的小分子荧光探针与待测试样混合后，在pH 6.8-8.2，在606 和570 nm处测定混合溶液的荧光比值与pH值为线性响应关系，所述应用为非疾病治疗或诊断目的。
8.一种检测、识别环境中pH的方法，其特征在于：包括以下步骤：
将如权利要求1所述的小分子荧光探针与待测试样混合；
在606 和 570 nm处测定混合溶液的荧光比值;
在pH 6.8-8.2，荧光比值与pH值为线性响应关系；
所述方法为非疾病治疗或诊断目的。
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