CN106518800A - 一种基于氢离子激活的双响应检测ClO‑/H2S荧光分子探针的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于氢离子激活的双响应检测ClO‑/ H2S荧光分子探针的制备方法及应用。通过将NBD‑Cl溶解于氯仿中，然后加入水合肼‑甲醇溶液，混合均匀，制得产物1，再溶于乙醇，加入苯甲醛、冰醋酸回流，冷却析出等步骤制得。适用于生物样本中ClO‑和H2S的定性、定量分析，检测灵敏、准确、快捷；其中生物样本主要包括胃液、胃粘膜、细胞等，可应用于分析化学、生命有机分析、疾病预诊及医学临床检测等相关领域。

Description

一种基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针的 制备方法及应用
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针的制备方法及应用。
背景技术
氧化还原平衡活性氧(ROS)和还原硫物种(RSS)在调节生物过程中扮演关键角色,如细胞增殖、分化和细胞凋亡。氧化还原平衡的破坏由于生产过剩的活性氧，压倒细胞的保护防御机制将导致的后果如过氧化反应，DNA损伤，甚至是更有害的结果，如果基因变异影响的正常修复蛋白质改变。作为一个著名的分子RSS、硫化氢(H2S)，已经被证明有抗凋亡和抗炎效果。由于硫化氢对胃黏膜有保护作用，因而，一直在利用新的溃疡性医学的设计，胃肠道炎症和恶性肿瘤疾病。不幸的是，越来越多的人类或者动物患有胃炎、胃粘膜的炎症，由于相对缺乏H2S在胃液和粘膜，在硫化氢被过量的活性氧，如次氯酸盐(ClO-)、过氧化氢(H2O2)，过氧亚硝基阴离子(ONOO-)等。在病理条件下，特别是过度ClO-由一些病理或通过食物摄取/水通过一个极快的反应会导致显著的低水平的H2S。因此，ClO-的失衡，H2S可能首先导致炎性疾病，然后在DNA损伤的炎症和最后的转换为胃炎症溃疡或癌症。更糟糕的是，在日常生活中，自来水消毒氯引起了ClO-的过度积累，已经导致胃部不适。因此，迫切需要研究氧化还原反应ClO - / H2S在体内或体外对生物体的各种响应。
显色和荧光活性氧探针享受优势包括高灵敏度和选择性, 分析可视化和方便被广泛设计等生化分析氧化分子ClO -、H2O2等。与此同时,许多复杂的RSS探针设计，与硫化氢、谷胱甘肽等,可以巧妙地检测各种样品像血液、组织、细胞和细胞器。此外,探讨氧化应激产生的ROS / RSS的不平衡,一些双响应探针在生物系统,适时地为氧化还原开发涉及超氧化物阴离子、氢聚硫化物、过氧硝酸盐、谷胱甘肽、过氧化氢、氢硫化物、次溴酸和硫化氢。然而,到目前为止,调查对氧化还原（ClO - / H2S)有响应的仍不发达。除了荧光Se–BODIPY以外，到目前为止还没有对（ClO - / H2S)同时检测的。此外，对于处在胃样品的酸性环境下的ClO - / H2S检测来说，需要的是一种能够在H +存在的条件对ClO-和H2S作出响应的探针。然而，据目前所知还没有探针能在酸性条件下对ClO - / H2S进行检测，这很显然限制了动物体内ClO -和H2S平衡的研究。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针（即探针BNBD）的制备方法. 制备得到的分子探针可应用于生物样本检测，具有响应性好、数据的准确性、重现性、精密度高等优点，
本发明还提供了其应用，即采用上述制备得到的分子探针检测胃液和胃粘膜中内源性ClO-和H2S的方法，本发明方法可实现对ClO-和H2S的同时检测，设备便捷易操作，可实施性强，特别适合大批量样本组合筛选等大数据研究。
本发明技术方案如下：
一种基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针的制备方法，步骤为：
（1）将NBD-Cl (7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1, 3-diazole) 溶解于氯仿中，溶解浓度0.002~0.012 g/mL，然后加入氯仿同体积的水合肼-甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌得棕色沉淀，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得产物1；
（2）将产物1溶于乙醇中，溶解浓度0.01-0.02g/mL，然后分别加入苯甲醛和冰醋酸，加入浓度分别为1mol/L和0.1mol/L，回流3h，冷却，析出红黑色固体，固体用体积比1:1的乙酸乙酯-石油醚洗脱液洗脱，收集第一个产物，烘干得红色固体，即为基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针。
步骤（1）中，所述的水合肼-甲醇溶液中，水合肼体积浓度为0.2～1.2%。
所述的基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针效果判断指标如下：
检测灵敏度: 检测限ClO-为2.7 nmol/L、H2S为 6.9 nmol/L；荧光猝灭倍数均为140倍；
检测速度：检测ClO-的速度为50秒; 检测H2S速度为10秒；
吸收波长改变：检测ClO-时吸收向蓝光移动200 nm；检测H2S时吸收向蓝光移动100nm；
双通道颜色变化：在日光灯下，接触H+时颜色由黄色变为红色，检测ClO-时颜色由红色变为无色，检测H2S时颜色由红色变为黄色；紫外灯下的颜色在接触H+时由无色变为黄色，检测ClO-和H2S时，颜色均变暗；
光学机理指标：在酸性环境下，探针荧光被触发，此时遇待测物后，PET恢复至荧光淬灭，从而实施定量，同时伴随不同程度的吸收蓝移来鉴别两个待测物ClO-和H2S。
上述方法制备的基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针的应用：适用于生物样本中ClO-和H2S的定性、定量分析，检测灵敏、准确、快捷；其中生物样本主要包括胃液、胃粘膜、细胞等，可应用于分析化学、生命有机分析、疾病预诊及医学临床检测等相关领域。
本发明基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针：定量分析生物样本中ClO-和H2S时，适用于同时检测胃液或胃粘膜中的ClO-和H2S的含量；定性分析生物样本中ClO-和H2S时，适用于胃液样品中ClO-和H2S的肉眼监测、胃粘膜组织内ClO-和H2S的监测和活细胞内ClO-和H2S的监测。
本发明基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针检测胃液和胃粘膜中内源性ClO-和H2S含量的方法，步骤包括：
1）配制溶液
配制探针BNBD储备液：准确称取基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针溶于无水乙腈，配制浓度为2×10-4M的探针BNBD储备液；
配制待测目标物ClO-储备液：准确称取待测目标物ClO-溶于水中，配制浓度为1×10-3M的ClO-储备液；
配制待测目标物H2S储备液：准确称取待测目标物H2S溶于水中，配制浓度为1×10-3 M的H2S储备液；
配制血清储备液：将空白样品和无水乙腈按体积比5:1混合，处理得血清储备液；
步骤1）中，所述的空白样品为人工胃液、离体胃液或离体胃粘膜；
所述的人工胃液的制备方法为：取稀盐酸16.4ml，加800ml水和10g胃蛋白酶，摇匀后，加水稀释至1000ml；其中，所述稀盐酸质量浓度为9.5～10.5%。
2）制备待测样品溶液
取100µL待测样品，加入30µL探针BNBD储备液、100µL浓度为0.2 mM、 pH 1.98的Britton-Robison缓冲液、100µL蒸馏水和670µL 乙腈混合均匀，得待测样品溶液；
步骤2）中，所述的待测样品为胃粘膜时，胃粘膜先由人工胃液冲洗，刮掉粘膜外的杂质，然后取1mm的薄层，用生理盐水浸泡清洗。
3）建立标准品的线性方程
ClO-标准品的线性方程：取步骤1）配制的待测目标物ClO-储备液稀，释得到梯度浓度为1～900μM的ClO-标准品溶液，然后分别取100µL稀释后的各浓度ClO-标准品溶液与30 µL探针BNBD储备液和770 µL血清储备液混合后，再分别加入100 µL 浓度为0.2 mM、 pH 1.98的Britton-Robison缓冲液，振摇混合均匀，于37℃下放置60min，然后经荧光分光光度计检测，建立血清/ClO-浓度与荧光信号强度的线性方程，即ClO-标准品的线性方程；
H2S标准品的线性方程：同上述 ClO-标准品的线性方程建立方法；
4）检测待测样品中ClO-和H2S含量
将1000µL步骤2）制备的待测样品溶液注入石英比色皿后，于荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入ClO-标准品的线性方程和H2S标准品的线性方程，计算得ClO-或H2S含量。
所述的待测样品溶液为胃粘膜待测样品溶液时，组织扫描聚显微镜使用激发波长为488 nm和记录波长在500～600nm。
上述基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针检测胃液中ClO-和H2S含量的应用，ClO-最优检测范围为荧光0～80μmol/L，H2S 最优检测范围为0～200μmol/L。本发明方法分别以荧光检测方法对待测物进行平行多次检测（n=7），并与标准品进行校准，得到荧光的最优检测范围，从而根据不同样品所含待测物的浓度范围来选择最优化的检测手段进行定量。
本发明基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针监测活细胞内ClO-和H2S的方法，步骤包括：
将空白活细胞样品置入培养基中培育24h，接种量为2×10 7～9×10 7个/mL，然后加入3 μM的基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针（探针BNBD），37 ℃共培育15min后，以PBS缓冲液洗涤三次，分别加入浓度梯度范围0 ~200 μM的ClO-和H2S，置入共聚焦下观测成像，然后待测活细胞样品观测成像，根据发光强度判断待测活细胞中含有ClO-和H2S的量。
所述的活细胞优选Hela细胞；所述的培养基为DMEM培养基；待测活细胞中基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针紫外灯下颜色为黄色。
本发明制备的BNBD的荧光分子探针检测机理：
为了解荧光开关机理，以量子计算的方法计算了NBD荧光基团及反应基团的激发态能级轨道（图1）。结果可见，电子供体的最高占据分子轨道HOMO（D1）明显升高，并足以引起向NBD荧光团进行的电子转移，使荧光猝灭。在H+存在条件下，BNBD形成稳定共轭结构phenyl-C = N+，造成较低的能量，从而抑制了电子从phenyl-C= N +向NBD荧光团的电子转移。经硫化氢还原后，探针BNBD的硝基转换（电子受体）为氨基（电子供体）后，迫使电子反向转移至phenyl-C = N+，导致荧光猝灭。另一方面，随着次氯酸根的添加，H-BNBD被其氧化，所得产物（图1）拥有比NBD荧光团更高的HOMO。因此，本发明新型H +驱动的荧光分子探针的设计是合理的。
本发明技术方案有益效果：
1）灵敏度高检测速度快：可同时检测ClO- 和H2S，最低检测限较同类探针低，ClO-的检测限为2.7nmoL/L，H2S的检测限为6.9nmoL/L；探针的响应速度快，分别达到50秒（ClO-）和10秒（H2S）；
2)多通道检测，准确度更高：本发明方法制备的探针同时兼具荧光开关功能和吸收波长位移功能，这是现有技术中以荧光探针检测待测物ClO-和H2S的方法所不具备的。本发明探针可以使荧光由关闭至打开再至关闭状态，由最终响应淬灭予以定量，同时亦可利用吸收波长位移予以定性，来判断其所致原因是ClO-还是H2S；
3)发光机理新颖独特，更适于光学检测：本发明探针的发光机理为首先由酸性环境下的氢离子对探针本身所具备的PET机理加以抑制，然后在待测物的作用下PET过程恢复。并且PET光致电子转移机理与吸收蓝移的组合，原理非常新颖，其中PET过程使原本处于荧光状态的探针在遇到两种待测物后荧光大幅减弱，可带来高灵敏响应；并且，探针所兼具的吸收蓝移是以紫外可见500 nm 的波数为起点向蓝光区转移，从而使产物的颜色显著改变，因而比其他单一机理的探针更适于光信号传感分析检测，且过程中荧光无发射位移，因而不会干扰比色分析；
4)多种生物样品成像：成功实施了待测物在活细胞、胃液、胃粘膜组织中的成像，这同样也是前人方法中所未能实现的。组织成像及定量的实现对于ClO-和H2S这一生物标志物的深入研究起到很大的推动作用；
5)肉眼监测，方便快捷：本发明探针和检测方法填补了ClO-和H2S检测方法的空白，使待测物的肉眼监测（无需仪器，直接观测）成为可能，检测过程比普通探针更加快捷。
附图说明
图 1为本发明制备的基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针检测及发光原理；
图2为基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针与ClO-反应后产物的质谱图；
图3为基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针的氢谱图；
图4为基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针的碳谱图；
图5为人工胃液、离体胃液、离体胃粘膜中待测样品ClO-和H2S含量的线性图；
图6为离体胃粘膜中荧光强度跟踪图；
图7为离体胃粘膜不同层切面同一时间的荧光图；
图8为加入不同ClO-浓度的细胞图；
图9为加入不同浓度的H2S的细胞图；
图10为细胞存活率的柱状图；
图11为基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针用量优化实验（待测物(A)ClO- / (B)H2S ：100 µM；温度：25 ℃，缓冲溶液：Britton-Robison缓冲液，pH 1.98)；
图12为基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针对PH的响应（探针浓度为3μM，缓冲溶液：Britton-Robison缓冲液，温度为25℃）；
图13为基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针的荧光动力学研究 (红色/黑色趋势线分别为探针分子在有/无待测物100 µM (A)ClO- / (B)H2S存在条件下的荧光信号响应；温度：25℃, 缓冲溶液：Britton-Robison缓冲液，pH 1.98)；
图14为温度对基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针 (3 μM) 与（A)ClO- /(B) H2S (100 μM)反应的荧光信号影响(缓冲溶液：Britton-Robison缓冲液，pH1.98，时间：1 min)；
图15为基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针对不同浓度的待测目标物（A)ClO- /(B) H2S的荧光响应图（浓度：0～200 µM）；
图16为基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针的选择性研究分析及比色(缓冲溶液：Britton-Robison缓冲液，pH 1.98，时间：1 min)。
具体实施方式
通过结合具体实施例描述本发明，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均包括在本发明的范围内。
将本发明实施例中高效液相-质谱分析是利用Agilent 1290连接Agilent 6460三重四极杆质谱系统 (Agilent, USA)，并配备Agilent Jet Stream电喷雾系统. 高效率液相色谱分离是借助SB C18 柱 (2.1 mm × 50 mm, 1.8 μm i.d., Agilent, USA)来完成。荧光检测是利用日立Hitachi F-7000 荧光光谱仪来进行，激发波长为495 nm，发射波长为560 nm, 激发和发射狭缝宽度均为 10.0 nm, 电压400V，扫描速度2400纳米/分。紫外可见光谱是通过Cary 300 Bio紫外可见光谱仪来进行，扫描范围为350-700纳米。荧光成像观测是通过Olympus Fluo View FV1000（日本）共聚焦来进行，物镜是用的40倍的物镜来观察。化合物的分离纯化是采用薄层色谱硅胶柱来实现(填料 300-400 目)。
实施例1：制备探针BNBD
一种基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针的制备方法，步骤为：
（1）将0.3g NBD-Cl溶解至50mL氯仿中，然后加入50mL体积浓度0.6%的水合肼-甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌30min，得棕色沉淀，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得0.29g棕色产物，得到产物1（HNBD），收率为97%；
（2）取产物1溶于20ml乙醇中，溶解浓度0.0195g/mL，加入苯甲醛，浓度为1mol/L，加入冰醋酸浓度为0.1mol/L，回流3h，冷却，析出红黑色固体，固体用体积比1:1的乙酸乙酯-石油醚洗脱液洗脱，收集第一个产物，烘干得红色固体，即为基于氢离子激活的双响应检测ClO-/H2S荧光分子探针。
上述基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针结构用核磁进行表征，见图3、图4。
上述基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针效果判断：
检测灵敏度: 检测限ClO-为2.7 nmol/L、H2S为 6.9 nmol/L；荧光猝灭倍数均为140倍；
检测速度快：检测ClO-的速度为50S; 检测H2S速度为10S；
吸收波长改变：检测ClO-时吸收向蓝光移动200nm；检测H2S时吸收向蓝光移动100nm；
双通道颜色变化：在日光灯下，接触H+时颜色有黄色变为红色，检测ClO-时颜色由红色变为无色，检测H2S时颜色由红色变为黄色；紫外灯下的颜色在接触H+时由无色变为黄色，检测ClO-和H2S时，颜色均变暗；
光学机理指标：在酸性环境下，探针荧光被触发。此时遇待测物后，PET恢复至荧光淬灭，从而实施定量。同时伴随不同程度的吸收蓝移来鉴别两个待测物ClO-和H2S。
实施例2：检测离体胃液中ClO-和H2S的含量（采用实施例1制备的基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针）
分别培养三组兔子，1组兔子用氯水喂养；2组兔子用半胱氨酸喂养；3组兔子为正常兔子。喂养半个月后分别取三组兔子的胃液进行测量检测。
配制溶液
配制探针BNBD储备液：准确称取基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针溶于无水乙腈，配制浓度为2×10-4M的探针BNBD储备液；
配制待测目标物ClO-储备液：准确称取待测目标物ClO-溶于水中，配制浓度为1×10-3M的ClO-储备液；
配制待测目标物H2S储备液：准确称取待测目标物H2S溶于水中，配制浓度为1×10-3 M的H2S储备液；
配制血清储备液：将空白离体胃液样品和无水乙腈按体积比5:1混合，处理得血清储备液；
2）制备待测样品溶液
取100µL待测离体胃液样品，加入30µL探针BNBD储备液、100µL浓度为0.2 mM、 pH 1.98的Britton-Robison缓冲液、100µL蒸馏水和670µL乙腈混合均匀，得待测样品溶液；
3）建立标准品的线性方程（见图5）
ClO-标准品的线性方程：取步骤1）配制的待测目标物ClO-储备液稀，释得到梯度浓度为1～200μM的ClO-标准品溶液，然后分别取100µL稀释后的各浓度ClO-标准品溶液与30 µL探针BNBD储备液和770 µL血清储备液混合后，再分别加入100 µL 浓度为0.2 mM、 pH 1.98的Britton-Robison缓冲液，振摇混合均匀，于37℃下放置60min，然后经荧光分光光度计检测，建立血清/ClO-浓度与荧光信号强度的线性方程，即ClO-标准品的线性方程；
H2S标准品的线性方程：同上述 ClO-标准品的线性方程建立方法；
4）荧光法检测待测胃液样品中ClO-和H2S含量
将1000µL步骤2）制备的待测样品溶液(三组）注入石英比色皿后，于荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入ClO-标准品的线性方程和H2S标准品的线性方程，计算得三组样品中分别含有：1组、硫化氢38.60 μM，2组、次氯酸67.7 μM，3组、硫化氢为85.42 μM。
实施例3：检测离体胃粘膜中样品ClO-和H2S的含量（采用实施例1制备的基于氢离子激活的双响应检测样品ClO-/H2S荧光分子探针）
离体胃粘膜：取自实施例2中的三组兔子，胃粘膜先由人工胃液冲洗，刮掉粘膜外的杂质，然后取薄层约1mm，用生理盐水浸泡清洗，置于载玻片上用于在显微镜下成像。
制备人工胃液：取质量浓度为9.5～10.5%的稀盐酸16.4ml，加800ml水和10g胃蛋白酶，摇匀后，加水稀释至1000ml。
1）配制溶液：方法同实施例2，将空白离体胃粘膜样品和无水乙腈按体积比5:1混合，处理得血清储备液；
2）制备待测样品溶液
取100µL待测离体胃粘膜样品（三组），加入30µL探针BNBD储备液、100µL浓度为0.2 mM、pH 1.98的Britton-Robison缓冲液、100µL蒸馏水和670µL 乙腈混合均匀，15min后，得待测样品溶液；
3）建立标准品的线性方程：方法同实施例2；
4）检测待测样品中ClO-和H2S含量
将1000µL步骤2）制备的待测样品溶液注入石英比色皿后，于荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入ClO-标准品的线性方程和H2S标准品的线性方程，计算得ClO-或H2S含量。
本实施例组织扫描聚显微镜使用激发波长为488 nm和记录波长在500-600nm，计算得三组样品中分别含有：1组、硫化氢35.47±2.64μM，2组、次氯酸57.91±3.03μM，3组、硫化氢为81.42±2.57。
探针加入胃粘膜后，对胃粘膜的荧光强度进行时间追踪得到下图（图6），由此可以看出本实验的探针的光稳定性在胃粘膜里面的表现还是比较良好的。同时对探针的穿透性进行研究，对同一时间同一浓度下的胃粘膜进行不同的层切面的荧光强度对比如图（图7），可以看的出本探针的膜穿透性能比较好。
实施例4：活细胞内ClO-和H2S的监测（以Hela细胞为例）
将置入培养基中培育24h，接种量为2×107～9×107个/mL，然后加入3 μM的基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针（探针BNBD），37℃共培育15min后，以PBS缓冲液洗涤三次，分别加入0～200 μM的ClO-和H2S，置入共聚焦下观测成像，然后待测活细胞样品观测成像，根据发光强度判断待测活细胞中含有ClO-和H2S的量。
将空白Hela活细胞样品置入DMEM培养基中培育，分别培养5组，空白Hela活细胞在培养基中接种量为2×10 7～9×10 7个/mL，培育24h，然后加入3 μM的基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针（探针BNBD）于37 ℃共培育15min，以PBS缓冲液洗涤三次，分别加入浓度梯度范围0～200 μM的ClO-和H2S置入共聚焦下观测成像，然后将待测活细胞样品观测成像，根据发光强度判断待测活细胞中含有ClO-和H2S的量。待测活细胞中BNBD颜色为：黄色（紫外灯下）。（见图8、图9）
实施例4中Hela细胞存活率的实验细胞毒性实验主要为了检验本专利所设计的有机小分子探针对细胞寿命的影响。分别培养两组Hela细胞，培养24h后，分别计算一下两组中的细胞个数，然后在其中一组中加入3 μM的有机探针，另外一组继续正常培养，同时培养6h。然后再计算一下各自的细胞个数。最终得到如图（图10）。
探针用量优化
探针用量关系到检测的灵敏度及试剂消耗等重要指标，往往做为检测优化的首要因素来进行调查研究。根据本探针的发光特点，其灵敏度应属较高，因此在实际检测时所需探针浓度应较低。如给定浓度偏高则由可能出现自淬灭使信息强度降低。因此，本发明选择了0-10μM 的浓度范围来进行优化。结果表明，在待测物浓度为100 μM时，浓度为3 μM的探针具有最强响应。该浓度将带入到后续优化实验过程（图 11）。
探针对PH的优化
探针对探针有一定的影响作用，首先要研究一下本探针在什么条件下比较稳定，适合研究。首先探针BNBD浓度控制为3μM，在酸性条件下进行一系列检测，由图12可以看出本探针在强酸性条件下，即ph＜1.98时趋于稳定，因此本实验选择的一系列实验均需在强酸性条件下进行。
反应时间优化
反应时间将影响探针分子BNBD与待测物ClO- / H2S的反应效率与反应程度，同时也将决定最终信号的强度与稳定性。因此，在确定探针浓度后，本发明对反应的时间进行优化。从图13中可以看出，ClO-在反应前40 S内，荧光信号呈下降趋势后至平台期，从而可确定反应时间为40 S ; 相比之下，H2S在反应前10 S内，荧光信号呈下降趋势后至平台期，从而可确定反应时间为10 S 。和不含待测物的探针溶液则未出现荧光强度的变化，这说明信号响应为待测物所致。
反应温度的优化
温度对化学反应的影响至关重要，对于本发明所研究的生物样本如活细胞、组织体系更是如此。通常动物体的温度一般为37 ℃左右，在此温度下探针能否对待测目标物有良好的响应将关系到整个实验的成败。如图14所示，本发明对温度在20~45 ℃范围的反应所带来的荧光响应进行了调查。从中不难发现，本探针所受温度的影响很小，因而特别适合于生物样本的应用与研究。
光学性质与机理验证
本发明旨在发明一种具备新颖发光机理的多功能分子探针。探针分子BNBD的发射光谱强度非常强（如图15所示），表明该分子内出现了可以让荧光有效淬灭的电子行为，而且其猝灭倍数能高达140倍，有着非常好的响应效果。
探针分子检测次氯酸和硫化氢的选择性分析
如图16 A为探针对ClO-选择性的比较，图B为针对H2S的选择性比较。两组图的左面第一个小瓶的颜色均为与后面的不同，A组中第一个为无色，后面的为橙色；B组中第一个为弱粉色，后面的为橙色。由图中可以看出，探针众多物质当中，很明显只对ClO- / H2S具有很强的响应。Cu2+, Fe3+, Zn2+, Co2+, Ca2+, F-, SO4 2-, HCO3-, NO2 -, NO3 -, SO3 2-, Cl-, PO4 3-,I-, Mg2+, O2 -•, H2O2, OH•, ONOO-, HSO3 -, SO3 2-, S2O3 -, S2O4 2-, S2O5 2-, SCN-, NO, Cl-,Br-, I-, N3 -, SO4 2-, HPO4 2-, OAc-, 柠檬酸盐, 硫辛酸, 金属硫因, 谷胱甘肽, 半胱氨酸, S亚硝基谷胱甘肽.
首先，相对于待测物ClO-、H2S，其他的所有物质的响应均表现的不是很明显，而且其他各种待测物的浓度均为ClO-、H2S的几倍甚至几十倍。因此，优秀的选择性使得BNBD完全适合在生物样本中的应用。同时，通过pH滴定实验发现，在pH值为酸性条件下反应最明显，荧光的强度也大幅度提高，但在强酸性条件下其稳定性也得到证实，这表明该探针在生物体酸性环境是完全适用的。此外，温度实验也证实了本探针稳定性很好，对生物体酸性环境检测完全适应。

Claims (10)

1.一种基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤为：
（1）将NBD-Cl溶解于氯仿中，溶解浓度0.002～0.012 g/mL， 然后加入氯仿同体积的水合肼-甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌得棕色沉淀，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得产物1；
（2）将产物1溶于乙醇中，溶解浓度0.01～0.02g/mL，然后分别加入苯甲醛和冰醋酸，加入浓度分别为1mol/L和0.1mol/L，回流3h，冷却，析出红黑色固体，固体用体积比1:1的乙酸乙酯-石油醚洗脱液洗脱，收集第一个产物，烘干得红色固体，即为基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的水合肼-甲醇溶液中，水合肼体积浓度为0.2～1.2%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针效果判断指标如下：
检测灵敏度: 检测限ClO-为2.7 nmol/L、H2S为 6.9 nmol/L；荧光猝灭倍数均为140倍；
检测速度：检测ClO-的速度为50秒; 检测H2S速度为10秒；
吸收波长改变：检测ClO-时吸收向蓝光移动200nm；检测H2S时吸收向蓝光移动100nm；
双通道颜色变化：在日光灯下，接触H+时颜色由黄色变为红色，检测ClO-时颜色由红色变为无色，检测H2S时颜色由红色变为黄色；紫外灯下的颜色在接触H+时由无色变为黄色，检测ClO-和H2S时，颜色均变暗；
光学机理指标：在酸性环境下，探针荧光被触发，此时遇待测物后，PET恢复至荧光淬灭，从而实施定量，同时伴随不同程度的吸收蓝移来鉴别两个待测物ClO-和H2S。
4.权利要求1所述方法制备的基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针的应用，其特征在于：适用于生物样本中ClO-和H2S的定性、定量分析；其中生物样本包括胃液、胃粘膜、细胞。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：定量分析生物样本中ClO-和H2S时，适用于同时检测胃液或胃粘膜中的ClO-和H2S的含量；定性分析生物样本中ClO-和H2S时，适用于胃液样品中ClO-和H2S的肉眼监测、胃粘膜组织内ClO-和H2S的监测和活细胞内ClO-和H2S的监测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针检测胃液或胃粘膜中内源性ClO-和H2S含量的方法，步骤包括：
1）配制溶液
配制探针BNBD储备液：准确称取基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针溶于无水乙腈，配制浓度为2×10-4M的探针BNBD储备液；
配制待测目标物ClO-储备液：准确称取待测目标物ClO-溶于水中，配制浓度为1×10-3M的ClO-储备液；
配制待测目标物H2S储备液：准确称取待测目标物H2S溶于水中，配制浓度为1×10-3 M的H2S储备液；
配制血清储备液：将空白样品和无水乙腈按体积比5:1混合，处理得血清储备液；
2）制备待测样品溶液
取100µL待测样品，加入30µL探针BNBD储备液、100µL浓度为0.2 mM、 pH 1.98的Britton-Robison缓冲液、100µL蒸馏水和670µL乙腈混合均匀，得待测样品溶液；
3）建立标准品的线性方程
ClO-标准品的线性方程：取步骤1）配制的待测目标物ClO-储备液稀，稀释得到梯度浓度为1～900μM的ClO-标准品溶液，然后分别取100µL稀释后的各浓度ClO-标准品溶液与30 µL探针BNBD储备液和770 µL血清储备液混合后，再分别加入100 µL 浓度为0.2 mM、 pH 1.98的Britton-Robison缓冲液，振摇混合均匀，于37 ℃下放置60min，然后经荧光分光光度计检测，建立血清/ClO-浓度与荧光信号强度的线性方程，即ClO-标准品的线性方程；
H2S标准品的线性方程：同上述 ClO-标准品的线性方程建立方法；
4）检测待测样品中ClO-和H2S含量
将1000µL步骤2）制备的待测样品溶液注入石英比色皿后，于荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入ClO-标准品的线性方程和H2S标准品的线性方程，计算得ClO-或H2S含量。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
步骤1）中，所述的空白样品为人工胃液、离体胃液或离体胃粘膜；所述的人工胃液的制备方法为：取稀盐酸16.4ml，加800ml水和10g胃蛋白酶，摇匀后，加水稀释至1000ml；其中，所述稀盐酸质量浓度为9.5～10.5%。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
步骤2）中，所述的待测样品为胃粘膜时，胃粘膜先由人工胃液冲洗，刮掉粘膜外的杂质，然后取1mm的薄层，用生理盐水浸泡清洗；
所述的待测样品溶液为胃粘膜待测样品溶液时，组织扫描聚显微镜使用激发波长为488 nm和记录波长在500～600nm。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针监测活细胞内ClO-和H2S的方法，步骤包括：
将空白活细胞样品置入培养基中培育24h，接种量为2×10 7～9×10 7个/mL，然后加入3 μM的基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针，37 ℃共培育15min后，以PBS缓冲液洗涤三次，分别加入浓度梯度范围0～200 μM的ClO-和H2S，置入共聚焦下观测成像，然后待测活细胞样品观测成像，根据发光强度判断待测活细胞中含有ClO-和H2S的量。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的活细胞为Hela细胞；所述的培养基为DMEM培养基；待测活细胞中基于氢离子激活的双响应检测ClO-/ H2S荧光分子探针紫外灯下颜色为黄色。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107382900A (zh) * 2017-06-30 2017-11-24 曲阜师范大学 一种pH荧光探针的制备方法及其应用
CN109734709A (zh) * 2019-02-12 2019-05-10 温州医科大学 一种小分子荧光探针及其制备方法与应用
CN111892552A (zh) * 2020-07-20 2020-11-06 山西大学 一种三苯胺衍生物及其制备方法和在对硫化氢的双通道荧光检测中的应用
CN112480098A (zh) * 2020-12-02 2021-03-12 湖北大学 一种亚甲基紫衍生物荧光探针及其合成方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101429074B1 (ko) * 2013-04-16 2014-08-14 중앙대학교 산학협력단 신규 셀레노니트로벤조옥사디아졸 유도체 화합물, 이의 제조방법, 이를 이용한 황화수소 검출 방법, 및 이를 포함하는 황화수소 검출용 조성물
CN104530102A (zh) * 2014-12-08 2015-04-22 辽宁科技大学 一种检测生物体内硫离子的荧光铜配合物及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101429074B1 (ko) * 2013-04-16 2014-08-14 중앙대학교 산학협력단 신규 셀레노니트로벤조옥사디아졸 유도체 화합물, 이의 제조방법, 이를 이용한 황화수소 검출 방법, 및 이를 포함하는 황화수소 검출용 조성물
CN104530102A (zh) * 2014-12-08 2015-04-22 辽宁科技大学 一种检测生物体内硫离子的荧光铜配合物及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JESSIE A. KEY等: "Detection of Cellular Sialic Acid Content Using Nitrobenzoxadiazole Carbonyl-Reactive Chromophores", 《BIOCONJUGATE CHEMISTRY》 *
LIN YUAN等: "Development of an ICT-based ratiometric fluorescent hypochlorite probe suitable for living cell imaging", 《CHEMCOMM》 *
PUHUI XIE等: "A novel fluorescent turn-on probe for bisulfite based on NBD chromophore", 《J. CHEM. SCI.》 *
WEN-LI WU等: "A fast-response colorimetric and fluorescent probe for hypochlorite and its real applications in biological imaging", 《SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL》 *
常雁红: "《有机化学》", 30 September 2016 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107382900A (zh) * 2017-06-30 2017-11-24 曲阜师范大学 一种pH荧光探针的制备方法及其应用
CN107382900B (zh) * 2017-06-30 2020-05-19 曲阜师范大学 一种pH荧光探针的制备方法及其应用
CN109734709A (zh) * 2019-02-12 2019-05-10 温州医科大学 一种小分子荧光探针及其制备方法与应用
CN111892552A (zh) * 2020-07-20 2020-11-06 山西大学 一种三苯胺衍生物及其制备方法和在对硫化氢的双通道荧光检测中的应用
CN112480098A (zh) * 2020-12-02 2021-03-12 湖北大学 一种亚甲基紫衍生物荧光探针及其合成方法和应用

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