CN109438426A - 一种基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种反应型的Hg2+荧光探针Cy‑PT及其制备方法和应用。本发明将作为识别单元的硫代氯甲酸苯酯通过酯键与稳定的半花菁骨架偶联，生成荧光探针Cy‑PT。当生成的硫代酸酯在Hg2+的催化下会发生水解作用，酯键断裂，羟基被裸露出来，由于分子内部ICT机制，探针荧光获得增强。该探针能够在生理pH环境中特异性识别Hg2+，伴随着溶液由靛蓝色转变为湖蓝色，可用于Hg2+的比色检测。另外，本发明的细胞毒性试验证明了该探针具备生物低毒性，且细胞成像实验表明该探针在活的复杂生物体系中能够检测到汞离子，这些都说明了它在活体检测方面具有发展潜力。

Description

一种基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一种用于检测金属离子的荧光探针，更具体地说，本发明涉及一种基于半花菁，识别检测Hg2+的反应型荧光探针Cy-PT及其制备方法和应用。
背景技术
众所周知，相对于其他众多金属离子，因为汞的耐久性、易转移性和高生物累积性，所以汞是毒性最强的金属之一。由于诸如燃煤电厂和金矿等人类活动，汞和汞物种不断被排放到环境中，这对人类健康和生存环境造成了不可忽略的威胁。因而，关于汞的选择性和灵敏性检测方式的发展仍然是迫切需要的。传统上，原子吸收光谱，电感耦合等离子体质谱和毛细管电泳已被用于分析检测环境样品中的汞离子含量。然而，以上这些测试手段不仅要求成本较高的测试仪器，还要求繁琐的样品准备工作。与传统测试手段不同，作为最有前途的测试方法之一，荧光探针由于具有高特异性、高灵敏度监测功能和响应时间迅速等优势，因此已成为化学传感、环境科学、生物成像和医学诊断等众多应用中的强大工具。因此，开发能够高选择性和灵敏地检测生物系统中的汞离子的荧光化学探针是非常重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT及其制备方法和应用。
为了实现本发明的上述第一个目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT，所述荧光探针Cy-PT化学结构式如下式一所示：
本发明的第二个目的在于提供上述所述的基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT的制备方法，所述方法包括如下步骤：
a)将间苯二酚和碳酸钾(K2CO3)依次溶解于无水乙腈中；
b)在氮气条件下将步骤a)所得溶液搅拌活化，形成混合活化液；
c)向步骤b)所得混合活化液中加入IR-780的乙腈溶液，然后在50℃条件下反应3～5h，反应结束后旋蒸，柱色谱纯化得到中间体Cy-OH；
d)将步骤c)所得中间体Cy-OH溶解在无水二氯甲烷(CH2Cl2)中，冰水浴条件下滴加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，滴加完毕后，继续在冰水浴条件下搅拌活化10～20min；
e)向步骤d)所得混合液中滴加硫代氯甲酸苯酯，35℃条件下反应4～6h，得粗产物，然后利用色谱柱纯化粗产物，再旋蒸、真空干燥，得到本发明所述的目标产物，即反应型Hg2+荧光探针Cy-PT。
进一步地，上述技术方案，步骤a)所述间苯二酚和碳酸钾的物质的量之比为1：1。
进一步地，上述技术方案，步骤b)所述搅拌活化工艺具体为：温度30～40℃，时间20～50min。
进一步地，上述技术方案，步骤c)所述加入的IR-780与间苯二酚的物质的量之比为1：2。
进一步地，上述技术方案，步骤d)所述中间体Cy-OH与无水二氯甲烷的用量比为0.5mmol：25ml。
进一步地，上述技术方案，步骤d)所述中间体Cy-OH与N，N-二异丙基乙胺的用量比为0.5mmol：200μl。
进一步地，上述技术方案，步骤e)所述硫代氯甲酸苯酯与中间体Cy-OH的物质的量之比为2：1。
进一步地，上述技术方案，步骤c)和步骤e)所述柱色谱纯化淋洗剂均采用二氯甲烷和甲醇，其中：步骤c)中二氯甲烷与甲醇的体积比为40：1，步骤e)中二氯甲烷与甲醇的体积比为50：1。
本发明上述所述荧光探针Cy-PT的合成路线如下式二所示：
本发明的第三个目的，在于提供上述所述的荧光探针Cy-PT的应用。
本发明上述所述的基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT在识别检测环境中Hg2 +的应用。
本发明上述所述的基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT在选择性检测活细胞中Hg2+的应用。
本发明的机理如下：
本发明以半花菁染料(发射波长为708nm)为荧光团，通过原料IR780合成中间体Cy-OH，然后将Cy-OH中的羟基与硫代氯甲酸苯酯发生酰化反应，由于羟基变成酯导致给电子能力降低，探针自身荧光很弱。当变成的硫代酸酯在二价汞离子的作用下发生水解作用，酯键断裂，羟基被裸露出来，由于分子内部的ICT机制，探针荧光获得增强。另一方面，伴随着汞离子的加入，探针溶液由靛蓝色变成湖蓝色，因此可用于Hg2+的比色检测。
与现有技术相比，本发明涉及的一种基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT及其制备方法和应用具有如下有益效果：
本发明的荧光探针Cy-PT在生理pH范围内能特异识别Hg2+，在与其它阳离子共存体系中具有高的选择性和灵敏度，响应时间较短。另外，细胞毒性试验表明本发明的探针Cy-PT具有低的生物毒性，细胞成像实验表明该探针在活的复杂生物体系中检测Hg2+方面具有很好的发展潜力。
附图说明
图1中(a)为实施例2中探针Cy-PT(10μM)与Hg2+(100μM)作用前后的紫外吸收光谱对比图；(b)为探针Cy-PT(10μM)与Hg2+(100μM)作用前后的荧光光谱对比图；
图2中(a)为实施例3中探针Cy-PT(10μM)与10当量各种常见金属离子作用后的荧光变化对比图；(b)探针Cy-PT(10μM)与各种金属离子作用后的溶液显色对比图，1-14代表滴加不同金属离子，其中7代表加入Hg2+，15为空白样；
图3为实施例4中探针Cy-PT的竞争性实验对比图；
图4中(a)为实施例5中，不同pH下，探针Cy-PT与Hg2+作用前后的荧光强度变化对比图；(b)探针Cy-PT与Hg2+作用后的荧光强度随时间变化图；(c)探针Cy-PT在与Hg2+作用前后的荧光强度随温度变化对比图；
图5中(a)为实施例6中，探针Cy-PT的荧光强度与Hg2+的浓度关联图(其中，(a)中插图为探针Cy-PT的荧光强度随CHg 2+浓度变化图)；(b)荧光强度与CHg 2+的线性关系图；
图6为实施例7中Cy-PT荧光探针在不同浓度条件下对A549细胞的存活率对比图；
图7为实施例8中Cy-PT在A549细胞中的成像图，其中：(A-C)为A549细胞和Cy-PT孵化30分钟的成像图；(D-F)为A549细胞、Cy-PT继续和汞离子孵化30分钟的成像图；(G-I)为A549细胞、Cy-PT继续和汞离子孵化60分钟的成像图：(左)明场，(中)暗场(590-650nm)，(右)叠加图；(J)平均荧光强度柱状图。
具体实施方式
下面对本发明的实施案例作详细说明。本实施案例在本发明技术方案的前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
实施例1
本实施例的一种基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT，所述荧光探针Cy-PT的化学结构式如发明内容中的式一所示。
上述所述的基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT采用如下方法制备而成，包括如下步骤：
(1)中间体Cy-OH的制备：将间苯二酚(332mg，3.0mmol)和K2CO3(413mg，3.0mmol)溶解于20mL无水的乙腈，氮气条件下，35℃条件下反应30分钟，然后向混合液中加入含有IR-780(1g，1.5mmol)的乙腈溶液。50℃条件下反应4h，TCL检测进度。反应结束后，真空蒸发溶剂，粗产物通过柱色谱纯化(VDCM/VMeOH＝40:1)，获得墨绿色粉末状产物0.41g Cy-OH，收率为65％。
(2)荧光探针Cy-PT的制备：将步骤(1)制得的化合物Cy-OH(0.142g，0.5mmol)溶于25ml无水的CH2Cl2中，0℃条件下滴加200μl N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，滴加完毕后继续在0℃条件下搅拌10min，然后加入硫代氯甲酸苯酯(0.1726g，1mmol)，35℃反应6h。原料反应完全后旋蒸溶剂，粗产物通过柱色谱纯化(VDCM/VMeOH＝50:1)，获得0.131g蓝色粉末状化合物Cy-PT，产率为48％。
分别将步骤(1)、步骤(2)制得的中间化合物Cy-OH、终产物荧光探针Cy-PT进行核磁测试，测试结果如下：
中间化合物Cy-OH的核磁测试数据：1H NMR(600MHz,chloroform-d):δ8.07(d,J＝14.1Hz,1H),7.30-7.21(m,3H),7.17(d,J＝9.2Hz,1H),7.02(t,J＝7.6Hz,1H),6.83(d,J＝7.5Hz,1H),6.71(d,J＝8.9Hz,1H),6.53(s,1H),5.63(d,J＝14.2Hz,1H),3.74(t,J＝7.2Hz,2H),2.64(t,J＝6.0Hz,2H),2.63(t,J＝6.0Hz,2H),1.91-1.75(m,4H),1.62(s,6H),1.03(t,J＝7.6Hz,3H)。
终产物荧光探针Cy-PT的核磁测试数据：1H NMR(600MHz,chloroform-d)δ8.15(d,J＝13.6Hz,1H),7.74(s,1H),7.63(d,J＝7.3Hz,1H),7.51-7.42(m,2H),7.33(d,J＝7.9Hz,1H),7.22(t,J＝7.4Hz,1H),6.65(dd,J＝9.0,2.1Hz,1H),6.43-6.39(m,1H),6.03(d,J＝13.5Hz,1H),4.10(t,J＝7.4Hz,2H),2.77(dt,J＝11.5,6.5Hz,4H),1.96-1.76(m,8H),1.12(t,J＝7.3Hz,3H).
另外，本发明还对苯实施例制得的荧光探针Cy-PT进行了质谱分析测试，测试结果如下：ESI-MS:for C35H34NO3S:expected m/z＝548.2254[M]+；found m/z＝548.2276[M]+。
综上所述，由上述核磁、质谱测试结果，可以确定，本实施例制得的目标化合物Cy-PT具有式一所示结构。
下述实施例2～7均是对实施例1制得的探针Cy-PT进行的。
实施例2Hg2+对探针Cy-PT紫外吸收光谱和荧光光谱的影响
(1)Hg2+对探针Cy-PT紫外吸收光谱的影响：探针Cy-PT的吸收和荧光光谱在DMSO/HEPES(2:8,v/v,pH7.4)溶液中测量，Cy-PT的最终浓度为10-5M，Hg2+浓度为100μM。如图1中(a)所示，化合物Cy-PT中存在汞离子时，587nm处的最强吸收峰迅速减弱，在660nm和693nm处显现出两个之前不存在的吸收峰，而且601nm处显现出一个等消光点，说明探针Cy-PT与Hg2+发生了作用。将加入Hg2+后的吸收光谱与Cy-OH的吸收光谱对比，发现两者的吸收光谱非常类似，这证实了Cy-PT探针识别汞离子的反应机理。
(2)Hg2+对探针Cy-PT荧光光谱的影响：探针Cy-PT的吸收和荧光光谱在DMSO/HEPES(2:8,v/v,pH7.4)溶液中测量，Cy-PT的最终浓度为10-5M，加入Hg2+(浓度为100μM)后，Cy-PT的荧光信号也表现出明显的变化。如图1中(b)所示，荧光强度在10分钟内增强到最大值，伴随着颜色由靛蓝色变成湖蓝色。由此产生的荧光光谱与Cy-OH也非常接近，同时溶液颜色也接近。由于探针Cy-PT中的羟基被硫代苯甲酸酯部分保护，减少了OH基团的给电子能力从而抑制了ICT过程，所以探针Cy-PT本身荧光很弱。但是，一旦从探针Cy-PT中除去硫代苯甲酸酯部分，ICT过程恢复，探针Cy-PT荧光得到增强。
实施例3：探针Cy-PT的选择性实验
探针的选择性实验：为了探究探针Cy-PT是否对Hg2+具有专一识别性，我们对不同常见金属阳离子(Fe3+，Mn2+，Cu2+，Zn2+，Pb2+，Co2+，Hg2+，Ni2+，Cr3+和Mg2+，K+，Al3+，Na+，Fe2+)进行了选择性实验。如图2中(a)所示，探针溶液分别与10当量其他常见金属离子溶液混合时，仅仅Hg2+致使荧光显著增强，其他金属离子对荧光光谱几乎无任何改变。并且通过裸眼观察到只有加入10当量的Hg2+时，探针溶液颜色才有了明显变化，如图2中(b)所示，证明探针Cy-PT对Hg2+具有特异性识别作用。
实施例4：探针Cy-PT的竞争性实验
探针的竞争性实验：除此之外，我们也进行了干扰实验研究。将10当量的Hg2+和其他金属离子一同加入探针Cy-PT测试液中，结果如图3所示，其他金属离子几乎不会影响探针Cy-PT对Hg2+的识别，进一步表明了探针Cy-PT对汞离子拥有特异性识别作用。
实施例5：pH、响应时间和温度对探针Cy-PT的影响
为了确定探针Cy-PT与Hg2+作用的最佳pH条件，我们研究了pH值对探针Cy-PT识别Hg2+的影响。由图4中(a)可以观察到，当pH<6时，Hg2+加入前后，探针Cy-PT荧光强度都很弱。当pH>6时，滴加Hg2+可以清楚地看到荧光不断增强，当pH>8时，探针Cy-PT与Hg2+反应后的荧光强度趋于稳定。另外，探针Cy-PT本身的荧光强度在碱性环境下不断增强，这是因为识别部位在碱性条件下会发生水解，导致荧光增强。这些实验现象表明探针Cy-PT可以在生理环境下检测Hg2+。
响应时间对探针Cy-PT的影响：如图4中(b)所示，探针Cy-PT和Hg2+在5分钟内迅速响应，5分钟之后荧光强度变化不是很明显，逐渐趋于饱和。因此，我们确定探针Cy-PT和Hg2+的响应时间为5分钟。温度对探针Cy-PT的影响：由图4中(c)所示，对探针Cy-PT与Hg2+在不同温度下的荧光强度进行了测试。在温度为25℃～45℃范围内，探针Cy-PT与Hg2+反应过程几乎不受温度变化影响，由此证明，探针Cy-PT适合活体生物的研究。
实施例6：探针Cy-PT对Hg2+荧光滴定
为了研究探针Cy-PT与汞离子浓度的关联，我们进行了荧光滴定实验。由图5中(a)所示，逐渐增大汞离子浓度时，探针的荧光强度伴随着相应升高，说明探针Cy-PT与Hg2+络合导致ICT机制恢复，进而荧光增强。当CHg2+滴加到2当量时，荧光强度改变程度降低，这意味着络合作用达到饱和。由于荧光强度与CHg 2+之间存在良好的关系，如图5中(b)所示，我们作了线性方程拟合，根据方程计算出检测限为0.18μM(基于DL＝3σ/S)。
实施例7：探针Cy-PT的细胞毒性实验
为了证实探针Cy-PT可用于活细胞检测，我们首先对探针Cy-PT的生物相容性进行了研究。探针Cy-PT的细胞毒性实验按照MTT实验进行检测。将A549细胞在96孔板中培养，每个孔中注入100μL培养液，维持在37℃、5％CO2实验条件下培育24h；弃去原培养液，无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗多次，依次注入不一样浓度(1μM，5μM，10μM，15μM，20μM)的Cy-PT溶液，各浓度组均设五个复孔，然后继续在37℃，5％CO2实验条件下培育24h；弃去原培养液，PBS冲洗多次，每孔注入0.1mLMTT溶液，再孵育4h；除去细胞培养液，注入100μL DMSO溶液，使甲瓒晶体溶解于有机溶剂，检测其在特定波长处的吸光度。结果如图6所示，探针Cy-PT浓度在2～10μM浓度范围内均不会对细胞造成明显毒性，实验结果证明探针Cy-PT几乎没有什么细胞毒性，适合活细胞检测。
实施例8：探针Cy-PT在活细胞中的成像
进一步研究了Cy-PT在活体细胞中对汞离子的成像实验。A549细胞在DEME细胞培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)中用10％FCS(胎牛血清)和双抗青霉素-链霉素溶液(青霉素0.5U·mL-1，链霉素0.5g·mL-1)，在37℃和5％CO2条件下培养。首先细胞置于6孔板中培养24小时，然后加入Cy-PT(10μM)探针37℃培育30分钟。用磷酸盐缓冲液洗涤3次除去多余的探针，再加入Hg2+(100μM)继续孵化30分钟和60分钟。冲洗三遍后进行荧光成像实验(Olympus IX71,Japan)。如图7，当Cy-PT探针和细胞培育后，并没有发现任何荧光。而当继续加入汞离子培育后，发现细胞出现明显的荧光。随着孵化时间的延长，荧光增强，当和汞离子孵化1小时后，细胞荧光呈现明显的增强。这些实验说明探针Cy-PT能够在复杂的活细胞内对汞离子实现选择性检测。

Claims (10)

1.一种基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT，其特征在于：所述荧光探针Cy-PT化学结构式如下式一所示：
2.权利要求1所述的基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
a)将间苯二酚和碳酸钾依次溶解于无水乙腈中；
b)在氮气条件下将步骤a)所得溶液搅拌活化，形成混合活化液；
c)向步骤b)所得混合活化液中加入IR-780的乙腈溶液，然后在50℃条件下反应3～5h，反应结束后旋蒸，柱色谱纯化得到中间体Cy-OH；
d)将步骤c)所得中间体Cy-OH溶解在无水二氯甲烷中，冰水浴条件下滴加N,N-二异丙基乙胺，滴加完毕后，继续在冰水浴条件下搅拌活化10～20min；
e)向步骤d)所得混合液中滴加硫代氯甲酸苯酯，35℃条件下反应4～6h，得粗产物，然后利用色谱柱纯化粗产物，再旋蒸、真空干燥，得到本发明所述的目标产物，即反应型Hg2+荧光探针Cy-PT。
3.根据权利要求2所述的荧光探针Cy-PT的制备方法，其特征在于：步骤a)所述间苯二酚和碳酸钾的物质的量之比为1：1。
4.根据权利要求2所述的荧光探针Cy-PT的制备方法，其特征在于：步骤b)所述搅拌活化工艺具体为：温度30～40℃，时间20～50min。
5.根据权利要求2所述的荧光探针Cy-PT的制备方法，其特征在于：步骤c)所述加入的IR-780与间苯二酚的物质的量之比为1：2。
6.根据权利要求2所述的荧光探针Cy-PT的制备方法，其特征在于：步骤d)所述中间体Cy-OH与无水二氯甲烷的用量比为0.5mmol：25ml。
7.根据权利要求2所述的荧光探针Cy-PT的制备方法，其特征在于：步骤d)所述中间体Cy-OH与N，N-二异丙基乙胺的用量比为0.5mmol：200μl。
8.根据权利要求2所述的荧光探针Cy-PT的制备方法，其特征在于：步骤e)所述硫代氯甲酸苯酯与中间体Cy-OH的物质的量之比为2：1。
9.权利要求1所述基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT在识别检测环境中Hg2+的应用。
10.权利要求1所述基于半花菁的反应型Hg2+荧光探针Cy-PT在选择性检测活细胞中Hg2+的应用。
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