CN115745899A - 一种汞(ⅱ)荧光探针、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种汞(Ⅱ)荧光探针、制备方法及其应用,该探针的分子式为:C34H23N3O2S;该探针对汞(Ⅱ)表现出很强的敏感性,具有较低的检测限,具有良好的时间稳定性;对汞(Ⅱ)有很好的响应;对汞(Ⅱ)具有高选择性,探针在复杂的环境下能够实现对汞(Ⅱ)的检测;本发明探针在细胞成像实验中,细胞毒性低,能准确定位细胞,可对HeLa细胞,斑马鱼和烟草幼苗中汞(Ⅱ)有良好的成像效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种汞(Ⅱ)荧光探针的制备方法和应用,属于有机小分子荧光探针领域。
背景技术
汞(Hg)是一种公认的毒性最强的重金属之一,它不仅危害生态环境,而且也威胁人类的身心健康。多年以来,汞排放的重要原因主要来自人为来源,尤其是矿石开采、化石燃烧、垃圾焚烧。汞(Ⅱ)污染往往具有极长的滞留时间,主要存在水和土壤中,通过食用进入人类生活区,最终在人类的体内富集,且很难排除体外,对人类的身体健康产生巨大威胁。例如通过饮用受污染的水源,吸入受污染的空气、食用含有汞的农副产品和鱼类海鲜,吸入或渗入人体的汞(Ⅱ)会与酶和蛋白质中的巯基结合,导致细胞损害,对人类的人脑、神经系统、肾功能产生很大威胁,尤其会对婴幼儿的神经功能产生严重的损害。因此,开发一种新型检测汞(Ⅱ)的荧光探针是非常必要的。
汞(Ⅱ)检测的传统技术有很多,例如原子吸收光谱法、X射线吸收光谱学、电感耦合等离子体发射光谱等,但是这些方法仪器昂贵、操作专业、制样过程复杂,此外无法实现实时原位监测。相比之下荧光探针因其在低成本、高灵敏度、样品用量少、高选择性等优势,被认为是一种强大的分析工具。在过去的几十年里,已经报道了很多对汞具有良好测定效果的荧光探针。但是基于三嗪染料为电子受体的荧光探针未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明提供一种汞(Ⅱ)荧光探针、制备方法及其应用,采用三嗪染料作为荧光团,该探针对汞(Ⅱ)表现出很强的敏感性,具有较低的检测限,具有良好的细胞相容性,对汞(Ⅱ)有很好的响应;在细胞成像实验中,细胞毒性低,能准确定位细胞,可对HeLa细胞,斑马鱼以及烟草茎中汞(Ⅱ)有良好的成像效果。
为解决上述技术问题,本发明采取以下技术方案:
一种汞(Ⅱ)荧光探针,该探针的分子式为:C34H23N3O2S。
该探针的化学式结构如下:
所述汞(Ⅱ)荧光探针的制备方法,按照以下步骤进行:将化合物TzAr-Nap-OH和硫代氯甲酸苯酯溶解在二氯甲烷中,缓慢滴加三乙胺,并在室温下搅拌23-25小时,得到汞(Ⅱ)荧光探针。
所述化合物TzAr-Nap-OH的化学结构式为:
所述TzAr-Nap-OH和硫代氯甲酸苯酯的摩尔比为1:1.1-1.3;所述TzAr-Nap-OH和二氯甲烷的质量体积比为31-33 mg:1mL;所述TzAr-Nap-OH和三乙胺的摩尔比为1:1.8-2.2。
所述的汞(Ⅱ)荧光探针的应用,该荧光探针应用于生物细胞体系中汞(Ⅱ)的传感检测。
所述的传感检测包含荧光检测和细胞成像检测。
探针TzAr-Nap-Hg的合成路线如下:
本发明采用上述技术方案,具有以下有益效果:
(1)探针的合成步骤简单,原料来源广泛;
(2)该探针对汞(Ⅱ)表现出很强的敏感性,具有较低的检测限,最低检测限为0.731μΜ;具有良好的时间稳定性;对汞(Ⅱ)有很好的响应;对汞(Ⅱ)具有高选择性,探针在复杂的环境下能够实现对汞(Ⅱ)的检测;1mol的探针最高可以检测10mol的Hg2+。
(3)本发明探针在细胞成像实验中,细胞毒性低,能准确定位细胞,可对HeLa细胞,斑马鱼和烟草幼苗中汞(Ⅱ)有良好的成像效果。
附图说明
图1 探针TzAr-Nap-Hg的1H NMR图谱;
图2 探针TzAr-Nap-Hg的13C NMR图谱;
图3 探针TzAr-Nap-Hg滴加Hg2+前后的紫外吸收图谱;
图4 探针TzAr-Nap-Hg滴定Hg2+后的荧光发射图谱;
图5 探针TzAr-Nap-Hg滴定Hg2+后的线性关系图;
图6 探针TzAr-Nap-Hg在不同pH下的荧光发射光谱图;
图7为探针TzAr-Nap-Hg加入汞后随时间变化的荧光发射光谱图;
图8 为探针TzAr-Nap-Hg加入汞后的时间和荧光强度的相关性图谱;
图9 探针TzAr-Nap-Hg离子选择性的荧光发射图谱;
1–Fe3+;2–Na+;3–HCO3 -;4–H2O2; 5–Ca2+; 6–Mg2+; 7–Cu2+;8–Al3+;9–Fe2+;10–Cys ;11–Arg;12–HClO;13–NO2-;14–O2-;15–Hg2+;
图10 探针TzAr-Nap-Hg对HeLa细胞活力的影响;
图11 探针TzAr-Nap-Hg的细胞成像图;
图12 探针TzAr-Nap-Hg的斑马鱼成像图;
图13 探针TzAr-Nap-Hg的烟草茎成像图;
其中a)为探针TzAr-Nap-Hg对具有不同浓度Hg(II)的烟草幼苗的茎段进行荧光成像图;
b)为图13a中绿色通道的荧光强度的柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明,TzAr-Nap-Hg代表汞(Ⅱ)荧光探针。
实施例中采用的HEPES缓冲溶液,浓度为10 mM, pH为7.4。
实施例1 探针TzAr-Nap-Hg的合成路线如下:
将化合物TzAr-Nap-OH(80.0 mg, 0.2 mmol)和硫代氯甲酸苯酯(41.6 mg, 0.24mmol)溶解在二氯甲烷(2.5 mL)中,逐滴加入三乙胺(40.0 mg, 0.4 mmol),并在室温下搅拌24小时。反应结束后,粗品经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯,v/v=10/1)纯化,得到白色固体TzAr-Nap-Hg(72.6 mg, 67.7%)1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.74 (d, J = 7.0 Hz,4H), 8.57 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 8.02 – 7.87 (m, 3H), 7.69 (s,1H), 7.59 (dd, J = 16.3, 8.8 Hz, 6H), 7.50 (dd, J = 15.1, 6.8 Hz, 3H), 7.42(d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.28 (s, 1H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ194.71, 171.44, 171.26, 153.56, 151.90, 141.92, 135.77, 134.47, 133.47,132.72, 131.92, 130.34, 129.76, 129.73, 129.06, 128.71, 128.66, 126.93,126.72, 124.96, 121.93, 121.81, 119.16. HRMS (ESI): calcd for C34H23N3O2S [M+H]+ 538.1584, found 538.1581.
探针的1H NMR图谱见图1,13C NMR图谱见图2。
探针TzAr-Nap-Hg的分子式为:C34H23N3O2S。
实施例2
取荧光探针TzAr-Nap-Hg溶于二甲基亚砜(DMSO)中,制成1mM的储备液。从荧光探针储备液中取出20 μL,滴加到含有25%的DMF的HEPES缓冲液(10 mM, pH=7.4)中,最终体积为2 mL,测量了探针的紫外吸收光谱;加入Hg2+(10 eq.)后再次测量了探针的紫外吸收光谱,如图3所示。TzAr-Nap-Hg的最大吸收峰从350 nm处红移至375 nm处,初步表明该探针在Hg2+的作用下生成了TzAr-Nap-OH,可以对Hg2+进行检测。
实施例3
从荧光探针储备液中取出20μL,滴加到1980μL含有25%(体积比)的DMF的HEPES缓冲溶液(10 mM, pH=7.4)中,然后滴加硝酸汞溶液(Hg2+相对于探针的摩尔当量为1.0-10.0eq.),测量探针的荧光发射光谱(λex = 375 nm)。如图4所示,随着Hg2+的加入荧光在470 nm处的荧光强度逐渐增强,当硝酸汞溶液的量加入到Hg2+相对于探针的摩尔当量为10.0 eq时,荧光强度趋于稳定(1mol的探针最高可以检测10mol的Hg2+)。如图5所示,探针TzAr-Nap-Hg最低检测限为0.731μΜ。
实施例4
从荧光探针储备液中取出20 μL,滴加到H2O/DMF=3/1(体积比为3:1)体系中,最终体积为2 mL;同样的方法共配制8份混合液,然后分别调pH为
3.1;4.1;5.1;6.1;7.4;8.1;9.1;10.1;测量了不同pH对探针的影响。
然后测量了在滴加硝酸汞溶液后(滴加硝酸汞溶液后所得的混合液中,汞离子和探针的摩尔比为10:1)不同pH的影响,如图6所示。
图6是检测的是荧光发射光谱,激发波长λex=375nm
纵坐标是最大发射波长470 nm处对应的荧光强度。
实施例5
从荧光探针储备液中取出20 μL,滴加到1980μL含有25%(体积比)的DMF的HEPES缓冲溶液(10 mM, pH=7.4)中,再加入硝酸汞溶液(Hg2+相对于探针的摩尔当量为10 eq.),测量其随着时间变化的荧光谱图(激发波长375nm);
如图7、8所示。当加入汞(Ⅱ)后,TzAr-Nap-Hg在最大发射峰处的荧光强度会随着时间逐渐增强,在最初阶段荧光强度迅速增加,往后荧光强度增加缓慢,最终在80min左右荧光强度会达到最大值(最大值286),最终趋向于稳定。这一现象表明TzAr-Nap-Hg具有良好的稳定性。
实施例6
从荧光探针储备液中取出20 μL,滴加到1.960mL含有25%(体积比)的DMF的HEPES缓冲溶液(10 mM, pH=7.4),再滴加20μL 的100 μM(终浓度)的各种离子溶液,最终体积为2.0 mL,测量了各种离子对TzAr-Nap-Hg荧光强度的影响,如图9所示。研究发现当加汞(Ⅱ)后,荧光强度强度会明显增强。但是加入其他离子后,荧光几乎不变。这一现象说明TzAr-Nap-Hg对汞(Ⅱ)具有高选择性,同时说明探针在复杂的环境下能够实现对汞(Ⅱ)的检测。
实施例7
对TzAr-Nap-Hg做了细胞毒性实验,采用标准的MTT比色法检测探针TzAr-Nap-Hg在体外对HeLa细胞的细胞毒性。首先,将2×105个细胞/mL的细胞接种在96孔板中,然后用不同浓度的TzAr-Nap-Hg (0、2、5、10、15、20和25 μM,终浓度)处理24小时。随后,向每个孔中加入10 μL MTT (5 mg/mL,终浓度)并再孵育3小时。最后,除去培养基,加入100μL DMSO以溶解甲瓒晶体。将平板轻微摇动约10分钟,用酶标仪测量570 nm处的吸光度。如图10所示。TzAr-Nap-Hg在HeLa细胞中的MTT分析显示存活率超过80%,表明该探针可作为复杂生物环境中Hg(Ⅱ)标记的实用工具。
图10中,HeLa细胞在 0、2、5、10、15、20、25 μM(终浓度)TzAr-Nap-Hg 中,细胞存活率分别为100%,98%,97%,95%,93%,92%,90%。
实施例8
TzAr-Nap-Hg对汞(Ⅱ)响应的细胞成像,如图11所示。具体操作如下将HeLa细胞(共孵育液中细胞密度为1×104个细胞/mL)与Hg2+ (100 μM,终浓度)孵育0.5 h,然后用无菌PBS缓冲液洗去HeLa细胞表面的汞离子残留物。然后将HeLa细胞(共孵育液中,细胞浓度为1×104个细胞/mL)与TzAr-Nap-Hg (10μM,终浓度)一起孵育1.5小时。最后,用无菌PBS缓冲液洗涤HeLa细胞三次,并用共聚焦显微镜成像。空白组只用探针处理HeLa细胞,HeLa细胞不用汞离子处理。(a,d)明场;(b,e)绿色通道,λex = 405 nm,λem = 450-500nm;(c,f)合并明场和绿色通道。
我们选取两组细胞进行对比实验,当与探针共同孵育海拉细胞加入汞离子后,荧光强度会有明显的增强。而只与探针共同孵育HeLa细胞在共聚焦显微镜下只有微弱的荧光。这一现象说明探针能够在复杂的生理环境下,对HeLa细胞内的汞(Ⅱ)进行成像,表明探针能够检测海拉细胞内的汞(Ⅱ)。
实施例9
TzAr-Nap-Hg对汞(Ⅱ)响应的斑马鱼成像,将活斑马鱼与Hg2+ (200 μM)孵育1小时,然后用蒸馏水洗掉斑马鱼表面的汞离子残留物。然后将活斑马鱼与探针TzAr-Nap-Hg溶液一起孵育1.5小时。最后,用蒸馏水洗涤斑马鱼表面上残留的荧光探针三次,并通过共聚焦显微镜成像。对照组没有用汞离子处理斑马鱼。如图12所示,(a,d)明场;(b,e)绿色通道,λex = 405 nm,λem = 450-500 nm;(c,f)合并明场和绿色通道。
如图12所示,加入汞离子的斑马鱼荧光明显增强,主要集中在斑马鱼的眼睛以及腹部,而未加入汞(Ⅱ)的斑马鱼几乎没有荧光。表明探针可以检测脊椎动物体内汞(Ⅱ)。
实施例10
首先将五叶大小的烟草幼苗在营养液中培养3天,然后在含有不同浓度Hg2+ (0、1、5、10、20、40 μM)的营养液中培养3天,并用蒸馏水洗涤整个根3次。最后,用含有TzAr-Nap-Hg (10μM)蒸馏水培养24小时。将烟草幼茎切片,然后用共聚焦显微镜成像。如图13所示,在没有Hg(II)的烟草幼苗的茎段中,在绿色通道中有微弱的荧光,荧光强度随着Hg(II)浓度的增加而逐渐增强。表明探针能够检测烟草幼苗体内的汞(Ⅱ)。(a)通过探针TzAr-Nap-Hg对具有不同浓度Hg(II)的烟草幼苗的茎段进行荧光成像;(b)图13a中绿色通道的荧光强度。λex = 405 nm,λem = 450-500 nm。
本发明汞(Ⅱ)荧光探针可以应用于复杂生物体细胞中汞(Ⅱ)的检测;可以对活体斑马鱼及烟草幼苗进行成像。
Claims (7)
1.一种汞(Ⅱ)荧光探针,其特征在于:该探针的分子式为:C34H23N3O2S。
3.权利要求1所述汞(Ⅱ)荧光探针的制备方法,其特征在于:按照以下步骤进行:将化合物TzAr-Nap-OH和硫代氯甲酸苯酯溶解在二氯甲烷中,缓慢滴加三乙胺,并在室温下搅拌23-25小时,得到汞(Ⅱ)荧光探针。
5.根据权利要求3所述汞(Ⅱ)荧光探针的制备方法,其特征在于:所述TzAr-Nap-OH和硫代氯甲酸苯酯的摩尔比为1:1.1-1.3;所述TzAr-Nap-OH和二氯甲烷的质量体积比为31-33 mg:1mL;所述TzAr-Nap-OH和三乙胺的摩尔比为1:1.8-2.2。
6.权利要求1所述的汞(Ⅱ)荧光探针的应用,其特征在于:该荧光探针应用于生物细胞体系中汞(Ⅱ)的传感检测。
7.根据权利要求6所述的汞(Ⅱ)荧光探针的应用,其特征在于:所述的传感检测包含荧光检测和细胞成像检测。
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