CN111548280B - 一种快速识别汞和甲基汞的荧光探针及其制备方法、应用 - Google Patents

一种快速识别汞和甲基汞的荧光探针及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学领域，涉及一种快速识别汞和甲基汞的荧光探针及其制备方法、应用。所述荧光探针的结构式如下：
Figure 100004_DEST_PATH_IMAGE001
。本发明制备的荧光探针在不加任何其他附加材料的条件下，提高了检测灵敏性，并且避免了填加附加材料,减少附加材料的消耗以及减少了在检测中的误差来源；在检测中成功检测了待测物在活细胞、斑马鱼体内的成像，适用于细胞和斑马鱼等活体内的实时监测区分，这种方法是在之前的方法中没有能够做到的。成像的实现对于区分汞和甲基汞的深入研究起到很大的推动作用。

Description

一种快速识别汞和甲基汞的荧光探针及其制备方法、应用
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种快速识别汞和甲基汞的荧光探针及其制备方法、应用。
背景技术
目前对Hg(II)和MeHg的研究多是间接的在体外缺氧环境进行的报道。监测Hg(II)和MeHg的方法多是间接的在体外对两者进行分离或者衍生，预处理和常规色谱分析分离非常耗时，这使得两种离子的体内和实时检测成为不可能。荧光成像为研究离子在其自然环境中的生理和病理提供了强有力的方法支撑，对生物系统的干扰极小。因此，使用具有生物相容性的双响应型荧光探针进行荧光成像是检测和区分Hg(II)或MeHg的理想途径。然而，目前所报道的探针显示Hg(II)或MeHg的发射始终在同一波长，难以同时在体内检测两个离子的选择性信号。因此，设计合成一种同时对Hg(II)和MeHg的发射进行区分的水溶性和生物相容性的荧光探针，对于这两种离子在体内的可视化监测是至关重要的。这也是在生物环境中监测两种离子的动态转化的先决条件。研发一个新型具有高选择性和高灵敏度的能成熟地选择性检测识别汞和甲基汞的荧光探针成为了亟待解决的问题。
发明内容
本发明针对现有技术以及生物领域的缺憾，提供了一种快速识别汞和甲基汞的荧光探针，该荧光探针可应用于生物样本检测，由于探针具有良好且快速的响应特性，因此可应用于活体中进行实时观察跟踪。具精密度高、现象明显易观察、准确度高等优点，设备便捷易操作，可操作性强，特别适合大批量样本组合筛选等大数据研究。
本发明还提供了一种快速识别汞和甲基汞的荧光探针的制备方法。
本发明还提供了上述荧光探针在生物样本中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种快速识别汞和甲基汞的荧光探针，所述荧光探针的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明还提供了一种上述荧光探针的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将2-溴-4′-羟基苯乙酮、4-二甲基氨基苯甲醛、碳酸钠溶于乙醇中，然后加入水，60℃搅拌6h，待反应物冷却后，加入盐酸调节pH至中性，过滤出固体，乙醇洗涤后除去溶液中的不溶性物质，然后将溶液旋转蒸发以去除溶剂，得橙红色固体BHDP；
（2）BHDP、4-甲酰基苯硼酸、碳酸钾、乙酸钯(II)、三苯基膦溶于1，4-二氧基和水的混合溶剂中，然后，在氮气保护下，80°C回流6h，溶剂在减压下被除去，然后，以石油醚和乙酸乙酯的混合物为洗脱液，在300-400目的硅胶上进行柱层析纯化粗品，得红色固体DPAHB。
进一步地，步骤（1）中，所述2-溴-4′-羟基苯乙酮、4-二甲基氨基苯甲醛和碳酸钠的摩尔比为1：1：2；所述2-溴-4′-羟基苯乙酮在乙醇中的浓度为0.25mol/L；所述乙醇和水的体积比为4：1。
进一步地，步骤（2）中，所述BHDP、4-甲酰基苯硼酸、碳酸钾、乙酸钯(II)和 三苯基膦的摩尔比为1：1：14：0.05：0.05；所述BHDP在混合溶剂中的浓度为0.04mol/L；所述1，4-二氧基和水的体积比为4：1。
上述洗脱液中，石油醚和乙酸乙酯的体积比为20：1。
本发明制备得到的比率探针DPAHB效果判断指标如下：
检测灵敏度: 汞检测限9.8nM；甲基汞检测限0.35 nM；
光学机理指标：兼具荧光功能及吸收红移蓝移功能。
本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的荧光探针在定性、定量检测生物样本中汞和甲基汞中的应用，该荧光探针适用于检测生物活体中，如细胞和斑马鱼体内中汞和甲基汞的定性区分；适用于生物样本中汞和甲基汞的实时监测区分；适用于生物活体中进行实时观察跟踪。
进一步的，所述荧光探针检测区分汞和甲基汞具体步骤包括：
配制溶液
探针储备液配制： 准确称取荧光探针溶于无水乙腈，配制浓度为60uM的探针储备液；
Hg(II)和MeHg的荧光反应体系为1ml，体系包含：探针DPAHB 10μM，pH=7.4的PBS缓冲液 20mM，反应时间均在1min之内完成；
Hg(II)和MeHg的紫外反应体系为2ml，体系包含：探针DPAHB 50μM，pH=7.4的PBS缓冲液 20mM，反应时间均在1min之内完成。
本发明提供的DPAHB的合成路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
本发明制备的探针是基于查尔酮母体环进行的延伸。本文合成了一种双响应荧光探针(E)-4’-(3-(4-(二甲基氨基苯基)丙烯酰)-3’-羟基-[1，1'-联苯]-3-卡乙醛(DPAHB)，用于同时区分检测Hg(II)和MeHg。该探针对两种离子都有很强的选择性，在不同的发射信号下，不会产生干扰。DPAHB探针具有良好的水溶性和生物相容性，并成功应用于细胞和斑马鱼中进行两个离子的可视化监测。
本发明制备的荧光探针应用于生物样本中汞和甲基汞区分的定性、定量分析，检测灵敏、准确、快捷；其中生物样本主要包括活细胞、斑马鱼等，可应用于分析化学、生命有机分析化学。
本发明制备的荧光探针探针检测机理：
荧光探针的设计方案，原理为：用密度泛函理论(DFT)和时间相关密度泛函理论(TDDFT)计算方法解释了DPAHB的光学性质以及加入Hg(II)和MeHg后的变化。DPAHB大约242nm的斯托克斯位移计算的吸收(π-π*电子从HOMO过渡到LUMO，图1A a-b)。这是基于DPAHB中酚羟基引发的高效激发态质子转移(ESPT)过程。这与实验中的Stokes位移220 nm(发射从460 nm吸收到680 nm)基本一致。此外，通过改变激发态，从440 nm (DPAHB的最大吸收)到480 nm，在680 nm处的发射减少，在595 nm处发射略有增加(图4)。根据计算，这可以通过在O2上的质子化来消除ESPT而产生576 nm的吸收(根据595 nm的实验数据)。在DPAHB中加入Hg(II)后，能量最有利的结合位点为N1(图1 A-a)，可以保证分子平行堆积的多个结合位点。
计算Hg(II)和H2O在N1(简化模型)上同时配位时的吸收蓝移。这是由于HOMO的稳定(通过Hg(II)与DPAHB在N1处的连接)导致HOMO-LUMO的能隙增大(图1A-a)。此外，Hg(II)的水解可以通过DPAHB的脱质子来消除ESPT过程。这导致斯托克位移(91 nm)小于DPAHB，这与实验结果(430 ~ 350 nm)一致。而对MeHg最有利的结合位点是O2。这可能降低相邻酚羟基的pKa值，通过去质子作用抑制ESPT。随后，我们计算了MeHg-(O2) DPAHB复合物的斯托克位移，其值为108nm，与实验数据一致(595~490 nm)。此外，本实验已经观察到，MeHg-(O2)DPAHB复合物的HOMO - LUMO能隙小会导致红移吸收。因此，Hg(II)和MeHg的选择性光学变化是由不同的ESPT抑制和不同结合位点的HOMO-LUMO能隙变化引起的。如图1B所示，Hg(II)与DPAHB在N1处结合，在430 nm处呈蓝色发射。而MeHg在O2时与DPAHB结合，在595 nm时产生黄色信号。
本发明技术方案有益效果为：
1）提高检测的灵敏性：
在不加任何其他附加材料的条件下，提高了检测灵敏性，并且避免了填加附加材料,减少附加材料的消耗以及减少了在检测中的误差来源。
2）生物样品成像多种多样化：
本发明在检测中成功检测了待测物在活细胞、斑马鱼体内的成像，适用于细胞和斑马鱼等活体内的实时监测区分，这种方法是在之前的方法中没有能够做到的。成像的实现对于区分汞和甲基汞的深入研究起到很大的推动作用。
附图说明
图1为Hg(II)-H2O-(N1)DPAHB (a)，DPAHB (b) and MeHg-(O2)DPAHB (c)的分子轨道（A）和传感策略（B）；
图2为实施例1制备的化合物BHDP的H谱(A)、C谱(B)图；
图3为实施例1制备的化合物DPAHB的H谱(A)、C谱(B)图；
图4为探针DPAHB与Hg(II)和MeHg响应的荧光光谱图。A) Hg(II).a)在不同Hg(II)浓度下的荧光光谱图。插图是荧光信号强度I430/I680对浓度的线性关系。b)对Hg(II)的选择性检测(Ex=410nm)；B) MeHg.a)在不同MeHg浓度下的荧光光谱图。插图是荧光信号强度I595对浓度的线性关系。b)对MeHg的选择性检测(Ex=480nm)；
图5为加入Hg(II)和MeHg的HeLa细胞的荧光共聚焦图像；其中，通道1：荧光收集波长640−740nm(激发波长：408nm)；通道2：荧光收集波长410−470nm(激发波长：408nm)；通道3：荧光收集波长550−630nm(激发波长：488nm)；通道4：明场；通道5：重叠。
图6为加入Hg(II)和MeHg的斑马鱼的荧光共聚焦图像。其中，通道1：荧光收集波长640−740nm(激发波长：408nm)；通道2：荧光收集波长410−470nm(激发波长：408nm)；通道3：荧光收集波长550−630nm(激发波长：488nm)；通道4：明场；通道5：重叠。
图7为给药后通过探针DPAHB共聚焦成像对解毒试剂的筛选。(A)空白；(B)0.5 h 5μM Hg(II)；(C)二巯基丙醇；(D)乙酰消旋青霉胺；(E)二巯基丙磺酸钠；(F)二巯基丁二酸钠。通道1：640−740nm(激发波长：408海里)；通道2：明场；通道3：伪彩图；通道4：流式细胞，其区域Q1、Q2、Q3、Q4分别为坏死、晚期凋亡、存活、早期凋亡细胞。
图8为解毒实验中6组细胞的比较。(A)空白；(B)0.5 h 5μM Hg(II)；(C)二巯基丙醇；(D)乙酰消旋青霉胺；(E)二巯基丙磺酸钠；(F)二巯基丁二酸钠。
图9为 Hg(II)和MeHg检测工作温度(A)和pH值(B)的条件优化图。
图10为DPAHB对Hg(II)和MeHg的实时荧光检测。
图11为探针DPAHB对Hela细胞体内细胞毒性检测实验。DPAHB浓度的1–5：0、5、10、20和30µM。
具体实施方式
通过结合更加具体实施例子描述本发明的小分子双响应探针，在围绕本发明所描述述技术思想情况下，根据一般的技术知识和通常用的技术手段研究的多种方式替换或变更，都属于本发明的范围内。
将本发明实施例中的荧光检测是利用FLS980荧光光谱仪来进行，激发波长为410nm/480nm，发射波长为430 nm和595nm, 激发和发射狭缝宽度均为 10.0 nm，扫描速度2400纳米/分。紫外可见光谱是通过UV2600紫外可见光谱仪来进行，扫描范围为350-700纳米。荧光成像观测是通过尼康A1R荧光共聚焦显微镜来进行。化合物的分离提纯是采用薄层色谱硅胶柱来实现。
细胞毒性实验：为了评估探针DPAHB在细胞中的毒性，我们进行了甲基噻唑啉四唑(MTT)测定。健康的海拉细胞在10%胎牛血清，于37°C、5%二氧化碳培养箱中孵化。然后，将不同浓度的探针DPAHB (0μM 5μM 10μM 20μM 30μM)加入细胞中继续孵育4 h。接下来，将25μLMTT(5mg/mL)添加到每个培养皿中继续培养4 h。使用MTT细胞毒性测试进行化验。所有的实验都在8个重复中进行。细胞存活率以平均值±标准差(SD)表示。
细胞实验：Hella细胞取自中国科学院类型培养收集委员会(Shanghai， China)，分别在添加了10%胎牛血清(FBS， Invitrogen)的DMEM培养基中，37℃，在含5% CO2气体的湿化培养箱中孵育。成像前，将细胞置于培养皿中，静置24小时，然后用DMEM培养基清洗细胞。然后用不同浓度的Hg(II)和MeHg或添加VB12的DMEM培养基对细胞进行培养。荧光成像采用物镜(×40)共聚焦激光扫描显微镜。
斑马鱼实验：斑马鱼由南京艾泽林卡生物公司提供。所有的动物实验都是在完全符合国际道德准则的情况下进行的。斑马鱼成像采用7天大的幼鱼。将斑马鱼分别在E3培养基中孵育(15mm NaCl， 0.5 mM KCl， 1mM MgSO4， 1mM CaCl2， 0.15 mM KH2PO4， 0.05 mMNa2HPO4和0.7 mM NaHCO3；pH 7.5)，孵育温度为28℃。随后，使用带有物镜(×10)的共聚焦激光扫描显微镜对幼鱼进行荧光成像。培养基每天都在更新。
实施例1：制备小分子探针
（1）将2-溴-4′-羟基苯乙酮(5mmol，1.075g)、4-二甲基氨基苯甲醛(5mmol，0.745g)、碳酸钠(10mmol，1.060g)溶于20ml乙醇中。然后加入5ml水，60℃搅拌6h，待反应物冷却后，加入盐酸(3ml，12m)，搅拌至中性。过滤出固体，乙醇洗涤后除去溶液中的不溶性物质。然后将溶液旋转蒸发以去除溶剂。产品为橙红色固体(1.005g)(55.2%)，其中，化合物BHDP的H谱(A)、C谱(B)如图2所示；
（2）BHDP(1mmol，0.534g)、4-甲酰基苯硼酸(1mmol，0.149g)、碳酸钾(14mmol，1.932g)、乙酸钯(II)(0.05mmol，0.011g)、三苯基膦(0.05mmol，0.013g)溶于1，4-二氧基(20mL)和水(5mL)的混合物中。然后，在氮气保护下，80°C回流6h。溶剂在减压下被除去。然后，以石油醚和乙酸乙酯的混合物为洗脱液(体积比20：1)，在硅胶(300-400目)上进行柱层析纯化粗品。产品为红色固体(0.212g)(31.0%)，化合物DPAHB的H谱(A)、C谱(B)如图3所示。
制备得到的的荧光探针效果判断指标如下：
检测灵敏度: 汞检测限9.8nM；甲基汞检测限0.35 nM；
光学机理指标：兼具荧光功能及吸收红移蓝移功能。
效果实施例
（一）实施例1制备的探针与甲基汞和汞区分的可行性验证：
荧光实验结果表明，DPAHB在460 nm处有吸收，在680 nm处有显著的独立荧光发射(图4A-a)。有趣的是，在DPAHB中加入Hg(II)后，430 nm处的荧光信号显著增强，而680nm处的荧光信号逐渐降低。并且与Hg(II)响应的光谱强度I430/I680具有良好的线性相关性(0.04 -25μM，R2 = 0.9921)，检出限(3σ/ k)约为9.8 nM。此外，该DPAHB探针对Hg(II)检测具有良好的选择性(图4A-b)。令人意外的是，当加入MeHg时，荧光光谱在595nm出现新峰，并随着浓度升高逐渐增强，而680nm处的荧光峰逐渐减弱。对MeHg的检测范围为0.002-35 μM，R2=0.9938，检出限(3σ/k)约为0.35nM。此外，对MeHg的选择性也很好(图4B-b)。值得注意的是，探针DPAHB的线性范围足以检测生物系统中的两个离子。
（二）实施例1制备的探针用于细胞内汞和甲基汞的区分
图5为加入Hg(II)和MeHg的HeLa细胞的荧光共聚焦图像。均置于10μMDPAHB的培养基中孵化后15min。
通过目前对DPAHB的检测实验，我们最终选择了Hela细胞作为检测模型。正如所证明的，与探针DPAHB孵育后，我们在细胞获得了显著的红色图像(通道640-740nm)(图5)。在与Hg(II)或MeHg孵育后，随着外加浓度的增加，红色信号逐渐减少。随着Hg(II)浓度的增加，蓝色发射(通道410-470nm)增加；随着MeHg浓度的增加黄色发射(通道550-630nm)增加。因此，合成的探针DPAHB可以同时用于Hg(II)和MeHg的体内成像，相互存在独立的荧光信号，不受任何干扰。
（三）实施例1制备的探针斑马鱼体内汞和甲基汞的区分
图6为加入Hg(II)和MeHg的斑马鱼的荧光共聚焦图像。均置于10μMDPAHB的培养基中孵化后15min。
同时，在细胞的基础上，我们对斑马鱼也进行了区分实验。正如所证明的，与探针DPAHB孵育后，我们在斑马鱼获得了显著的红色图像(通道640-740nm)(图6)。在与Hg(II)或MeHg孵育后，随着外加浓度的增加，红色信号逐渐减少。随着Hg(II)浓度的增加，蓝色发射(通道410-470nm)增加；随着MeHg浓度的增加黄色发射(通道550-630nm)增加。因此，合成的探针DPAHB可以同时用于Hg(II)和MeHg的体内成像，相互存在独立的荧光信号，不受任何干扰。
（四）实施例1制备的探针应用于解毒试剂的筛选
图7为给药后通过探针DPAHB共聚焦成像对解毒试剂的筛选。在培育10μM Hg(II)0.5h后，细胞被喂食了20mmol/kg的解毒试剂进行共聚焦成像。(10μM DPAHB)
图8为 解毒实验中6组细胞的比较。(A)空白；(B)0.5 h 5μM Hg(II)；(C)二巯基丙醇；(D)乙酰消旋青霉胺；(E)二巯基丙磺酸钠；(F)二巯基丁二酸钠。
通过使用探针DPAHB采用基于目前的细胞成像技术对汞中毒的解毒试剂进行筛选评价。如图7A所示，在没有Hg(II)的情况下，有显著的红色荧光信号，存活率为100%。而汞中毒发生时，Hg(II)的加入(图7B)，导致红色强度明显减少，存活率低15.18%。随后加入二巯基丙醇、乙酰消旋青霉胺、二巯基丙磺酸钠、二巯基丁二酸钠四种解毒试剂进行细胞解毒。根据图7C-F所示的荧光信号增加，治疗效果明显。经过0.5 h的处理，我们发现使用二巯基丙磺酸钠(图7E)的存活率恢复得最好，达到38.81%，同时也比其他方法显示出更高的红色荧光。信号强度(图8)与存活率数据一致，通过影像学证实了本评价方法的可靠性。因此，通过简单的影像学检查，可以选择出更好的解毒试剂，对诊断和医学研究有一定的帮助。
（五）本发明双响应小分子荧光探针各项技术指标的实验验证，具体如下：
（1）反应温度和pH的优化
在化学反应中，温度的影响是非常重要，对于本发明所研究的生物样本如活细胞、组织体系更是如此。不同温度下探针对待测目标物有较好的反应是整个实验成败的关键。如图9所示，我们对温度在20~42℃范围的反应具有的荧光响应进行了研究。接下来，我们对其检测环境的pH和温度条件进行优化，从图9中我们可以发现，该探针的响应条件比较温和，在生物环境中能够进行检测，这也为我们后面的生物实验检测奠定了一定的实验基础条件。
（2）反应时间的优化
为了验证我们的实验可行性，我们同时对探针进行了时间检测实验，从图10中我们可以看到，该探针对Hg(II)和MeHg具有极快的响应速度。
（3）细胞毒性实验
为了验证该探针在生物体内的可行性分析实验，我们对其进行了细胞毒性（MTT）实验测试。从图11中我们可以看到，该探针细胞毒性较小，因此，具有在生物体内检测实验的基本条件。

Claims (6)

1.一种快速识别汞和甲基汞的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）将2-羟基-4-溴苯乙酮、4-二甲基氨基苯甲醛、碳酸钠溶于乙醇中，然后加入水，60℃搅拌6h，待反应物冷却后，加入盐酸调节pH至中性，过滤出固体，乙醇洗涤后除去溶液中的不溶性物质，然后将溶液旋转蒸发以去除溶剂，得橙红色固体BHDP；
（2）BHDP、4-甲酰基苯硼酸、碳酸钾、乙酸钯(II)、三苯基膦溶于1，4-二氧六环和水的混合溶剂中，然后，在氮气保护下，80°C回流6h，溶剂在减压下被除去，然后，以石油醚和乙酸乙酯的混合物为洗脱液，在300-400目的硅胶上进行柱层析纯化粗品，得红色固体DPAHB。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述2-羟基-4-溴苯乙酮、4-二甲基氨基苯甲醛和碳酸钠的摩尔比为1：1：2；所述2-羟基-4-溴苯乙酮在乙醇中的浓度为0.25mol/L；所述乙醇和水的体积比为4：1。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述BHDP、4-甲酰基苯硼酸、碳酸钾、乙酸钯(II)和 三苯基膦的摩尔比为1：1：14：0.05：0.05；所述BHDP在混合溶剂中的浓度为0.04mol/L；所述1，4-二氧六环和水的体积比为4：1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱液中，石油醚和乙酸乙酯的体积比为20：1。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，制备得到的比率探针DPAHB效果判断指标如下：
检测灵敏度: 汞检测限9.8nM；
甲基汞检测限0.35 nM；
光学机理指标：兼具荧光功能及吸收红移蓝移功能。
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