JP3711544B2 - 化学発光測定試薬 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、ペルオキシダーゼの酵素活性を、増感剤の存在下での化学発光により測定する化学発光測定試薬に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、放射性同位元素を用いる測定方法に変わって、化学発光を用いる方法が普及し始めている。化学発光を用いる方法では、測定対象物質の増減に応じて変化する標識物質として、化学発光基質または酵素を使用する方法がある。しかし、発光の持続性に起因する測定装置の汎用性や測定精度の点で、酵素を標識する方法が優れた方法である。標識する酵素にも種々あるがペルオキシダーゼが多く利用されており、ペルオキシダーゼを標識物質とする系において、ルミノールなどの化学発光基質と酸化剤の存在下で生じる化学発光を測定する方法が主に用いられている。この反応を増感剤を用いて増感する方法が感度の良い方法として知られており、種々の増感剤が開発されている(Methods in Enzymology,Vol.133,p.331-353,1986、特開平2−291299号公報、特開昭59−171839号公報、特表昭59−500252号公報、特表平1−503730号公報等)。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
試薬の構成として、上記特開昭59−171839号公報、特表昭59−500252号公報等には、ペルオキシダーゼ、ルミノール、増感剤及び酸化剤の4つを別々の試薬として保存し、反応時に混合してルミネセンス反応を開始させることが記載される。さらに具体的には、使用の数時間前にルミノールと過酸化水素を混合して溶液を調製し、これを増感剤を予め加えた、ペルオキシダーゼ−抗体複合体を含む反応系に注入して反応を開始させることが記載されている。また、上記特開平2−291299号公報等には、ルミノールと過酸化水素水を使用の約2時間前に混合し、使用直前にさらに増感剤を加えて混合した混合液を、反応系に添加することが記載されている。
一般に、これらの化学発光反応を利用する測定方法が適用される分析対象物質は超微量であることが多々有り、上記各方法で充分ということはなく、さらに高感度でかつ安定な測定ができる、保存安定性の高い試薬の開発が望まれている。
本発明はこれらの課題を解決するものであり、特に保存安定性に優れた簡便で精度の良い化学発光測定試薬を提供するものである。
【0004】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、ペルオキシダーゼの酵素活性を、化学発光基質、反応増感剤及び酸化剤を用いる化学発光により測定する試薬であって、化学発光基質及び反応増感剤を含有するpH9〜13に調製された試薬▲1▼と酸化剤及び防腐剤を含有するpH4〜8に調製された試薬▲2▼として保存してなる化学発光測定試薬に関する。
【0005】
本発明の試薬を用いる化学発光測定は、増感剤の存在下に、ペルオキシダーゼの触媒作用により化学発光基質及び酸化剤を反応させ、生じた発光を検出・定量する方法であれば特に限定するものではない。ペルオキシダーゼは一般に標識物質として用いられるが、非標識体のまま用いることもできる。例えば、標識酵素として用いる特異的結合反応として、一抗体免疫分析法、二抗体免疫分析法、競合分析法、サンドイッチ法、ホモジーニアス法、ヘテロジーニアス法、ウェスタン分析法、DNAプローブ法等の各種分析法に利用できる。
【0006】
本発明で用いられるペルオキシダーゼは特に限定するものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼの塩基性アイソザイムが増感剤との組合せにより、高い特異発光量が得られる点から好適である。西洋ワサビペルオキシダーゼの塩基性アイソザイムにはB、C、D及びEの各型が知られているが、これらの中ではC型がRZ値(ヘミンとタンパク質の比を示す)及び酵素活性の点で最も好ましい。これは、例えば東洋紡(株)から市販され入手可能である。
【0007】
化学発光反応に用いる化学発光基質としては、ルミノール類、ロフイン、ルシゲニンなどがあるが、ルミノール類が好ましく、具体的には、ルミノール、イソルミノール、N−エチルイソルミノール、N−(4−アミノブチル)−N−エチルイソルミノールヘミサクシミド、N−(6−アミノヘキシル)−N−エチルイソルミノール等が挙げられる。中でも、ルミノール又はイソルミノールが安定性や発光量子収率の点で好ましく、特にルミノールが好ましい。ルミノールは、通常入手できる試薬グレードのものには製造原料であるヒドラジン及び硫化物イオンが混入している場合が多いので、再結晶を繰り返し、精製したものを用いるのが好ましい。
【0008】
化学発光に用いる酸化剤としては、過酸化水素、過硼素酸塩、過酸化尿素などが好ましいものとして挙げられるが、特に過酸化水素が取扱いやすさの点で好ましい。
化学発光反応に用いる増感剤は、増発光効果や発光持続性効果のあるものであれば特に限定するものではないが、p−ヨードフェノール、p−ブロムフェノール、フェノールインドール、4−[4′−(2′−メチル)チアゾリル]フェノール、4−(4′−チアゾリル)フェノール、4−[4′−(2′−(3′−ピリジル))チアゾール]フェノール、4−(2′−チエニル)フェノール、4−[2′−(4′−メチル)チアゾリル]フェノール、フェノチアジン−N−プロピルスルフォネート又はフェノールインドフェノール等のフェノール誘導体、6−ハイドロキシベンゾチアゾール、4−(4−ハイドロキシフェニル)チアゾール等のチアゾール誘導体、3−(10−フェノチアジル)−プロピルスルホン酸塩、p−ヒドロキシフェニルプロピオン酸、ジエチルアニリンなどが好ましいものとして用いられる。中でも好ましいものは、4−[4′−(2′−メチル)チアゾリル]フェノール、4−(4′−チアゾリル)フェノール、4−[4′−(2′−(3′−ピリジル))チアゾール]フェノール、4−(2′−チエニル)フェノール、4−[2′−(4′−メチル)チアゾリル]フェノール、フェノチアジン−N−プロピルスルフォネート又はフェノールインドフェノールであり、特に好ましいものは、S/N比(シグナルとノイズの比)が高い点で4−[4′−(2′−メチル)チアゾリル]フェノールである。
【0009】
本発明において防腐剤は、試薬に防腐効果を付与し、保存安定性を高めるために用いられる。
本発明に用いる防腐剤としては、種々のものが用いられるが、アジ化ナトリウム、チメロサール以外の化合物が好ましい。即ち、アジ化ナトリウムはペルオキシダーゼを阻害する傾向にあり、チメロサールは環境汚染の問題のある有機水銀化合物のため、使用したくない物質である。
本発明に用いる好ましい防腐剤としては、イソチアゾリン化合物(イソチアゾリン、その誘導体、それらのハロゲン化物等)、ピリジニウムハロゲン化合物 (アルキルピリジニウムハライド等)、アンモニウムハロゲン化合物(モノ、ジ、トリ、テトラアルキル置換アンモニウムハライド等)、ハロゲン化ジオキサイド化合物(ジオキサン又はその誘導体のハロゲン化物、アルキレングリコール又はその誘導体のハロゲン化物等)、パラベン誘導体(パラオキシ安息香酸エステル類等)及びチオピロリン誘導体(ハロゲン化チオピロリン誘導体等)であり、これらは単独で又は2種以上を併用して使用できる。これらは防腐効果の他に、発光の持続安定性の効果を付与できるものであり、これらを反応時に存在させることにより、安定でより高感度な測定が可能となる。
具体的化合物としては、イソチアゾリン化合物として5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、ピリジニウムハロゲン化合物としてヘキサデシルピリジニウムクロリド、アンモニウムハロゲン化合物としてトリメチル−テトラデカン−アンモニウムブロマイド、トリメチル−ヘキサデカン−アンモニウムブロマイド、ハロゲン化ジオキサイド化合物として5−ブロモ−5−ニトロ−1,3−ジオキサン、2−ブロモ−2−ニトロプロパン−1,3−ジオール、パラベン誘導体としてメチルパラベン(パラオキシ安息香酸メチル)、チオピロリン誘導体としてメチルクロロチオピロリン等が好ましいものとして挙げられる。
この中で、ピリジニウムハロゲン化合物及びアンモニウムハロゲン化合物が発光の持続安定性の効果が高いので好ましく、特にヘキサデシルピリジニウムクロリド、トリメチル−テトラデカン−アンモニウムブロマイドが発光の持続安定性の効果が特に高いので好ましい。
【0010】
本発明の試薬においては、これらを化学発光基質及び反応増感剤を含有するpH9〜13に調製された試薬▲1▼と、酸化剤及び防腐剤を含有するpH4〜8に調製された試薬▲2▼の2液として保存する。酸化剤及び防腐剤を含有する試薬▲2▼はpHが上記範囲より高すぎても低すぎても安定な試薬にならない。また、化学発光基質及び反応増感剤を含有する試薬▲1▼はpHが低すぎると不安定になる。
上記pHとするために、各試薬に用いる緩衝液としては、試薬▲2▼(pH4〜8)にはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が好ましいものとして使用でき、試薬▲1▼(pH9〜13)にはホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、アンモニウム緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が好ましいものとして用いられる。これらの緩衝液の組み合わせは任意に選択することが出来、それぞれの濃度とpHにより両試薬が混ざった時の最終反応液のpHや塩濃度を調整し最適反応条件にすることができる。
最終反応液の好ましいpHは8〜10であり、pHが低すぎると感度が低下しやすく、高すぎるとブランクが高くなりすぎる。
【0011】
各試薬中の成分濃度は、使用する成分の種類、試薬▲1▼と試薬▲2▼の混合割合等により違ってくるが、最終反応液の濃度が以下に示す範囲に入るようにすれば良い。最終反応液中の酸化剤(例えば過酸化水素)濃度は0.1〜10mMの範囲が好ましく、これより少ないと基質不足により感度が低下する傾向にあり、多すぎると酵素活性を阻害し感度が低下する傾向にある。
化学発光基質(例えばルミノール)の最終反応液中の濃度は0.1〜100mMの範囲が好ましく、この範囲を外れると感度が低下する傾向にある。
反応増感剤の濃度は、使用する物質、測定するペルオキシダーゼの濃度範囲等で最適濃度が違ってくるので、特に制限されるものではないが、一般に最終反応液中に1mM〜1M程度の濃度で使用される。例えばp−ヨードフェノールの場合は0.01〜10mMの範囲が好ましく、4−〔4′−(2′−メチル)チアゾリル〕フェノールの場合は0.001〜10mMの範囲で使用するのが好ましい。各反応増感剤の濃度がこの範囲を外れると増感効果が低下する傾向にある。
防腐剤の濃度も使用する物質により最適濃度が違ってくるが、通常、0.00001〜1%(w/v)、特に0.001〜1%(w/v)の範囲で使用するのが好ましい。防腐剤が少なすぎると防腐効果及び発光減衰を抑える効果が低下する傾向にあり、多すぎると発光を阻害する傾向にある。
試薬▲1▼と試薬▲2▼を1:1(容積比)で混合する方法は好ましい方法であるが、その場合各試薬中の各成分の好ましい濃度は、前記の最終反応液中の好ましい濃度の2倍となる。
【0012】
本発明に用いる、化学発光基質及び反応増感剤を含有するpH9〜13に調製された試薬▲1▼と、酸化剤及び防腐剤を含有するpH4〜8に調製された試薬▲2▼は、測定されるペルオキシダーゼが入った反応容器に、測定時に同時に又は順次に分注することにより混合しても良いし、測定前に両液を混合し1液にして測定時に反応容器に分注してもよい。なお、予め混合し1液にした場合は発光液の感度が徐々に低下し、通常室温で数日しか使用できないので混合後早めに使用するのが好ましい。
本発明に用いる酸化剤及び防腐剤を含有するpH4〜8の範囲に調製された試薬▲2▼は測定精度を向上させるため、さらに蛋白成分や界面活性剤等を含有してもよい。
【0013】
本発明の試薬を用いることのできる測定対象物は、ペルオキダーゼを直接測定すること又は標識酵素として用いて測定することにより、測定できるものであれば特に制限されるものではない。例えば、酵素免疫測定法に用いることにより、pg/mlオーダーまでの高感度測定が可能となるので、成長ホルモン(GH)、エンドセリン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、遊離サイロキシン4(FT4)等のペプチドホルモンやサイトカイン等の微量生体成分などの測定試薬として適用できる。
【0014】
【実施例】
実施例1 試薬の安定性に及ぼすpHの影響
ストリップ型黒色マイクロウェル(NUNC社製)にペルオキシダーゼ溶液 (西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼC型をPBS(Phosphate Buffer Saline)溶液に溶解、濃度100pg/ml)を5μl入れる。次に1mM過酸化水素、防腐剤として0.025%(w/v)トリメチル−テトラデカン−アンモニウムブロマイドを含有する発光液A(10mMりん酸緩衝液又はほう酸緩衝液でpH9から3までの水溶液を調製)100μlと0.16mM 4−[4′−(2′−メチル)チアゾリル]フェノール及び10mM ルミノールを含有する発光液B(pH9〜13、100mMほう酸緩衝液で対応する発光液Aと混合したとき最終pHが9となるように調製)100μlを分注する。撹拌混合し、化学発光測定装置(コロナ電気(株)製、MLR-100)を用いて、5分後の化学発光量を測定した。
また、発光液A及び発光液Bの両試薬を37℃で保管した苛酷試験により、保存安定性を評価した結果を図1に示した。ここから分かるように、発光液AのpHが4〜8の範囲にあるとき(このとき発光液BはpHが9〜13にある)安定なことがわかった。なお、防腐剤を5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オンと2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オンの混合物(0.05%(w/v))、ヘキサデシルピリジニウムクロリド(0.05%(w/v))及びメチルパラベン(0.1%(w/v))に代えても同様の結果が得られた。
【0015】
実施例2 防腐剤添加による発光持続性の検討
ストリップ型黒色マイクロウェル(NUNC社製)にペルオキシダーゼ溶液(西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼC型をPBS溶液に溶解、濃度100pg/ml)を5μl入れる。次に1mM過酸化水素及び防腐剤(下記物質を下記濃度で含む)を含有する発光液A(10mMりん酸緩衝液pH7)100μlと0.16mM 4−[4′−(2′−メチル)チアゾリル]フェノール及び10mM ルミノールを含有する発光液B(200mMほう酸緩衝液pH10)100μlを分注する。撹拌混合し、化学発光測定装置(コロナ電気(株)製、MLR-100)を用いて、5分後の化学発光量を測定した。
5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オンと2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オンの混合物(混合重量比は前者:後者=2.3:0.7、合計で0.00015%(w/v)、防腐剤A)、ヘキサデシルピリジニウムクロリド(0.05%(w/v)、防腐剤B)、トリメチル−テトラデカン−アンモニウムブロマイド(0.025%(w/v)、防腐剤C)及びメチルパラベン(0.1%(w/v)、防腐剤D)を発光液Aに添加したときの発光の時間変化は図2のようになり、防腐剤を加えないものに比べ、発光の減衰が低減できることがわかった。
【0016】
実施例3 酵素免疫測定法への応用
本化学発光試薬の酵素免疫測定法への応用として血清中の成長ホルモン(GH)の測定を検討した。
抗GHモノクローナル抗体を感作したストリップ型黒色マイクロウェル(NUNC社製)に血清25μlとビオチン化抗GHヒツジ抗体溶液100μlを分注し、60分間室温で攪拌しながらインキュベーションした。0.05%(v/v)ツィーン20含有PBSで4回洗浄した後、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ溶液を100μl分注し、10分間室温で攪拌しながらインキュベーションした。0.05%(v/v)ツィーン20含有PBSで4回洗浄した後、実施例2と同様の発光液AとBを100μlずつ分注した。撹拌混合し、化学発光測定装置(コロナ電気(株)製、MLR-100)を用いて、5分後の化学発光量を測定した。
血清の代わりに濃度既知の標準血清を用いて検量線を求めたところ良好な検量線が得られた(図3)。また、同一検体を繰り返し11回測定し、同時再現性を求めた結果、表1のように良好な再現性が得られた。
【0017】
【表1】
【0018】
【発明の効果】
本発明の化学発光測定試薬は、保存安定性に優れ、また化学発光時の発光の減衰の遅延を生じさせることができ、簡便で精度の良い測定をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施例における種々のpHの発光液A及び発光液Bの両試薬を37℃に保管した苛酷試験により保存安定性を評価したグラフである。なお、1ルミカウントの発光量は1.2×10-16Wである。
【図2】本発明における防腐剤の添加による発光の減衰の低減の効果を示すグラフである。なお、1ルミカウントの発光量は1.2×10-16Wである。
【図3】本発明の実施例におけるGH定量用の検量線を示すグラフである。なお、1ルミカウントの発光量は1.2×10-16Wである。
Claims (6)
- ペルオキシダーゼの酵素活性を、化学発光基質、反応増感剤及び酸化剤を用いる化学発光により測定する試薬であって、化学発光基質及び反応増感剤を含有するpH9〜13に調製された試薬(1)と酸化剤及び防腐剤を含有するpH4〜8に調製された試薬(2)として保存してなること、化学発光基質がルミノール類であること、反応増感剤がフェノール誘導体であること、酸化剤が過酸化水素、過硼素酸塩又は過酸化尿素であること、及び、防腐剤がイソチアゾリン化合物、ピリジニウムハロゲン化合物、アンモニウムハロゲン化合物、ハロゲン化ジオキサイド化合物、パラベン誘導体又はチオピロリン誘導体であることを特徴とする化学発光測定試薬。
- 化学発光基質がルミノール又はイソルミノールである請求項1記載の化学発光測定試薬。
- 酸化剤が過酸化水素である請求項1又は2記載の化学発光測定試薬。
- 反応増感剤が4−[4′−(2′−メチル)チアゾリル]フェノール、4−(4′−チアゾリル)フェノール、4−[4′−(2′−(3′−ピリジル))チアゾール]フェノール、4−(2′−チエニル)フェノール、4−[2′−(4′−メチル)チアゾリル]フェノール、フェノチアジン−N−プロピルスルフォネート又はフェノールインドフェノールである請求項1〜3のいずれかに記載の化学発光測定試薬。
- 防腐剤がイソチアゾリン化合物、ピリジニウムハロゲン化合物、アンモニウムハロゲン化合物、又はパラベン誘導体である請求項1〜4のいずれかに記載の化学発光測定試薬。
- ペルオキシダーゼが標識された西洋ワサビペルオキシダーゼである請求項1〜5のいずれかに記載の化学発光測定試薬。
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