JPH0648270B2 - 化学発光分析方法および検定用キツト - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は試料中のベータラクタムを検出する方法に関
し、また化学ルミネセンス反応の成分の検出に関する。
本発明はまたこれらの検定のあるものを実施するための
検定用キツトにも関する。

発明の背景 いくつかの化合物は化学ルミネセンス作用を示し、そし
てこの性質のために一般に尊重される。ルミノール（５
−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオ
ン）は酸化するとき光を発する能力のあることでよく知
られている。それは多くの分析方法に使用される。例え
ば、痕跡の金属イオン、銅、鉄、過酸化物およびシアン
化物を分析するために使われる。

ルミノールの発光は典型的にはそれを、ペルオキシター
ゼのような酸化反応用触媒の存在で過酸化水素のような
酸化剤と混合することにより引き出される。ここでこの
反応を「ルミノール反応」と呼ぶ。ホワイトヘツドら、
ネーチユア、３０５巻、１５８−１５９頁、１９８３年
（Whiteheadh,et al.，Nature，３０５，１５８−１５
９（１９８３））により、ホタルルシフエリンのルミノ
ール反応への添加は光出力を向上させると報告されてい
る。

化学的に誘導されたけい光を利用する検定法は当該技術
分野に公知であり、例えば米国特許第４，２２０，４５
０号を参照されたい。

米国特許第４，４３３，０６０号は、過酸化物とクロラ
ミンにより活性化されたトリフエニルメタン染料を利用
する化学ルミネセンス免疫検定法を開示している。トリ
フエニルメタン染料は標識物質として使用される。

ユーロウら、アナリテイカ・ヒミカ・アクタ、６８巻、
２０３−２０４頁、１９７４年（Yurow et al.，Analyt
ice Chimica Acta.，６８，pp.２０３−２０４（１９７
４））はルミノールを含む化学ルミネセンス反応を使用
するある種のケトンの検定法を開示している。

ベータラクタムによるけい光または化学ルミネセンスの
報告は何も知られていない。

発明の要約 本発明は、ルミノール反応のような反応の化学ルミネセ
ンスを増強する化合物としてのベータラクタムの使用に
関する。さらに詳細に述べれば、ルミノールおよびその
他の化学ルミネセンス化合物と協力するベータラクタム
の化学ルミネセンス作用は特定のベータラクタム類、特
にベータラクタム環構造を含む抗生物質のルミネセンス
検出において、またこれらのベータラクタム類の定性的
および定量的測定において有用である。本発明はまた、
ベータラクタムを使用することにより反応の感度を増加
させる結果として化学ルミネセンス反応（例えばルミノ
ール反応）に基づく検定法の改良に関する。本発明はま
た、酸化触媒の必要を減じるかまたは除くことにより化
学ルミネセンス反応を単純化することに関する。最後
に、本発明はまた化学ルミネセンス検定を実施するため
のキツトに関する。

さらに詳細には、試料中のベータラクタムを検出するた
めの本発明の一方法は、a) i) 化学ルミネセンス化合
物、過酸化物源および塩基から成る反応系とii）分析さ
れる試料の予め定量された一部を合わせて混合物とする
工程、およびb) 前記混合物の光出力を測定する工程、
から成る。前記反応系はさらに、もし前記試料の予め定
量された一部が唯一のベータラクタムとしてペニシリン
Ｇを含み、その含有量が結果として前記混合物がペニシ
リンＧを０．４５mMの濃度に含むことになる程である
と、光出力信号を発生し、これをルミノメーターで測定
して、信号の開始から３０秒に亘り積分すると、前記試
料の予め定量された一部がベータラクタムを含まない場
合に出す出力の少なくとも約２倍、そして好ましくは少
なくとも約４倍であることを特徴とする。反応系はさら
に化学ルミネセンス反応のための酸化触媒を含むことも
ある。

本発明の他の一つの方法は試料中のベータラクタムを検
出するための方法であつて、a) i) 化学ルミネセンス化
合物、過酸化物源および塩基から成る反応系とii）前記
試料の予め定量された一部を合わせて混合物とする工
程、およびb)前記混合物の光出力を測定する工程から成
り、その方法において化学ルミネセンス化学物がルミノ
ール、ルミノール類似体、イソルミノール、イソルミノ
ール類似体、クマリン２、スルホロダミン１０１、ウン
ベリフエロン、４−メチルウンベリフエロンおよびフル
オレセインから成る群より選択される。

さらに本発明の他の一つの方法は、化学ルミネセンス化
合物、過酸化物源および任意に酸化触媒を含む化学ルミ
ネセンス反応の一成分の検出用の検定反応の感度を向上
させる方法である。

本発明において見いだされたことは、ベータラクタムに
より引き起される化学ルミネセンス反応の増加した光出
力は一般に付加的というよりはむしろ相乗作用的、すな
わち総光出力は個々の反応物の光出力の合計よりも大で
ある。この理由により、ここに述べた型の化学ルミネセ
ンス反応、すなわち「ベータラクタム反応」はベータラ
クタム類、特にベータラクタム抗生物質の強力な、非常
に高感度の検定方法を提供する。同様に、化学ルミネセ
ンス化合物（例えば、ルミノール）、過酸化物源、また
は酸化触媒（例えば、セイヨウワサビペルオキシダー
ゼ）のようなベータラクタム反応の一成分の化学ルミネ
センス検定においてベータラクタム反応の使用はそのよ
うな成分の非常に高感度の検定方法を与える。

詳細な説明 本発明は化学ルミネセンスの作用を示す新規な反応と組
成物を開示し、またその新規な反応と組成物の分析検定
手段としての利用についても開示する。

本明細書および特許請求の範囲を通じて用いられると
き、「ベータラクタム」なる用語は を含む化合物を表わす。

検定される物質の量に比例して測定し得る信号または標
識の存在はすべての定量的診断上の検定および分析の手
順の本質的な要素である。本発明の目的にとつて、測定
される信号は光出力である。ベータラクタム、そして特
にベータラクタム抗生物質が、酸化触媒の存在で酸化さ
れるとおだやかに化学ルミネセンスを行なうことは既に
知られている。この現象自身が驚きべきことであり且つ
有用である。さらに驚くべき意外なことに、ルミノール
反応のように化学ルミネセンス反応がベータラクタムの
存在で行なわれると、相乗的化学ルミネセンス反応が起
る。この反応は、その光出力が成分の光出力の和よりも
大であるという事実において相乗的であることが発見さ
れた。ルミノール反応自身は実施例１の条件で約１００
０相対光単位（relative light unit）を与える。実施
例２に示すように、実施例１の条件でベータラクタムの
みを反応させた場合、２２５相対光単位までのおだやか
な化学ルミネセンスが観察された。実施例１の実験Ｂ、
Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦにおいて、光出力の非常に大きな増
加がルミノール反応から得られることが判つた。

ルミノール反応のような化学ルミネセンス反応は一般
に、化学ルミネセンス化合物（例えば、ルミノール反応
におけるルミノール）、過酸化物のような酸化剤、およ
び時にはペルオキシダーゼのような酸化触媒の存在を必
要とする。以下に示すように、ベータラクタム反応にお
けるベータラクタムの存在は、多くの場合に、化学ルミ
ネセンス反応から酸化触媒の除去を可能にする。そのよ
うな除去は、反応系を簡素化する（すなわち、一成分の
削減により）ことになるので、また検定の感度の向上を
しばしば来すので、望ましい。

本明細書および特許請求の範囲において用いられると
き、「化学ルミネセンス化合物」という用語は、過酸化
物の存在でエネルギーを受け螢光としてそれを放出する
（すなわち、過酸化物の化学ルミネセンス化合物との反
応および／または後者の存在における分解の結果として
上記の作用をする）化合物を表わす。本発明の実施に使
用される化学ルミネセンス化合物に含まれるものはルミ
ノールとイソルミノール、米国特許第４，３５５，１６
５号および同第４，２２６，９９３号に記載のようなル
ミノールとイソルミノールの類似体、クマリン２、フル
オレセイン、フルオレセインアミンアイソマーII、スル
ホロダミン１０１、およびウンベリフエロンと４−メチ
ルウンベリフエロンである。

過酸化物源に関する限り、ルミノール反応に役立つ過酸
化物源らなみな本質的に現在のベータラクタム反応に役
立つと信じられる。ベータラクタム反応に使用できる適
当な過酸化物源の例に含まれるものは過酸化水素、過ホ
ウ素ナトリウム、ｍ−クロロ過安息香酸のような有機過
酸化物、およびターシヤリーブチルペルオキシドのよう
な有機ヒドロペルオキシドなどである。

本発明の使用に適する酸化触媒に含まれるものは、セイ
ヨウワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダー
ゼ、水溶液中の酸化性金属イオン、例えばCo⁺²、Fe⁺²、
Cu⁺、Cr⁺³、Ni⁺²およびその他の遷移金属イオンの水溶
液、ミクロペルオキシダーゼ（シグマ・ケミカル・コン
パニー、セントルイス、ミズーリ、Sigma Chemical C
o.，St．Louis，Missouri）、コバラミン、ヘモグロビ
ンおよびヘマチンのような金属ポルフイリン型化合物な
どである。その上、多くの場合に本発明の相乗的反応は
ルミノール反応に必要な触媒なしで、または極く少量の
触媒だけで実施できることが判つた。

本発明のベータラクタム反応を使用して検出されるベー
タラクタム、または化学ルミネセンス化合物、過酸化物
源、または酸化触媒を検出するための検定に使用される
ベータラクタムに含まれるものは、ペニシリンＧ、ペニ
シリンＶ、アンピシリン、クロキシシリン（cloxicilli
n）とアミノペニシリン酸のようなペニシリン類、およ
びセフアピリンとセフアロシンのようなセフアロスポリ
ン類などである。

本発明のベータラクタム反応の増加した光出力は化学ル
ミネセンス化合物対ベータラクタルのモル比に関係して
変化する。これは化学ルミネセンス化合物としてのルミ
ノールについて実施例３と９に定量的に示されている、
実施例３では、１５０ng／ml程も少量のペニシリンＧが
検出されている。化学ルミネセンス反応は１００ng／ml
程も少量のベータラクタムについても検出された。感度
は使用される特定のベータラクタムと採用される反応条
件に依存するであろう。

ルミノール反応は存在するベータラクタムの量に関係し
て直線的に増加する光出力を示す（実施例３）という観
察を考慮すると、この反応は存在するベータラクタムの
濃度を定量的に測定するために利用できよう。これは標
準曲線との比較を含めて実施される。異なるベータラク
タム類は夫々異なる程度の増加光出力を示すので、各ベ
ータラクタムについて別々の標準曲線を調製することが
必要である。

ベータラクタム反応が起るためには、水性媒体は塩基性
でなければならない。すなわち、pHが約７．５より大で
あるべきであり、好ましくは７．５〜１２の範囲、最も
好ましくは約８．５〜１２の範囲である。ルミノール、
過酸化水素またはベータラクタムの分析のためには、好
ましいpHは約１０〜１２である。本発明の特定の化学ル
ミネセンス反応に好ましいpHは包含される反応物の性
質、例えばベータラクタムの種類に関係して変動する。
その反応は普通の有機または無機の塩基、例えば重炭酸
ナトリウム、水酸化ナトリウム、グリシン、ホウ酸ナト
リウム、リン酸ナトリウム、イミダゾール、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタンなど、を使用して塩基性
にすることができ、比較的弱い塩基が好ましい。

上記のように、ここに述べるベータラクタム反応は、液
体の（例えば、水溶液の）試料、例えばミルクとプラズ
マ、の中のベータラクタム、特にベータラクタム抗生物
質の定性および定量分析のため非常に有用である。さら
にまた、実施例５に論じられ且つ第２図に示されるよう
に、各ベータラクタムは、ルミノメーターと組合せたス
トリツプレコーダーにより記録されると、別々の特徴あ
る光出力線図を示す。従つて、これらの化学ルミネセン
スの「指紋」は定性分析の方法として役立つ。

ベータラクタム反応が試料中のベータラクタムを検出す
る方法に使用される場合に、そのような方法に採用され
る反応系は化学ルミネセンス化合物、過酸化物源、塩基
および任意に酸化触媒から成る。本発明のこのような一
方法において、反応系のさらに特徴となるものは、もし
検定される試料の予め定量された一部が唯一のベータラ
クタムとしてペニシリンＧを含み、この含有量が結果と
して全体の反応混合物がペニシリンＧを０．４５mMの濃
度に含むような程であると、光出力信号の発生し、これ
を慣用のルミノメーターで測定して、信号の開始から３
０秒に亘り積分すると、前記試料の予め定量された一部
がラクタムを含まない場合に出す出力の少なくとも２倍
になることである。ある反応系がこの特別の方法に適す
るかどうかを判定するためには、ベータラクタムを含ま
ないことが知られている（例えば、他の分析法で判定さ
れたとして）ある試料の予め定量された一部（すなわ
ち、例えば、血漿が本発明の方法を使用して検定される
場合には、その血漿の一部）を用いて検定を行ない、次
に（反応系と予め定量された試料の一部とから成る）混
合物中のペニシリンＧの濃度が０．４５mMになるために
十分な量のペニシリンＧを含有することが知られている
試料の予め定量された一部について再び検定する。光出
力信号をルミノメーターを使用し且つ前記のように最初
の３０秒に亘つて積分することにより測定する。それか
らこれらの信号を比較する。ある反応系がこの特別の方
法に用いるために適当であるかどうかを判定する場合に
は、光出力信号の測定は試料と反応系の成分が混合され
た時から約１０秒以内に開始されなければならない。

本発明の方法自身は、勿論、光出力信号を測定するどん
な適当な手段を採用してもよいことは理解されるべきで
ある。すなわち、光出力信号を、例えばピークの高さを
測り、全体の信号またはその部分の下の面積を積分する
など、いかなる適当な方法によつても分析することがで
きる。

ベータラクタムを検出するために本発明の方法を実施す
る際には、反応系の種々の成分および試料の予め定量さ
れた一部をどんな順序で混合してもよい。

ここに述べられるベータラクタム反応はまた、化学ルミ
ネセンス化合物、過酸化物源または酸化触媒のようなベ
ータラクタム反応の成分の分析検定において非常に有用
である。

ここに述べられるベータラクタム反応はまた、標識が化
学ルミネセンス化合物（例えば、ルミノール）または化
学ルミネセンス反応用の触媒である分析用反応において
役立つ。これらの反応の感度はより高められる。すなわ
ち、ベータラクタムの存在のために得られるより大きな
光出力によつて検定している成分が検出され且つより容
易に定量される。さらに、本発明はまた標識としてのベ
ータラクタムの使用、例えば、ベータラクタムで標識づ
けた化学種を測定する配位子−反配位子結合検定におけ
る使用を可能にする。

公知のルミノールに基づく免疫検定の例はプロゲステロ
ンのようなステロイド用、ビオチンとアビジン用、チロ
キシン用、およびヘパチチスＢ表面抗原用などの検定で
ある。これらの検定法は「ルミネセンス検定：内分泌学
および臨床化学における展望」エム・セリオとエム・ポ
ザグリ編、ラベン・プレス、ニユーヨーク、１９８２年
（“Luminecent Assays：Perspective in Endocrinolog
y and Clinical Chemistry”edited by M. Serio and
M. Pozzagli, Raven Press, New York，１９８２）とい
う本に記載されている。

標識種がセイヨウワサビペルオキシダーゼ、ミクロペル
オキシダーゼ、ヘミンまたはヘモグロビンであるルミノ
ール反応に基づく検定に含まれるものは、オルソンら、
ジヤーナル・オブ・イミユノロジカル・メソツズ，２５
巻、１２７−１３５頁、１９７９年（Olsson et al.,
J. Immunological Methods，２５，１２７−１３５（１
９７９））に記載のようなタンパク質結合検定、前記の
「ルミネセンス検定：内分泌学および臨床化学における
展望」に記載のようなヘモグロビン用検定および酵素免
疫検定、およびアナリテイカル・ケミストリー、５４
巻、１１２６−１１２９頁、１９８２年（Analytical C
hemistry，５４、１１２６−１１２９、（１９８２））
に記載のようなヒト血清アルブミン上のヘミン触媒標識
に基づく検定などである。

検定を改良する方法としての化学ルミネセンス反応の増
加の有用性は次のようにより十分に説明することができ
る。すなわち、化学ルミネセンス反応は数種の基質を必
要とするかまたは利用する。一つ以上の（一般にはすべ
ての）基質が決定的に重要であるかまたは速度を限定す
る。それらの基質は結合していても、または結合してい
なくてもよい。すなわち、ある場合に基質は他の物質、
例えば、薬剤、抗体、タンパク質、抗原、ＤＮＡなどと
結合して、そのような他の物質がそれによつて検出され
るような標識を与える。

ルミノール反応の例では、自由のルミノールまたは他の
ある物質に結合したルミノールが検出される。この反応
は本発明の方法によれば増強されるであろう。

化学ルミネセンス反応において過酸化物源は必要な成分
であるので、過酸化物の存在は化学ルミネセンス反応の
発生によつて示すことができよう。従つて、本発明の方
法は、例えば、過酸化水素または過酸化水素を発生する
基質の検出を容易にするであろう。

同様に、ベータラクタム類、他の物質に結合したベータ
ラクタム類、ルミノール反応の触媒および他の物質に結
合した触媒の検出は本発明の方法によつて改良されよ
う。

ベータラクタムの化学ルミネセンスを考慮すると、ベー
タラクタムは免疫検定の標識としてて使用することがで
きる。例えば、米国特許第４，２２０，４５０号は、ベ
ータラクタムの存在によつて増強される化学ルミネセン
ス反応を含むが、これらすべての反応は本発明の利用の
機会を与えるであろう。すなわち、米国特許第４，２２
０，４５０号に記載の配位子または反配位子を化学ルミ
ネセンス反応の一成分によつて標識をつけることがで
き、そして配位子または反配位子をベータラクタムを使
用して化学ルミネセンス反応の増加の結果としてより容
易に検出することができよう。

上記のように、酸化触媒の使用は本発明のベータラクタ
ム反応においては任意である。また、ここに述べた酸化
触媒を含むベータラクタム反応のあるものにアスコルビ
ン酸塩（例えば、アルコルビン酸ナトリウム）の添加、
あるいは酸化触媒を毒するある種のイオンの塩の添加は
化学ルミネセンス検定の感度を増させることも見いださ
れた。適当なイオン塩に含まれるものはアジ化塩（例え
ば、アジ化ナトリウム）、アジ化塩とシアン化塩の混合
物（例えば、後者はシアン化ナトリウム）である。アル
コルビン酸塩とアジ化塩の混合物もまた適当であること
が判つた。理論に束縛されることは望まないが、二種の
反応が酸化触媒、例えばセイヨウワサビペルオキシダー
ゼ、が存在する本発明の化学ルミネセンス反応に包含さ
れていると信じられる。一つの反応は従来の化学ルミネ
センス反応であり、他の反応はベータラクタムの存在を
必要とする別の反応である。酸化触媒の毒の存在で前者
の反応の光出力の減少および／または後者の反応の光出
力の増加を起すために感度が増すと信じられている。

化学ルミネセンス反応の一成分を検出するための本発明
の検定用キツトは、ｉ）検定されるべき成分以外の化学
ルミネセンス反応の反応物、およびii）ベータラクタム
から成る。そのような反応物とベータラクタムは複数の
検定を行なうに十分な量に存在し、実質的に安定な形に
包装されている（すなわち、そのキツトは室温において
少なくとも３０日の貯蔵寿命を示す）。

次の実施例は例証のために提供されるが、限定のためで
はない。

実施例１ ルミノール０．００２０Ｍ、エチレンジアミン四酢酸
０．００２５Ｍおよび重炭酸ナトリウム０．３０Ｍの水
溶液（pH１０．５）の１００μl，ベータラクタム抗生
物質水溶液（２×１０^-3Ｍ）の１００μl，およびセイ
ヨウワサビペルオキシダーゼ（４４０ng／ml）、牛の血
清アルブミン（２００μg／ml）と０．００５０Ｍのエ
チレンジアミン四酢酸を含む水溶液の１００μlを混合
して溶液を調製した。反応をルマツク・ビオカウンター
２０１０（Lumac Biocounter２０１０）〔スリーエ
ム、セントポール、ミネソタ（３Ｍ、St. Paul, Mineso
ta）から入手できるルミノメーター〕を使用して監視し
た。反応をそれからエチレンジアミン四酢酸０．００１
０Ｍの過酸化水素０．０１８Ｍ水溶液の１００μlの添
加により開始させた。光出力を反応開始後３０秒間測定
し、ストリツプ・チヤート・レコーダー上に線図として
記録し、そしてルミノメーターにより記録し且つ積分し
た。ブランクとして、ベータラクタム抗生物質を含む溶
液１００μlを蒸留水と取り替えて反応を実験した。

第Ｉ表はルミノメーターで測定した光出力、計算した増
加光出力（ＥＬＯと略記され、記録された光出力からブ
ランクの光出力を減じた差を表わす）および増加光出力
係数（ここではＥＬＯ係数と略記され、光出力をブラン
クの光出力で割つた商を表わす）を示す。光出力の単位
は前記の計器で測定された通り相対光単位（ここではＲ
ＬＵと略す）である。

実験Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦにおいて、ベータラクタム
抗生物質は反応により大きな光の増加を生じ、実験Ｅの
２３０％から実験Ｃの１１５０％に及んだ。ベータラク
タムの加水分解生成物（実験ＧとＨ）および非ラクタム
抗生物質（実験Ｉ，Ｊ，およびＫ）は光出力に比較し得
る程大きな増加を生じなかつた。

実施例２ 重炭酸ナトリウム０．３０Ｍ（pH１０．５）およびエチ
レンジアミン四酢酸０．００２５Ｍの水１００μl、ベ
ータラクタム抗生物質水溶液（２×１０^-3M)の１００μ
l、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（４４０ng
／ml）、牛の血清アルブミン（２００μg／ml）とエチ
レンジアミン四酢酸（０．００５０Ｍ）を含む水溶液の
１００μlを混合して溶液を調製した。反応をルミノメ
ーターを使用して監視し、そして過酸化水素０．０１８
Ｍおよびエチレンジアミン四酢酸０．００１０Ｍの水溶
液１００μlを添加して反応を開始させた。光出力を反
応開始後３０秒間測定し、ストリツプ・チヤート・レコ
ーダー上に線図として記録し、そしてルミノメーターに
より記録し且つ積分した。

第II表は、示されたベータラクタム抗生物質が使用され
た場合のルミノメーターで測定された光出力を示す。

これらの結果は、すべての試験されたベータラクタム抗
生物質がおだやかな化学ルミネセンスを示したが、総化
学ルミネセンス量は採用された条件下では抗生物質の間
にかなりの変動のあることを示した。

実施例３ ベータラクタム反応がここではペニシリンＧ、アンピシ
リン、およびセフアロシンを定量するために用いられ
た。水に希釈されたベータラクタム溶液（５０μl）を
０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、０．００５Ｍエチレンジア
ミン四酢酸、および０．１％トイーン２０（Tween
２０）〔ポリオキシエチレン・ソルビタン・モノラウレ
ート、アイ・シー・アイ・アメリカ、ウイルミントン、
デラウエア（ICI America、Wilmington, Delaware）か
ら入手可能〕を含むルミノール溶液、０．１mg／ml、に
加えて、夫々pH１１．０（ペニシリンＧ）、pH１２．０
（アンピシリン）、またはpH１０．０（セフアロシン）
に調製した。反応をターシヤリーブチルヒドロペルオキ
シド０．０２Ｍ溶液（０．００１Ｍエチレンジアミン四
酢酸を含む）１００μlを加えて開始させ、その反応に
よつて発生した光を１分間の区間で積分した。

ペニシリンＧ、アンピシリン、およびセフアロシンにつ
き夫々３分、２分および１分における光出力を第１図に
夫々曲線Ａ、ＢおよびＣとして記入した。これらのプロ
ツトは、これらの反応から発生した光が反応混合物中に
存在する特定のベータラクタム抗生物質の濃度に対して
直線的関係にあることを示した。これらの検定のおおよ
その感度は、バツクグランド反応の標準偏差を２回測定
すると、夫々１５０、２５０および５００ng／mlであ
る。

実施例４ ベータラクタム反応からの光出力は、適当な反応条件と
反応物を選択することによつて光出力の量と光出力の継
続期間の両方において変えることができる。ペニシリン
Ｇ、１mg／ml水溶液の１００μl、との反応を実施し、
その光出力を時間に対して記録した（第２図）。使用さ
れた過酸化物が過酸化水素、０．０１８Ｍ溶液の１００
μl、pH１１．０、であつた場合に、反応は大量の光を
速やかに発生したが（曲線Ｄ）、光の発生は殆ど同様な
速さで減退した。もし添加された過酸化物がターシヤリ
ーブチルヒドロペルオキシド、０．０２Ｍ溶液の１００
μl、であると、反応ははるかに多くの光を発生する
（曲線Ｅ、ＦおよびＧ）が、それほど遠くない。pH１
０．０では（曲線Ｅ）、ピークの光出力は１８分まで到
達されないが、pH11.0（曲線Ｆ）とpH１２．０（曲線
Ｇ）ではピークはさらに速く、夫々６分と２分に到達さ
れ、その際光の総発生量に著しい減少は見られない。

実施例５ 第３図は実施例１においてルミノメーターを連結したス
トリツプレコーダーにより記録された３０秒線図を夫々
ペニシリンＧ（第３Ａ図）、ペニシリンＶ（第３Ｂ
図）、アンピシリン（第３Ｃ図）、アミノペニシリン酸
（第３Ｄ図）およびセフアロシン（第３Ｅ図）について
示す。これらの特徴的線図は、試験された各ベータラク
タム毎に異なり、種々のベータラクタム類についての化
学ルミネセンス指紋の役をつとめるので、定性分析法と
して役立つ。

実施例６ １０μgのルミノール、０．１％トイーン２０（Tween
２０）、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、および０．０
０５Ｍエチレンジアミン四酢酸を含むルミノール溶液
（pH１０．０）の１００μlに、ベータラクタム抗生物
質１mg／mlを含む溶液５０μlと、牛のヘモグロビン
（シグマ）２．３×１０^-7mg／ml、ミクロペルオキシダ
ーゼ（シグマ）２．６×１０^-8mg／ml、または水のうち
一つの５０μlを加えることにより一連の反応を実験し
た。これらの溶液に、１００μlの過酸化水素溶液
（０．０１８Ｍ、エチレンジアミン四酢酸０．００１Ｍ
を含む）または過ホウ酸ナトリウム溶液（０．０２Ｍ、
エチレンジアミン四酢酸０．００２Ｍを含む）を実施例
１に述べたように暗所で注入した。これらの反応から発
生する光を観察したが、その結果を第III、IVおよびＶ
表に示す。

これらのデータは、ベータラクタム抗生物質のルミノー
ルへの添加反応はヘモグロビンまたはミクロペルオキシ
ダーゼ触媒の存在ではより大量の光を発生すること、お
よび触媒なしでもこの反応はまたかなりの光を発生する
ことを示す。また、過酸化水素と過ホウ酸ナトリウムの
両方共にこれらの反応に酸化剤として役立つことが示さ
れた。セフアロシンとセフアピリンの場合に、過ホウ酸
ナトリウムを使用すると、過酸化水素よりも著しく大量
の光を発生する。

実施例７ ペニシリンＧ（１mg／ml水溶液）と過ホウ酸ナトリウム
（０．０２Ｍ、エチレンジアミン四酢酸０．００２Ｍを
含む）の反応に試験化合物を添加した。各化合物を、エ
チレンジアミン四酢酸の０．００５Ｍ溶液であり且つ
０．１％トイーン２０（Tween ２０）をpH９．５で
含む０．０５Ｍホウ酸ナトリウム中に溶解した。但し、
クマリン２とアクリドンは別で、これらは０．５mlのジ
メチルスルホキシド中に溶解してから、ホウ酸塩緩衝液
で１０．０mlに希釈した。各反応は実施例１と同じくセ
イヨウワサビペルオキシダーゼ５０μlと共に、または
触媒なしで５０mlの緩衝液と共に実験された。反応を、
過酸化物、１００μlの試験化合物溶液、および５０μl
のペニシリンＧを実施例１と同様に混合することにより
開始させ、発生する光を観測した。

これらの反応の結果を、存在するペニシリンＧによつて
発生した光のそれなしで発生した光に対する比として、
第VI表に示した。本発明に従つて化学ルミネセンス作用
について試験された化合物のうちで、クマリン２、スル
ホロダミン１０１、４−メチルウンベリフエロン、ウン
ベリフエロン、フルオレセインアミン・アイソマーII、
フルオレセイン、ルミノールおよびイソルミノールはベ
ータラクタム反応のため有用な化学ルミネセンス化合物
として行動し、そしてこれらのうちイソルミノールとル
ミノールが好ましい。第VI表に列記された残りの化合物
は本発明の実施に使用するには適しない。

実施例８ 化学ルミネセンス反応用の緩衝剤はベータラクタム反応
から発生する光に影響を与える。エチレンジアミン四酢
酸の０．００５Ｍ溶液であり且つ０．１％トイーン２０
（Tween ２０）を含む緩衝液（pH９．５）中にルミ
ノールを０．０１mg／mlに溶解することにより第VII表
に示す種々の緩衝剤の存在で反応を実験した。これらの
ルミノール溶液１００μlに、５０μlのベータラクタム
水溶液（１mg／ml）と５０μlのセイヨウワサビペルオ
キシダーゼ溶液（６．８×１０^-5mg／ml）を添加した。
反応を実施例１と同様に過酸化水素溶液（０．０１８
Ｍ、エチレンジアミン四酢酸０．００１Ｍを含む）の注
入によつて開始させた。

これらの反応の結果（第VII表）は、各緩衝剤毎にＥＬ
Ｏがあるが、炭酸塩、ほう酸塩、およびトリス緩衝剤が
試験されたベータラクタムにつき最大のＥＬＯ係数を発
生することを示している。

実施例９ ルミノールはまた過酸化物の存在で、しかし酸化触媒の
不在でのベータラクタム反応によつて検出することがで
きる。ルミノールを０．１mg／ml〜２．５ng／ml含む溶
液を、０．００５Ｍエチレンジアミン四酢酸と０．１％
トイーン２０（Tween 20）を含む０．１Ｍ重炭酸ナト
リウム緩衝剤（pH１０．０）中に希釈することによつて
調製した。各１００μlのルミノール溶液に５０μlの水
と５０μlのペニシリンＧ溶液（１．０mg／ml水溶液）
を添加した。０．００１Ｍエチレンジアミン四酢酸溶液
中０．０１８Ｍの過酸化水素１００μlを注入すること
により化学ルミネセンス反応を開始させた。反応の光出
力を実施例１のように観測したが、ここでは光出力を６
０秒間に亘つて積分した点が異なる。

この検定の結果を第４図に示す。これらの条件の下での
検出の限界は溶液ml当り１．５ngのルミノール（８．５
×１０^-9Ｍ）であると見られる。

実施例１０ ベータラクタム反応はまた過酸化水素の存在の検出に使
用することができる。過酸化水素の溶液を０．０１８Ｍ
の濃度から１．８×１０^-6Ｍへ水中に希釈して調製し
た。ルミノールを１μg／ml、０．００５Ｍエチレンジ
アミン四酢酸と０．１％トイーン２０（Tween ２
０）を含むルミノール溶液（pH１０．０）の１００μl
とペニシリンＧ溶液（１mg／ml）の１００μlに、１０
０μlの過酸化水素溶液を加えて、その反応により発生
した光を実施例８と同じく６０秒間観測した。

その検定結果を第５図に示すが、過酸化水素は３．７×
１０^-7Ｍの濃度まで検出できることを示している。

実施例１１ ２種の別の過酸化物をベータラクタム反応において過酸
化水素の代りに使用した。１００μlのルミノール溶液
（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、０．００５Ｍエチレンジ
アミン四酢酸、および０．１％トイーン２０（Tween
２０）の液中０．１mg／ml、pH１０．０）と１００μl
のベータラクタム溶液（１mg／ml水中）の混合物に暗所
で１００μlのターシヤリーブチルヒドロペルオキシド
（ｔ−BuOOH）（０．００１Ｍエチレンジアミン四酢酸
中０．０２Ｍ）、または１００μlのメタ−クロロ過安
息香酸（MCPB）（０．００１Ｍエチレンジアミン四酢酸
中０．００２Ｍ）のいずれかを加え、反応により発生し
た光を１分間に亘り積分した。その反応の結果が第VIII
表にＥＬＯ係数として報告されている。

これらの結果は、これらの過酸化物がベータラクタムと
の反応に際して著しい量の光を発生することを示す。タ
ーシヤリーブチルヒドロペルオキシドの使用は、観測さ
れた高いＥＬＯ係数から見られるように、特にこれらの
反応において効果がある。

実施例１２ ベータラクタム反応は血漿と乳の両方に有用である。反
応は実施例３の方法で、ペニシリンＧの水溶液（１０mg
／ml）を血漿または生ミルクで１０倍に希釈して、最終
濃度１mg／mlのペニシリンＧ溶液としたものと共に実施
された。さらにベータラクタム抗生物質の希釈が適当な
液体（すなわち、血漿または乳）によつて行なわれた。
５０μlの血漿または乳に１００μlの水と１００μlの
ルミノール溶液（０．１mg／mlのルミノール、０．１Ｍ
重炭酸ナトリウム、０．００５Ｍエチレンジアミン四酢
酸、および０．１％トイーン２０（Tween ２０）を
含む）を加えた。反応を１００μlの過酸化水素溶液
（０．００１Ｍエチレンジアミン四酢酸中０．０１８
Ｍ）を暗所で注入して開始させてから、反応からの光を
６０秒間監視した。血漿と乳夫々について第６図と第７
図に示された、ペニシリンＧの濃度に対する正味の光出
力のプロツトから、ベータラクタム反応からの光出力は
ペニシリンＧの濃度と共に直線状に変化することが見ら
れる。このことはこの抗生物質の検出と定量を血漿では
約１０μg／ml、乳では１μg／mlの水準まで可能にす
る。

分析される試料が乳である場合には、反応の解析を反応
系の成分と試料とを混合した後直ちに（すなわち、約１
０秒以内に）開始することが感度の理由で望ましい。

実施例１３ ベータラクタム反応を１００μlのルミノール溶液
（０．１Ｍ NaHCO₃、０．００５Ｍエチレンジアミン四
酢酸、および０．１％トイーン２０（Tween ２０）溶
液中１mg／ml、pH１０．０）、５０μlのペニシリンＧ
水溶液（１mg／ml）、および１００μlの過酸化水素
（０．０１８Ｍ、０．００１Ｍエチレンジアミン四酢
酸）によつて行なつた。この反応を５０μlのシアン化
ナトリウム（２．６mg／ml）またはアジ化ナトリウム
（２．８mg／ml）のいずれかを添加して改変した。

これらの反応により発生した光をストリツプ・チヤート
・レコーダー上で監視し、第８図に再現し、そして５分
間に毎分積分した。その結果は、第IX表に示されている
が、アジ化物の添加は反応により発生した光を著しく増
加させる（それのない場合の１８５％）ことを示す。シ
アン化物は光出力を減少させるが（５分間の観測で約３
０％の減少）、アジ化物と組合せて使用された場合に
は、アジ化物単独使用の場合とほぼ同じ、あるいは改変
しない反応の１７４％の光出力である。注意すべき他の
一つの結果は、アジ化物および／またはシアン化物が存
在する場合に、それらが不在の場合よりも速くピークの
光出力が達成されることである（第８図）。

実施例１４ ベータラクタム反応をペニシリンＧとアジ化ナトリウム
単独かまたはアジ化ナトリウム／シアン化ナトリウム混
合物のいずれかを使用して実施例１３と同様に実験し
て、ペニシリンＧを含まないバツクグラウンド反応と比
較した。反応の３０秒と６０秒における積分光出力の比
が第Ｘ表に示されており、かなりの増加、すなわちアジ
化ナトリウムでは夫々１．９および１０．５倍、アジ化
ナトリウムとシアン化ナトリウムでは夫々１．１および
３．１倍、を示している。

実施例１５ ベータラクタム反応を再びペニシリンＧと、今回はアス
コルビン酸ナトリウム（３００ng／ml）、またはアスコ
ルビン酸ナトリウム（３００ng／ml）とアジ化ナトリウ
ム（２．８mg／ml）の混合物を使用して実施例１３と同
様に実験した。反応の光出力は著しい影響を受けなかつ
たが、バツクグラウンド光出力はかなり減少した。これ
は第XI表に示されたこれらの反応のＥＬＯ係数によつて
見られ、ＥＬＯ係数は反応２分後に２００以上に増加し
ている。

実施例１６ ルミノール反応の酸化触媒をベータラクタム反応によつ
て検出および定量することができる。１００μlのルミ
ノール溶液（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、０．００５Ｍ
エチレンジアミン四酢酸、および０．１％トイーン２０
（Tween ２０）、pH10.0の溶液中、ルミノール１mg
／ml）、５０μlのペニシリンＧ溶液（０．２mg／ml水
溶液）、および５０μlのセイヨウワサビペルオキシダ
ーゼ溶液（緩衝液で５６００から１４ng／mlへ希釈され
た）の混合物に１００μlの過酸化水素（０．０１８
Ｍ）を暗所で加えてから、反応により発生した光を１０
秒間監視した。第９図に反応の正味光出力が触媒の濃度
に対してプロツトされており、それらの間に直線関係の
存在することを示している。このグラフから、これらの
条件における検出限界の６ng／mlが示される。

【図面の簡単な説明】

第１図はベータラクタム濃度に対する本発明の方法を使
用して得られた光出力のプロツトである。（実施例３参
照） 第２図は時間に対する本発明の方法を使用する光出力の
プロツトである。（実施例４参照） 第３図は本発明の方法を使用して得られる特定のベータ
ラクタムに特徴的な線図の例示である。（実施例５参
照） 第４図はルミノール濃度に対する本発明の方法を使用し
て得られる光出力のプロツトである。（実施例９参照） 第５図は過酸化水素濃度に対する本発明の方法を使用し
て得られる光出力のプロツトである。（実施例１０参
照） 第６図は血漿中のペニシリン濃度に対する本発明の方法
を使用して得られる光出力のプロツトである。（実施例
１２参照） 第７図は生ミルク中のペニシリン濃度に対する本発明の
方法を使用して得られた光出力のプロツトである。（実
施例１２参照） 第８図は時間に対する本発明の方法を使用して得られた
光出力のプロツトである。（実施例１３参照） 第９図はセイヨウワサビペルオキシダーゼ濃度に対する
本発明の方法を使用して得られる光出力のプロツトであ
る。（実施例１６参照）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ベータラクタムを含有すると思われる試料
   中のベータラクタム環を含む化合物の検出方法であっ
   て、 a) i)化学ルミネセンス化合物、過酸化物源、および塩
   基から成る反応系、およびii)前記試料の予め定量され
   た一部、を合わせて混合物とする工程、および b) 前記混合物の光出力を測定する工程、から成る上記
   の検出方法において、もし前記試料の前記予め定量され
   た一部が唯一のベータラクタムとしてペニシリンＧを含
   み、かつ、その含有量が結果として前記混合物がペニシ
   リンＧを0.45mMの濃度で含むことになるならば、前記反
   応系が光出力信号を発生し、これをルミノメーターで測
   定して信号の開始から30秒に亘り積分すると、前記試料
   の前記予め定量された一部がベータラクタムを含まない
   場合に出す出力の少なくとも約2倍であることを特徴と
   する上記の検出方法。
2. 【請求項２】前記反応系がさらに酸化触媒を含む、特許
   請求の範囲第1項に記載の方法。
3. 【請求項３】ベータラクタムを含有すると思われる試料
   中のベータラクタム環を含む化合物の検出方法であっ
   て、 a) i)化学ルミネセンス化合物、過酸化物源、および塩
   基から成る反応系、およびii)前記試料の予め定量され
   た一部、を合わせて混合物とする工程、および b) 前記混合物の光出力を測定する工程、から成り、前
   記方法において化学ルミネセンス化合物がルミノール、
   ルミノール類似体、イソルミノール、イソルミノール類
   似体、クマリン2、スルホロダミン101、ウンベリフェロ
   ン、4-メチルウンベリフェロンおよびフルオレセインか
   ら成る群より選択されることを特徴とする上記の方法。